«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение ...»
«-» - стабилизаторы не вносили
В дальнейшем оптимизацию ЭМкрахмал и ЭМжелатин проводили путем совместной иммобилизации ферментов и их субстратов.
Многокомпонентную иммобилизацию люциферазы и НАДН:ФМН- оксидоредуктазы со стабилизаторами и субстратами в 3 % крахмальный гель проводили, варьируя концентрацию НАДН и добавляя разные стабилизаторы ферментов в иммобилизованный реагент. В готовый крахмальный гель, непрерывно помешивая, добавляли последовательно растворы ферментов (КРАБ), тетрадеканаля, НАДН и раствор калий – фосфатного буфера, содержащий стабилизаторы ферментов. Количество ферментов и субстратов рассчитывали таким образом, чтобы количество люциферазы и стабилизаторов в одном диске соответствовало количеству люциферазы в растворе (контроль) при единичном измерении.
При использовании ферментов, иммобилизованных совместно с субстратами, реакционная смесь состояла из диска, раствора ФМН и буферного раствора. Количество люциферазы в растворе (контроль) и иммобилизованном реагенте одинаково и составило 0,2 мкг; концентрация тетрадеканаля в многокомпонентном иммобилизованном препарате составляла 0,0002 %; концентрации ДТТ или меркаптоэтанола - 10-4 М.
Рисунок 1.3.12 - Зависимость выхода активности биферментной системы от концентрации НАДН и стабилизаторов ферментов в многокомпонентном иммобилизованном препарате.
Лучший результат достигается при использовании дисков, содержащих совместно иммобилизованные ферменты и субстраты, и предварительно высушенные на лавсане. Без стабилизаторов выход активности составляет от 5 до 18 %, при добавлении ДТТ выход активности достигает 55 % (рис. 1.3.12).
Выход активности биферментной системы, иммобилизованной совместно с 10-4 М раствором меркаптоэтанола, практически не отличается от выхода активности биферментной системы, иммобилизованной без добавления стабилизаторов.
Время выхода свечения на максимум для многокомпонентного реагента существенно меньше, по сравнению с иммобилизованными ферментами: 20-110 с в зависимости от концентрации НАДН и используемого стабилизатора. Скорость падения интенсивности свечения многокомпонентного препарата не отличалась от таковой для растворимых ферментов.
Таким образом, в ходе работы были оптимизированы прототипы экспериментальных моделей Эмкрахмал и ЭМжелатин. Были подобраны оптимальные соотношения компонентов биолюминесцентных реакций в прототипах экспериментальных моделей. Многокомпонентный иммобилизованный препарат должен содержать 0,2 мкг люциферазы, концентрация тетрадеканаля в одном диске должна составлять 0,0002 %, концентрация НАДН - 210-4 М.
Оптимальным по вязкости микроокружением для фермент-субстратных комплексов следует признать 3 % крахмальный гель. Дополнительное внесение 10-4М ДТТ позволяет существенно увеличить выход активности биферментной системы Л+Р в экспериментальной модели ЭМкрахмал.
По-видимому, существенным фактором, снижающим эффективность работы ферментов в ЭМкрахмал и ЭМжелатин, является их предварительное высушивание. Окончательная экспериментальная модель функционирования ферментов в клетке на примере ферментов светящихся бактерий может быть получена при исключении из процедуры иммобилизации стадии высушивания геля.
1.3.3 Исследование механизмов влияния вязкости на ферментативные системы
Инактивация ферментов под влиянием температуры сопряжена со многими структурными изменениями молекулы. Следовательно, изменение каталитической активности ферментов в результате температурных воздействий может дать весьма полезную информацию для изучения тонких структурных изменений молекулы белка в процессе ее инактивации и денатурации, а также указать на механизмы стабилизации белковых молекул и эффективности функционирования ферментативных метаболических цепей в клетке.
В настоящее время установлено, что процессы со сложной кинетикой, отвечающей достаточно разнообразным механизмам, встречаются чаще, чем процессы инактивации по первому порядку (V(t) = V(0)exp(-kt), где V(t) – скорость реакции в момент времени t). Интересно, что даже для белков без четвертичной структуры инактивация, описываемая уравнением первого порядка, наблюдается далеко не при всех условиях.
На основании совокупности применения физических и кинетических методов можно указать, по крайней мере, на четыре кинетических типа инактивации ферментов.
- Необратимая инактивация первого порядка
Е Еден,
где Е и Еден соответственно каталитически активная и неактивная формы фермента. Процесс перехода между этими формами фермента в условиях данного кинетического эксперимента можно считать кинетически необратимым. Из графика, построенного в координатах уравнения первого порядка, легко вычислить константу скорости денатурации kд = tg (рис. 1.3.13 а).
- Инактивация по системе последовательных превращений первого порядка (рис.1.3.13 б)
Естаб Енестаб Еден.
- Инактивация по механизму последовательно-параллельных реакций первого порядка (Рис. 1.3.13, в).
