« Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума РАН ...»

В Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН создан новый отечественный препарат – синтетический ненаркотический анальгетик «Аноцептин». Лекарственная форма препарата представляет собой раствор для внутривенных инъекций. Экспериментально доказано, что действие препарата «Аноцептин» основано на активации механизма мембранной сигнализации, участвующего в кодировании ноцицептивного сигнала и регулирующего активационное воротное устройство натриевого тетродотоксинустойчивого канала. Исследование специфической фармакологической активности препарата показало, что по анальгетическим свойствам «Аноцептин» в 10 раз превосходит анальгин, и сопоставим с трамадолом. В опытах in vivo на разных видах животных доказано, что препарат не вызывает психической и физической зависимости. При приеме на фоне эмоционального стресса проявляет легкие антидепрессивные и транквилизаторные свойства. «Аноцептин» купирует токсические эффекты опиатов. Препарат не оказывает негативного влияния на сердечно-сосудистую, пищеварительную и дыхательную системы. Препарат не имеет негативных эффектов в отношении ЦНС.

В опытах in vitro на 10-12 дневных куриных эмбрионах обнаружена способность коменовой кислоты, дозозависимо регулировать рост и пролиферацию клеток. Действие препарата тканеспецифично. Оно основано, на способности коменовой кислоты модулировать сигнальную функцию Na/K –АТФазы. Специальные исследования по изучению влияния препарата «Аноцептин» на рост перевитых опухолей (карцинома Эрлиха, саркома Плиса) показали, что препарат не стимулирует рост новообразований.

Исследования на собаках показали, что начальные фазы фармакокинетики протекают очень быстро и связаны с распределением коменовой кислоты из водной составляющей крови в ткани. Перераспределение происходит с высокой скоростью: за первые 10 минут из плазмы крови уходит около 95 % введенного препарата, а через 2 ч в плазме крови остается около 1% от первоначального количества. Общее время нахождения препарата в организме составляет также около 5.5–6.0 ч. Препарат не осаждается в печени и почках утилизируется в самом организме. Максимальная терапевтическая доза препарата «Аноцептин» для человека составляет 5 мг/кг в сутки. При приеме препарата больше 350 мг в сутки анальгетический эффект не повышается, начинает проявляться седативный. Разработаны документы, позволяющие провести клиническое исследование препарата. Пакет документов утвержден Получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на проведение 1 фазы клинического исследования безопасности и фармакокинетики препарата «Аноцептин» в клинике Института мозга человека РАН. Срок проведения исследования с 03.05.2007 по 01.08.2008. В исследовании примут участие 32 добровольца.

Поданы заявки на изобретение (РФ): № 2006128504/15(030968) от 01.08.2006 Синтетическое анальгетическое средство и способ лечения. Авторы Б.В. Крылов, Е.В. Лопатина; № 2007135967 от 27.09.2007 Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства. Авторы: Е.В.Лопатина, А.В.Карецкий, Б.В.Крылов; № 2007135968 от 27.09.2007 Анальгетическое средство и способ лечения болевого синдрома различной этиологии с помощью этого средства. Авторы Б.В. Крылов, Е.В. Лопатина.

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СОЗДАНИЯ СТИМУЛ-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Л.И. Валуев, И.Л. Валуев, Г.А. Сытов

Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН, Москва

Одной из актуальных проблем современной химии, фармакологии и медицины является создание макромолекулярных терапевтических систем, которые способны выделять, в том числе и по механизму обратной связи, заключенные в них лекарства в ответ на изменение параметров окружающей среды, например рН, температуры или химического состава. Эти системы относятся к наиболее физиологичным лекарственным препаратам, поскольку именно такой принцип обратной связи лежит в основе функционирования живых организмов.

Возможность создания таких систем была изучена на примере систем, контролируемо выделяющих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы, то есть моделирующих функцию поджелудочной железы. В качестве макромолекулярной глюкозочувствительной системы был использован гидрогель на основе сополимеров акриламида с N-(2-D-глюкоз)акриламидом (ГАА) или N-(2-D-глюкоз)метакриламидом (ГМАА), сшитых конканавалином А (Кон А). Кон А имеет четыре места связывания глюкозы с константой связывания (3,7±0,5)•103 М-1. Константы связывания Кон А с ГАА и ГМАА равны (1,4±0,6) •102 М-1 и (1,8±0,6) •102 М-1, соответственно.

