«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение ...»
Из приведенных данных видно, что термоинактивация люциферазы в водно-органических смесях происходит аналогично термоинактивации контроля. Глицерин стабилизирует люциферазу против повышенных температур, а ДМСО, в комплексе с температурой, инактивирует люциферазу, поэтому ускоренный изотермический тест имеет смысл применить для водно-глицериновых смесей.
Из табл. 1.1.3. возьмем значения k для контроля и 12.5% глицерина при 400 и 420 С. Графики зависимостей lnk(1/T), где Т - температура, выраженная в Кельвинах (К) y=a+kx, причем прямая для глицерина проходит выше прямой для контроля. Из полученного графика можно определить время сохранения активности люциферазы в 12.5% глицерине по сравнению с 0,02 М фосфатным буфером при разных температурах.
Пусть Т=400 С. Из полученного нами графика найдем значения kк=0,086 мин и kgl=0,042 мин. В уравнении у=kt+а, а=lnIo=ln100=4,61, а у=lnIt=lnO=1. Зная k для контроля и глицерина легко найти время хранения t=3,6/k: tк=41,9 мин, tgl=85,8 мин. Найдем коэффициент стабилизации q=kк/kgl=0,5.
Итак, глицерин защищает люциферазу против термоинактивации при повышенных температурах и, согласно ускоренному изотермическому методу, должен стабилизировать фермент при хранении. ДМСО не защищает люциферазу от действия высоких температур.
Таким образом, в результате проведенных исследований были измерены параметры термоинактивации ферментов в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин. Предложен способ описания кинетики процесса и механизмов термической инактивации ферментов в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин для различных водно-органических сред на основе корреляционного анализа между энергией активации при различных температурах и физико-химическими характеристиками органических растворителей (logP, диэлектрическая проницаемость, вязкость и др.). Полученные результаты необходимы для оценки соответствия характеристик изучаемых экспериментальных моделей условиям функционирования ферментов в клетке.
1.1.3 Подбор условий иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН-
оксидоредуктаза-люцифераза в гели различной природы
Была изучена эффективность работы люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в гелевом окружении, имеющем различную химическую природу. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбора соответствующей гелеобразующей системы в качестве носителей для иммобилизации. Предварительные исследования показали перспективность использования гелей для создания оптимального микроокружения ферментов и сохранения высокой каталитической активности. Метод иммобилизации в гели состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор. В качестве носителей для иммобилизации выбраны желатиновый и крахмальный гели, при которых не происходит инактивации и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.
Рассматривались два варианта стабилизации ферментов на основе иммобилизации: в первом случае были иммобилизованы только НАДН:ФМН-оксидоредуктаза и люцифераза, во втором, проводили совместную иммобилизацию ферментов вместе с субстратами и кофакторами – алифатическим альдегидом (C14), ФМН и НАДН.
Показано, что выход активности при иммобилизации ферментов в гели зависит от природы используемого полимерного геля (рис. 1.1.11). В ходе эксперимента были исследованы характеристики биферментной системы, иммобилизованной в гели, приготовленные из картофельного, рисового и кукурузного крахмалов различных концентраций. Из рисунка 1.1.11 видно, что интенсивность свечения биферментной системы, иммобилизованной в «картофельный» гель, уменьшается с увеличением процентного содержания крахмала в геле. Для «рисового» геля разницы по интенсивности свечения между 4% и 5% гелем не наблюдали. В случае «кукурузного» геля достоверных различий по интенсивности свечения препаратов ферментов иммобилизованных в гели разной концентрации не получили.
Рисунок 1.1.11 - Зависимость интенсивности свечения иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от концентрации крахмала.
Максимальная активность наблюдалась у биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза–люцифераза, иммобилизованной в «картофельный» гель. Наиболее удобным в работе оказался 3,5% «картофельный» крахмальный гель. В этом случае иммобилизованные ферменты обладали высокой активностью (Imax=850mV), и сохранялась целостность иммобилизованных дисков. При использовании более низкой концентрации геля (3%) наблюдалось нарушение целостности дисков с иммобилизованными ферментами. Кроме того, гель низкой концентрации недостаточно связывал ферменты, и они быстро переходили из гелевой фазы в реакционную среду, при этом диск с иммобилизованными ферментами разрушался. При использовании высоких концентраций геля (4%, 5%) возникали сложности в дозировании препарата из-за высокой вязкости геля. Это связано с тем, что процедура иммобилизации проходит при температуре 300С, когда клейстеризация геля в основном завершается. Таким образом, в процессе проведения иммобилизации гель высокой концентрации быстро застывает, и включение фермента в матрицу геля становится практически невозможным.
Поэтому для проведения дальнейших исследований был выбран 3,5% «крахмальный» гель. При использовании данной концентрации картофельного крахмала в гелевом растворе, достигается высокий выход активности иммобилизованных препаратов и диски обладают достаточной прочностью.
Оптимальным временем высушивания иммобилизованных препаратов является 6-8 часов. При меньшем времени высушивания диски недостаточно высыхают и при помещении их в реакционную смесь быстро разрушаются. В работе был подобран температурный режим высушивания иммобилизованных препаратов. Высушивание дисков при 200С приводило к нарушению их целостности. Оптимальным режимом высушивания дисков является 40С - в этом случае диски обладают высокой активностью и целостностью, что упрощает использование их в биолюминесцентном анализе.
Далее исследовали способ стабилизации биферментной системы путем совместной иммобилизации ферментов и их субстратов. На рисунке 1.1.12 представлены зависимости интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при добавлении одного из субстратов биферментной реакции в иммобилизованном виде, в то время как остальные компоненты добавляли в реакционную смесь в виде растворов. Максимальная активность биферментной системы наблюдалась при добавлении в реакционную смесь 13мкг ФМН; 137нг тетрадеканаля; 140 мкг НАДН для получения иммобилизованного реагента. При использовании меньших количеств субстратов активность иммобилизованных препаратов мала из-за недостатка субстратов, а при использовании больших количеств активность препаратов уменьшалась из-за ингибирования активности ферментов избытком субстратов.
На рисунке 1.1.13. представлены результаты исследования эффективности работы биферментной системы при совместной иммобилизации ферментов и их субстратов. Наибольшей активностью обладали реагенты, содержащие (R+L)+C14 и (R+L)+НАДН+С14, иммобилизованные в 3% и 3,5% крахмальный гель, в этих случаях выход активности ферментов составил 100% (Рис. 1.1.13). Многокомпонентные реагенты включающие: (R+L)+ФМН; (R+L)+НАДН; (R+L)+ФМН+C14 и (R+L)+ФМН+НАДН обладали низким выходом активности (от 1% до 5%). Максимальная активность иммобилизованного реагента, включающего все компоненты биферментной системы, составила 10%. Таким образом, наиболее стабильной является биферментная система, иммобилизованная совместно с альдегидом и НАДН.