Е Е’стаб Е”стаб
Еден Еден
- Диссоциативный механизм термоинактивации, учитывающий предварительный распад на субъединицы
Е2 2Е1 Еден,
где Еден – продукт необратимого изменения субъединиц белка, а Е2 и Е1 соответственно димерная и мономерная формы. Поскольку диссоциативный процесс в данном случае второго порядка, кинетические кривые термоинактивации не имеют протяженных строго линейных участков в координатах уравнения первого порядка, хотя иногда их можно представить как кривую с «изломом», фактически разделяющим две асимптоты к реальной кинетической кривой. Схематически это показано на рисунке 1.3.13, в.
Иммобилизация фермента может не изменять химический механизм термодеградации, но она влияет на кинетику процесса. Во-первых, могут измениться численные значения каталитических постоянных. Во-вторых, если каждая из субъединиц фермента независимо связана с носителем, то при диссоциации субъединицы оказываются локализованы в одном месте, что облегчает обратный процесс ассоциации. Простейшая кинетическая схема в этом случае имеет вид
Е2актив Е2неактив 2Еден.
а – необратимая инактивация первого порядка; б – инактивация по системе последовательных превращений первого порядка; в – инактивация по механизму последовательно-параллельных реакций первого порядка
Рисунок 1.3.13 - Кинетические кривые термоинактивации ферментов, соответствующие различным механизмам.
Еще одна весьма существенная характеристика фермента с точки зрения его практического применения – это его термостабильность. Как и другие химические процессы, ферментативные реакции ускоряются при повышении температуры. Однако с повышением температуры начинает заметно протекать процесс термоинактивации фермента, и наблюдаемая скорость ферментативной реакции падает. Именно этим обусловлен колоколообразный вид зависимости скорости большинства ферментативных процессов от температуры.
В результате химического присоединения к носителям повышается стабильность самых разных ферментов при использовании разнообразных носителей и методов пришивки. Надо полагать, что главной причиной стабилизации является образование связей между ферментом и носителем, причем степень стабилизации определяется количеством образованных связей. Таким образом, иммобилизация ферментов предоставляет новые возможности в их практическом применении.
В работе выявлены факторы, повышающие термостабильность ферментов, в том числе варьирование микроокружения путем изменения вязкости среды (добавлением гелей различной природы), внесением стабилизатора SH-групп ферментов (дитиотрейтола). Получены температурные зависимости констант инактивации ферментов в различном микроокружении, рассчитаны коэффициенты стабилизации биферментной системы по сравнению с контролем.
В ходе работы было исследовано влияние микроокружения на характеристики растворимой биолюминесцентной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН–оксидоредуктаза–люцифераза. Проведено сравнение кинетических и термодинамических характеристик биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза в присутствии буферного раствора, крахмального и желатинового гелей. Также исследовано изменение этих характеристик при добавлении в реакционную смесь стабилизатора ферментов дитиотрейтола. Методами спектрального анализа исследована зависимость скорости расходования НАДН в биолюминесцентных реакциях, катализируемых люциферазой и оксидоредуктазой, от микроокружения.
Термостабильность и термоинактивация биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в крахмальном геле
Интенсивность свечения биферментной системы НАДН:ФМН- оксидоредуктаза-люцифераза зависит от окружающей её среды. Для исследования термостабильности и термоинактивации биферментной системы в присутствии ДТТ и 2 % крахмального геля варьировали время предварительной инкубации ферментов (0,5-30 минут) при различных температурах (15-50°С).
Из рис. 1.3.14 и 1.3.15 видно, что при изменении микроокружения ферментов расширения температурного оптимума не происходит, однако наблюдается изменение его значения. Температурный оптимум сдвигается в область более высоких температур и составляет 33°С в крахмальном геле, и геле с добавлением ДТТ. Тот факт, что в крахмальном геле ферменты более активны при более высоких температурах, можно объяснить тем, что увеличение вязкости приводит к тому, что максимальная скорость реакции достигается при более высоких температурах.
а – контрольное измерение; б – контрольное измерение с добавлением ДТТ
Рисунок 1.3.14 – Зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от температуры при инкубации ферментов в буферном растворе в течение 0, 0,5, 1, 5, 10, 20, и 30 минут.
а – измерение в геле; б - измерение в геле с добавлением ДТТ
Рисунок 1.3.15 – Зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от температуры при инкубации ферментов в крахмальном геле в течение 0, 0,5, 1, 5, 10, 20, и 30 минут.
По тангенсу угла наклона зависимости максимальной интенсивности свечения биферментной системы от времени инкубации ферментов в гелевом растворе при различных температурах (Рис. 1.3.16) рассчитывали константы термоинактивации биферментной системы (Табл. 1.3.4).
а – 180С, б - 230С, в - 280С, г - 330С, д -380С, е - 430С
Рисунок 1.3.16 – Зависимость интенсивности свечения биферментной системы от времени инкубации ферментов с добавлением геля и ДТТ при различных температурах.