Сополимеры акриламида (M1) и ГАА или ГМАА (М2) синтезировали радикальной сополимеризацией водных растворов мономеров, используя в качестве инициатора окислительно-восстановительную систему. Рассчитанные значения констант сополимеризации этих мономеров составляют r1=1,1±0,1 и r2=0,02±0,01 для ГАА и r1=1,3±0,2 и r2=0,10±0,02 для ГМАА.

При смешении водных растворов синтезированных сополимеров и Кон А практически мгновенно происходит образование гидрогелей. При этом Кон А выполняет роль четырехфункционального сшивающего агента, а сшивка цепей сополимеров происходит за счет биоспецифического взаимодействия Кон А с остатками глюкозы в составе сополимера.

При добавлении к набухшему гидрогелю глюкозы сначала никаких видимых изменений с гидрогелем не происходит (степень набухания гидрогеля не изменяется). Однако при достижении концентрации глюкозы некоторого порогового значения происходит быстрый переход гидрогеля в растворимое состояние с выделением в раствор содержащегося в гидрогеле инсулина. Значение пороговой концентрации является функцией концентрации остатков глюкозы в сополимере и для изученных сополимеров составляет величину 100-500 мг/100 мл, то есть лежит именно в тех областях, в которых происходит секреция инсулина в живом организме.

Таким образом, полученные гидрогели представляют собой глюкозочувствительные системы, способные выделять содержащиеся в них вещества, например, инсулин, при вполне определенной концентрации глюкозы в окружающей среде.

БЕЛКИ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ КАК ИНГИБИТОРЫ ТРОМБОГЕНЕЗА

С.Д. Варфоломеев, М.А. Розенфельд, Е.А. Костанова

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва

Процесс свертывания крови осуществляется последовательно протее-кающими ферментативными реакциями, заканчивающимися генерацией тромбина, который превращает растворимый фибриноген в фибриновый гель и одновременно с этим активирует фибринстабилизирующий фактор (ФXIIIa). Последний катализирует образование -(-глутамил)лизиновых перекрестных связей в - и - полипептидных цепях молекул фибрина. В связи с отсутствием физиологических ингибиторов неконтролируемое повышение ферментативной активности ФXIIIa обусловливает возникновение тяжелых видов коагулопатий.

Методом аффинной хроматографии на сорбенте КМ-химопапаин-сефароза 4В был выделен комплекс ингибиторов природного происхождения из клубней картофеля Solanum tuberosum, подавляющий транспептидазную активность фермента. Белковый препарат относится к классу ингибиторов цистеиновых протеиназ (ИЦП) и способен блокировать активность ФXIIIa прямым воздействием на его существенную сульфгидрильную группу.

Методом ВЭЖХ комплекс ингибиторов был разделен на пять основных отдельных белковых компонентов: высокомолекулярных с массами: ~ 80 и 65 кДа; низкомолекулярных с массами: ~36, 25 и 22 кДа. Методом рэлеевского светорассеяния показано, что все белковые компоненты за исключением ингибитора с м.м. 80 кДа образуют с фибринстабилизирующим фактором эквимолярный комплекс, что обусловливает ингибирующее действие белков ИЦП. Это подтверждено прямым методом флуоресцентного электрофореза, где выявлено подавление ферментативной транспептидазной активности ФXIIIa в присутствии вышеуказанных ИЦП.

Методом электрофореза восстановленных образцов перекрестно-сшитого фибрина установлено, что белки с молекулярными массами 65, 36, 25, и 22 кДа соответственно ингибируют скорость процессов -диме-ризации и -полимеризации полипептидных цепей фибрина. Турбидиметрическим методом выявлена повышенная чувствительность фибринового геля в присутствии ингибиторов к гидролитическому действию плазмина.

Также показано, что ингибиторы снижают ферментативную активность фибринстабилизирующего фактора в плазме крови доноров и больных.

РАЗРАБОТКА НАБОРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ОЦЕНКА ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ТЯЖЕЛЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ПЕЧЕНИ

И.В. Урываева 1), Э.И. Гальперин 2), Р.И. Атауллаханов 3), Т.Г.Дюжева 2), Л.В. Платонова 2), Н.Н. Ионочкина 2), М. Кочергин 2), А.В.Пичугин 3), Т.М. Мельникова 4), Г.В. Делоне1)

1)Институт биологии развития РАН, 2)Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, 3) Институт иммунологии МЗ, 4) Институт органической химии РАН

Несмотря на выраженную способность печени к регенерации и восстановлению лечение некоторых заболеваний печени требует усиления ее регенераторной и функциональной активности, что связано с продукцией различных эндогенных факторов, обладающих активностью, направленной на стимуляцию размножения клеток паренхимы. Многочисленными экспериментальными исследованиями, проведенными нами, показана возможность стимуляции регенерации поврежденной печени (Гальперин Э.И. и др., 1985-2005).