Рисунок 1.1.12 - Зависимость интенсивности свечения биферментной системы от количества субстратов в иммобилизованных дисках («крахмальный» гель).
Рисунок 1.1.13 - Выход активности биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, иммобилизованной совместно с субстратами в крахмальный гель.
Были выбраны условия, обеспечивающие максимальную эффективность работы ферментов биферментной системы при использовании желатина в качестве носителя для иммобилизации. Максимальный выход активности биферментной системы, иммобилизованной в желатиновый гель, составил менее 20% как для реагента (R+L), так и для (R+L)+НАДН+С14 (рис. 1.1.14.) и достигнут при использовании 5% концентрации желатина.
Рисунок 1.1.14 - Выход активности иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза.
Иммобилизованная биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза не требует специальных условий хранения для обеспечения поддержания высокой активности ферментов: при иммобилизации в крахмальный гель максимальная активность сохраняется не менее одного года, при иммобилизации в желатиновый гель – один месяц. В то же время, интенсивность свечения раствора биферментной системы уменьшается до нуля в течение трех суток.
1.1.4 Анализ влияния состава вязких сред на компоненты биолюминесцентной реакции методами флуоресцентной спектроскопии
С целью моделирования работы биолюминесцентной биферментной системы в бактериальной клетке ранее было исследовано влияние на интенсивность биолюминесценции четырех вязких сред, содержащих глицерин, сахарозу, желатин и крахмал. Механизмы воздействия вязких сред различаются: от стимулирования свечения растворами желатина до ингибирования растворами глицерина или сахарозы. Однако вопрос о том, насколько тушение биолюминесценции связано непосредственно с вязкостью раствора остается открытым. Альтернативой ингибированию «по Крамерсу», характерному для ферментов, претерпевающих в ходе катализа существенные конформационные изменения (Uribe and Sampedro, 2003) является специфическое взаимодействие компонентов вязких сред с участниками биолюминесцентной реакции, что приводит к снижению их активности. Для обнаружения специфических взаимодействий со средой и конформационных изменений ферментов удобно использовать методы флуоресцентной спектроскопии, поскольку межмолекулярные взаимодействия отражаются на структуре электронно-возбужденных состояний молекул.
Важнейшими компонентами биолюминесцентной реакции бактерий являются ферменты люцифераза и НАДН:ФМН-оксидоредуктаза и субстрат ФМН.
Бактериальная люцифераза представляет собой -гетеродимер с молекулярной массой около 80 кДа, не содержащий металлов или кофакторов (Pocker and Janjic, 1990). Поэтому люминесцентные свойства данного фермента обусловлены содержащимися в его составе триптофановыми аминокислотными остатками. Согласно литературным данным бактериальные люциферазы содержат в своей аминокислотной последовательности 7-8 остатков триптофана. Спектр флуоресценции бактериальной люциферазы имеет максимум при 330 нм (Mejri et al., 1998).
НАДН:ФМН-оксидоредуктаза представляет собой белок с молекулярной массой приблизительно 26 кДа. Молекула этого фермента содержит один триптофановый остаток в положении 212, находящийся близко к поверхности глобулы, и восемь тирозиновых остатков (Джеймс, 1980).
Флавины обнаруживают интенсивную желто-зеленую флуоресценцию с максимумом при 520-530 нм (Kramers, 1940). Квантовый выход флуоресценции флавинов не зависит от длины волны возбуждения (в диапазоне 260-500 нм), что свидетельствует об очень высокой скорости внутренней конверсии и, как следствие, малых потерях энергии из-за излучения с высших состояний и интеркомбинационной конверсии. В растворителях, менее полярных, чем вода, максимум спектра испускания флавинов обычно сдвигается в коротковолновую область и частично разрешается структура колебательных подуровней. Уменьшение полярности растворителя приводит также к увеличению квантового выхода флуоресценции флавинов. При связывании с белками квантовый выход флуоресценции ФМН и его производных, как правило, значительно уменьшается (флавопротеины флуоресцируют слабо). Исключение составляют бактериальная люцифераза, люмазиновый апопротеин и желтый флуоресцентный белок (Джеймс, 1980).
Целью данного этапа работы являлось исследование влияния состава вязких сред на спектрально-люминесцентные характеристики основных компонентов биолюминесцентной реакции бактерий – ФМН, бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы.
Спектры флуоресценции
Были получены спектры люминесценции флавинмононуклеотида (ФМН), бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в присутствии разных концентраций глицерина, сахарозы, желатина и крахмала. Влияние сред на спектры флуоресценции описаны в таблице 1.1.4.
Показано, что флуоресценция ФМН характеризуется максимумом при длине волны 530 нм. Положение максимума флуоресценции ФМН не подвержено влиянию ни одной из вязких сред, исследуемых в данной работе. Это свидетельствует о том, что для молекулы ФМН не происходит снижения полярности микроокружения (Fischer et al., 1996). С другой стороны, модифицированные вязкие среды влияют на интенсивность люминесценции ФМН, а значит на его квантовый выход флуоресценции. При этом установлено, что глицерин усиливает интенсивность люминесценции ФМН почти в 1,25 раза, а сахароза, напротив, ее тушит почти в 4 раза (таблица 1.1.4). Возможно, это связано с разными механизмами влияния компонентов сред на молекулы растворителя. Так, известно, что сахароза обладает способностью к структуризации молекул воды. В ее присутствии усиливаются водородные связи между молекулами растворителя и уменьшается их мобильность.
Табл. 1.1.4.
Влияние состава среды на спектрально-люминесцентные свойства компонентов биолюминесцентной системы: спектр флуоресценции (СФ) и анизотропию флуоресценции (АФ) при 20°С.
| Компонент (концентрация) | ФМН* (110-5 М) | Бактериальная люцифераза# (110-6 М) | НАДН:ФМН- оксидоредуктаза# (0,56 ед.акт/мл) |
| Состав среды (диапазон концентраций) | |||
| Фосфатный буфер (0,05 М) | СФ: max=530 нм, Imax= 7 о.е. АФ: 0,005 | СФ: max=330 нм, Imax= 7 о.е. АФ: 0,045 | СФ: max=331 нм, Imax= 14,6 о.е. АФ: 0,053 |
| Глицерин (10-80%) | СФ: форма сохраняется, Imax увеличивается на 25% АФ: растет от 0,009 до 0,119 | СФ: гипсохромный сдвиг на 5 нм, Imax уменьшается на 15% АФ: растет от 0,053 до 0,063 | СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 30% АФ: растет от 0,049 до 0,051 |
| Сахароза (10-65%) | СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 75% АФ: растет от 0,018 до 0,301 | СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 50% АФ: растет от 0,058 до 0,072 | СФ: гипсохромный сдвиг на 5 нм, Imax уменьшается на 59% АФ: растет от 0,073 до 0,087 |
| Желатин (0,1-1%) | СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 16% АФ: растет от 0,008 до 0,014 | СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 63% АФ: растет от 0,062 до 0,085 | СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 72% АФ: растет от 0,059 до 0,077 |
| Картофельный крахмал (0,5-5%) | СФ: форма сохраняется, Imax уменьшается на 14% АФ: сохраняется 0,011 | СФ: не изменяется АФ: растет от 0,048 до 0,059 | СФ: не изменяется АФ: сохраняется 0,070 |
* Условия регистрации: длина волны возбуждения – 450 нм, длина волны регистрации – 530 нм, спектральная ширина щелей возбуждающего и регистрирующего монохроматоров – 4 нм.
