«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение ...»
* Табличные значения (Никольский и др., 1963)
# Значения вычислены с помощью калибровочной зависимости
Используя полученные времена жизни и значения анизотропии флуоресценции, были вычислены времена вращательной корреляции ФМН (cal) для исследованных сред по формуле (Lacowicz, 2006):
,
где - время жизни флуоресценции, r0 – фундаментальная анизотропия ФМН (равная 0,354), r – экспериментально измеренная анизотропия флуоресценции ФМН (таблица 1.3.5.2).
Известно, что время вращательной корреляции линейно связано с вязкостью среды () по формуле (Lacowicz, 2006):
,
где V- объем вращающейся частицы, k – константа Больцмана, Т – температура.
На основе вычисленных времен вращательной корреляции и известных значений вязкости растворов, содержащих глицерин, была построена калибровочная зависимость для определения вязкости других сред (рисунок 1.3.26). На предыдущем этапе было выявлено, что использованные среды не оказывают влияния на структуру электронно-возбужденных состояний молекулы ФМН, а значит, можно допустить, что объем молекулы ФМН не изменяется при переходе из одной среды в другую.
Рисунок 1.3.26 – Калибровочная прямая для определения вязкости микроокружения ФМН
Получено эмпирическое уравнение, связывающее время вращательной корреляции ФМН и вязкость среды:
.
Используя данное уравнение, были оценены вязкости растворов, содержащих желатин и крахмал. Получено, что в диапазон значений вязкости клеточной цитоплазмы (2-50 спз) попадают вязкость 5%-х растворов данных веществ (таблица 1.3.9) при 20°С. Интерполяция полученных значений позволяет оценить, что, начиная приблизительно с 2%-го содержания биополимера, вязкость микроокружения ФМН превышает 2 спз, т.е. становится схожей с характеристиками клеточной цитоплазмы. Следует отметить, что методика эксперимента (а именно, частое перемешивание и термостатирование в течение не более 20 минут) предполагает, что в исследованных образцах не происходило образования геля.
Таким образом, разработана методика оценки вязкости среды на основе анизотропии флуоресценции флавинмононуклеотида и установлено, что вязкость, характерная для клеточной цитоплазмы, достигается при концентрациях растворов крахмала и желатина более 2% (при 20°С).
1.4. Обоснованность и достоверность полученных результатов
Полученные в проекте научные результаты подтверждают гипотезу о возможности стабилизации ферментов путем иммобилизации. Результаты, полученные для ферментов светящихся бактерий, могут быть применимы для создания экспериментальных моделей функционирования других фермент-субстратных комплексов в клетке. Подготовлены экспериментальные образцы многокомпонентного иммобилизованного реагента, готовые для использования в биотестировании сточных вод промышленных предприятий.
Раздел 2 Разработка математической модели функционирования бактериальной биолюминесцентной системы
2.1 Анализ вклада различных механизмов и стадий реакции в кинетику свечения биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза
На основании полученных ранее экспериментальных данных построена математическая модель сопряженной биферментной реакции НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза для оценки вклада различных механизмов и стадий реакции в кинетику свечения.
Измерения кинетики биферментной реакции проводили на планшетном биолюминометре TriStar LB 941 фирмы «Berthold Technologies» (Германия). Измерение интенсивности свечения проводили в течение 30 с, время единичного измерения составляло 0.5 с. Измерения каждой экспериментальной точки проводили не менее чем в пяти параллельных измерениях.
Подача реагентов в лунку планшета осуществлялась с помощью двух инжекторов, единоразовый объем каждой новой порции смеси реактивов составлял 50 мкл. Раствор для первого инжектора содержал 0.12 мМ ФМН, 9.5 мкМ тетрадеканаля (C14H28O), 16.6 мМ этанола, 64.5 нМ люциферазы, 4.3 единиц активности редуктазы на литр. Инициировали реакцию с помощью второго инжектора 19 мкМ раствором НАДH. При исследовании кинетики биферментной системы в присутствие бензохинона в реакционную смесь помимо указанных компонентов вносили 10 мкл бензохинона заданной концентрации. Для получения контрольных зависимостей интенсивности биолюминесценции от времени вместо бензохинона в лунку планшета вносили 10 мкл дистиллированной воды.
Математическое моделирование проводили с помощью программы Solver, встроенной в электронную таблицу Excel («Microsoft», США). Для статистической обработки результатов также использовали пакет прикладных программ Excel.
2.1.1 Кинетические схемы функционирования моно- и биферментной системы светящихся бактерий
Конечной, индикаторной стадией биотеста является реакция, катализируемая люциферазой. На рисунке 2.1.1 представлена кинетическая схема реакции. Следует отметить, что отдельные стадии люциферазной реакции протекают достаточно медленно по сравнению со временем биотеста, что не позволяет использовать квазистационарное приближение Михаэлис-Ментен, обычно используемое для описания ферментативных реакций. Кроме того, в люциферазной реакции бактерий участвуют три субстрата: ФМНH2, кислород и длинноцепочечный альдегид, что ставит вопрос о порядке присоединения субстратов к ферменту. Анализ поведения кривых свечения люциферазной реакции при различных условиях позволил построить кинетическую схему люциферазной реакции, поведение которой соответствует известным экспериментальным данным.
L – люцифераза; L* – люцифераза с возбужденным хромофором; A – алифатический альдегид; F – ФМНH2, f – ФМН, O - кислород, c – жирная кислота. Подстрочные символы соответствуют указанным химическим компонентам в составе соответствующих фермент-субстратных комплексов. Небольшая кинетическая схема в центре описывает всегда имеющее место окисление восстановленного флавинмононуклеотида кислородом – "кислородный шунт".
Рисунок 2.1.1 - Общая минимальная трехсубстратная кинетическая схема функционирования бактериальной люциферазы (В.В.Межевикин).
НАДH:ФМН-оксидоредуктаза поставляет в реакционную среду ФМНH2 – один из субстратов люциферазной реакции. До настоящего времени точно не известен механизм работы этого фермента. В последнем обзоре на эту тему (Tu, 2008) утверждается, что одиночная НАДPH-редуктаза работает по механизму с замещением субстрата ("ping-pong"-механизм), но в присутствии люциферазы реализуется последовательный механизм прямой передачи восстановленного флавинового кофактора люциферазе через образование комплекса редуктаза-люцифераза. В отношении НАДH-редуктазы подобных данных о существовании ферментного комплекса нет. Более того, существуют литературные данные, приведенные в работе (Петушков и др., 1984), свидетельствующие против существования комплекса люцифераза-редуктаза, об этом же говорит результат, полученный в этой работе.
Выбор между механизмами с последовательным присоединением субстратов и замещением (ping-pong) на данном этапе является несущественным, поскольку при принятых условиях протекания биферментной реакции (высокая и постоянная концентрация ФМН в реакционной смеси) качественного различия в зависимости квазистационарной скорости реакции от НАДH нет. Квазистационарное приближение для редуктазы применимо, вследствие малого времени оборота фермента (Петушков и др., 1984).