Из рис. 1.3.16 видно, что при температурах выше 350С зависимость интенсивности свечения биферментной системы светящихся бактерий от времени инкубации ферментов носит нелинейный характер. Этот эффект связан с тем, что при высоких температурах происходит термоинактивация второго порядка. Термоинактивация второго порядка означает, что реально протекают 2 процесса инактивации, предположительно это: денатурации ферментов и диссоциация люциферазы на отдельные субъединицы. В табл. 1.3.4 для температур выше 350С представлены значения констант термоинактивации для обоих процессов.
Таблица 1.3.4
Константы термоинактивации биферментной системы в 2% крахмальном геле и в присутствии ДТТ
| T, °С | k, мин-1 | |||||||
| Буфер | Буфер + ДТТ | Крахмальный гель | Крахмальный гель + ДТТ | |||||
| 18 | 0,04 | 0,035 | 0,028 | 0,01 | ||||
| 23 | 0,046 | 0,052 | 0,044 | 0,027 | ||||
| 28 | 0,064 | 0,056 | 0,059 | 0,02 | ||||
| 33 | 0,062 | 0,053 | 0,072 | 0,064 | ||||
| 38 | 0,645 | 0,014 | 1,529 | 0,004 | 1,32 | 0,007 | 1,633 | 0,007 |
| 43 | 0,53 | 0,101 | 0,482 | 0,081 | 1,161 | 0,008 | 0,922 | 0,005 |
Из табл. 1.3.4 видно, что при температурах менее 350С при добавлении ДТТ константа инактивации практически не меняется по сравнению с контрольным измерением. В то же время, крахмальный гель оказывает стабилизирующее действие на биферментную систему. Наибольший стабилизирующий эффект наблюдался при одновременном внесении в реакционную смесь крахмального геля и ДТТ: в этом случае термоинактивация ферментов происходит с наименьшей скоростью. Особенно хорошо этот эффект заметен в случае, когда температура инкубации ферментов выше 350С.
По соотношению констант термоинактивации в буферном растворе и гелевом окружении вычислили коэффициенты стабилизации биферментной системы (табл. 1.3.5). Из таблицы 1.3.5 видно, что крахмальный гель, действительно оказывает стабилизирующий эффект на биферментную систему. Крахмальный гель с добавлением ДТТ оказывает более ощутимый стабилизирующий эффект на биферментную систему. Этот эффект обусловлен тем, что дитиотрейтол предохраняет SH-группы ферментов от окисления. Однако, при внесении ДТТ в буферный раствор, стабилизации биферментной системы светящихся бактерий не наблюдается.
Из табл. 1.3.4 -1.3.5 видно, что при температуре выше 35°С как добавление ДТТ, так и крахмального геля приводит к снижению скорости денатурации ферментов, но увеличивает скорость диссоциации люциферазы на отдельные субъединицы. Наибольший стабилизирующий эффект оказывает крахмальный гель с добавлением ДТТ: скорость денатурации ферментов при 35°С в 20 раз меньше по сравнению со скоростью денатурации ферментов в буферном растворе.
Таблица 1.3.5
Коэффициент стабилизации биферментной системы в 2% крахмальном геле и в присутствии ДТТ
| T, °С | Коэффициент стабилизации S | |||||||
| Буфер + ДТТ | Крахмальный гель | Крахмальный гель + ДТТ | ||||||
| 18 | 1,14 | 1,43 | 4,00 | |||||
| 23 | 0,88 | 1,05 | 1,70 | |||||
| 28 | 1,14 | 1,08 | 3,20 | |||||
| 33 | 1,17 | 0,86 | 0,97 | |||||
| 38 | 0,42 | 3,50 | 0,49 | 2,00 | 0,39 | 2,00 | ||
| 43 | 1,10 | 1,25 | 0,46 | 12,63 | 0,57 | 20,20 | ||
Энергию активации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза- люцифераза определяли по тангенсу угла наклона прямой, построенной в координатах Аррениуса по экспериментальным данным для диапазона температур, при которых зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от времени инкубации ферментов имеет линейный характер (рис. 1.3.17). Для расчета энергии активации при более высоких температурах, когда наблюдается термоинактивация второго порядка, необходимы более сложные расчеты, в данной работе они не приводятся.
Из рисунка 1.3.18 видно, что энергия активации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза зависит от микроокружения ферментов. При добавлении ДТТ энергия активации не изменяется по сравнению с контрольным значением (равным 24 кДж) и равна 20 кДж. В крахмальном геле энергия активации для этого процесса увеличивается до 46 кДж, а с добавлением ДТТ – до 78 кДж, то есть для термоинактивации ферментов в крахмальном геле с добавлением ДТТ требуются дополнительные затраты энергии.
Рисунок 1.3.17 - Зависимость натурального логарифма константы инактивации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от температуры (координаты Аррениуса).
Рисунок 1.3.18 – Значения энергии активации биферментной системы в крахмальном геле в присутствии дитиотрейтола.