#Условия регистрации: длина волны возбуждения – 285 нм, длина волны регистрации – 335 нм, спектральная ширина щелей возбуждающего и регистрирующего монохроматоров – 4 нм.
Известно, что глицерин оказывает обратное действие – он увеличивает подвижность молекул растворителя (Mejri, 1998), что по-видимому, и происходит в нашем случае.
Желатин является наиболее изученным гелеобразующим веществом биологической природы. В отличие от других гелей он способен образовывать гель не только при охлаждении, но и в результате набухания в воде (Илларионов и др., 1988). Экспериментальные наблюдения показывают, что желатиновый гель представляет собой систему, к которой водородные связи и гидрофобные силы сбалансированы.
Спектры бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы характеризуется максимумами при длине волны около 330 нм. Следует заметить, что, согласно литературным данным (Lee, 1993), спектры флуоресценции триптофана в воде и глицерине имеют максимумы при 347 и 343 нм, соответственно. Это говорит о том, что большинство триптофановых остатков люциферазы и оксидоредуктазы находятся в неполярном окружении и спрятаны от растворителя внутри белковой глобулы. Зарегистрирован гипсохромный сдвиг приблизительно на 5 нм спектров флуоресценции люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в растворе сахарозы и глицерина. В случае оксидоредуктазы такое изменение спектра свидетельствует о конформационном изменении фермента в среде, содержащей сахарозу. Направление сдвига указывает на уменьшение полярности окружения триптофанов оксидоредуктазы, что может быть результатом более плотной упаковки глобулы данного белка. Сдвиг спектра люциферазы может быть вызван как конформационными изменениями данного фермента, так и тушением флуоресценции части триптофановых остатков в ее составе. Для обоих ферментов сдвиг спектра сопровождается уменьшением интенсивности люминесценции. Не смотря на то, что при уменьшении полярности микроокружения следует ожидать увеличения квантового выхода флуоресценции триптофана (Tanner et al., 1996), полученные в данной работе результаты могут объясняться сближением триптофановых остатков с группами-тушителями в составе белков (например, с цистеиновыми остатками) (Демченко, 1988).
Анизотропия флуоресценции
Поляризация или анизотропия излучаемого флуорофором света может свидетельствовать о его скорости вращательной диффузии, а, следовательно, о вязкости микроокружения или взаимодействии с макромолекулами. При изучении закономерностей функционирования ферментов в вязких и особенно гелеобразных средах часто возникает проблема измерения величины микровязкости окружения, в котором протекают исследуемые реакции. Это вызвано тем, что макровязкость растворов биополимеров, измеряемая стандартным способом с помощью визкозиметра, определяется прежде всего размерами макромолекул, тогда как микровязкость зависит от взаимодействия небольших сегментов соседних молекул (Кузьмин и Кузьмина, 1987). С этой точки зрения более подходящим способом измерения микровязкости является флуоресцентный метод, основанный на явлении анизотропии флуоресценции. Среди реагентов биолюминесцентной реакции бактерий имеется флуоресцирующее в видимой области низкомолекулярное соединение, которое может играть роль естественного зонда на вязкость – это молекула ФМН. Калибровка данного зонда с помощью растворов глицерина и сахарозы описаны в п.1.3.5 отчета. Было получено значительное увеличение анизотропии флуоресценции ФМН в средах с высокой вязкостью (таблица 1.1.4, рис. 1.1.15).
Рисунок 1.1.15 - Зависимость анизотропии флуоресценции ФМН от вязкости
среды в присутствии разных концентраций глицерина и сахарозы.
Величины анизотропии флуоресценции триптофановых остатков в составе исследованных ферментов варьируют в диапазоне 0,05-0,09 (рис.1.1.16). Низкая величина анизотропии флуоресценции белков, полученная в данной работе, говорит о малом вкладе в деполяризацию вращения белковой глобулы как целого (Демченко, 1988). Согласно литературным данным, даже для вращения триптофана в воде анизотропия флуоресценции приблизительно равна 0,14 (Lee, 1993). Поэтому, очевидно, низкая величина анизотропии флуоресценции люциферазы и оксидоредуктазы свидетельствует о сокращении излучательного времени жизни флуоресцентного состояния триптофанов в их составе. Не смотря на спрятанность триптофановых остатков внутри белковой глобулы, на которую указывает положение спектров люминесценции, их анизотропия флуоресценции чувствительна к вязкости среды. Это может быть следствием конформационных изменений ферментов, приводящих к увеличению локальной микровязкости окружения триптофанов и/или к сокращению времени жизни флуоресцентных состояний. Интересным фактом является относительно высокое значение анизотропии флуоресценции ферментов при сравнительно низких использованных концентрациях желатина. Также наблюдается отсутствие изменение анизотропии флуоресценции ФМН и редуктазы в средах, содержащих крахмал. Увеличившись при концентрации 0,5% до определенного предела по сравнению с буферным раствором, анизотропия этих веществ практически не меняется даже когда концентрация крахмала вырастает в 10 раз. Учитывая отсутствия изменений в спектрах компонентов в данном случае, можно предположить, что влияние на анизотропию флуоресценции ферментов в присутствии крахмала оказывает затруднение вращения белка как целого.
Рисунок 1.1.16. Анизотропия флуоресценции ФМН, бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в разных средах.
Таким образом, установлено, что компоненты вязких сред оказывают влияние, главным образом, на интенсивность флуоресценции ферментов и ФМН. Спектры флуоресценции белков свидетельствуют об экранировке триптофановых остатков в их составе белковой матрицей от полярных молекул растворителя. Зарегистрирован гипсохромный сдвиг приблизительно на 5 нм спектров флуоресценции люциферазы в растворе глицерина и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в растворе сахарозы, что может быть вызвано конформационными изменениями данных белков. Полученное возрастание анизотропии флуоресценции ферментов с увеличением вязкости среды свидетельствует о том, что часть триптофановых остатков в их составе находится на поверхности и подвержена влиянию растворителя. Обнаружено, что наименьшее влияние при исследованных концентрациях на компоненты биолюминесцентной реакции оказывает картофельный крахмал.
1.2. Сравнительный анализ физико-химических характеристик растворимых ферментов и ферментов, иммобилизованных совместно с субстратами
В работе проведено сравнение кинетических и термодинамических характеристик растворимой и иммобилизованной в полимерные гели различной природы биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с целью выбора метода получения стабильного и высокоактивного реагента для биолюминесцентного анализа.