Кинетическая схема редуктазной реакции для механизма с замещением субстрата приведена на рисунке 2.1.2.
R – редуктаза; R' – редуктаза с протоном; N – НАДH; n – НАД; F – ФМНH2, f – ФМН
Рисунок 2.1.2 - Кинетическая схема функционирования НАДH:ФМН-оксидоредуктазы.
2.1.2 Построение упрощенной математической модели функционирования биферментной системы
Для описания люциферазной реакции по предложенной кинетической схеме требуется 17 дифференциальных уравнений, для описания работы редуктазной реакции - 5 уравнений. При таком большом общем количестве дифференциальных уравнений и входящих в них параметров чрезвычайно сложно провести реконструкцию величин этих параметров по кинетической кривой. Заранее можно сказать, что ее вид определяется в основном относительно небольшим числом параметров сопряженной реакции. Задача состоит в поиске этих параметров.
Построение максимально простой математической модели, которая в основном воспроизводит существенные черты наблюдаемых кинетических кривых, требует введения предположения о существенных переменных системы и, кроме того, накладывает требования на условия проведения экспериментов, которые способствовали бы упрощению модели. Эти предположения и условия таковы:
- начальная концентрация НАДH существенно меньше концентрации ФМН (условие);
- вследствие автоокисления доля восстановленного флавина много меньше доли окисленного (предположение, имеющее основания);
- скорость связывания флавина с люциферазой много меньше скорости его окисления (предположение, требующее проверки).
- алифатический альдегид не лимитирует скорость люминесцентной реакции (предположение, истинность которого зависит от условий);
- доля люциферазы, вовлеченной в химические превращения, много меньше ее начальной концентрации (предположение, зависящее от начальных условий).
Тогда модель динамики свечения описывается системой дифференциальных уравнений:
, (1)
где N – НАДH, F0 – ФМН; F – ФМНH2; L0 – начальная концентрация люциферазы; L* - люцифераза с возбужденным хромоформ; VR – активность редуктазы; kd – константа скорости автоокисления ФМНH2, k2 – скорость образования продукта реакции – свечения.
Аналитическое решение этой системы имеет вид:
. (2)
Проверку качественного соответствия динамики свечения в построенной модели и экспериментальных данных, без сопоставления на данном этапе параметров модели с параметрами реакции в эксперименте проводили с использованием программы Solver, встроенной в электронную таблицу Excel. Эта программа осуществляет минимизацию выбранной целевой функции, подбирая произвольное количество параметров при наличии необходимых ограничений. В качестве целевой функции была выбрана сумма квадратов разностей между экспериментальными значениями и модельным прогнозом. В процессе нахождения минимума невязки подбирались, при наличии ограничения на их неотрицательность, следующие три параметра модели:
Типичный вид результата подбора параметров при различных условиях проведения реакции приведен на рисунке 2.1.3.
Пунктирная линия - модельное решение, сплошная – экспериментальная кинетическая кривая
Рисунок 2.1.3 - Экспериментальная и модельная кривые свечения биферментной реакции НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в растворе.
Легко видеть, что при наличии относительно удовлетворительного количественного соответствия (отклонение значений модельной кривой от экспериментальной не превышает 8 %), имеется существенное качественное расхождение. В контексте конечной цели исследований – получение инструмента для оценки констант и параметров биферментной люминесцентной реакции при различных внешних воздействиях – имеющееся расхождение существенно, поскольку указывает на различие в механизмах, формирующих вид кривой. Так, например, при рассмотрении характера отклонения модельной и экспериментальной кривой, видно, что максимальное свечение в эксперименте достигался большее время, чем это следует из модели. Кроме того, кривая спада свечения в эксперименте имеет двухфазный характер, сначала падение интенсивности происходит быстрее, чем в модели, а затем наоборот. Подобный факт свидетельствует, что в формировании кривой на стадии падения интенсивности свечения принимают участие, по крайней мере, два механизма. Это может означать, что некоторые упрощающие предположения, принятые в модели не верны.
Если не обеспечить качественное соответствие кривых, то при внешне удовлетворительных количественных результатах сопоставления кривых мы будем получать данные совсем о других стадиях реакции, причем совершенно неверные. Отсюда следует необходимость проверить адекватность модельного описания биферментной системы путем прямого переноса в модель экспериментальных значений констант и концентраций.
2.1.3 Анализ механизмов формирования кинетических кривых свечения
Параметры реакционной смеси
Исходя из условий проведения эксперимента был сделан расчет содержания субстратов и ферментов непосредственно в кювете: концентрация люциферазы в кювете равна 4*10-9 М, [НАДH] = 8,710-5 M, [ФМН] = 1,110-5 M, скорость потребления субстрата (НАДH) окисидоредуктазой равна 1,1*10-7 М/мин.
Учет того, что концентрация люциферазы на 4 порядка меньше концентрации флавина, приводит к необходимости учитывать изменения концентрации свободной люциферазы и в то же время считать концентрацию окисленного флавина постоянной и равной F0:
(3)
где L0 – начальная концентрация люциферазы; L* - люцифераза с возбужденным хромофором; kd – константа скорости автоокисления ФМНH2, k2 – константа скорости образования продукта реакции – свечения.
Система уравнений (3) аналитического решения не имеет и поэтому исследование свойств модели приходится проводить численно. Вычисления показали, что при любом подборе свободных параметров системы не удается описать своеобразный небольшой «горб» в районе максимума свечения (Рис. 2.1.4). Это указывает на необходимость учета дополнительных реакционных процессов.
Рисунок 2.1.4 - Ансамбль кинетических кривых биферментной люминесцентной реакции, полученных при одинаковых условиях.
Самым естественным является предположение, что «горб» есть проявление повышенного количества свободной люциферазы в начале реакции. Такое распределение свободной люциферазы по времени может быть связано с тем, что после высвечивания люцифераза какое-то время находится в неактивном (связанном с продуктами реакции) состоянии. Учет этого неактивного состояния люциферазы приводит к необходимости введения еще одной переменной в систему:
(4)
где Lin – люцифераза в инактивированном состоянии; kr – константа скорости перехода люциферазы из пассивного в активное состояние.
Результаты численных расчетов модели (4) приведены на рисунке 2.1.5. Можно видеть, что учет временной инактивации люциферазы в модели позволяет воспроизвести качественные особенности кинетики биферментной системы.
Рисунок 2.1.5 - Модельная кинетика свечения биферментной реакции.
Модельная кинетика воспроизводит экспериментальную при определенных значениях свободных параметров реакции. Однако остается открытым вопрос, насколько модель при выбранных значениях параметров способна описывать поведение реальной биферментной системы при воздействии тестовых химических соединений. То есть вопрос о своеобразной устойчивости полученных оценок модельных параметров.
В качестве пробной сложной кинетики была выбрано поведение биферментной системы в присутствие хинона (Рис.2.1.6).
Рисунок 2.1.6 - Кинетика биферментной системы в присутствие различных концентраций хинона.
