WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |
-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Сибирский федеральный университет»

УДК 577.151.03, 577.151.45

Код ГРНТИ 34.15.19; 34.17.15

УТВЕРЖДАЮ

Ректор СФУ

академик РАН

Е.А. Ваганов

______________________

(подпись)

“____” декабря 2010 г.

М.П.

ОТЧЕТ

по проекту № 2.2.2.2/5309 «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий»

аналитической ведомственной целевой программы “Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)”

мероприятие: 2. Проведение фундаментальных исследований в области естественных, технических и гуманитарных наук. Научно-методическое обеспечение развития инфраструктуры вузовской науки

раздел: 2.2. Научно-методическое обеспечение развития инфраструктуры вузовской науки

подраздел: 2.2.2. Научно-методическое обеспечение международного научного и образовательного сотрудничества. Развитие совместных научных и научно-образовательных программ и проектов с зарубежными партнерами. Развитие научной и академической мобильности в рамках международного сотрудничества. Научно-методическое обеспечение подготовки научных кадров в высшей школе и развития научно-исследовательской работы студентов и аспирантов

направление: 2.2.2.2. Развитие совместных научных и научно-образовательных программ и проектов с зарубежными партнерами

вид отчета: заключительный

Руководитель проекта: _________________________ профессор, д.б.н. В.А. Кратасюк

г. Красноярск 2010 г.

Список исполнителей

Научный руководитель,
д.б.н., профессор
подпись, дата Кратасюк В.А.
(реферат, введение, разделы 1,2,3,4, заключение)
Исполнители
Зав. кафедрой биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, профессор, д.б.н. подпись, дата Кратасюк В.А.
реферат, введение, разделы 1,2,3,4, заключение)
Профессор кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, в.н.с. Института биофизики СО РАН, профессор, д.ф.-м.н. подпись, дата Белобров П.И.
(разделы 1.1, 1.4, 3.1, 3.2)
Доцент кафедры физической химии Института цветных металлов и материаловедения СФУ, в.н.с. Института биофизики СО РАН, профессор, д.ф.-м.н. подпись, дата Кудряшева Н.С.
(разделы 1.3, 3)
Зав. кафедрой онкологии и лучевой терапии с курсом ПО Красноярского государственного медицинского университета им. В.Ф. Войно-Ясенецкого, профессор, д.м.н.
подпись, дата
Дыхно Ю.А.
(раздел 3)
Профессор кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, зав. лаб. Института биофизики СО РАН, профессор, д.ф.-м.н.
подпись, дата
Барцев С.И.
(раздел 2)
Доцент кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, н.с. Института биофизики СО РАН, к.б.н.
подпись, дата
Есимбекова Е.Н.
(введение, разделы 1, 2,4)
С.н.с. кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, к.б.н.
подпись, дата
Свидерская И.В.
(раздел 2, 4.1,4.2)
Доцент кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, с.н.с. Института биофизики СО РАН, к.б.н.
подпись, дата
Межевикин В.В.
(разделы 2)
Доцент кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, к.б.н.
подпись, дата
Суковатая И.Е.
(разделы 1.1, 1.3, 3.3-3.7)
Директор Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, профессор, к.ф.-м.н.
подпись, дата
Сапожников В.А.
(раздел 3.6, 3.7)
Доцент кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, к.ф.-м.н.
подпись, дата
Немцева Е.В.
(разделы 1.1.1, 1.1.2, 1.1.4, 3, 4)
С.н.с. лаборатории техногенных лесных экосистем Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, к.ф.-м.н.
подпись, дата
Борисов А.Н.
(раздел 3)
Старший преподаватель кафедры высшей математики Сибирского государственного технологического университета
подпись, дата
Ронжин Н.Л.
(разделы 3)
Директор ООО «Прикладные биосистемы»
подпись, дата
Оюн А.М.
(раздел 4.4)
Инженер кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Даценко М.В.
(раздел 3)
Инженер НИЧ
подпись, дата
Бушмелева Т.М.
(раздел 4.4)
Инженер кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Гусев С.М.
(раздел 3.4)
Инженер НИЧ
подпись, дата
Суковатый А.Г.
(раздел 3.3, 3.4)
Инженер НИЧ
подпись, дата
Денисова А.Ю.
(раздел 4)
Инженер НИЧ
подпись, дата
Лемешенко Т.Л.
(раздел 3.6, 3.7 )
Аспирантка Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Александрова М.А. (раздел 1.2.2, 3 )
Аспирант Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Римацкая Н.В. (раздел 1.2, 2, 3)
Стажер-исследователь Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Кондик А.М. (раздел 1.1)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Орлова А.В.
(раздел 1.2)
Аспирант Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Гульнов Д.В.
(разделы 1.1.1, 1.1.2, 1.1.4, 3, 4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Туманян А.Г.
(раздел 3.1, 3.4, 4.4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Зайцева Н.А.
(раздел 3.1, 4.4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Лукьяненко К.А.
(раздел 3.1, 4.4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Безруких А.Е.
(раздел 1.2, 3.1, 3.2, 3.7)
Аспирант Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Денисов И.А. (раздел 3, 4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Тарновский М.О. (раздел 3.6)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Авсиевич Т.И. (раздел 1.1.4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Сутормин О.С. (раздел 1.3.3)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Архипова В.В. (раздел 1.3.4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Кудряшева Г.А. (раздел 1.3.5)
Магистрант Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Бука Н.С. (раздел 1.1.1, 3)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Сумарокова М.В. (раздел 4.4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Черняев В.А. (раздел 1.2, 3)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Гребнев Я.В. (раздел 3.6, 3.7)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Якимов А.С. (раздел 1.1.3, 4.4)
Студент Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ
подпись, дата
Арбузов В.А. (раздел 1.2.2, 3.2, )
Преподаватель СФУ
подпись, дата
Комаров В.А. (раздел 3.3, 3.4)
М.н.с., Институт биофизики СО РАН, к.ф.-м.н.
подпись, дата
Белогурова Н.В. (раздел 1.2, 3)
Нормоконтролер подпись, дата Даценко М.В.