Таким образом, показано, что изменение вязкости среды (добавлением крахмального геля), внесение стабилизатора SH-групп ферментов (дитиотрейтола) являются факторами, повышающими термостабильность ферментов.
Оценка эффективности взаимодействия люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы в различных условиях
В работе исследовали влияние крахмального геля на активность НАДН:ФМН-оксидоредуктазы. Проводили сравнение скоростей неферментативного окисления НАДН, окисления НАДН оксидоредуктазой в отсутствии люциферазы и при ее добавлении (в составе препарата КРАБ). Кроме того, определяли скорость окисления НАДН эндогенным ФМН в составе люциферазы, в этом случае в реакционную смесь вносили только люциферазу.
Из таблицы 1.3.6 видно, что скорость расходования НАДН зависит от микроокружения ферментов. Внесение стабилизатора снижает скорость ферментативных реакций окисления НАДН, катализируемых оксидоредуктазой. В то же время внесение ДТТ повышает скорость ферментативных реакций, катализируемых люциферазой, в 1,7 раза. Снижение скорости реакции, катализируемой оксидоредуктазой, и увеличение скорости реакции, катализируемой люциферазой, может объясняться тем, что ДТТ может осуществлять реакцию восстановления ФМН вместо НАДН. При использовании оксидоредуктазы или двух ферментов одновременно (в виде реагента КРАБ) стабилизирующий эффект не проявляется - скорость окисления НАДН не изменяется при внесении ДТТ.
Таким образом, при добавлении ДТТ в реакционную смесь сложно оценить эффект, который он оказывает на биферментную систему светящихся бактерий, так как ДТТ может не только стабилизировать ферменты, но и восстанавливать ФМН, тем самым увеличивая скорость реакций, катализируемых люциферазой. Поэтому мы не можем точно сказать, какой процесс при этом вносит больший вклад в увеличение скорости реакций.
Крахмальный гель обладает существенно большим стабилизирующим эффектом по сравнению с ДТТ, скорость реакций, катализируемых оксидоредуктазой и люциферазой, увеличивается по сравнению с реакциями в буферном растворе в 2,5 и 2,2 раз, соответственно. Так же стабилизирующим действием обладает крахмальный гель и ДТТ, скорость реакций, катализируемых оксидоредуктазой и люциферазой, увеличивается по сравнению с реакциями в буферном растворе в 2,1 и 2,2 раз, соответственно.
Кроме того, из таблицы 1.3.6 видно, что при использовании биферментной системы (препарата КРАБ) скорость окисления НАДН в крахмальном геле существенно увеличивается, причем дополнительное внесение ДТТ уменьшает ее, однако это значительно больше по сравнению со скоростью реакции окисления НАДН оксидоредуктазой. Подобный эффект может служить подтверждением гипотезы о том, что НАДН-оксидоредуктаза и люцифераза не могут создавать комплекс. Кроме того, существуют литературные данные, свидетельствующие против существования такого комплекса.
Таблица 1.3.6
Зависимость скорости окисления НАДН и коэффициент Kv изменения скорости окисления НАДН от состава реакционной смеси
| Используемые фермент | Буфер | Буфер+ДТТ | Крахмал | Крахмал+ДТТ | |||
| V, мкМ/мин | V, мкМ/мин | Kv | V, мкМ/мин | Kv | V, мкМ/мин | Kv | |
| Отсутствие ферментов | 0,08 | 0,87 | 1,06 | 0,60 | |||
| Оксидоредуктаза | 0,63 | 0,53 | 0,8 | 1,60 | 2,5 | 1,30 | 2,1 |
| Люцифераза | 1,75 | 2,90 | 1,7 | 3,92 | 2,2 | 3,90 | 2,2 |
| КРАБ | 2,70 | 2,46 | 0,9 | 5,00 | 1,9 | 3,70 | 1,4 |
Таким образом, методами спектрального анализа подтверждено, что увеличение вязкости микроокружения путем добавления крахмального геля приводит к существенной стабилизации люциферазы, снижая скорость ее тепловой денатурации.
Активность биферментной системы в растворе желатина
В ходе работы были получены зависимости интенсивности свечения биферментной системы светящихся бактерий от температуры в присутствие в реакционной смеси различных концентраций желатина: 0.5%, 1%, 1.5%, 5% (Рис. 1.3.19).
Видно, что при низких концентрациях желатина (0.5%) активность биферментной системы снижается на всем интервале исследованных температур. При увеличении концентрации желатина (1% и более) наблюдается высокая интенсивность свечения при температуре Т<Tг (температуры гелеобразования), максимальное увеличение интенсивности с последующим резким ее падением при ТТг и низкий выход активности ферментов при Т>Тг. Кроме того, изменение интенсивности свечения при ТТг становится более выраженным при увеличении концентрации желатина.
а – 0.5% раствор желатина; б – 1% раствор желатина; в – 1.5% раствор желатина; г – 5% раствор желатина.