Для моделирования наблюдаемого отклика на хинон модель должна учитывать механизм действия хинона на биферментную систему. Ранее была высказана гипотеза о том, что на начальном этапе хинон, присутствующий в системе окисляет производимый редуктазой восстановленный флавин и переходит в пассивную форму. Вследствие очень высокого сродства хинона к восстановленному флавину, при больших концентрациях хинона свечение вначале может практически не наблюдаться (см. Рис.2.1.6). Учет вклада хинона в динамку системы приводит к очередному расширению модели:
(5)
где H – хинон; kH – константа скорости связывания хинона с восстановленным флавином.
Численное моделирование системы (5) показало, что принятая гипотеза о механизме ингибирования хиноном позволяет объяснить появление перегиба на начальном этапе кинетики свечения и почти полное гашение свечения, и сдвиг максимума при высоких концентрациях хинона (Рис.2.1.7). Однако понижение интенсивности свечения после достижения максимального значения модель, построенная в рамках данной гипотезы, не описывает. Более того, при увеличении концентрации хинона интенсивность свечения после достижения максимального значения даже несколько возрастает.
Таким образом, возникает необходимость рассмотрения других возможных механизмов реагирования биферментной системы на хинон. Ранее было показано, что в присутствие редуктазы скорость окисления хинонами молекул НАДH значительно выше по сравнению с неферментативным процессом (Кудряшева, 2004). Высказано предположение о недостаточно высокой специфичности редуктазы к ее субстрату (ФМН) и возможности катализа редуктазой реакции восстановления других окислителей, в частности хинонов (Кудряшева, 2004).
Рисунок 2.1.7 - Кинетика свечения биферментной системы в присутствие хинона в модели, учитывающей окисление восстановленного флавина хиноном. Сплошная линия – контроль.
Тогда уменьшение интенсивности свечения после достижения максимального значения связано с тем, что в присутствии хинона возрастает активность редуктазы, что приводит к уменьшению концентрации НАДH в среде, и, как следствие, к снижению интенсивности свечения. В этом случае работу редуктазы можно описать следующей кинетической схемой (рис. 2.8):
R – редуктаза; R* – редуктаза с протоном; N – НАДH; FR – ФМНH2,
F – ФМН; H – хинон
Рисунок 2.1.8 - Кинетическая схема функционирования НАДH:ФМН-
оксидоредуктазы при наличии дополнительного субстрата - хинона.
Для вывода квазистационарной скорости реакции по отношению к двум субстратам применен метод графов (Волькенштейн, 1975):
Для упрощения анализа было принято, что и равны единице, тогда:
.
В этом случае модель биферментной системы в тех же обозначениях принимает следующий вид:
(6)
Результаты численных расчетов модели (6) приведены на рисунке 2.1.9.
(А) - вариант кинетики со специально подобранными значениями констант (см.текст); (Б) – типичная кинетика свечения. Сплошная линия – контроль
Рисунок 2.1.9 - Кинетика свечения биферментной системы в присутствие хинона в модели, учитывающей использование хинона в качестве субстрата редуктазы.
Для этого варианта модели удается подобрать параметры и кинетические константы таким образом, что наблюдается ожидаемое уменьшение уровня свечения (Рис.2.1.6А). Однако диапазон значений констант, где наблюдается этот эффект очень узок и, главное, при этих значениях параметров исчезает характерный «горб» который наблюдается в реальных условиях (Рис. 2.1.4, 2.1.6). При других значениях параметров, сохраняющих «горб» на кривой свечения, типичная кинетика имеет вид, представленный на Рис.2.1.6 (Б), который качественно не отличается от предыдущего варианта (Рис.2.1.7). Отсюда следует, что для объяснения наблюдаемого падения интенсивности необходимо учитывать другие механизмы.
Один из путей воздействия экзогенных соединений на биолюминесценцию – взаимодействие их с ферментами биолюминесцентной системы реакций, которое может приводить к нарушению их каталитической активности. В работах Ветровой с соавторами показано, что в присутствие бензохинона наблюдается изменение таких флуоресцентных характеристик препаратов ферментов, как интенсивность, время жизни, а также спад анизотропии флуоресценции эндогенного флавина (Vetrova et al., 2005, 2007). Подобные изменения характеристик ферментов объясняются изменениями конформации ферментов в присутствие бензохинона. Таким образом, вероятным механизмом воздействия хинона являются обратимая или необратимая инактивация (ингибирование) части редуктазы или люциферазы самим хиноном или продуктом его восстановления.
Результаты вычислительных экспериментов вариантами модели, описывающими вышеприведенные случаи, приведены на рисунках 2.1.10 и 2.1.11.
А) – обратимое и Б) – необратимое ингибирование редуктазы; В) – обратимое и Г) – необратимое ингибирование люциферазы
Рисунок 2.1.10 - Варианты кинетики свечения модельной реакции
при ингибировании ферментов хиноном.
Не погружаясь в детальное рассмотрение причин, формирующих тот или иной тип кинетических кривых, можно отметить, что в случае, когда ингибитором является сам хинон, то качественно близкие эксперименту кинетики реализуются в случае необратимой инактивации ферментов. Следует отметить, что нет существенных различий между модельными кинетическими кривыми для случаев инактивации редуктазы или люциферазы.
А) – обратимое и Б) – необратимое ингибирование редуктазы; В) – обратимое и Г) – необратимое ингибирование люциферазы
Рисунок 2.1.11 - Варианты кинетики свечения модельной реакции
при ингибировании ферментов продуктом восстановления хинона.
В том случае, когда в качестве ингибитора выступает продукт восстановления хинона, получается обратная предыдущему случаю картина. Удовлетворительное качественное соответствие наблюдается, когда ингибитор обратимо взаимодействует с ферментом, причем, как и в предыдущем случае, существенной разницы между редуктазой и люциферазой не обнаружено.
Сопоставляя полученные варианты кинетических кривых с полученными в эксперименте (Рис.2.1.6) можно видеть, что сдвиг максимума свечения наблюдается во всех вариантах модели, имеется несколько вариантов, где помимо сдвига воспроизводится падение интенсивности после достижения максимума. Однако очень важное качественное свойство кинетических кривых – уменьшение угла наклона начальных стадий с ростом концентрации хинона воспроизведено только на Рис. 2.1.10 (А), то есть для случая, когда сам хинон обратимо инактивирует (ингибирует) редуктазу. В принципе можно допустить одновременное действие трех механизмов: непосредственное восстановление хинона восстановленным флавином, обратимая инактивация редуктазы хиноном и обратимое ингибирование люциферазы продуктом восстановления хинона. Однако перед не очень эстетичным комбинированием трех разных механизмов имеет смысл проверить возможность существования других механизмов, вызывающих уменьшение наклона кинетической кривой.
Поскольку вид участка кривой, описывающей достижение максимума, зависит от двух показателей – динамики концентрации восстановленного флавина от времени и от константы скорости формирования возбужденного комплекса, то обратимся к этой константе.