Реферат

Отчет _176_ с., _1_ ч., _71_ рис., _19_ табл., _27_ источников

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ, ЛЮЦИФЕРАЗА, МИКРООКРУЖЕНИЕ, ИММОБИЛИЗАЦИЯ, ВЯЗКОСТЬ СРЕДЫ, СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ, ВКЛЮЧЕНИЕ В ГЕЛЬ, ИННОВАЦИОННОЕ ОБРАЗОВАНИЕ, МАГИСТЕРСКАЯ ПРОГРАММА, МЕЖДУНАРОДНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Проект направлен на понимание процессов поведения ферментативной люминесцентной системы светящихся бактерий в условиях близких к in vivo. Представлены исследования по моделированию процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий», в рамках которого разрабатываются и развиваются совместные научные и научно-образовательных программы и проекты с зарубежными партнерами: Университетом Флориды (США), Университетом Болоньи (Италия), рядом университетов стран Шанхайской организации сотрудничества.

Цель проекта: разработка и описание свойств экспериментальной (биферментная система, иммобилизованная в полимерные гели различной природы, и помещенная в вязкие растворы сахарозы и глицерина) и математической моделей функционирования биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза в клетке.

Для выполнения проекта использован инновационный методологический подход к изучению механизмов функционирования метаболических цепей в клетке – получение и исследование прототипов экспериментальных моделей клетки, созданных на основе иммобилизованных ферментативных комплексов, в которых воссоздана цепь сопряжения люциферазы с другими ферментами бактерий.

За 3 этапа реализации проекта получены следующие основные результаты:

  1. Для решения фундаментальной задачи понимания механизмов сопряжения и функционирования ферментативных метаболических цепей в клетке созданы 4 прототипа экспериментальных моделей (ЭМсахароза, ЭМглицерин ЭМкрахмал ЭМжелатин), в которых реконструирована цепь сопряжения двух ферментов светящихся бактерий (люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы) в растворах повышенной вязкости (сахарозы и глицерина), а также в матричной структуре крахмального или желатинового геля. Модели проявляют биолюминесцентную активность и имитируют вязкое микроокружение ферментов в матриксе, а также связь с мембранными структурами.
  2. Установлены механизмы стабилизации биферментной системы светящихся бактерий путем создания благоприятного микроокружения близкого к in vivo посредством иммобилизации ферментов в гели крахмала и желатина с сохранением функциональной активность ферментов, что подтверждается спектрально-люминесцентными анализом. Показано, что наиболее эффективным механизмом стабилизации биферментной системы является совместная иммобилизация люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, а также их субстратов и кофакторов в 3 % крахмальный гель. Биферментная система, иммобилизованная совместно с субстратами и кофакторами, сохраняет свою активность в течение длительного времени, не требует специальных условий хранения.
  3. Показано, что иммобилизация в крахмальный и желатиновый гели приводит к значительной стабилизации биферментной системы по отношению к денатурирующим воздействиям: рН-оптимум расширяется, как в кислую, так и щелочную области, сохраняется высокая активность ферментов при увеличении концентрации солей, повышается термостабильность.
  4. Установлено, что термоинактивация биферментной системы в желатиновом и крахмальном гелях имеет нелинейный характер и протекает по диссоциативному механизму.
  5. Описано влияние процесса иммобилизации и вязкости среды на субстратную специфичность ферментов. Показано, что при использовании желатинового геля выход активности существенно ниже, а значения Km каж для ФМН и НАДН, а также величина энергии активации более высоки, чем в случае крахмального геля. Полученные закономерности объясняются различиями в физико-химических характеристиках и природе гелеобразующих полимеров.
  6. На примере биферментной системы светящихся бактерий показано, что изменение вязкости микроокружения оказывает влияние на механизмы сопряжения между ферментами в метаболических цепях, изменяет вероятность образования и скорость распада возбужденного интермедиата реакции.
  7. Подобраны условия (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.
  8. Установлена зависимость между термостабильностью биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и физико-химическими характеристиками микроокружения ферментов. Показано, что ЭМсахароза обладает большей термостабильностью по сравнению с моделью ЭМглицерин.
  9. Установлена гидрофобная природа взаимодействий при образовании фермент-субстратных комплексов. Эффекты влияния органических веществ и органических растворителей на ферменты объясняются как их прямым действием на гидратную оболочку или на активный центр белка, так и изменением электростатических и гидрофобных внутри- и межмолекулярных взаимодействий.
  10. Для соответствия характеристик вязких сред свойствам клеточной цитоплазмы необходимо создание комбинированной среды, содержащей высокую концентрацию макромолекул и низкую концентрацию сахаридов.
  11. Разработана методика оценки вязкости среды на основе анизотропии флуоресценции флавинмононуклеотида и установлено, что вязкость, характерная для клеточной цитоплазмы, достигается при концентрациях растворов крахмала и желатина более 2% (при 20°С).
  12. Лучшим из 4 прототипов экспериментальных моделей является ЭМкрахмал. В крахмальном геле с добавлением ДТТ термоинактивация ферментов происходит с наименьшей скоростью. Энергия активации процесса термоинактивации биферментной системы в крахмальном геле с добавлением ДТТ в 3 раза выше по сравнению с энергией активации в буферном растворе.

План НИР четвертого этапа выполнения работ по проекту включал разработку математических моделей функционирования бактериальной биолюминесцентной системы in vivo с использованием полученных на предыдущих этапах работы экспериментальных данных.





За отчетный период получены следующие основные результаты:

1. Проведен анализ вклада различных механизмов и стадий реакции в кинетику свечения биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза.

2. На основе анализа механизмов формирования кинетических кривых свечения построена математическая модель сопряженной биферментной реакции НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза для описания работы экспериментальной модели.

3. Построенная математическая модель апробирована для описания экспериментальной модели при анализе кинетики свечения биферментной системы в присутствие хинонов.

4. Показано, что для соответствия математической модели экспериментальным результатам необходимо учитывать следующие механизмы влияния хинонов на функционирование биферментной системы: возможность окисления хиноном субстратов биферментной реакции (ФМНН2 или НАДН), возможность участия хинона в качестве субстрата в редуктазной реакции, влияние на активность ферментов, обусловленное конформационными изменениями в присутствии хинона.