1.2.1 Сравнение субстратной специфичности растворимой и иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза
На рис. 1.2.1 представлены зависимости интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от концентрации субстратов в координатах Иди-Хофсти. Рассчитанные кажущиеся константы Михаэлиса для растворимой и иммобилизованной биферментной системы представлены в Табл. 1.2.1.
В результате иммобилизации биферментной системы происходит увеличение кажущихся констант Михаэлиса для всех трех субстратов по сравнению с растворимыми ферментами. Однако для ферментов, иммобилизованных в крахмальный гель, увеличение Km каж для ФМН и НАДН происходит в 2 и 2,5 раза, соответственно. Для ферментов, иммобилизованных в желатиновый гель, изменения Km каж по сравнению с растворимой биферментной системой является более существенным: Km каж увеличивается в 4 и 5 раз для ФМН и НАДН, соответственно. Для тетрадеканаля наблюдалось увеличение Km каж в 4 и 6 для ферментов, иммобилизованных в желатиновый и крахмальный гели, соответственно.
Увеличение Km каж для иммобилизованных ферментов можно объяснить тем, что в процессе иммобилизации ферментов происходит ограничение конформационной лабильности белковых молекул, отражающееся в скорости каталитического акта. Это ограничение усугублялось фактом совместной иммобилизации 2 ферментов. Субстратом для люциферазы являлся продукт реакции, катализируемый оксидоредуктазой - ФМНН2, который является крайне нестойким соединением и быстро окисляется кислородом воздуха до ФМН.
а) ФМН, б) НАДН, в) миристиновый альдегид. 1 - растворимые R+L; 2 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель; 3 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель
Рисунок 1.2.1 - Зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от концентрации субстратов в координатах Иди-Хофсти.
Таблица 1.2.1.
Значения кажущихся констант Михаэлиса для биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза
Субстраты Биферментная система | Km каж (мг/мл) | |||
| ФМН | НАДН | Тетрадеканаль | ||
| Растворимые R+L | (0,6 ± 0,1) x 10-3 | (3,4 ± 0,7) x 10-2 | (0,18 ± 0,04) x 10-6 | |
| R+L, иммобилизованные в крахмальный гель | (1,3 ± 0,3) x 10-3 | (9,0 ± 1,8) x 10-2 | (1,2 ± 0,2) x 10-6 | |
| R+L, иммобилизованные в желатиновый гель | (2,8 ± 0,6) x 10-3 | (17,9 ± 3,5) x 10-2 | (0,7 ± 0,1) x 10-6 | |
Еще одной причиной снижения сродства субстратов к ферментам является то, что в структуре матрикса оказываются иммобилизованными не только комплексы люциферазы и оксидоредуктазы, но и сами эти ферменты по отдельности. В этом случае увеличение констант Михаэлиса происходит в результате диффузионных ограничений, возникающих при доставке ФМНН2 между пространственно разнесенными в геле ферментами.
1.2.2 Влияние физических и химических факторов на активность растворимой и иммобилизованной биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза – люцифераза
Показано, что иммобилизация изменяет свойства ферментов, в том числе зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, влияет на стабильность ферментов по отношению к денатурирующим воздействиям различного рода. На рисунке 1.2.2 представлена рН-зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза. Видно, что рН-оптимум растворимых ферментов составлял 6,8, при этом для всех иммобилизованных ферментов наблюдался сдвиг рН-оптимума в щелочную область. В то же время, для иммобилизованной в крахмальный гель биферментной системы интенсивность свечения составляла не менее 80% по отношению к максимуму активности во всем рассмотренном диапазоне значений рН, а рН-оптимум находился в диапазоне от 5,8 до 7,8. Для многокомпонентного реагента, иммобилизованного в желатиновый гель, рН-оптимум был более узким и располагался в диапазоне рН 6,6 - 7,3.
1 - растворимые R+L; 2 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель; 3 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель совместно с НАДН и альдегидом; 4 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель; 5 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель совместно с НАДН и альдегидом
Рисунок 1.2.2 - рН - зависимость нормированной интенсивности свечения биферментной системы светящихся бактерий:.
Подобное влияние рН на активность иммобилизованных ферментов можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, заряженные группы носителя для иммобилизации могут влиять на распределение протонов в микроокружении иммобилизованных ферментов. Этот эффект должен быть заметным для ферментов, иммобилизованных в желатиновый гель, имеющий заряженные группы. В случае иммобилизации ферментов в крахмальный гель слабая зависимость активности биферментной системы от рН объясняется электронейтральностью носителя. Во-вторых, полимерная матрица, увеличивая вязкость среды, препятствует свободной диффузии протонов внутри иммобилизованного фермента и тем самым вызывает существенное изменение рН–зависимости активности, что особенно заметно с возрастанием рН, т.е. при уменьшении концентрации протонов в растворе. Кроме того, возможно сочетание эффектов распределения протонов и ограничения их диффузии. Расширение рН–оптимума для многокомпонентного иммобилизованного реагента, вероятно, обусловлено дополнительной стабилизацией молекул ферментов вследствие встраивания субстратов в активные центры ферментов в процессе иммобилизации.
Нами также исследовано действие температуры на активность биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза. Иммобилизованные препараты ферментов сохраняли высокую каталитическую активность при действии температур во всем рассмотренном диапазоне. Для препаратов ферментов, иммобилизованных в крахмальный гель, интенсивность свечения составляла не менее 60% от максимальной, а для препаратов ферментов, иммобилизованных в желатиновый гель, - не менее 50% (рис. 1.2.3).
1 - растворимые R+L; 2 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель; 3 - R+L, иммобилизованные в крахмальный гель совместно с НАДН и альдегидом; 4 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель; 5 - R+L, иммобилизованные в желатиновый гель совместно с НАДН и альдегидом.
Рисунок 1.2.3 - Зависимость нормированной интенсивности свечения
биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктазы-люциферазы от температуры инкубирования.
Для растворимой биферментной системы при инкубировании в диапазоне температур от 15 до 300С сохранялось не менее 60% активности от максимальной, в то время как полная инактивация ферментов происходила уже при температуре 400С. Для растворимой биферментной системы температурный оптимум активности, при котором интенсивность свечения препаратов ферментов была максимальной, находился в пределах 20-250С. Для иммобилизованных ферментов и ферментов, иммобилизованных совместно с тетрадеканалем и НАДН, наблюдалось расширение температурного оптимума: для препаратов, иммобилизованных в крахмальный гель, до диапазона 5-500С, для препаратов, иммобилизованных в желатиновый гель, - до 15-500С. Увеличение термостабильности ферментов при их иммобилизации объясняется уменьшением подвижности ферментов и их субъединиц в матриксе геля.
Таким образом, иммобилизация в полимерные гели приводит к стабилизации биферментной системы, однако эффект стабилизации уменьшается при увеличении температуры. Эффективные значения энергии активации (Ed) для растворимой и иммобилизованной биферментной системы представлены в таблице 1.2.2.