Согласно детальной модели люциферазной реакции, константа скорости формирования возбужденного комплекса является сложной и зависит в частности от концентрации альдегида и конкурирующих с ним веществ. По своей химической структуре продукт восстановления хинона может выступать в качестве конкурентного к альдегиду ингибитора. В этом случае, «константа» скорости формирования возбужденного состояния будет уменьшаться с ростом концентрации продукта восстановления хинона в среде.
Результаты вычислительных экспериментов с этим вариантом модели приведены на рисунке 2.1.12.
Рисунок 2.1.12 - Кинетика свечения биферментной системы в модели,
учитывающей использование хинона в качестве субстрата редуктазы и зависимость скорости формирования возбужденного комплекса от концентрации продукта восстановления хинона.
Можно видеть, что основные характерные особенности экспериментальных кривых – «горб», сдвиг максимума, уменьшение интенсивности после максимума и уменьшение наклона кривой до максимума – воспроизводятся данным вариантом модели.
Однако общий ход, форма кинетических кривых отличается от таковых в эксперименте. Для получения сходства форм кинетических кривых (эстетика соответствия) в модели комбинировали три вышеуказанных механизма: непосредственное восстановление хинона восстановленным флавином, обратимая инактивация редуктазы хиноном и обратимое ингибирование люциферазы продуктом восстановления хинона. Этот вариант модели имеет вид:
(7)
(8)
где H – хинон; H- - восстановленная форма хинона; R- - неактивный комплекс редуктазы с хиноном; L- - неактивный комплекс люциферазы с восстановленной формой хинона. Остальные обозначение приведены выше.
Результаты вычислительных экспериментов с этим вариантом модели представлены на рисунке 2.1.13. Видно, что форма кинетических кривых в этом варианте модели хорошо соответствует экспериментальным данным (Рис.2.1.6).
Рисунок 2.1.13 - Кинетика свечения биферментной системы в модели,
учитывающей восстановление хинона в результате редуктазной реакции, обратимую инактивацию редуктазы хиноном и обратимое ингибирование люциферазы продуктом восстановления хинона.
Более точное, уже количественное сопоставление можно проводить после оценки ряда констант в независимых измерениях и проведения численной оптимизации модели по критерию минимума невязки. Совпадение форм модельных и экспериментальных кривых дает основание для умеренного оптимизма. В то же время мы далеки от мысли, что найден окончательный вариант модели, пригодный для проведения биотестов и решения обратных задач. В первую очередь необходимо экспериментально проверить эффекты ингибирования ферментов системы и путь утилизации хинона в биферментной системе. Часть экспериментов должна быть направлена на непосредственную проверку построенной модели при различных условиях протекания реакции.
2.2 Моделирование кинетики функционирования иммобилизованной биолюминесцентной системы светящихся бактерий
2.2.1 Роль диффузии в функционировании иммобилизованной биферметной системы
Для описания работы иммобилизованных биолюминесцентных систем как действующего физического макета функционирования бактериальной биолюминесцентной системы in vivo была сформулирована теоретическая концептуальная модель, описывающая количественные зависимости выхода активности иммобилизованной биолюминесцентной системы от концентрации соединений, участвующих в реакции, срока хранения, вязкости среды иммобилизации с учетом химической природы среды, использованной для иммобилизации. Модель была использована для установления роли процессов диффузии в реакциях с использованием иммобилизованных компонентов биолюминесцентной системы светящихся бактерий. Было проведено экспериментальное исследование динамики светоизлучения растворимой и иммобилизованной в крахмальный гель биферментной системы в связи с кинетикой диффузии молекул ФМН в ЭМкрахмал.
В работе использовали произведенный лабораторией бактериальной биолюминесценции Института биофизики СО РАН (Красноярск) комплект реактивов аналитической биолюминесценции (КРАБ), содержащий люциферазу из рекомбинантного штамма E.coli и НАД(P)H:ФМН-оксидоредуктазу из Vibrio fischeri. Один флакон КРАБа содержал 0,5 мг/мл люциферазы, 0,15 ед.активности НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы и 0,2·10-4 ДТТ. Степень чистоты люциферазы 80%.
Для измерения биолюминесценции использовали биолюминометр Lumat LB 9507 (Berthold technologies, Германия). Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра UVIKON 943 (Kontron Instruments).
Иммобилизацию флавинмононуклеотида в крахмальный гель проводили следующим образом: крахмальный гель кипятили до прозрачности, остужали до +25С, интенсивно помешивая, к гелю добавляли ФМН. Полученную смесь дозировали микропипеткой по 50 мкл на лавсановую пленку и высушивали при температуре 4С в течение 6-8 часов.
Для получения многокомпонентного иммобилизованного реагента, в полученный крахмальный гель, помимо раствора субстрата вносили раствор КРАБа. Количество крахмального геля, ферментов и субстратов рассчитывали таким образом, чтобы количество ферментов и ФМН в одном диске соответствовало количеству ферментов и ФМН в свободном растворе при единичном измерении.
Для анализа использовали следующие свежеприготовленные растворы: 4·10-4 М раствор НАДH, 5·10-4 М раствор ФМН, раствор 0,0025 % миристинового альдегида. Перед измерениями во флакон КРАБа вносили 6 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера. Раствор хранили на льду и использовали в течение шести часов после приготовления.
Измерения биолюминесценции растворимой системы проводили следующим образом: в кювету биолюминометра вносили последовательно 300 мкл 0,05 М буфера, 2 мкл раствора КРАБа, 50 мкл 0,002% раствора тетрадеканаля, 10-50 мкл 5·10-4 М раствора ФМН, 100 мкл 4·10-4 М раствора НАДH. При использовании иммобилизованного препарата реакционная смесь состояла из иммобилизованного диска и растворов ферментов или субстратов, отсутствующих в диске.
Скорость диффузии ФМН из иммобилизованных дисков оценивали по изменению оптической плотности растворов, полученных путем выдерживания дисков в буферном растворе в течение различных промежутков времени, регистрируемой на длине волны 448 нм.
Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ ЕXCEL («Microsoft», США). Представленные экспериментальные данные получены в 3 сериях экспериментов, измерения каждой экспериментальной точки проводили не менее чем в 5 параллельных измерениях. Вычисляли среднее значение параметров биолюминесценции и стандартное отклонение. Ошибка экспериментов не превышала 15%.
Для исследования влияния иммобилизации ФМН на кинетику биферментной сопряженной системы НАД(Р)Н:ФМН–оксидоредуктаза-люцифераза в качестве контроля регистрировали интенсивность свечения биферментной системы в присутствие различных концентраций ФМН, добавляемого в виде раствора (рис. 2.2.1). Кинетические зависимости интенсивности свечения системы в растворе представляют собой несимметричную относительно единственного максимума кривую. Максимум свечения достигается значительно быстрее, чем последующее уменьшение интенсивности свечения. Наибольшее значение интенсивности свечен ия достигается в присутствие 10-5 М ФМН, увеличение концентрации ФМН в растворе приводит к уменьшению активности биферментной системы. По-видимому, 10-5 М концентрация ФМН является насыщающей, при увеличении содержания ФМН в реакционной смеси наблюдается процесс субстратного ингибирования.