Рисунок 1.3.19 - Зависимость интенсивности свечения биферментной системы от температуры в растворах желатина разной концентрации.
Температура гелеобразования Тг в данном случае введена формально, для удобства описания полученных результатов. Согласно литературным данным (Джеймс, 1980) Тг27°С. Падение интенсивности свечения наблюдалось вблизи именно этой температуры, но дополнительных экспериментов, доказывающих или опровергающих наличие гелеобразного состояния желатина ниже и его разрушение выше указанной температуры, проведено не было. Тем не менее, в качестве одной из гипотез можно выдвинуть предположение о наличии взаимосвязи между резким изменением интенсивности свечения и нарушением гелевой структуры желатина.
В таком случае, из полученных результатов следует, что ферменты, помещенные в гелевую матрицу, работают стабильнее, чем ферменты в растворе. Возможно, это связано с тем, что молекулы ферментов включаются в структуру (матрицу), образованную спиральными цепями желатина, благодаря электростатическим, гидрофобным взаимодействиям или путем образования водородных связей. Образованные связи стабилизируют фермент, препятствуя его инактивации, о чем свидетельствует высокий выход активности.
При температуре выше температуры гелеобразования поперечные связи между молекулами разрушаются и полипептдные цепи желатина начинают двигаться независимо друг от друга. Молекулы ферментов, скорее всего, тоже разрывают свои связи с желатином, а постоянное хаотическое движение больших молекул желатина мешает нормальной работе ферментов и способствует их инактивации.
Снижение интенсивности свечения в растворе желатина низкой концентрации на всём диапазоне исследованных температур, вероятно, связано с тем, что такой концентрации не достаточно для образования геля.
Термоинактивация биферментной системы в растворе желатина
Изучение термоинактивации биферментной системы светящихся бактерий показало, что кинетика термоинактивации в присутствие в реакционной смеси 0,5% желатина и его отсутствие имеет принципиально одинаковый характер на всём диапазоне температур. При Т=30-40С наблюдается термоинактивация второго порядка, включающая в себя два различных механизма инактивации биферментной системы, последовательно сменяющие друг друга и протекающие с разными скоростями (Рис. 1.3.20).
Известно, что бактериальная люцифераза и НАДН:ФМН-оксидоредуктаза обладают четвертичной структурой и представляют собой гетеродимер и гомодимер соответственно. Таким образом, логично предположить, что самым первым процессом, происходящим при термодеградации биферментной системы, является диссоциация ферментов на субъединицы. Как раз процессу диссоциации и соответствует первый «линейный» участок кинетических кривых термоинактивации. За расхождением субъединиц люциферазы и (или) НАДН:ФМН-оксидоредуктазы при высокой температуре, скорее всего, следует необратимая денатурация ферментов: люциферазы и (или) НАДН:ФМН-оксидоредуктазы. То есть второму «линейному» участку кинетических кривых термоинактивации биферментной системы, наверняка, соответствует денатурация ферментов. На данном этапе исследований, к сожалению, невозможно точно сказать, у какого именно фермента происходит нарушение структуры. Для этого необходимы дальнейшие подробные исследования термоинактивации люциферазы и оксидоредуктазы отдельно друг от друга.
Следовательно, можно предположить, что термоинактивация биферментной системы светящихся бактерий происходит по диссоциативному механизму.
a – без желатина; b – 0,5% раствор желатина.
Рисунок 1.3.20 - Кинетические кривые термоинактивации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных значениях температуры в присутствие 0,5% желатина и его отсутствии.
При Т=15-25С в присутствие 0,5% желатина и его отсутствие наблюдается медленная инактивация биферментной системы по первому порядку. Предположительно она связана с процессом диссоциации ферментов на субъединицы. Денатурация при такой невысокой температуре не происходит.
Из рисунка 1.3.20 видно, что первый этап термоинактивации, соответствующий диссоциации ферментов, в желатине происходит с большей скоростью, чем без него, при всех исследованных температурах. При этом наличие желатина практически не влияет на скорость денатурации.
Изучение термоинактивации биферментной системы в 1% растворе желатина показало, что кинетика термоинактивации в присутствие в реакционной смеси желатина и его отсутствие имеет одинаковый характер не на всём диапазоне температур, как в случае 0,5% желатина, а лишь при Т>Тг. При Т=23-38С кинетические кривые инактивации в полулогарифмических координатах состоят из двух «линейных» участков, соответствующих процессам диссоциации и денатурации (Рис. 1.3.21). При Т>43С наблюдается быстрая инактивация первого порядка. Это объясняется тем, что кинетические режимы термоинактивации становятся экспериментально неразличимыми из-за резкого увеличения с ростом температуры скорости диссоциации ферментов на субъединицы.
Значительного различия скоростей инактивации в присутствие желатина и его отсутствие не наблюдается. Причиной этому может служить тот факт, что процесс диссоциации происходит слишком быстро при высоких температурах, а скорости денатурации ферментов в желатине и без него, как и в предыдущем случае, практически одинаковы.
a – без желатина; b – 1% раствор желатина.