Таблица 1.2.2.
Значения Ed (кДж/M) для биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-
люцифераза
| Растворимые R+L | R+L | R+L+С14+НАДН | R+L | R+L+С14+НАДН |
| Иммобилизованные в желатиновый гель | Иммобилизованные в крахмальный гель | |||
| 201 ± 39 | 79 ± 18 | 162 ± 33 | 30 ± 7 | 129 ± 28 |
Из таблицы 1.2.2 видно, что значения энергии активации для иммобилизованных ферментов меньше по сравнению с энергией активации растворимых ферментов. По-видимому, в случае иммобилизованных препаратов ферментов не наблюдается больших изменений свободной энергии по причине ужесточения конформации белков и ограничения их подвижности в иммобилизованном состоянии. Таким образом, образовавшийся в процессе иммобилизации комплекс белок-матрица, термодинамически становится более выгодным. Значения энергии активации для многокомпонентных систем оказываются больше, чем для ферментов, иммобилизованных без субстратов, в случае как крахмального, так и желатинового гелей. Это означает, что совместная иммобилизация ферментов и субстратов не приводит к дополнительной стабилизации ферментов, что выявляется в экспериментах по термоинактивации. Среди рассмотренных реагентов самой термодинамически стабильной является биферментная система, иммобилизованная в крахмальный гель, поскольку она характеризуется наименьшей энергией активации.
При сравнении свойств ферментов, иммобилизованных в гели разной природы, выяснилось, что при использовании желатинового геля выход активности существенно ниже, а значения Km каж для ФМН и НАДН и величина энергии активации более высокие, чем в случае крахмального геля. Так как единственным отличием в условиях иммобилизации биферментной системы была природа используемого геля, то это, на наш взгляд, в первую очередь связано с различиями в физико-химических характеристиках и природе гелеобразующих полимеров. Крахмальный гель является химически нейтральным, и сохранение в нем высокой активности ферментов, вероятно, объясняется отсутствием ковалентных связей с активными группами включенных в него ферментов. В отличие от крахмала, желатин является полипептидом, содержащим значительное количество как полярных аминокислотных остатков (например, глицин и гидроксипролин, составляющие 30-35% и 10 % от общего состава аминокислотных остатков), так и гидрофобных аминокислотных остатков (например, пролин и аланин, каждый из которых составляет более 10 % от общего состава аминокислотных остатков) (Джеймс, 1980), которые способны образовывать водородные, гидрофобные и другие связи с молекулами оксидоредуктазы и люциферазы. Кроме того, в процессе студнеобразования между -цепями, формирующими молекулы желатина, происходит образование множества вторичных поперечных связей (преимущественно водородных), а также формируются коллагено-подобные спиральные конгломераты между несколькими цепями полипептидов (Джеймс, 1980). Так как включение ферментов в желатиновый гель проводится непосредственно в момент студнеобразования, это, по-видимому, может привести к частичной деформации конформации белков и, как следствие этого, к снижению их активности.
Итак, при сравнении кинетических и термодинамических характеристик растворимой и иммобилизованной в полимерные гели биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза было показано, что иммобилизация в крахмальный и желатиновый гели приводит к значительной стабилизации биферментной системы по отношению к денатурирующим воздействиям при сохранении высокой активности ферментов, что указывает на возможность получения стабильного и высокоактивного реагента для биолюминесцентного анализа с использованием этих методов. Таким образом, показано, что экспериментальная модель ЭМкрахмал имеет лучше характеристики чем ЭМжелатин. Однако при использовании других типов желатина возможно найти условия, в которых бы желатиновая модель имела преимущества.
1.3 Разработка 4 прототипов экспериментальных моделей функционирования ферментов внутри клетки.
Для решения фундаментальной задачи понимания механизмов сопряжения и функционирования ферментативных метаболических цепей в клетке создано несколько вариантов экспериментальных моделей (ЭМ), в которых реконструирована цепь сопряжения двух ферментов светящихся бактерий (люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы) в микроокружении, отличающемся разной вязкостью. Разработаны следующие прототипы экспериментальных моделей:
1).ЭМсахароза. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза – люцифераза осуществляется в среде, вязкость которой меняется в зависимости от содержания сахарозы.
2).ЭМглицерин. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза осуществляется в среде, вязкость которой меняется в зависимости от содержания глицерина.
3).ЭМкрахмал. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза одна или вместе с субстратами и другими необходимыми для биолюминесценции компонентами иммобилизована в крахмальный гель.
4).ЭМжелатин. Биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза иммобилизована в желатиновый гель вместе с субстратами и другими необходимыми для биолюминесценции компонентами.
В моделях имитируется вязкое микроокружение ферментов в матриксе путем введения растворов сахарозы и глицерина, а также связь с мембранными структурами путем иммобилизации в крахмальный и желатиновый гели.
Оценку эффективности каждой модели проводили, измеряя активность биолюминесцентной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза –люцифераза. Для всех четырех типов экспериментальных моделей проведено исследование характеристик биолюминесценции биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, функционирующей в условиях различной вязкости, и биферментной системы, иммобилизованной в гели различных концентраций. Для обеспечения различных условий микроокружения использовались растворы сахарозы, глицерина, желатина и крахмала различных концентраций, что позволяло создавать микроокружение для ферментов с наперед заданными физико-химическими свойствами (гидрофобность, диэлектрическая проницаемость, вязкость, донорно-акцепторные свойства и др.). Полученные экспериментальные результаты позволяют выявить слабые и сильные стороны каждой из экспериментальных моделей и провести усовершенствование экспериментальных моделей, в том числе и с подключением методов математического моделирования, что в конечном итоге необходимо для выяснения разницы в условиях функционирования люциферазы в клетке и в растворе.
В работе проводили выбор оптимального соотношения компонентов биолюминесцентных реакций в 4 прототипах экспериментальных моделей (ЭМглицерин, ЭМсахароза, ЭМкрахмал, ЭМжелатин), позволяющих улучшить характеристики биолюминесцентной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза по сравнению с растворимыми системами. Были проведены следующие исследования:
Исследованы кинетические параметры биолюминесцентной биферментной системы при варьировании вязкости реакционной среды путем введения в реакционную смесь органических растворителей (глицерина и сахарозы) или гелевых растворов разной природы (крахмального и желатинового);
Исследованы кинетические параметры биолюминесценции биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при варьировании вязкости и pH реакционной среды.
Изучено влияние температуры на кинетические параметры биферментного комплекса в условиях различной вязкости.
1.3.1 Подбор условий оптимизации экспериментальных моделей ЭМглицерин и ЭМсахароза
Оптимизация микроокружения для биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза была достигнута за счет подбора соответствующих реакционных сред, отличающихся концентрациями органических растворителей, а также за счет вариьрования таких физико-химических характеристик реакционной среды как температура и рН в условиях различной вязкости.