Иммобилизация ФМН в крахмальный гель различной концентрации не приводит к принципиальным изменениям динамики свечения по сравнению с контролем, однако максимальная интенсивность свечения при использовании иммобилизованного ФМН существенно ниже (в 4-5 раз) по сравнению с интенсивностью свечения при добавлении ФМН в виде раствора. Подобный результат объясняется уменьшением эффективной концентрации субстрата, например, его доступности для ферментов при использовании иммобилизованного ФМН.
( – 10-5 М, – 2*10-5 М, – 3*10-5 М, – 4*10-5 М, – 5*10-5 М)
Рисунок 2.2.1 - Динамика интенсивности свечения растворимой
биферментной системы НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при различных концентрациях ФМН.
На Рис. 2.2.2 представлены зависимости максимальной интенсивности свечения биферментной системы НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от количества ФМН в растворе и иммобилизованных дисках с различным содержанием крахмала. Увеличение количества ФМН в иммобилизованном диске приводит к росту максимальной интенсивности свечения.
При совместной иммобилизации ФМН и ферментов НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы временная динамика свечения изменяется: наблюдается быстрое достижение максимальной интенсивности свечения (5-10 с), затем резкое (в течение 2-3 минут) падение интенсивности свечения до фоновых значений (рис. 2.2.3).
При варьировании количества ФМН в иммобилизованном препарате, содержащем дополнительно ферменты, показано, что увеличение содержания ФМН в дисках приводит к увеличению максимальной интенсивности свечения для дисков с 3 и 3,5 % содержанием крахмала. Активность иммобилизованных препаратов, приготовленных на основе 4 и 5 % крахмального геля, не зависит от содержания ФМН в исследуемых концентрациях (рис.2.2.4).
1 – концентрация ФМН в растворе – 10-5 М, в мембране – 10-4 М, 2 – концентрация ФМН в растворе – 2*10-5 М, в мембране – 2*10-4 М, 3 – концентрация ФМН в растворе – 3*10-5 М, в мембране – 3*10-4 М, 4 – концентрация ФМН в растворе – 4*10-5 М, в мембране – 4*10-4 М, 5 – концентрация ФМН в растворе – 5*10-5 М, в мембране – 5*10-4 М.
Рисунок 2.2.2 - Максимумы интенсивности свечения биферментной системы при добавлении ФМН в виде раствора и иммобилизованного препарата с различным процентным содержанием крахмала.
( – 3% гель, – 3,5 % гель, – 4 % гель, – 5 % гель)
Рисунок 2.2.3 - Динамика интенсивности свечения биферментной системы НАДH:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, иммобилизованной совместно с ФМН
(10-4 М) в гели разной концентрации.
1 – концентрация ФМН в растворе – 10-5 М, в мембране – 10-4 М,
2 – концентрация ФМН в растворе – 2*10-5 М, в мембране – 2*10-4 М, 3 – концентрация ФМН в растворе – 3*10-5 М, в мембране – 3*10-4 М, 4 – концентрация ФМН в растворе – 4*10-5 М, в мембране – 4*10-4 М, 5 – концентрация ФМН в растворе – 5*10-5 М, в мембране – 5*10-4 М
Рисунок 2.2.4 - Максимумы интенсивности свечения биферментной
системы при добавлении ФМН в виде раствора и иммобилизованного препарата с различным процентным содержанием крахмала.
Для оценки характерных времен диффузии иммобилизованных низкомолекулярных компонентов из мембраны в раствор мы использовали модельную систему: помещали мембрану с иммобилизованным ФМН (или ФМН, иммобилизованный совместно с ферментами) в буферный раствор. Затем измеряли оптическую плотность растворов, полученных путем выдерживания дисков в буферном растворе в течение различных промежутков времени. Оптическую плотность регистрировали на длине волны 448 нм, что соответствует максимальному поглощению ФМН. Временная динамика оптической плотности при диффузии иммобилизованного ФМН в раствор из диска во всех случаях имеет схожий вид: оптическая плотность растворов увеличивается в течение первых 5-8 минут, затем скорость роста замедляется и примерно через 20 минут от начала эксперимента достигается равновесное значение концентрации ФМН. Такая зависимость хорошо соответствует классическим представлениям о закономерностях диффузии. В начале, когда градиент концентрации высок, скорость диффузии выше, по мере выхода молекул ФМН из диска, градиент концентрации уменьшается и падает скорость диффузии.
Сравнение динамики диффузии ФМН из дисков, приготовленных из геля одной концентрации, показывает, что при возрастании концентрации ФМН в диске наблюдается два эффекта: (1) увеличиваются равновесные значения оптической плотности, (2) уменьшается время достижения равновесного значения оптической плотности.
При сравнении динамики диффузии ФМН из дисков, приготовленных из крахмального геля разных концентраций и содержащих различное количество ФМН, показано, что скорость диффузии ФМН зависит от концентрации геля: скорость увеличения оптической плотности максимальна для 3 % геля. Действительно, чем выше концентрация крахмального геля, тем медленнее происходит процесс набухания геля, и тем медленнее будут вовлекаться в диффузию более глубоко расположенные молекулы ФМН. Поскольку в проведенных экспериментах, в течение 40 минут этого не происходит, то это означает, что этого времени недостаточно для вовлечения в диффузию глубокорасположенных молекул ФМН. Этим и объясняется уменьшение значения плато на временной динамике оптической плотности раствора. Достижение этого плато не означает достижения выравнивания содержания ФМН в мембране и растворе и достижение равновесного содержания ФМН. Это означает завершение выхода в раствор тех молекул ФМН, которые расположены в поверхностном и приповерхностном слоях мембраны. По-видимому, вовлечение в диффузию более глубоко расположенных молекул требует больше, чем 40 минут, в течение которых выполнялись измерения оптической плотности. В пользу это предположения говорит тот факт, что после 40-минутного пребывания в растворе буфера мембраны остаются все еще целыми.
В результате проведенных экспериментов было показано, что характерное время диффузии ФМН из ЭМкрахмал, представляющей собой крахмальный диск, составляет 5-10 минут, после чего выход молекул ФМН из диска прекращается и не возобновляется в течение ближайшего часа. Закономерного влияния иммобилизованных в крахмальном диске ферментов на темпы диффузии ФМН не выявлено. То, что интенсивность свечения в реакции с иммобилизованным ФМН достигает максимума свечения быстрее, чем достигается равновесная оптическая плотность при диффузии молекул ФМН из диска в раствор, означает, что скорость диффузии ФМН из диска меньше, чем скорость расходования ФМН в биолюминесцентной реакции. Это свидетельствует в пользу того, что биолюминесцентная реакция происходит на поверхности крахмального диска. При добавлении всех необходимых реагентов к иммобилизованному субстрату, происходит быстрое светоизлучение и далее интенсивность падает из-за расходования другого субстрата биферментной системы – НАДН. Об этом свидетельствует то, что время снижения интенсивности свечения на половину максимального примерно одинаковое и для реакции в растворе, и в случае иммобилизации ФМН.