5. Проведено экспериментальное исследование динамики светоизлучения растворимой и иммобилизованной в крахмальный гель биферментной системы с учетом кинетики диффузии молекул ФМН в ЭМкрахмал.

6. Установлена роль процессов диффузии в реакциях с использованием иммобилизованных компонентов биолюминесцентной системы светящихся бактерий. Показано, что процесс диффузии непосредственно не влияет на динамику и интенсивность светоизлучения в реакции, происходящей при совместной иммобилизации субстратов и ферментов.

Работа имеет высокую практическую значимость, так как разработанный многокомпонентный реагент «Энзимолюм» является биологическим модулем для создания биолюминесцентного сенсора и проведения биолюминесцентного анализа. Разработаны и зарегистрированы в Ростехрегулировании Технические условия и каталожный лист реагента «Энзимолюм» (ТУ № 2639-001-93879568-2009 «Реагент «Энзимолюм», зарегистрированы 25.12.2009 за № 003534). Начаты процессы коммерциализации научных результатов, полученных в ходе выполнения проекта.

В рамках проекта получен 1 патент и принято положительное решение о выдаче 3-х патентов. Технология производства и использования реагента «Энзимолюм» оформлены в виде заявок на патенты РФ: № 2009110636 «Биолюминесцентный биомодуль и способ его приготовления» и № 2009113656 «Экспресс-способ биотестирования токсичности природных, сточных вод и водных растворов». «Методика измерений интенсивности биолюминесценции с использованием реагента «Энзимолюм» для определения токсичности проб питьевых, природных, сточных и очищенных сточных вод» аттестована в Федеральном государственном унитарном предприятии «Уральский научно-исследовательский институт метрологии» (Свидетельство об аттестации № 224.0137/01.00258/2010). Получен патент РФ № 2376380 «Биолюминесцентный способ определения антиоксидантной активности гуминовых веществ», принято положительное решение о выдаче патента: «Флуоресцентный способ определения концентрации кальция».

Для создания научно-образовательного пространства, включающего преподавателей, научных работников, молодых ученых и студентов и аспирантов разных специальностей развивался инновационный образовательный процесс на основе новых полученных результатов. Были разработаны новые принципы ведения научных исследований со студентами 3-5 курсов при выполнении студентами курсовых и дипломных работ по темам проекта; внедряются в учебный процесс разработанные участниками проекта Учебно-методические комплексы по дисциплинам: «Фотобиофизика», «История и методология биологии и биофизики», «Информационные технологии в научных исследованиях»; разработан проект вовлечения молодежи в инновационную деятельность в рамках Молодежной Международной Открытой Лаборатории Перспективных Исследований и Технологий (МОЛПИТ); организован Научно-образовательный семинар по биохимической физике. Особое внимание уделяется развитию Биофизического практикума на основе современного оборудования, имеющегося в СФУ.

В рамках проекта активно развивается международное сотрудничество, как в науке, так и в образовании. В качестве консультантов к осуществлению исследований привлечены сотрудники зарубежных и российских университетов: Университета Болоньи (Италия), Университета Флориды (США), Центра геномных регуляций Университета Помпеи Фабра (Испания) и других. Совместно с Университетом Флориды (США) и Университетом Шанхайской организации сотрудничества разработаны концепции и проекты совместных магистерских программ «Биологическая инженерия для устойчивого развития» (США) и «Устойчивое развитие и экологическая безопасность». Подготовлены проекты Соглашения о сотрудничестве с Университетом Флориды (США), Университетом Болоньи (Италия), Центром геномных регуляций Университета Помпеи Фабра (Испания), компанией «НовоСИБ» (Лион, Франция).

Заключены договора о сотрудничестве и проведении практик со следующими российскими организациями: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Институтом биофизики СО РАН, НИИ биологии Иркутского госуниверситета, Факультетом естественных наук Новосибирского госуниверситета, с ООО «Международный научно-производственный центр «ЭкоКонтинент».

Проведен сравнительный анализ программы и учебных планов магистерских программ и методов обучения кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ и Департамента сельского хозяйства и биологической инженерии Университета Флориды (США). Разработана концепция совместной магистерской программы кафедры биофизики СФУ и Департамента сельского хозяйства и биологической инженерии Университета Флориды (США). Разработаны учебные планы совместной магистерской программы кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии и Департамента сельского хозяйства и биологической инженерии Университета Флориды (США). В программу Темпус подготовлен проект создания совместной магистерской программы по направлению «Радиоэкология». Методические разработки и практические рекомендации, полученные при выполнении Проекта, будут использованы в деятельности по продвижению образовательных технологий, созданию совместных международных магистратур и научных достижений по разработке инновационных технологий для устойчивого развития и их продвижению международные рынки образовательных услуг СФУ.


Содержание

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Раздел 1 РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ ФУНКЦИОНИРОВАИЯ БИФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ НАДН:ФМН-ОКСИДОРЕДУКТАЗА-ЛЮЦИФЕРАЗА В ВЯЗКОМ МИКРООКРУЖЕНИИ

1.1 Выбор микроокружения для построения экспериментальной модели функционирования люциферазы в клетке

1.1.1 Экспериментальное изучение кинетических параметров работы ферментов в вязких растворах сахарозы и глицерина при изменении рН и температуры

1.1.2 Анализ кинетических параметров работы ферментов в растворах разной вязкости и сравнение с аналогичными показателями в клетках

1.1.3 Подбор условий иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза

1.1.4 Анализ влияния состава вязких сред на компоненты биолюминесцентной реакции методами флуоресцентной спектроскопии

1.2 Сравнительный анализ физико-химических характеристик растворимых ферментов и ферментов, иммобилизованных совместно с субстратами

1.2.1 Сравнение субстратной специфичности растворимой и иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза 42

1.2.2 Влияние физических и химических факторов на активность растворимой и иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза 45

1.3 Разработка 4 прототипов экспериментальных моделей функционирования ферментов внутри клетки. 49

1.3.1 Подбор условий оптимизации экспериментальных моделей ЭМглицерин и ЭМсахароза