Для достижения поставленной цели исследовалось влияние глицерина и сахарозы на кинетические параметры сопряженной ферментной системы НАД(P)H:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при направленном изменении физико-химических характеристик реакционной среды.
Показано, что органические растворители, которые повышают вязкость реакционной среды, - глицерин и сахароза ингибируют интенсивность свечения биолюминесценции при всех исследуемых значениях рН, но в разной степени. Интенсивность свечения бактериальной биолюминесцентной реакции уменьшается с увеличением концентрации сахарозы при всех исследованных значениях рН. Изменение рН реакционной среды приводит к уменьшению интенсивности свечения по отношению к контролю при всех исследованных концентрациях как сахарозы, так и глицерина. Наибольший инактивирующий эффект в присутствии сахарозы имеет рН реакционной среды 5,8, в присутствии глицерина - 7,84.
На рисунках 1.3.1 – 1.3.4 представлены зависимости интенсивности свечения биферментной биолюминесцентной системы при значениях рН = 5,8; 6,4; 6,9; 7,3; 7,8 от вязкости, различные значения которой получены путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы (используемые концентрации органических растворителей: сахарозы: 0,06 М; 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М; 4,06 М и глицерина: 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,43 М; 8,15 М).
1- глицерин; 2- сахароза
Рисунок 1.3.1 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 5,8 от вязкости реакционной среды.
Интенсивность свечения, которая характеризует скорость ферментативной биолюминесцентной реакции, при значении рН 5,8 линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды при введении глицерина в реакционную среду (рис. 1.3.1, прямая 1), тогда как при использовании сахарозы для достижения аналогичных значений вязкости в реакционной среде зависимость интенсивности свечения от вязкости не является линейной (рис. 1.3.1, кривая 2). Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от вязкости реакционной среды для сахарозы и глицерина, не совпадают: значения интенсивности свечения в глицерине значительно выше по сравнению с этими же параметрами при той же самой вязкости в сахарозе.
Таким образом, при рН 5,8 реакционной среды увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной реакции приводит к уменьшению интенсивности свечения биферментной биолюминесцетной бактериальной реакции как в глицерине, так и сахарозе. Результаты показали, что природа растворителя является важным фактором, определяющим изменение интенсивности свечения биолюминесценции, поскольку эти растворители не только в разной степени оказывают ингибирующее действие на активность сопряженной биолюминесцентной ферментативной системы, но и характер этого ингибирования существенно отличается (глицерин линейно уменьшает интенсивности свечения, тогда как сахароза – нет) при значении рН 5.8. Из рисунка 1.3.1 видно, что при рН 5,8 реакционной среды сахароза является более сильным ингибитором по сравнению с глицерином. В свою очередь глицерин является лучшим стабилизатором по сравнению с сахарозой при увеличении вязкости реакционной среды до значения 4 мПас.
На рисунке 1.3.2 представлена зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 6,4 от вязкости реакционной среды.
Интенсивность свечения при рН 6.4 линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как при введении органического растворителя глицерина, так и сахарозы (рис. 1.3.2). Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от вязкости реакционной среды для сахарозы и глицерина не совпадают: значения интенсивности свечения в сахарозе значительно выше по сравнению с этими же параметрами при той же самой вязкости в глицерине, но сахароза лучше предохраняет биферментную биолюминесцентную систему от инактивации по сравнению с глицерином при увеличении вязкости реакционной среды во всем измеренном диапазоне значений вызкости. Результаты показали, что при рН 6,4 природа растворителя является важным фактором, определяющим изменение интенсивности свечения биолюминесценции.
Интенсивность свечения, которая характеризует скорость ферментативной биолюминесцентной реакции, линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как при введении органического растворителя - глицерина, так и сахарозы (рис. 1.3.3) в стандартных условиях (при рН 6.9) также. Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от концентрации как сахарозы, так и глицерина, практически совпадают: значения интенсивности свечения находятся в пределах ошибки измерения. Таким образом, при нейтральных значениях pH реакционной среды природа растворителя не является фактором, определяющим изменение интенсивности биолюминесценции. Таким образом, интенсивность свечения линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН.
1- сахароза; 2- глицерин
Рисунок 1.3.2 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 6,4 от вязкости реакционной среды.
На рисунке 1.3.4 представлена зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 7,3 от вязкости реакционной среды. Интенсивность свечения ферментативной биолюминесцентной реакции линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как при введении глицерина, так и сахарозы (рис. 1.3.4). Зависимости интенсивности биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы от концентрации как сахарозы, так и глицерина, практически совпадают: значения интенсивности свечения находятся в пределах ошибки измерения. Таким образом, при рН 7,3 увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной реакции является важным физико-химическим фактором, изменение интенсивности свечения линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и не зависит от природы используемого растворителя при этом значении рН
1- сахароза; 2- глицерин
Рисунок 1.3.3 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,9 от вязкости реакционной среды.
.
1- сахароза; 2- глицерин
Рисунок 1.3.4 - Зависимость интенсивности свечения биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН = 7,3 от вязкости реакционной среды.
Аналогичные результаты получены и при pH 7,9 реакционной среды для бактериальной биолюминесценой реакции.
Таким образом, интенсивность свечения уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при больших значения рН, начиная с нейтрального рН.
Максимальный ингибирующий эффект при всех значениях вязкости для всех исследуемых концентрациях сахарозы и глицерина наблюдается при рН=5.8. Остальные исследуемые значения рН вносят незначительный вклад в ингибирование биолюминесценции в диапазоне значений вязкости не превышающим 4 мПас.
Органические растворители оказывают существенное влияние не только на интенсивность светоизлучения биферментной биолюминесцентной системы, но и на константу спада биолюминесценции (kcn), которая характеризует скорость распада долгоживущего интермедиата.
На рисунках 1.3.5 – 1.3.7 представлены зависимости константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при рН 5,8; рН 6,4; рН 6,9; рН 7,3; рН 7,8 от вязкости, различные значения которой получены путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы (используемые концентрации органических растворителей: сахарозы: 0,06 М; 0,51 М; 1,01 М; 2,03 М; 4,06 М и глицерина: 0,91 М; 1,09 М; 2,72 М; 5,43 М; 8,15 М).
Рисунок 1.3.5 представляет зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при рН 5.8 от вязкости реакционной среды, из которого видно, что при одних и тех же значениях вязкости реакционной среды и фиксированном значении рН, константа спада биолюминесценции имеет отличающиеся значения в глицерине и сахарозе, что говорит о существенном влиянии природы растворителя на этот кинетический параметр.
Согласно результатам, представленным на рис. 1.3.5 показано, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина - в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы при рН 5.8 приводит в конечном итоге к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы, но в разной степени.
1 - сахароза; 2- глицерин
Рисунок 1.3.5 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН = 5.8 от вязкости реакционной среды.