Время достижения максимума свечения одинаково для раствора и иммобилизованного ФМН, а уменьшение величины максимума интенсивности свечения происходит из-за стерических ограничений, возникающих благодаря иммобилизации субстрата. При иммобилизации ФМН совместно с ферментами максимум светоизлучения достигается быстрее, чем в растворе, в первые секунды от начала реакции. Это указывает на то, что происходит предварительное образование фермент-субстратного комплекса, быстро взаимодействующего с остальными необходимыми субстратами реакции с быстрым светоизлучением. И эти комплексы расположены на поверхности диска. Таким образом, и в случае совместной иммобилизации субстрата и ферментов, иммобилизация основных компонентов биолюминесцентной реакции происходит на поверхности диска. Молекулы субстрата и ферментов, иммобилизованные внутри гелевого диска вступают в реакцию позже после достижения максимума светоизлучения, что приводит к уменьшению эффективной концентрации субстратов и ферментов, участвующих в реакции.
Таким образом, показано, что процесс диффузии непосредственно не влияет на динамику и интенсивность светоизлучения в реакции, происходящей при совместной иммобилизации субстратов и ферментов. Уменьшение активности биолюминесцентной системы обусловлено самим фактом иммобилизации и снижением количества молекул, участвующим в реакции. Полученный иммобилизованный препарат может быть использован в качестве реагента для ферментативного биотестирования, так как при этом регистрируется величина максимума интенсивности свечения, в реакции биолюминесценции, происходящей с участием только молекул, расположенных на поверхности диска. Чувствительность к анализируемым токсикантам при этом не уменьшается по сравнению с растворимым реагентом в силу отсутствия препятствий их взаимодействия с компонентами биолюминесцентных реакций.
2.2.2 Моделирование процесса диффузии ФМН из гелевого диска
При помещении мембраны в раствор молекулы ФМН, расположенные внутри крахмального матрикса начинают выходить в раствор. Из общих соображений нужно предположить, что молекулы ФМН могут проникать обратно внутрь мембраны и связываться там. Процесс диффузии молекул в такой системе можно представить в виде схемы:
где X – "концентрация" связанных с гелем молекул ФМН, F – концентрация свободных молекул ФМН в растворе, M – "концентрация" вакантных для молекул ФМН мест в мембране, k1 и k-1 – константы скорости прямой и обратной реакции.
Данная кинетическая схема описывается уравнением:
. (9)
Введем следующие обозначения:
. (10)
Решение уравнения имеет вид:
, (11)
где X0 – начальная "концентрация" связанных с гелем молекул ФМН. Функция f(t) описывает динамику молекул флавина. Используя эту функцию в качестве шаблона для подбора параметров в программе Solver пакета Excel можно оценить параметры исследуемого процесса по имеющимся экспериментальным данным. На рисунке 2.2.5 приведен типичный вид временной зависимости процесса высвобождения флавина из гелевой мембраны в эксперименте и в модели.
Рисунок 2.2.5 - Экспериментальная (точки) и модельная (линия) динамики высвобождения флавина из гелевого диска.
- ФМН, - ФМН совместно с ферментами
Рисунок 2.2.6 - Рассчитанные константы скорости выхода флавина
из дисков, содержащих ФМН или ФМН совместно с ферментами.
Вычисленные значения константы скорости высвобождения флавина для дисков с разной концентрацией крахмала приведены на рисунке 2.2.6.
Во всех случаях константа равновесия не превышала искусственно принятое ограничение для программы нахождения минимума K=0,001. Это дает основание перейти к более упрощенной модели, в которой обратного процесса не происходит. Тогда кинетическая схема, описывающая выделение молекул из мембраны, имеет вид:
. (12)
Эта схема описывается простым уравнением:
. (13)
И для F будем иметь решение:
. (14)
Константы скорости реакции были вычислены по экспериментальным данным и отображены на рисунке 2.2.7.
- ФМН, - ФМН совместно с ферментами
Рисунок 2.2.7 - Рассчитанные по упрощенной модели константы
скорости выхода флавина из дисков, содержащих ФМН или ФМН совместно с ферментами.
Константы скорости выделения ФМН убывают при увеличении содержания крахмала в геле. Отмечается, что в 3% геле константа несколько больше остальных значений. Этот результат ожидаем, поскольку молекулы ФМН встречают больше затруднений при выходе из мембран с большим содержанием крахмала.
Однако оценка константы скорости высвобождения по всей кривой, включая довольно длительное плато, может приводить к понижению чувствительности метода, поскольку для мембран с разной концентрацией геля плато должно находиться примерно на одном уровне, при различии участков выхода на плато. Действительно, если взять экспериментальные значения оптической плотности первых 15-17 минут (когда динамическое равновесие в растворе еще устанавливается), то рассчитанные константы скорости будут будут иметь вид, представленный на рисунке 2.2.8.
Даная гистограмма более точно отображает (ожидаемую) зависимость констант от содержания крахмала в геле. При этом более заметно различие между мембранами в которых был дополнительно иммобилизован фермент и мембранами без него. Присутствие фермента, как и ожидалось, уменьшает значение k1, однако говорить о статистической достоверности еще рано, необходимы дополнительные измерения.
- 3% геля, - 3,5% геля,
- 4% геля, - 5% геля
Рисунок 2.2.8 - Рассчитанные константы скорости по начальным значениям
кривых оптической плотности растворов, содержащих диски с разной концентрацией геля.
Итак, процесс высвобождения флавина из гелевой мембраны весьма удовлетворительно описывается простой моделью, допускающей аналитическое решение, что существенно упростит построение модели биферментной реакции в гелевом диске. Однако при построении модели собственно биферментной реакции в растворе обнаружились качественные расхождения в ходе модельной и экспериментальной кривых, что с большой вероятностью может указывать на существование неучтенных в модели процессов. Эти процессы могут быть вызваны либо присутствием комплекте КРАБ двух оксидо-редуктаз с различающимися свойствами, либо какими-либо иными компонентами, которые могут присутствовать в данном комплекте, имеющем относительно низкий уровень очистки оксидоредуктазного компонента. Кроме того, в рамках приведенных данных о начальных концентрациях компонентов реакции и активности редуктазы имеется расхождение с кинетикой свечения, которая демонстрирует более быстрое падение интенсивности. Для выяснения этих вопросов требуются дополнительные итерации во взаимодействии "эксперимент-модель".