1.3.2 Подбор условий оптимизации экспериментальных моделей ЭМкрахмал и ЭМжелатин

1.3.3 Исследование механизмов влияния вязкости на ферментативные системы 1.3.4 Изучение связи «структура-функция» в зависимости от микроокружения

1.3.5 Обеспечение условий вязкости, подобных условиям в клеточном матрикс

1.4 Обоснованность и достоверность полученных результатов……………….37

Раздел 2 РАЗРАБОТКА МАТЕМАТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ СИСТЕМЫ

2.1 Анализ вклада различных механизмов и стадий реакции в кинетику свечения биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза

2.1.1 Кинетические схемы функционирования моно- и биферментной системы светящихся бактерий

2.1.2 Построение упрощенной математической модели функционирования биферментной системы

2.1.3 Анализ механизмов формирования кинетических кривых свечения

2.2 Моделирование кинетики функционирования иммобилизованной биолюминесцентной системы светящихся бактерий

2.2.1 Роль диффузии в функционировании иммобилизованной биферметной системы

2.2.2 Моделирование процесса диффузии ФМН из гелевого диска

Раздел 3 РАЗРАБОТКА ПРИНЦИПОВ ОБУЧЕНИЯ И ФОРМ ОРГАНИЗАЦИИ НАУЧНО-ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА ……………………………..38

3.1. Выполнение студентами –участниками проекта курсовых и дипломных работ по темам проекта…………………………………………………39

3.2. Работа Научно-образовательного семинара по биохимической физике как способ формирования современного научно-образовательного пространства по биохимической физике……………………………………………………………. 45

3.3. Чтение оригинальных курсов лекций с включением результатов исследований по проекту……..……………………………..........................................46

3.4. Разработка специальных практикумов по темам проекта …………...47

3.5. Внедрение в учебный процесс учебно-методических комплексов дисциплин ………………………………….…………………...48

3.6. Организация студенческих конференций………………………………..52

3.7. Участие студентов и молодых ученых в научных конференциях и стажировках……………………………………………………………………….53

Раздел 4. РАЗВИТИЕ СОВМЕСТНЫХ НАУЧНЫХ И НАУЧНО- ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ПРОГРАММ И ПРОЕКТОВ С ЗАРУБЕЖНЫМИ ПАРТНЕРАМИ

4.1 Разработка совместной магистерской программы кафедры биофизики СФУ Института фундаментальной биологии и биотехнологии и Департамента сельского хозяйства и биологической инженерии Университета Флориды (США)

4.2 Участие в образовательном проекте Университета Шанхайской организации сотрудничества

4.3 Приглашение профессоров ведущих российских и зарубежных вузов в СФУ

4.4 Создание Молодежной Международной Открытой Лаборатории Перспективных Исследований и Технологий (МОЛПИТ)

4.5. Перспектива развития международной деятельности в области науки и образования по теме проекта

4.5.1 Список конференций, на которых представлены результаты, полученные по теме проекта

4.5.2 Список публикаций по теме проекта

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ………………………………74

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

Биолюминесценция - свечение живых организмов
Хемилюминесценция - излучение света в результате дезактивации молекул, образованных в ходе химической реакции
Люцифераза - фермент, катализирующий биолюминесцентную реакцию
Эмиттер - молекула в электронно-возбужденном состоянии, ответственная за излучение регистрируемой люминесценции
I - интенсивность люминесценции
С14 - тетрадеканаль
ФМН - флавинмононуклуотид
FМNН2 - восстановленный флавинмононуклеотид
Кm - Константа Михаэлиса
С50 –пороговая концентрация растворителя, при которой происходит потеря половины ферментативной активности
kcn - константа спада биолюминесценции
Q - квантовый выход реакции
T - температура
ES-комплекс - фермент-субстратный комплекс
Биферментная система -смесь оксидоредуктазы и люциферазы
Вязкость -свойство текучих тел, жидкостей, оказывать сопротивление перемещению одной их части относительно другой
Гидрофобность -характеристика интенсивности молекулярного взаимодействия поверхности тел с водой. между молекулами воды и любого тела всегда будут действовать меньшей степени межмолекулярные силы притяжения
Бактериальная люцифераза - флавин-зависимая монооксигеназа
ЭМсахароза - экспериментальная модель с использованием сахарозы
ЭМглицерин - экспериментальная модель с использованием глицерина
Еа - энергия активации
НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза - сопряженная бактериальная биолюминесцентная система на основе бактериальных люцифераз и резуктаз
БСЖО - биологическая система жизнеобеспечения

ВВЕДЕНИЕ

Одной из важных задач современной образовательной реформы в России является развитие совместных научных и научно-образовательных программ и проектов с зарубежными партнерами, научной и академической мобильности в рамках международного сотрудничества, научно-методическое обеспечение подготовки научных кадров в высшей школе и развития научно-исследовательской работы студентов и аспирантов.

В проекте представлены исследования по направлению «Моделирование процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий», в рамках которого планируется организация и развитие совместных научных и научно-образовательных программ и проектов с зарубежными партнерами: Университет Флориды (США), Университет Болоньи (Италия), страны Шанхайской организации сотрудничества и др.

В последние годы получено много новых данных о молекулярной организации клетки. Клетку уже больше не рассматривают просто как вместилище равномерно распределенных ферментов и субстратов, так как установлено, что ее составные части и происходящие в ней процессы организованы совершенно определенным образом. Например, метаболические пути функционируют более эффективно, если субстраты для ферментативных реакций оказываются в соответствующем месте в нужное время. Исследование высокоочищенных ферментов в разбавленных растворах, где кинетика реакции соответствует уравнению Михаэлиса-Ментен, много дало для понимания их поведения в этих условиях. Однако большинство внутриклеточных ферментов никогда не функционирует в условиях, отвечающих уравнению Михаэлиса-Ментен, и обычно находится не в разбавленном растворе, а в сложной неоднородной среде (Тривен, 1983). Кроме того, в последние годы получено немало доказательств того, что многие ферменты в клетках работают в виде структурно и кинетически единых комплексов. В них проходит цепь последовательных процессов, когда продукт первого фермента является субстратом для второго фермента и т.д. (Березов, Коровкин, 1998). С этой точки зрения гораздо важнее исследовать функционирование не отдельно взятого фермента, а цепей сопряженных ферментативных реакций. Прямые исследования этих комплексов в клетке произвести трудно. Поэтому весьма актуальной для понимания процессов, происходящих в клетке, является создание моделей структурно и кинетически единых ферментативных комплексов, находящихся в соответствующем микроокружении.