Рисунок 1.3.21 - Кинетические кривые термоинактивации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных значениях температуры в присутствие 1% желатина и его отсутствие.
При анализе кривых инактивации, полученных для 5% желатина, было выявлено, что кинетика термоинактивации в присутствие в реакционной смеси желатина и его отсутствие, также как и для 1% желатина, имеет похожий вид только при Т>Тг. При Т=28-38С наблюдается термоинактивация второго порядка, а при Т>43С – первого порядка (Рис. 1.3.22). Однако, в данном случае скорость денатурации ферментов в желатине несколько ниже, чем в его отсутствие.
a – без желатина; b – 5% раствор желатина.
Рисунок 1.3.22 - Кинетические кривые термоинактивации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза при разных значениях температуры в присутствие 5% желатина и его отсутствие.
При температурах, меньших температуры гелеобразования желатина (Т<Тг), в желатинах с концентрациями 1% и 5% происходит значительная активация биферментной системы с течением времени, в то время как в отсутствие желатина идёт медленная инактивация по первому порядку. Пример таких кинетических кривых для 1% желатина приведён на рисунке 1.3.23. Этот необычный результат лишний раз подтверждает факт стабилизации ферментов при их помещении в гелевую матрицу желатина.
Кроме того, было замечено, что при помещении биферментной системы, выдержанной в присутствие желатина при высокой температуре (35-50С) в течение небольшого промежутка времени (30 с – 1 мин), обратно в условия с комнатной температурой (20С) происходит ее реактивация (Рис. 1.3.24). В отсутствие желатина такой эффект тоже наблюдается, однако в желатине реактивация гораздо более сильно выражена. Таким образом, можно сделать вывод о том, что процесс термоинактивации биферментной системы частично обратим, а также о том, что наличие желатина способствует восстановлению активности ферментов.
Рисунок 1.3.23 - Зависимость интенсивности свечения биферментной системы от времени выдерживания в присутствие 1% желатина и его отсутствие при Т=10С в полулогарифмических координатах.
Рисунок 1.3.24 – Кинетические зависимости интенсивности свечения биферментной системы для разных интервалов времени выдерживания в
1% растворе желатина при 48С.
Сравнение кинетических кривых термоинактивации в присутствие желатинов разной прочности (Bloom) показало, что принципиальных различий кинетических характеристик биферментной системы в разных желатинах нет. Также было выяснено, что, несмотря на снижение абсолютного значения активности биферментной системы в растворах желатина, отношение активности в присутствие желатина к активности в отсутствие желатина растет с увеличением времени инкубирования ферментов при данной температуре.
Таким образом, показано, что активность биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и кинетика её термоинактивации в желатине низкой концентрации (предположительно, не достаточной для образования геля) и в желатине высокой концентрации (достаточной для образования геля) различаются. Термоинактивация биферментной системы имеет нелинейный характер и, предположительно, протекает по диссоциативному механизму. Желатин, находящийся в жидкой фазе, ускоряет первый этап термоинактивации, а гелеобразный желатин, напротив, способствует активации биферментной системы. В присутствие желатина возможна реактивация биферментной системы при комнатной температуре.
1.3.4 Изучение связи «структура-функция» в зависимости от микроокружения
Была проверена применимость термодинамической модели денатурирующего действия органических растворителей на различные белки и ферменты к люциферазам. Авторами модели (Белова и др., 1991) предложен новый параметр ДС – денатурирующая сила, который учитывает несколько характеристик органических растворителей: параметр гидрофобности (-logP), размер молекулы, сольватирующую способность, и предполагает, что денатурация растворителями происходит, в основном, из-за вытеснения молекул воды из гидратной оболочки белка. Данная термодинамическая модель широко используется для описания функционирования различных ферментов в водно-органических средах. Следуя методике авторов, для расчета и "привязки" шкалы ДС к люциферазе, были выбраны "хорошие" опорные органические растворители: этиленгликоль и ацетон, имеющие значительные различия в величинах ДС (табл.1.3.7), и средние для различных ферментов значения параметров logX этих растворителей. На основе экспериментальных пороговых концентраций С50 ЭТГЛ и АЦ для обеих люцифераз построены теоретические прямые корреляции С50 от параметра logX (рис. 1.3.25, прямые 1,2). Значения logX (табл. 1.3.7) для других растворителей рассчитаны по формуле:
logX=((ДСх-ДСэтгл)/(ДСац-ДСэтгл))·(logАЦ-logЭТГЛ)+logЭТГЛ.