Раздел 3. Разработка принципов обучения и форм организации научно-образовательного процесса
В основу активности, способствующей повышению уровня знаний студентов положен принцип интеграции науки и образования. Этот принцип реализуется на основе тесного взаимодействия кафедры с Институтом биофизики СО РАН, Институтом леса им. В.Н.Сукачева СО РАН, Красноярским региональным радиологическим центром и другими НИИ и организациями. Эта интеграция поддерживается также за счет функционирующих на кафедре биофизики Научно-образовательного центра «Енисей», организованноого по программе «Фундаментальные исследования и высшее образование» Министерства образования и науки Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF), и НОЦ «Исследовательская кафедра биофизики», организованного в рамках гранта Федеральной Целевой программы “Интеграция высшего образования и фундаментальной науки».
Повышение уровня знаний и качества научных работ студентов на кафедре физико-химической биологии ИФБ и БТ СФУ происходит за счет того, что практически все студенты кафедры вовлечены в работу этих Научно-образовательных центров. В рамках настоящего проекта происходит концентрирование на исследовательских задачах, относящихся к развитию биолюминесцентного аналитического направления и биолюминесцентных биосенсоров.
Образовательный план работ по проекту базируется на программе научных исследований, проводимых преподавателями кафедры, и включает следующие взаимосвязанные элементы, способствующие повышению уровня знаний студентов:
1. Выполнение студентами –участниками проекта курсовых и дипломных работ по темам проекта.
2. Постоянно действующие объединенные научные семинары для студентов, аспирантов, преподавателей университета и научных сотрудников с привлечением специалистов из других вузов и исследовательских институтов по теме проекта
3. Чтение оригинальных курсов лекций с включением результатов исследований по проекту.
4. Разработка специальных практикумов по темам проекта
5. Подготовка учебно-методических комплексов дисциплин
6. Организация студенческих конференций.
7. Участие студентов и молодых ученых в научных конференциях и стажировки.
8. Открытие новых направлений обучения, переход на двухуровневое высшее образование.
9. Разработка концепции создания Молодежной Международной Открытой Лаборатории Перспективных Исследований и Технологий (МОЛПИТ)
3.1 Выполнение студентами – участниками проекта курсовых и дипломных работ по темам проекта.
Самой эффективной формой привлечения студентов к исследованиям являлось выполнение студентами – участниками проекта курсовых и дипломных работ по темам проекта. Студенты, выполняющие научные исследования по проекту обучаются на 1-3 курсах специальности «Биохимическая физика», а также в магистратуре по направлению «Физика», магистерские программы «Биофизика» и «Окружающая среда и человек: основы контроля и надзора». Открыта новая магистерская программа «Устойчивое развитие и экологическая безопасность», в рамках которой реализуется взаимодействие с вузами стран Шанхайской организации сотрудничества по направлению «Экология», в 2010-2011 учебном году произведен первый набор на эту программу.
Результаты, полученные в студенческих работах, вошли в отчет по проекту либо будут представлены на следующих этапах выполнения проекта.
За 2 года реализации проекта было успешно защищено 9 дипломных работ по теме проекта (Табл 3.1):
Таблица 3.1.
Дипломные работы по теме проекта
| № | Ф.И.О. студента | Тема диплома | Год Защи-ты | Научный руководитель Ф.И.О., степень, звание, должность |
| Кондик Анна Михайловна | Исследование чувствитель- ности иммобилизованной биолюминесцентной бифер- ментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза - люцифераза к действию токсических веществ. | 2009 | Есимбекова Елена Николаевна, к.б.н., н.с. лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН | |
| Шманько Надежда Валерьевна | Оценка токсичности воздушной среды с помощью биолюминесцентных тест-объектов | 2009 | Немцева Елена Владимировна, к.ф.-м.н., доцент кафедры биофизики, Институт фундаментальной биологии и биотехнологии, СФУ | |
| Бука Нина Сергеевна | Влияние вязкости и рН реакционной среды на кинетику бактериальной биферментной биолюминесцентной системы | 2009 | Суковатая Ирина Егоровна, к.б.н., доцент кафедры биофизики, зам. директора, Институт фундаментальной биологии и биотехнологии, СФУ | |
| Тарасова Анна Сергеевна | Биолюминесцентный мониторинг процессов детоксикациии растворов редокс-активных соединений гуминовыми веществами | 2009 | Кудряшева Надежда Степановна, д.ф.-м.н., профессор, профессор кафедры физической и неорганической химии, Институт цветных металлов и материаловедения, СФУ | |
| Алиева Роза Ришатовна | Изучение спектров биолюминесценции и фотолюминесценции обелина при различных концентрация Са2+ | 2009 | Кудряшева Надежда Степановна, д.ф.-м.н., профессор, профессор кафедры физической и неорганической химии, Институт цветных металлов и материаловедения, СФУ | |
| Брюховских Татьяна Викторовна | Воздействие галоидсодержащих ксантеновых красителей на биолюминесцентные реакции различных организмов | 2009 | Кудряшева Надежда Степановна, д.ф.-м.н., профессор, профессор кафедры физической и неорганической химии, Институт цветных металлов и материаловедения, СФУ | |
| Васюнькина Елена Владимировна | Действие радионуклидов на биолюминесцентные системы: роль перекисных соединений. | 2010 | Кудряшева Надежда Степановна, д.ф.-м.н., профессор, профессор кафедры физической и неорганической химии, Институт цветных металлов и материаловедения, СФУ | |
| Гульнов Дмитрий Валерьевич | Исследование конформации компонентов биолюминесцентной реакции бактерий в вязких средах методами оптической спектроскопии. | 2010 | Немцева Елена Владимировна к.ф.-м.н., доцент, доцент кафедры биофизики, Институт фундаментальной биологии и биотехнологии, СФУ | |
| Орлова Анна Валерьевна | Влияние микроокружения на характеристики биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза -люцифераза. | 2010 | Есимбекова Елена Николаевна, к.б.н., н.с., лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН | |
В июне 2009 г. также успешно были защищены три магистерских диссертации по новым направлениям развития данного проекта:
1. Латынина Анастасия Аркадьевна, магистрант специальности «Новые материалы и технологии». Магистерская диссертации «Исследование спектров комбинационного рассеяния и инфракрасного отражения нанокомпозитов на основе алмазной и графеновой фаз» (руководитель - д.ф.-м.н. А.Н. Втюрин, научный наставник - д.ф.-м.н. П.И. Белобров) посвящена изучению оптических свойств наноалмазного композита, который испльзуется в настоящее время как депо лекарств при операциях на животных.
2. Знак Дмитрий Александрович, магистрант специальности «Приборостроение». Магистерская диссертации «Исследование магнитных свойств композита на основе алмазной и графеновой фаз» (руководитель - д.ф.-м.н. П.И. Белобров) посвящена изучению магнитных свойств наноалмазных композитов, которые имеют важные биологические и медицинские применения.
3. Цегельник Сергей Сергеевич, магистрант специальности «Приборостроение». Магистерская диссертации «Исследование электрических свойств нанокомпозита на основе алмазной и графеновой фаз» (руководитель - д.ф.-м.н. П.И. Белобров) посвящена изучению электрических свойств наноалмазных композитов, которые эффективно применяются в биологии и медицине.