Цель проекта – разработка и исследование экспериментальной модели для изучения функционирования цепей сопряжения ферментов внутри клетки на примере люминесцентной системы светящихся бактерий. В качестве физических моделей рассматриваются структуры, в которых сопряженная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза иммобилизуется в полимерные гели различной природы, либо помещается в условия повышенной вязкости, созданные ратворами сахарозы или глицерина.

Основная цель плана НИР второго этапа (2010 г.) работы над проектом состояла в разработке математической модели функционирования бактериальной биолюминесцентной системы in vivo на основе полученных в проекте экспериментальных данных.

Другой целью настоящего проекта являлось вовлечение молодежи в научную деятельность и построение образовательного процесса на основе новых научных результатов. Реализация этой цели осуществлялась на кафедры биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ (ИФБиБТ СФУ), возглавляемой руководителем настоящего проекта - проф., д.б.н. Кратасюк В.А.

Основная часть


Раздел 1 Разработка экспериментальных моделей функционирования биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в вязком микроокружении

1.1 Выбор микроокружения для построения экспериментальной модели функционирования люциферазы в клетке

1.1.1 Экспериментальное изучение кинетических параметров работы ферментов в вязких растворах сахарозы и глицерина при изменении рН и температуры

Для понимания процессов поведения ферментативной люминесцентной системы светящихся бактерий в условиях близких к in vivo было изучено влияние специально подобранной гетерогенной среды на биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза. Оптимизация микроокружения была достигнута за счет подбора соответствующих реакционных сред, отличающихся концентрациями органических растворителей, которые повышают вязкость реакционной среды, - глицерин и сахароза.

Важный физико-химический параметр, который очень сильно влияет на активность биферментной биолюминесцентной системы — это рН. Влияние рН на интенсивность свечения биферментной биолюминесцентной системы изучено в условиях различной вязкости. Для измерения интенсивности биолюминесценции в зависимости от кислотности среды использовали различные значения рН: 5,8; 6,4; 6,9; 7,3; 7,8 и концентрации органических растворителей: сахарозы: 0,06 М; 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М; 4,06 М и глицерина: 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,43 М; 8,15 М. За контроль принимали значения кинетических параметр, полученных при значении рН = 6,9.

Показано, что органические растворители, которые повышают вязкость реакционной среды, - глицерин и сахароза ингибируют интенсивность свечения биолюминесценции при всех исследуемых значениях рН в разной степени.

Полученные зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации органических растворителей были охарактеризованы параметром С50 –пороговой концентрацией растворителя, при которой происходит потеря половины ферментативной активности. Экспериментально определенные значения С50 для органических растворителей составляет при рН=6.9 (контроль): для глицерина С50 = 6,65 М; для сахарозы С50=1,993 М (рис.1.1.1). Следовательно, более сильным ингибитором биферментной биолюминесцентной реакции по сравнению с глицерином является органический растворитель – сахароза.

1 – глицерин, 2 – сахароза

Рисунок 1.1.1 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции (% ) от концентрации глицерина и сахарозы при рН=6.9.

Интенсивность свечения бактериальной биолюминесцентной реакции уменьшается с увеличением концентрации сахарозы при всех исследованных значениях рН. Изменение рН реакционной среды приводит к уменьшению интенсивности свечения по отношению к контролю при всех исследованных концентрациях, как сахарозы, так и глицерина. Наибольший инактивирующий эффект в присутствии сахарозы имеет рН реакционной среды 5,8, тогда как в присутствии глицерина - рН равняется 7,84.

Анализ параметра С50, характеризующий инактивирующее действие органических растворителей на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему (табл. 1.1.1.), в реакционных средах с различным значением рН показал, что более сильным ингибитором биферментной биолюминесцентной реакции является органический растворитель - сахароза, по сравнению с глицерином.

Исследование влияния вязкости реакционной среды, моделируемой введением различных концентраций сахарозы, на рН–оптимум биферментной бактериальной системы показало, что рН – оптимум реакционной среды для бактериальной биферментной биолюминесцентной реакции в фосфатном буфере, равный 6,9, не изменяется при варьировании вязкости реакционной среды путем введения сахарозы до 1,01 М ее содержания в реакционной среде.

Таблица 1.1.1

Параметр С50, характеризующий инактивирующее действие органических растворителей на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему

С50, М рН Сахароза Глицерин
5,8 0,30 7,29
6,4 1,93 6,53
6,9 2,70 8,10
7,3 1,53 7,57
7,8 1,21 7,80

Интенсивность свечения биферментной биолюминесцентной реакции уменьшается с увеличением концентрации сахарозы как щелочной, так и в кислой среде: в щелочной среде интенсивность свечения уменьшается с увеличением концентрации сахарозы на 24,2%; 38,1%; 67% и 83,3% для 1,01 М; 2,03 М и 4,06 М сахароза, соответственно, или не меняется (0,51 М); в кислой среде при рН = 5,8 значение интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы уменьшается в среднем на 75 % для 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М и 4,06 М концентраций сахарозы (рис. 1.1.2). В реакционной среде, содержащей 4,06 М сахарозы, рН–оптимума не было зарегистрировано.

Далее бала исследована зависимость интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы от рН в условиях различной вязкости при использовании глицерина. Показано, что рН–оптимум реакционной среды для бактериальной биферментной биолюминесцентной реакции не изменяется при варьировании вязкости реакционной среды путем введении глицерина за исключением концентрации глицерина равной 8,15 М (рис. 1.1.3). В щелочной среде интенсивность свечения с увеличением концентрации глицерина 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,44 М; 8,15 М уменьшается на 13,6%; 15,1 %; 22,9 %; 26,9 % и 56,3%, соответственно. В кислой среде значение интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы с увеличением концентрации глицерина или увеличивается (0,91 М глицерина), или уменьшается на 29,2%; 44,8 %; 51,2 % и 62,3 % для 1,09 М; 2,72 М; 5,44 М; 8,15 М концентрации глицерина, соответственно.