Цель проекта: создать для лечения повреждений печени лекарственный препарат, состоящий из набора естественных индукторов регенерации печени, образующихся в органе в период регенерации.

Задачи проекта – выделить из ткани неонатальной печени набор биологически активных веществ, обладающих регенерирующей активностью, и установить их природу и основные физико-химические свойства.

Результаты. Получен экстракт из печени 2-3-дневного поросенка с использованием оригинальной технологии, основанной на гомогенизации ткани печени с дистиллированной водой, центрифугировании, прогре-вании, осаждении этанолом, удалении спирта упариванием. Для удаления из экстракта балластных веществ и выделения активной фракции, содер-жащей естественные индукторы регенерации, использовали несколько фракционирующих приемов – диализ, осаждение сульфатом аммония. Наиболее эффективным оказался диализ через мембрану с пределом эксклюзии 12КД, позволивший получить две фракции: диализат (остаток в мешке) и маточник (вне мешка) в весовом соотношении 1:10. Эффект воздействия экстракта и фракций на поврежденную печень изучали на экспериментальной модели токсического повреждения печени мышей тиоацетамидом (ТАА, 250 мг/кг), оценивая изменение активности АСТ и АЛТ в сыворотке крови опытных животных по сравнению с контроль-ными. Активность АСТ и АЛТ в сыворотке крови мышей с токсическим повреждением печени после введения экстракта из печени поросенка (2,3 мг белка на мышь) была наибольшей через 48 ч после введения ТАА и cоставила 65±8 % и 68±9 % (p<0,05) (n=23) по сравнению с контролем, соответственно. Активность АСТ и АЛТ в сыворотке крови эксперимен-тальных мышей после введения диализата (1,15 мг белка на мышь) составила 52 и 53 % (p<0,05) по сравнению с контролем, соответственно. Маточник был неактивен. Высаживание полимерных фракций в экстракте сульфатом аммония приводило к потере активности как в осадке, так и маточнике. Изучены физико-химические свойства экстракта и диализата. Экстракт не терял своей активности при нагревании при 40-45° в течение 1 часа, при концентрировании раствора, при лиофильной сушке с по-следующим растворением сухой массы, а также при хранении при комнатной температуре в течение 4 суток, в последнем случае активность даже увеличивалась. Анализ диализата на жидкостном хроматографе на колонке TSK-50S показал, что он гомогенен по молекулярной массе, име-ет один пик, а маточник гетерогенен – более 5 пиков. Молекулярная масса активного вещества находится в пределах 80-20 КД. Количественный анализ на белок показал, что активная фракция на 99 % состоит из белка.

Выводы. Получен экстракт из печени 2-3-дневного поросенка, обладающий регенерирующей эффективностью в процессе восстановления поврежденной печени. Проведена частичная очистка комплекса биологически активных веществ, установлена их принципиальная природа и изучены физико-химические свойства. Планируется дальнейшая очистка по химическим свойствам комплекса биологически активных веществ, обладающих регенерирующей активностью, идентификация известных индукторов в составе набора веществ, определение их концентрации и в дальнейшем искусственный синтез их копии для реконструкции комплекса веществ.

СОЗДАНИЕ НОВОГО КЛАССА АЗОТИСТЫХ ГЕТЕРОЦИКЛОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

О.М. Нефедов1), Ю.В. Томилов1), В.А. Докичев2)

1)Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва

2)Институт органической химии УНЦ РАН, Уфа

Несмотря на успехи современной медицины в области сердечно-сосудистых заболеваний поиск новых высокоэффективных лекарственных препаратов для лечения аритмии сердца и заболеваний центральной нервной системы остается актуальной задачей, которая в первую очередь связана с работами над созданием препаратов широкого спектра действия с пониженной токсичностью.

Показано, что методология 1,3-диполярного циклоприсоединения диазосоединений к олефинам и последующее восстановление образующихся пиразолинкарбоксилатов является эффективным методом синтеза полициклических и спироциклопропансодержащих 3-амино-пирролидин-2-онов, обладающих широким спектром физиологической активности. В ряду изученных реагентов и методов, используемых в практике органического синтеза при восстановлении С=N и N=N-связей наиболее эффективным является способ каталитического гидрирования метил-1Н-пиразолин-3-карбоксилатов водородом (50–100 бар) в присутствии Ni-Ренея при 60–100 оС. Таким путем осуществлен направленный синтез новых гетероциклических соединений, в том числе из доступных аддуктов N-замещенных малеимидов с генерируемым in situ диазоциклопропаном, и выявлены вещества, обладающие высокой антиаритмической и антивирусной активностью. Два из них представляют особый интерес и рекомендованы для проведения дальнейших испытаний.