Следует отметить, что сахароза оказывает небольшой активирующий эффект на константу спада биолюминесценции при значении вязкости 3 мПа.с (рис. 1.3.5, кривая 1). В глицерине же уменьшение константы спада происходит по линейному закону (рис. 1.3.5, прямая 2). Полученные результаты показали, что при рН 5.8 увеличение вязкости реакционной среды при введении как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в глицерине стабилизация наблюдается в большой степени (рис. 1.3.5, прямая 2). Аналогичные результаты плучены при рН=7.3.
Рисунок 1.3.6 представляет зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН 6.4 от вязкости реакционной среды, из которого видно, что при одних и также значения вязкости реакционной среды и фиксированном значении рН, константы спада биолюминесценции имеют близкие значения и в глицерине, и в сахарозе, возможно, из-за влиянии природы растворителя на этот кинетический параметр.
1- сахароза; 2- глицерин
Рисунок 1.3.6 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН = 6.4 от вязкости реакционной среды.
Полученные результаты показали, что увеличение вязкости реакционной среды при введении, как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем при рН 6.4 в сахарозе стабилизация наблюдается в большой степени. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы.
Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при рН 6,9 от вязкости реакционной среды представлена на рис. 1.3.7. Эксперименты показали, что присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина - в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с увеличением концентрации глицерина и сахарозы.
1- сахароза; 2- глицерин
Рисунок 1.3.7 - Зависимость константы спада биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,9 от вязкости реакционной среды.
Константа спада биферментной биолюминесцентной системы, которая характеризуется скоростью распада долго живущего интермедиата, уменьшается с увеличением вязкости, как при введении глицерина, так и сахарозы. Максимальное уменьшение kcn наблюдается при введении в реакционную смесь глицерина: константа спада биолюминесценции уменьшается практически на 80% в 6М глицерине, тогда как при введении сахарозы kcn уменьшается всего на 20% в 8M сахарозе. Существенное влияние на изменение константы спада оказывает, по-видимому, природа растворителя. Из рис. 1.3.7 видно, что введение в реакционную смесь увеличивающихся концентраций глицерина приводит к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата, тогда как использование в качестве растворителя для реакционной среды буферно-сахарозных смесей не приводит к существенному увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата.
Эксперименты показали, что при рН 6,9 присутствие возрастающих концентраций органических растворителей - сахарозы и глицерина - в реакционной среде биферментной биолюминесцентной системы приводит к стабилизации возбужденного интермедиата реакции. То есть, скорость распада фермент-субстратных комплексов монотонно изменяется с ростом доли органического компонента в реакционной среде: увеличивается с возрастанием концентрации глицерина и сахарозы. Аналогичные результаты получены и для рН 7.8.
Полученные результаты показали, что увеличение вязкости реакционной среды при введении как глицерина, так и сахарозы приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции при значении рН = 6,9 и рН = 7.8, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в сахарозе стабилизация наблюдается в большой степени. Полученные результаты показали, что при рН 7.8 увеличение вязкости реакционной среды при введении глицерина приводит к уменьшению константы спада биолюминесценции, а значит, к увеличению времени жизни долгоживущего интермедиата биолюминесцентной сопряженной системы, то есть к его стабилизации, причем в глицерине стабилизация наблюдается в большой степени, тогда как в сахарозе стабилизации практически не наблюдается.
Исследование влияния рН на квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы в условиях различной вязкости показало, что квантовый выход с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН, за исключением рН 6.4, где наблюдается небольшое увеличение квантового выхода (рис. 1.3.8).
Увеличение вязкости биферментной биолюминесцентной системы путем введения органического растворителя - сахарозы приводит к увеличению испускания числа квантов, примерно в 1,5 раза, за счет стабилизации долгоживущего интермедиата (рис. 1.3.8). При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему глицерина квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 20%. Таким образом, при рН 6,4 увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения сахарозы приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение глицерина существенно не изменяет квантовый выход биолюминесценции. Можно предположить, что значение рН 6,4 стабилизирует квантовый выход в глицерине и способствует его возрастанию в сахарозе.
1 - сахароза; 2- глицерин
Рисунок 1.3.8 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,4 от вязкости реакционной среды.
На рисунке 3.1.9 представлена зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при значении рН 6,9 от вязкости путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы. Увеличение вязкости биферментной биолюминесцентной системы путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, примерно в 2 раза, за счет стабилизации долгоживущего интермедиата (рис. 1.3.9). При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему сахарозы квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 20%.
На рисунке 1.3.10 представлена зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при рН 7,3 от вязкости путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы. Увеличение вязкости биферментной биолюминесцентной системы путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, примерно в 2 раза, за счет стабилизации долгоживущего интермедиата (рис. 1.3.10). При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему сахарозы квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 40%.
1- глицерин; 2- сахароза
Рисунок 1.3.9 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 6,9 от вязкости реакционной среды.
1- глицерин; 2- сахароза
Рисунок 1.3.10 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 7,3 от вязкости реакционной среды.
На рисунке 1.3.11 представлена зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной реакции при рН 7,9 от вязкости путем введения органических растворителей: глицерина и сахарозы. При введении в реакционную биферментную биолюминесцентную систему сахарозы квантовый выход биолюминесценции уменьшается на 60%.
1- глицерин; 2- сахароза
Рисунок 1.3.11 - Зависимость квантового выхода биолюминесценции биферментной биолюминесцентной системы при значении рН 7,9 от вязкости реакционной среды.
Для подбора условий (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации и термоинактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo, были проведены эксперименты по изучению кинетических параметров бактериальной биолюминесцентной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин при разных температурах.
Исследование влияния вязкости среды на интенсивность свечения биферментной системы показало, что введение увеличивающихся концентраций сахарозы и глицерина в реакционную среду в конечном итоге приводит к уменьшению интенсивности свечения.
Квантовый выход биферментной биолюминесцентной реакции с увеличением концентрации сахарозы уменьшается при всех значениях рН. Изменение рН (как увеличение, так и уменьшение по отношению к контролю) приводит к уменьшению испускания квантов.
Квантовый выход биферментной биолюминесцентной системы при введении глицерина не изменяется в кислой среде и увеличивается в щелочной, по сравнению с контрольным.
Таким образом, увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы не изменяет существенно квантовый выход.
Таким образом, в ходе экспериментального изучения кинетических параметров работы ферментов в вязких растворах сахарозы и глицерина и в буферном растворе с низкой вязкостью при изменении рН были получены следующие основные результаты:
1). Подобраны условия (рН, вязкость и другие физико-химические характеристики микроокружения ферментов биолюминесценой системы), при которых не происходит инактивации биферментной системы в экспериментальных моделях ЭМсахароза и ЭМглицерин и сохраняется высокая субстратная специфичность ферментов, что наилучшим образом отвечает условиям работы ферментов in vivo.