1- контроль; 2- 0,06 М; 3- 0,51 М; 4- 1,01 М; 5- 2,03 М; 6-4,06 М сахароза

Рисунок 1.1.2 - Зависимость интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы от рН в условиях различной вязкости.

1-0,91 М; 2- контроль; 3- 1,09 М; 4- 2,72 М; 5- 5,44 М; 6-8,15 М глицерина

Рисунок 1.1.3 - Зависимость интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы от рН в условиях различной вязкости.

Органические растворители оказывают существенное влияние не только на интенсивность светоизлучения биферментной биолюминесцентной системы, но и на константу спада биолюминесценции (kcn), которая характеризует скорость распада долгоживущего интермедиата. Эксперименты показали, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина, в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции (рис. 1.1.4). То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы.

1 – сахароза, 2 – глицерин

Рисунок 1.1.4 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при контроле (значении рН = 6,9) от концентрации сахарозы иглицерина.

Полученные результаты показали, что увеличение вязкости реакционной среды при введении, как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесценой сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в сахарозе стабилизация наблюдается в большой степени.

Зависимости константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при разном значении рН (6,9; 5,8; 6,4: 7,3; 7,8) от концентрации сахарозы представлены на рисунке 1.1.5.

Показано, что скорость распада долгоживущего интермедиата при всех исследованных значениях рН уменьшается на 10-15% с увеличением концентрации органического растворителя – сахарозы (рис.1.1.6), причем при рН в контроле наблюдаются минимальные значения константы спада биолюминесценции, то есть при рН 7,3 наблюдается максимальная стабилизация фермент-субстратного комплекса. При рН 6,4 наблюдаются максимальные значения константы спада биолюминесценции. Из рисунка 1.1.6 видно, что максимальное значение константы спада светоизлучения биферментной биолюминесцентной системы при всех используемых концентрациях глицерина наблюдается в контроле (значении рН 6,9). Константа спада биолюминесценции при рН реакционной системы равной 5,8; 6,4 и 7,3; 7,8 практически совпадает при всех используемых концентрациях глицерина.

1- 6,4; 2-5,8: 3- 7,84; 4- 7,3; 5- 6,9 (контроль)

Рисунок 1.1.5 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от концентрации сахарозы при разных значениях рН.

Таким образом, эксперименты показали, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина, в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы.

1- контроль; 2- 7,84: 3- 5,8; 4- 7,33; 5-6,39

Рисунок 1.1.6 - Зависимость константы спада биферментной биолюминесцентной системы при разном значении рН от концентрации глицерина.

Исследование влияния рН на квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы в условиях различной вязкости квантовый выход с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН.

При значении рН реакционной среды для функционирования биферментной биолюминесцентной системы, равной 6,9, с увеличением концентрации сахарозы квантовый выход светоизлучения уменьшается незначительно (рис. 1.1.7), тогда как при рН 5,8 в реакционной среде квантовый выход биолюминесценции с увеличением концентрации сахарозы уменьшается на 60 % по сравнению с рН 5,8 в реакционной смеси без органического растворителя. Число квантов Q, испущенных в ходе реакции, при контроле выше приблизительно на 35 %, чем при рН 5,8.

При рН 6,4 значение Q биферментной биолюминесцентной системы ниже, чем в контроле. При значении рН равном 6,4 с увеличением концентрации сахарозы до 2,03 М (рис.1.1.7, кривая 2) квантовый выход биолюминесценции увеличивается приблизительно на 40% по сравнению с реакционной системой при рН 6,4 без сахарозы. При 4,06 М сахарозы квантовый выход уменьшается по сравнению с реакционной системой при рН 6,4 без сахарозы незначительно. Число испущенных квантов при рН 6,9 выше, чем при рН 6,4.

1- 6,4; 2- 5,8; 3- контроль; 4-7,8; 5-7,3

Рисунок 1.1.7 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при разном значении от концентрации сахарозы при различных рН.

Значения Q биферментной биолюминесцентной системы в контроле и при рН 7,3 при малых концентрациях сахарозы от 0 М до 0,06 М совпадает, при дальнейшем повышении концентрации сахарозы квантовый выход биолюминесценции при рН 7,3 уменьшается значительно: при 4,00 М сахарозе квантовый выход составляет 15 % от контроля. Значения Q биферментной биолюминесцентной системы при рН 7,8 меньше, чем в контроле. При повышении концентрации сахарозы квантовый выход биолюминесценции при рН 7,8 уменьшается значительно по сравнению с контролем, приблизительно на 65 %. Таким образом, число испущенных квантов в ходе реакции в контроле выше, чем при рН 7,8.

Таким образом, квантовый выход биферментной биолюминесцентной реакции с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН. Изменение рН (как увеличение, так и уменьшение по отношению к контролю) приводит к уменьшению испускания квантов.

Квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы при введении глицерина не изменяется в кислой среде и увеличивается в щелочной незначительно, по отношению к контролю (рис. 1.1.8).

1-6,9 (контроль); 2-6,4: 3-5,8; 4-7,3; 5-7,8

Рисунок 1.1.8 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции

биферментной биолюминесцентной системы от концентрации глицерина при разных значениях рН.

Итак, увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход.

Таким образом, при изучении кинетических параметров биферментной биолюминесценой реакции при изменении вязкости и рН реакционной среды показано, что увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной бактериальной реакции приводит к уменьшению максимального значения интенсивности свечения и константы спада при различных значениях рН. Значения рН–оптимума изменяется при введении в реакционную смесь только высоких концентраций глицерина и сахарозы. Интенсивность свечения линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН. Увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход. Сахароза является более сильным инактиватором биферментной биолюминесцентной системы по сравнению с глицерином.