Теоретические значения пороговых концентраций растворителей С50(т) определены графически из теоретических корреляционных прямых (табл. 1.3.7). Экспериментальные пороговые концентрации органических растворителей С50(э) значительно отличаются от теоретических (табл. 1.3.7) и коррелируют с параметром logX с низкими коэффициентами корреляции, около 46% для обеих люцифераз (рис. 1.3.25, кривые 1`, 2`). Отсюда следует, что вытеснение воды из гидратной оболочки люцифераз,по-видимому вносит определенный вклад в ингибирование биолюминесценции. Для параметра ДС, так же как и (-logP), наблюдается общая тенденция: с увеличением ДС уменьшается пороговая концентрация С50. Использование шкалы ДС, приведенной в работе, может только качественно охарактеризовать действие органических растворителей на люциферазу: сильный денатурант, слабый денатурант. Значения С50 для любых органических растворителей, предсказанные теоретически, плохо соотносятся с практическими полученными пороговыми концентрациями.
1,2 – теоретические; 1`,2` - экспериментальные корреляционные прямые для люцифераз Р.leiognathi и V.harveyi, соответственно, при использовании тетрадеканаля
Рисунок 1.3.25 - Корреляция пороговых концентраций органических
растворителей С50 с параметром (-logX).
По-видимому, действие органических растворителей на белок не ограничивается вытеснением воды из гидратной оболочки фермента, а сопровождается влиянием органических растворителей на связывание люциферазы с ее субстратами (ФМН и альдегидом), кроме того, не учтено и взаимодействие между субстратами и средой.
Таблица 1.3.7.
Шкала ДС, рассчитанные значения параметра (-logХ) и экспериментальные
(С50(э), об.%) и теоретически рассчитанные (С50(т), об.%) пороговые концентрации органических растворителей для люцифераз Р.leiognathi и V.harveyi при использовании тетрадеканаля.
растворитель | ДС | -logX | P.leiognathi | V.harveyi | |||||||
| C50(т) | С50(э) | C50(т) | C50(э) | ||||||||
| ФА | 0 | 0,90 | 22 | 11 | 22 | 13,5 | |||||
| ЭТГЛ | 3,3 | 0,92 | 21 | 30 | 33 | 33 | |||||
| ГЛ | 10,7 | 0,98 | 20 | 20 | ---- | ---- | |||||
| МЕТ | 29,6 | 1,12 | 19 | 11,8 | 22 | 19,5 | |||||
| ЭТ | 52,1 | 1,29 | 11,5 | 10,3 | 15 | 14,3 | |||||
| ДМСО | 59,6 | 1,35 | 9,5 | 15 | 10 | 11,5 | |||||
| АЦТНТР | 64,4 | 1,39 | 8,5 | 3 | ---- | ---- | |||||
| АЦ | 79,4 | 1,50 | 6,5 | 6,5 | 9,5 | 9,5 | |||||
Как известно, характер нативной конформации белка определяется не каким-либо одним эффектом, а представляет собой результат совместного тонко сбалансированного действия целого ряда факторов и взаимодействий. Реально существующая структура белков упорядочена и компактна и определяется, в основном, гидрофобными взаимодействиями, которые чаще всего рассматриваются как стабилизирующий фактор для белковых макромолекул. Проверка применимости термодинамической модели Беловой, Можаева с сооавторами, основанной на представлении о том, что денатурация белков органическими растворителями происходит в основном из-за вытеснения молекул воды из гидратной оболочки фермента показала, что, во-первых, процесс инактивации ферментативной активности люцифераз складывается из процессов увеличения гидрофобности реакционной среды при введении органических растворителей и вытеснения молекул воды из гидратной оболочки белка; во-вторых, теоретически определенные значения пороговых концентраций органических растворителей на основании шкалы ДС превышают экспериментально полученные значения С50 для обеих люцифераз; в третьих, шкала ДС качественно характеризует действие органических растворителей на люциферазы: сильный денатурант, слабый денатурант. Таким образом, термодинамическая модель качественно описывает процесс потери ферментативной активности.
1.3.5 Обеспечение условий вязкости, подобных условиям в клеточном матриксе
Был проведен поиск наиболее чувствительных компонентов систем, позволяющих оптимизировать состав компонентов в предложенных прототипах моделей для выбора условий, в которых влияние вязкости на активность биолюминесцентных систем соответствовало бы условиям работы ферментов в клеточном матриксе.
Проанализировано соответствие вязкости исследованных экспериментальных моделей вязкости клеточной цитоплазмы.
С одной стороны, известно, что абсолютная вязкость цитоплазмы колеблется от 2 до 50 спз и меняется в различных частях клетки и в разные периоды клеточного цикла. Особенностью цитоплазмы является то, что при понижении температуры ниже 12—15°С и повышении выше 40—50°С вязкость цитоплазмы увеличивается.
Для двух из использованных экспериментальных моделей – ЭМглицерин и ЭМсахароза зависимость вязкости среды от концентрации хорошо изучена (Никольский и др., 1963). Из литературных данных следует, что для достижения вязкости, присущей клеточной цитоплазме, необходимо очень высокое содержание глицерина и сахарозы в растворе (20-75% (2,2-8,2М) и 25-60% (1,4-3,4М) соответственно). Такие концентрации действуют ингибирующе на биолюминесцентную реакцию (см. п.1.1.1 отчета).