2). Получены результаты, которые позволят варьировать условиями реакционной среды (рН, вязкости) для увеличения интенсивности свечения и квантового выхода биолюминесцентной реакции, приводящие в конечном итоге к увеличению чувствительности биолюминесцентного анализа. В частности, исследование влияния вязкости и рН реакционной среды на биферментную биолюминесцентную бактериальную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза показало, что увеличение вязкости реакционной среды для биолюминесцентной биферментной бактериальной реакции приводит к уменьшению максимального значения интенсивности свечения и константы спада при различных значениях рН, а значения рН–оптимума изменяются только в присутствии в реакционной среде высоких концентраций глицерина и сахарозы.
3) Интенсивность свечения биолюминесценции линейно уменьшается с увеличением вязкости реакционной среды, как в глицерине, так и в сахарозе, и практически не зависит от природы используемого растворителя при нейтральном значении рН. Увеличение вязкости реакционной среды биферментной биолюминесцентной реакции путем введения глицерина приводит к увеличению испускания числа квантов, тогда как введение сахарозы существенно не изменяет квантовый выход биолюминесценции.
4). Предложены объемные пропорции компонентов реакционной среды, влияющих на активный центр люциферазы и характер связи субстратов с ферментом. В частности, в экспериментальной модели ЭМглицерин стабилизация возбужденного интермедиата происходит в большей степени при увеличении вязкости реакционной среды, чем в модели ЭМсахароза.
1.3.2 Подбор условий оптимизации экспериментальных моделей ЭМкрахмал и ЭМжелатин
Ранее в экспериментальных моделях ЭМкрахмал и ЭМжелатин осуществляли выбор оптимального по вязкости микроокружения для фермент-субстратных комплексов. С этой целью изучали эффективность работы люциферазы (Л) и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы (Р) в гелевом окружении различной вязкости и имеющем различную химическую природу.
Рассматривали два варианта стабилизации ферментов в экспериментальных моделях ЭМкрахмал и ЭМжелатин: в первом случае были иммобилизованы только НАДН:ФМН-оксидоредуктаза и люцифераза, во втором, проводили совместную иммобилизацию ферментов вместе с субстратом и кофактором – алифатическим альдегидом (C14) и НАДН.
В ходе эксперимента были исследованы характеристики биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза–люцифераза (Л+Р), иммобилизованной в гели, приготовленные из картофельного, рисового и кукурузного крахмалов и желатина различных концентраций. Показано, что выход активности иммобилизованных в гели ферментов зависит от вязкости среды и природы используемого полимерного геля (табл. 1.3.1).
Максимальная активность наблюдалась у биферментной системы Л+Р, иммобилизованной в 3 % гель на основе картофельного крахмала. Максимальный выход активности ферментов, иммобилизованных в крахмальный гель, составил 60 %.
В желатиновом геле эффективность работы биферментной системы существенно ниже по сравнению с крахмальным гелем. Присутствие желатина даже в низких концентрациях (0,1 % и 0,05 %), соответствующих значениям вязкости живых клеток, вызывает существенное снижение активности биферментной системы: по сравнению с буферным раствором в выбранных модельных средах интенсивность свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза уменьшается в 3 раза, хотя спектральные характеристики биферментной системы не изменялись. Максимальный выход активности биферментной системы, иммобилизованной в желатиновый гель и предварительно высушенной в течение 8 часов на лавсановой пленке, наблюдался при использовании 4 % желатинового геля и составил около 17 % (табл. 1.3.1).
Таблица 1.3.1.
Выход активности биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза- люцифераза иммобилизованной в крахмальный и желатиновый гели.
| Носитель для иммобилизации биферментной системы | Концентрация геля, % | ||||
| 3 | 3,5 | 4 | 5 | 6 | |
| Выход активности биферментной системы, % | |||||
| Картофельный крахмал | 60 | 44 | 25 | 18 | - |
| Рисовый крахмал | 51 | - | 32 | 22 | - |
| Кукурузный крахмал | 17 | - | 26 | 14 | - |
| Желатин | - | - | 17 | 7 | 6 |
«-» - измерения не проводили
Для улучшения характеристик биолюминесцентной биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза по сравнению с растворимыми системами осуществляли выбор оптимального соотношения компонентов биолюминесцентных реакций в прототипах экспериментальных моделей ЭМкрахмал и ЭМжелатин. С этой целью варьировали содержание ферментов в иммобилизованных дисках. Измерения активности иммобилизованных препаратов ферментов, предварительно высушенных в течение 8 часов при температуре 40С, сравнивали с активностью растворимых ферментов, используемых в качестве контрольных образцов. Количество люциферазы в растворе и иммобилизованном реагенте одинаково для каждого отдельного опыта.
Уменьшение содержания люциферазы в дисках или растворе приводит к существенному снижению максимальной интенсивности свечения (Табл. 1.3.2). Максимальный выход активности иммобилизованных ферментов - 60 % - достигался при содержании люциферазы в диске 0,33 мкг. Минимальное содержание люциферазы, при котором наблюдалось значительное по сравнению с фоновым свечение биферментной системы, составило 0,2 мкг.
Таблица 1.3.2.
Зависимость параметров биолюминесценции биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза в ЭМкрахмал от содержания люциферазы
| Содержание люциферазы, мкг | I макс, усл.ед. | Выход активности, % | |
| Л+Р Растворимые | Л+Р ЭМкрахмал | ||
| 0,33 | 480420 ± 36618 | 290411±28628 | 60 |
| 0,24 | 444048 ± 58811 | 42587 ± 18919 | 9,6 |
| 0,2 | 348526 ± 49150 | 22728 ± 1623 | 6,5 |
Для улучшения характеристик ЭМкрахмал путем стабилизации работы ферментов исследовали зависимость параметров биолюминесценции иммобилизованных ферментов Л+Р от концентрации дитиотрейтола (ДТТ) и меркаптоэтанола, используемых в качестве стабилизаторов SН-групп ферментов. Активность ферментов, иммобилизованных совместно со стабилизаторами или без них, сравнивали с активностью растворимых ферментов в присутствии стабилизаторов или их отсутствии (контроль). Показано, что дополнительное внесение 10-4 М ДТТ увеличивает выход активности ферментов до 76 % (Табл. 1.3.3).
Таблица 1.3.3.
Зависимость параметров биолюминесценции биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза в ЭМкрахмал от содержания стабилизаторов
| Концентрация, стабилизатор | I макс, усл.ед. | Выход активности, % | |
| Растворимые Л+Р | Л+Р ЭМкрахмал | ||
| - | 38832 ± 4264 | 22728 ± 1623 | 58,5 |
| 10-4, ДТТ | 50583 ± 12291 | 38498 ± 4820 | 76,1 |
| 10-5, ДТТ | 38533 ± 4507 | 15267 ± 776 | 39,6 |
| 10-4, меркаптоэтанол | 46885 ± 6999 | 33195 ± 539 | 70,8 |
| 10-5, меркаптоэтанол | 67020 ± 8067 | 20889 ± 1449 | 31,2 |