Для подбора условий (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo, были проведены эксперименты по изучению кинетических параметров бактериальной биолюминесцентной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин при разных температурах.

Исследование влияния вязкости среды на интенсивность свечения биферментной системы показало, что введение увеличивающихся концентраций сахарозы и глицерина в реакционную среду в конечном итоге приводит к уменьшению интенсивности свечения: при различных температурах реакционных смесей наблюдалась инактивация интенсивности свечения.

Показано, что температурный оптимум бактериальной биферментной системы не изменяется и находится в пределах 25°C - 26 °C при всех используемых концентрациях глицерина. Сама же интенсивность светоизлучения уменьшается с увеличением концентрации глицерина. Нормирование графиков зависимостей интенсивности свечения от концентрации глицерина позволяет оценить смещение температурного оптимума, а также изменение стабильности бактериальной биолюминесцентой биферментной системы при разных температурах в условиях различной вязкости. При всех используемых концентрациях глицерина нормированные зависимости интенсивности свечения от температуры совпадают, то есть увеличение вязкости реакционной среды при введении глицерина не приводит к изменению температурного профиля реакции, а значит и к заметным эффектам стабилизации или дестабилизации.

Зависимости интенсивности свечения от температуры практически совпадают, что свидетельствует о стабилизирующем эффекте сахарозы на биферментную систему в этом диапазоне температур: концентрация сахарозы растет, а активность остается на уровне контроля.

При проведении реакции при 170С увеличивающаяся вязкость среды, достигаемая путем введения сахарозы в реакционную смесь, оказывает существенное влияние на термостабильность биферментной системы. Термостабильность в этих условиях уменьшается с увеличением вязкости среды. При 170С температурный оптимум смещается в сторону более высоких температур на два градуса при 50%-ном содержании сахарозы в реакционной среде.

Интенсивность свечения биолюминесцентной реакции в присутствии сахарозы ингибируется в меньшей степени, чем при глицерине. Это также совпадает с результатами, полученными при изучении кинетики биферментной биолюминесцентной системы в присутствии этих эффекторов, которые также показали, что уменьшение максимальной скорости реакции на 50% происходит в более низких концентрациях сахарозы по сравнению с глицерином.

Далее были изучены зависимости константы спада биолюминесценции от температуры при различном содержании сахарозы и глицерина в реакционной среде.

Показано, что константа спада биолюминесцентной реакции kcn имеет рН-оптимум, который в буферном растворе равен 25 ° С. Температурный оптимум смещается в сторону больших температур на 2-30С при 50% содержании как сахарозы, так глицерина в реакционной среде. Показано, что kcn максимальна в буферном растворе во всем исследуемом диапазоне температур, и уменьшается с увеличением содержания органического растворителя в реакционной среде.

Экспериментальные результаты показали, что возрастающие концентрации сахарозы и глицерина понижают константу спада во всем диапазоне исследуемых температур, причем возрастающие концентрации сахарозы в реакционной среде стабилизируют долгоживущий интермедиат реакции в большей степени по сравнению с глицерином. Следует заметить, что степень стабилизации долгоживущего интермедиата зависит от температуры реакционной среды. В большей степени увеличивающиеся концентрации как глицерина, так и сахарозы стабилизируют долгоживущей интермедиат при температурах, близких к температурному оптимуму: в этом случае значения константы спада минимальны при максимальном содержании сахарозы или глицерина. При, например, 420С уменьшение константы спада в 50 % глицерине происходит в меньшей степени. Особенно это хорошо видно из зависимостей константы спада биферментной биолюминесцентной системы от концентраций органических растворителей при различных температурах для глицерина и сахарозы. Кроме того, из этих зависимостей следует, что при увеличении концентрации глицерина для любой из исследуемых фиксированных температур наблюдается существенная (почти на порядок) стабилизация долгоживущего интермедиата. В присутствии сахарозы наблюдается аналогичный эффект, но степень стабилизации в 2 раза меньше.

Квантовый выход биферментной биолюминесцентной реакции зависит от изменения константы спада светоизлучения, и в меньшей степени определяется начальной скоростью реакции.

Увеличивающиеся концентрации, как глицерина, так и сахарозы уменьшают квантовый выход реакции, причем в глицерине это уменьшение наблюдается в большей степени, чем в сахарозе. 50 % содержание сахарозы в реакционной среде способствует большему количеству излучения квантов, чем такая же концентрация глицерина (рис. 1.1.9 и 1.1.10). Зависимость для квантового выхода биферментных биолюминесцентных систем от температуры также характеризуется температурным оптимумом, который не изменяется при увеличении концентрации как глицерина, так и сахарозы.

Рисунок 1.1.9 - Зависимость квантового выхода биферментной

биолюминесцентной системы от температуры при различных концентрациях глицерина.

Рисунок 1.1.10 - Зависимость квантового выхода биферментной биолюминесцентной системы от температуры при различных концентрациях сахарозы.

При сравнении абсолютных значений кинетических параметров биолюминесцентной биферментной реакции в вязких средах при увеличении температуры по отношению к оптимуму, можно сделать вывод, что при более высоких исследуемых температурах в диапазоне от 36,6 до 42 °C глицерин является более сильным ингибитором, чем сахароза. Температурный оптимум для биферментной биолюминесцентной системы равен 25°C и не зависит от вязкости среды в исследованных пределах.

Таким образом, в ходе экспериментального изучения кинетических параметров работы ферментов в вязких растворах сахарозы и глицерина и в буферном растворе с низкой вязкостью при изменении рН и температуры были получены следующие основные результаты:

1). Подобраны условия (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.

2). Получены результаты, которые позволят варьировать условиями реакционной среды (рН, вязкости и температуры) для увеличения интенсивности свечения и квантового выхода биолюминесцентной реакции, приводящие в конечном итоге к увеличению чувствительности биолюминесцентного анализа. В частности, исследование влияния вязкости и рН реакционной среды на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему НАДH:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза показало, что увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной бактериальной реакции приводит к уменьшению максимального значения интенсивности свечения и константы спада при различных значениях рН, а значения рН–оптимума изменяются только в присутствии в реакционной среде высоких концентраций глицерина и сахарозы. Интенсивность свечения биолюминесценции линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН. Увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход биолюминесценции. Показано, что сахароза является более сильным инактиватором биферментной биолюминесцентной системы по сравнению с глицерином в условиях температурного оптимума.