Таким образом, ЭМглицерин и ЭМсахароза не могут в полной мере соответствовать природным условиям функционирования биолюминесцентной системы в бактериальной клетке.
С другой стороны, известно, что вязкость биологических сред определяется в большинстве случаев структурной вязкостью. В частности, вязкость клеточной цитоплазмы связана со структурой составляющих её биополимеров и субклеточных образований, что вызывает отклонения вязкого течения от ньютоновского закона нормальных жидкостей. Биохимические процессы в клетках происходят при высокой концентрации макромолекул – 50-400 мг/мл (Таблица 1.3.8). И хотя общая концентрация каждого конкретного вида макромолекул невелика, эти соединения стремятся локализоваться в определенной области клетки (молекулярный краудинг). Такие условия также оказывают влияние на характер протекания биохимических процессов.
Таблица 1.3.8
Примерный химический состав бактериальной клетки
| Доля от общей массы клетки, % | Число типов молекул | |
| Вода | 70 | 1 |
| Неорганические ионы | 1 | 20 |
| Сахара и их предшественники | 1 | 250 |
| Аминокислоты и их предшественники | 0,4 | 100 |
| Нуклеотиды и их предшественники | 0,4 | 100 |
| Жирные кислоты и их предшественники | 1 | 50 |
| Другие малые молекулы | 0,2 | 300 |
| Макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды) | 26 | 3000 |
Все это говорит о необходимости создания экспериментальной модели с использованием высоких концентраций макромолекул. Действие таких модельных сред на биолюминесценцию (ЭМжелатин и ЭМкрахмал) было изучено (см. п.1.3.2 отчета).
Разработана методика оценки вязкости среды с помощью молекулы ФМН в качестве флуоресцентного зонда. Для этого проведено измерение времен жизни флуоресценции ФМН в растворах, содержащих различные концентрации глицерина, сахарозы, желатина и картофельного крахмала (таблица 1.3.9). Установлено, что с ростом содержания глицерина и сахарозы в среде увеличивается время жизни флуоресценции молекулы ФМН, а в присутствии крахмала и желатина (за исключением последнего в концентрации 5%) оно не изменяется. Следует отметить, что изменение времени жизни флуоресценции является недостатком флуорофора, претендующего на роль зонда для измерения вязкости (идеальный зонд должен иметь неизменное время жизни флуоресцентного состояния). Тем не менее, возможно учесть погрешность, вводимую изменением данного параметра.
Таблица 1.3.9
Измеренные времена жизни и анизотропия флуоресценции ФМН в разных средах и вычисленные времена вращательной корреляции (20°С, возбуждение 450 нм)
| Содержание компонента, % | Вязкость раствора, спз | , нс | r | cal, нс |
| Буфер | ||||
| 100 | 1,00* | 4,69 ± 0,01 | 0,005 | 0,07 |
| Глицерин | ||||
| 10 | 1,31* | 4,71 ± 0,01 | 0,011 | 0,15 |
| 20 | 1,77* | 4,75 ± 0,01 | 0,016 | 0,22 |
| 30 | 2,50* | 4,86 ± 0,01 | 0,021 | 0,31 |
| 40 | 3,75* | 4,84 ± 0,01 | 0,022 | 0,32 |
| 50 | 6,05* | 4,95 ± 0,02 | 0,035 | 0,55 |
| 60 | 10,96* | 4,96 ± 0,02 | 0,060 | 1,01 |
| 70 | 22,94* | 4,96 ± 0,04 | 0,070 | 1,23 |
| 80 | 62* | 4,98 ± 0,09 | 0,119 | 2,52 |
| Сахароза | ||||
| 10 | 1,33* | 4,72 ± 0,01 | 0,018 | 0,26 |
| 20 | 1,94* | 4,81 ± 0,02 | 0,023 | 0,33 |
| 30 | 3,18* | 4,81 ± 0,02 | 0,055 | 0,88 |
| 50 | 15,4* | 4,95 ± 0,02 | 0,126 | 2,73 |
| 60 | 58,37* | 4,93 ± 0,04 | 0,301 | 27,66 |
| Крахмал | ||||
| 0,5 | 0,95# | 4,69 ± 0,01 | 0,008 | 0,11 |
| 1 | 1,14# | 4,70 ± 0,01 | 0,009 | 0,13 |
| 5 | 11,32# | 4,69 ± 0,01 | 0,064 | 1,04 |
| Желатин | ||||
| 0,1 | 1,01# | 4,67 ± 0,01 | 0,008 | 0,11 |
| 0,5 | 1,62# | 4,67 ± 0,01 | 0,012 | 0,17 |
| 1 | 1,88# | 4,66 ± 0,01 | 0,014 | 0,19 |
| 5 | 25,53# | 4,51 ± 0,01 | 0,12 | 2,31 |