Темы магистерских диссертаций, защищенных в июле 2010г. по направлению «Физика»: магистерская программа 010700.68.06 Биофизика: (рук. д.б.н., проф. Кратасюк В.А.) и магистерская программа 010700.68.06 Окружающая среда и человек:основы контроля и надзора» (рук. д.б.н., проф. Кратасюк В.А.) представлены в таблице 3.2.
Таблица 3.2
Магистерские диссертации, защищенные в рамках проекта в 2010 году
| ФИО магистранта | ФИО руководителя | Тема магистерской диссертации |
| Корастилева Ксения Александровна | Смирнова Ольга Валентиновна, проф., д.м.н. | «Структурно-метаболические особенности лимфоцитов и нейрофилов у больных хроническим лимфолейкозом в зависимости от стадии заболевания» |
| Бобылева Ксения Аркадьевна | Коваленко Виталий Владимирович, к.г.-м.н. | «Радиационная обстановка а пойме реки Енисей в зоне наблюдения ФГУП «Горно-химический комбинат» :характеристика и динамика изменения» |
| Воднев Юрий Алексеевич | Кургуз Сергей Александрович, к.т.н. | «Влияние содержания радона внутри помещений на динамику мощности дозы гамма-излучения» |
| Гетц Анна Николаевна | Кургуз Сергей Александрович, к.т.н. | «Радоновыделение и радонопроницаемость природных материалов и грунтов различной влажности» |
| Дрыгин Олег Викторович | Печуркин Николай Савельевич, проф., д.б.н. | «Контроль уровней электромагнитных полей,создаваемых антеннами передающего радиотехнического объекта с использованием данных измерений анализатора спектра» |
| Каталкина Людмила Леонидовна | Григорьев Александр Иванович | «Определение техногенной составляющей в структуре индивидуальных доз облучения» |
| Коваленко Светлана Геннадьевна | Коваленко Виталий Владимирович к.г.-м.н | «Структура и динамика доз медицинского облучения населения Красноярского края» |
| Соколик Владимир Александрович | Кургуз Сергей Александрович, к.т.н. | «Количественная оценка шумовых характеристик транспортных потоков на улично-дорожной сети г. Красноярска» |
Кроме того, были успешно защищено 20 курсовых работ по теме проекта (табл. 3.3, 3.4 и 3.5):
Таблица 3.3.
Курсовые работы студентов 1-2 курса по теме проекта
| № | Ф.И.О. | Тема научной работы | Год защиты | Научный руководитель |
| 1 | Туманян Артур Геворкиевич | Анализ технических модулей биосенсоров и алгоритмов программирования цифровых контроллеров | 2009 | д.ф.-м.н., проф. Белобров П.И. |
| 2 | Якимов Антон Сергеевич | Возможные интерфейсы между биологическими тканями и наноматериалами | 2009 | д.ф.-м.н., проф. Белобров П.И. |
| 3 | Лукьяненко Кирилл Андреевич | Модели и классификация биологических барьеров | 2009 | д.ф.-м.н., проф. Белобров П.И. |
Таблица 3.4.
Курсовые работы студентов 3 курса по теме проекта
| № | Ф.И.О. | Тема научной работы | Год защиты | Научный руководитель |
| 1 | Безруких Анна Евгеньевна | Термостабильность и термоинактивация биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в желатиновом геле | 2009 | К. б. н., Есимбекова Е.Н. |
| 2 | Арбузов Вячеслав Александрович | Изучение структуры и свойств нанолмаза в композите | 2009 | д.ф.-м.н., проф. Белобров П.И. |
| 3 | Архипова Валерия Владимировна | Коррекция кривой динамики свечения бактерий Photobacterium phosphoreum при разведении бактериальной суспензии | 2009 | Д. ф. -м. н.,проф. Кудряшева Н.С., асп. М.А. Александрова |
| 4 | Кудряшева Галина Александровна | Влияние галоид-замещенных антраценов на биолюминесцентную реакцию бактерий | 2009 | К.ф.–м.н. доцент ИФБиБТ Немцева Е.В. |
| 5 | Авсиевич Татьяна Игоревна | Анализ влияния дезинфицирующих средств на бактериальную биолюминесценцию in vivo и in vitro | 2010 | к.ф.-м.н., Немцева Е.В. |
| 6 | Туманян Артур Геворкиевич | Разработка электронного модуля для микрофлюидного биочипа. | 2010 | д.ф.-м.н., проф. Белобров П.И. |
| 7 | Черняев Вячеслав Андреевич | Определение функционального состояния организма детей с заболеваниями ДЦП и сколиоза до и после занятия иппотерапией. | 2010 | д.б.н., проф. В.А. Кратасюк |
| 8 | Якимов Антон Сергеевич | Проблемы создания ацетилхолинового биосенсора на основе люцифераз: теория и экспериментальные реализации биочипов | 2010 | д.ф.-м.н. Белобров П.И. |
Таблица 3.5.
Курсовые работы студентов 4 курса по теме проекта
| № | Ф.И.О. | Тема научной работы | Год защиты | Научный руководитель |
| 1 | Орлова Анна Валерьевна | Термодинамические характеристики биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в крахмальном геле | 2009 | К. б. н., Есимбекова Е.Н. |
| 2 | Гульнов Дмитрий Валерьевич | Анализ влияния вязких сред на спектрально-люминесцентные характеристики компонентов биолюминесцентной реакции бактерий | 2009 | К.ф.–м.н. доцент ИФБиБТ Немцева Е.В. |
| 3 | Денисов Иван Андреевич | Коллективные электронно-колебательные состояния наночастиц, макромолекул и клеток | 2009 | Д. ф. -м. н.,проф. Белобров П.И., к.б.н. В.В. Межевикин |
| 4 | Васюнькина Елена Владимировна | Роль свободных радикалов в водных растворах в процессе воздействия Аm-241 на биолюминесцентные системы | 2009 | Д. ф. -м. н.,проф. Кудряшева Н.С., ст. преп. Т.В. Рожко |
| 5 | Арбузов Вячеслав Александрович | «Изучение структуры и свойств наноалмаза в композите» | 2010 | Д. ф. -м. н.,проф. Белобров П.И. |
| 6 | Архипова Валерия Владимировна | Влияние тритиевой воды (НТО) на свечение бактерий в присутствии гуминовых веществ. | 2010 | Д. ф. -м. н.,проф. Кудряшева Н.С. |
| 7 | Безруких Анна Евгеньевна | Термостабильность и термоинактивация биферментной системы светящихся бактерий НАДH:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в желатине. | 2010 | К. б. н., Есимбекова Е.Н. |
| 8 | Кудряшева Галина Александровна | Влияние галоид-производных антрацена на биохимические реакции. | 2010 | К.ф.–м.н. доцент ИФБиБТ Немцева Е.В. |
| 9 | Сутормин Олег Сергеевич | Влияние глицерина и сахарозы на стабильность сопряженной ферментной системы НАД(P)H:ФМН-оксидоредуктаза -люцифераза. | 2010 | к.б.н., доцент И.Е. Суковатая, |