3). Была получена зависимость между термостабильностью биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и физико-химическими характеристиками микроокружения ферментов. Показано, что ЭМсахароза обладает большей термостабильностью по сравнению с моделью ЭМглицерин.

4). Предложены объемные пропорции компонентов реакционной среды, влияющих на активный центр люциферазы и характер связи субстратов с ферментом. В частности, в экспериментальной модели ЭМглицерин стабилизация возбужденного интермедиата происходит в большей степени при увеличении вязкости реакционной среды, чем в модели ЭМсахароза в широком диапазоне исследуемых температур (17-420С).

1.1.2 Анализ кинетических параметров работы ферментов в растворах разной вязкости и сравнение с аналогичными показателями в клетках

Современным и перспективным методом оценки стабильности (устойчивости) биологической активности биопрепаратов различной природы при их длительном хранении является ускоренный изотермический тест на термостабильность при повышенных температурах, который позволяет количественно оценивать их стабильность и прогнозировать сроки хранения в зависимости от температуры.

Нами предпринята попытка использования этого метода для прогноза сроков хранения люциферазы в водно-органических смесях. Предлагаемый метод предполагает проведение люциферазной реакции при повышенных температурах. Простейшая модель термоинактивации предполагает, что молекулы активного центра фермента (Еа) претерпевают необратимые структурные и химические изменения, приводящие к неактивной форме (Еi):

Еа Еi (1)

Скорость приведенного выше процесса можно представить в виде дифференциального уравнения первого порядка:

dEa

--- = - k Ea

dt

или ln(Ea(t)) = ln(Ea(0)) - kt, (2)

где k - константа скорости инактивации,c, t - время, мин.

Константа скорости инактивации и энергия активации связанным уравнением Аррениуса:

k = ko·exp(E/RT), (3)

где R = 1,987 кал/(град·моль).

Если известны константы скорости инактивации для двух разных температур, которые получают из анализа изменения активности фермента в определенного течение времени, то можно получить значения k для любой температуры на основании этого уравнения.

Полученные нами зависимости активности буферного раствора люциферазы при различных температурах от времени носят линейный характер и описываются уравнением вида y=a+kx, где k=tga=ln(Ea(t))/t и а - угол наклона прямой.

Статистические данные температурной денатурации люциферазы в буферном растворе приведены в таблице 1.1.2. Из них можно заключить, что, как и было показано ранее, при разных температурах инактивация люциферазы происходит по экспоненциальному закону и полностью описывается константой скорости мономолекулярной реакции превращения фермента в неактивную форму. Возрастание температуры инкубации приводит к увеличению константы инактивации фермента.

Для исследования влияния вязкости на термостабильность люциферазы были выбраны два растворителя с высокими пороговыми концентрациями: диметилсульфоксид (ДМСО), который слабо меняет вязкость реакционной среды, и глицерин. Экспериментальные данные получены для смесей с содержанием органического компонента меньше порогового значения. Такой выбор концентраций органических растворителей основан на предположении, что белок необратимо теряет свою нативную форму при достижении пороговой концентрации.

Зависимости ln I от времени инкубации в буферно-глицериновых растворах люциферазы для 400 С и 420 С достоверно отличаются от контроля. Зависимости lnI(t) носят линейный характер и описываются уравнением вида y=a+bх. Графики, описывающие зависимости для буферно-глицеринового раствора люциферазы при выбранных нами температурах, проходят значительно выше соответствующих контролей. Значит, глицерин оказывает стабилизирующее действие на термоинактивацию люциферазы.

Статистические данные ингибирующего действия температуры и органических растворителей (12,5%ГЛ и 5%ДМСО) на люциферазу представлены в табл. 1.1.3.

Табл. 1.1.2.

Статистические данные термоинактивации люциферазы в буферном растворе

температура, 0 С 32 36 40 42
а 4.23 4.05 4.49 4.66
-k 0.008 0.013 0.097 0.22
r 0.59 0.69 0.98 0.99

где r - коэффициет корреляции, а=ln (Еа(0)).

В экспериментах по изучению влияния 5% DMSO, добавляемого в буферный раствор фермента, на термостабильность люциферазы ферментативную реакцию проводили при 400 С и 420 С. Буферный и водно-органический растворы фермента во время проведения измерений находились при этих же температурах. Полученные в результате опыта зависимости ln I от времени для DMSO аналогично контролю носят линейный характер. С увеличением времени инкубации происходит уменьшение ферментативной активности; и чем выше температура инкубации, тем быстрее происходит термоинактивация. Легко сделать вывод об ингибирующем действии DMSO на люциферазу, сравнив термоинактивацию контроля при 400 С и 420 С и термоинактивацию фермента в присутствии 5% DMSO в реакционной смеси при этих же температурах: значения ln I в присутствии DMSO с течением времени убывают быстрее, чем значения ln I для контроля при одной и той же температуре.

Ингибирующее действие DMSO на активность люциферазы наблюдается при проведении ферментативной реакции при 360 С, где в качестве водно-органического компанента использовали 12.5% DMSO. В результате эксперимента получены достоверно отличающиеся значения ln I при контроле от значений ln I для водно-органических растворов фермента. Аналогичные результаты получены и для 2.5%,7.5%,12.5% ДМСО при 400 С.

Табл.1.1.3.

Статистические данные совместного ингибирования люциферазы органическими растворителями и температурой

температура, С
параметры уравнения 40 40 42 42 40 40 42 42 36 36
ГЛ к к ГЛ ДМСО к к ДМСО к ДМСО
а 4.7 4.8 4.6 4.6 4.8 4.3 4.7 4.9 4.5 4.5
0.042 0.09 0.2 0.2 0.5 0.3 0.1 0.2 0.03 0.1
-r 0.96 0.95 1 1 1 1 1 1 0.9 1


Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |
 





<


 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.