Продолжены исследования синтезированного нами ранее 5-амино-экзо-3-азатрицикло[5.2.1.02,6]декан-4-она, обладающего противовоспали-тельной, анальгетической, антиаритмической и ноотропной активностью. При пероральном применении в дозе 11,5 мг/кг это соединение оказывает выраженный антиаритмический эффект при желудочковой форме аритмии, вызванной хлоридом бария, и обеспечивает выживаемость 100 % животных. Внутривенно в дозе 0,35 мг/кг в 50–70 % случаев полностью предупреждает развитие строфантиновой аритмии. Соединение обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа A/Rostock/34 (H7N1), сопровождающейся снижением титра вируса до 1 lg БОЕ/мл (подавление размножения вируса на 90 %). С целью оценки степени повреждающего действия азатрицикло[5.2.1.02,6]деканона при его месячном введении осуществлен субхронический токсикологический эксперимент. Оценка токсического действия проводилась по следующим параметрам: на интегральные показатели (внешний вид, поведение, симптомы интоксикации, прирост массы тела, потребление пищи и воды); на отдельные биохимические показатели крови (уровень белка, холестерина, билирубина, аминострансфераз: АЛТ, АСТ); на периферическую кровь (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин). Кроме того, проводили макроскопические исследования внутренних органов. Препарат вводили перорально при помощи металлического зонда в дозе 1/10 от LD50 (68,0 мг/кг) ежедневно в течение 30 дней (т.е. за 30 дней была введена тройная доза LD50). При вскрытии животных, только на 30 день отмечено увеличение веса внутренних органов и изменение их внешнего вида. Показатели морфологического состава крови, ее биохимические параметры не выходили за пределы колебаний физиологической нормы в продолжении всего эксперимента. Поведение животных и внешний вид волосяного покрова и кожи оставался без изменений. Результаты эксперимента показали низкую куммулятивную активность препарата: соединение в испытанной дозе хорошо переносится животными и только к 30 дню проявляет токсическое действие на органы и системы крыс, при этом не вызывая гибели животных. Совокупность фармакологических свойств, выявленная у 5-амино-экзо-3-азатрицикло[5.2.1.02,6]декан-4-она, в сочетании с низкой токсичностью делают его перспективным для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (патент РФ № 2281938).

МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЯ ВОЗБУДИМОСТИ НЕРВНЫХ КЛЕТОК ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ЭНДОГЕННЫМИ АНТИБИОТИКАМИ

А.Д.Ноздрачев, Ю.А.Толкунов, Д.А.Сибаров, Е.Л.Поляков, В.Б.Плахова

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

Эндогенные антибиотики дефенсины активно участвуют в поддержании гомеостазиса. Они продуцируются нейтрофильными гранулоцитами и клетками покровного эпителия слизистой оболочки кишки. В работе посредством методики внутриклеточной регистрации нейрональной активности исследовано влияния дефенсина NP-1 человека (Sigma, США) и антибиотика цефотаксима (Cefotaxime, клафорана, Aventis) на возбудимость нейронов при действии серотонина (5-HT), гистамина, интерлейкина-1 и ацетилхолина в стенке тонкой кишки морской свинки (компоненты функциональных модулей метасимпа-тической нервной системы). Установлено, что первичные афферентные нейроны метасимпатической нервной системы тонкой кишки активиру-ются при действии серотонина, гистамина, интерлейкина-1 и ацетил-холина. Дефенсин NP-1 не влияет на значение потенциала покоя мембра-ны нейронов, однако снижает чувствительность клеток ко всем исследо-ванным медиаторам. Минимальная пороговая концентрация дефенсина NP-1 оказалась равной 1x10-12 моль/л. Применение цефотаксима, в отли-чие от дефенсина NP-1, сопровождалось более стойкими нарушениями развития импульсной активности первичных афферентных нейронов, а в высоких концентрациях цефотаксим полностью блокировал развитие потенциалов действия (ПД) в исследованных клетках. Минимальная пороговая концентрация цефотаксима равна 1x10-8 моль/л. Известно, что в мембране исследованных нейронов имеется два типа возбуждающих ионных каналов: быстрые тетродоксин-чувствительные Na+-ионные ка-налы и Ca2+-ионные каналы. Специальные исследования показали, что применение блокатора Са2+-каналов – ионов Cd3+ (10 ммоль/л) не блоки-рует развитие ПД в первичных афферентных нейронах при действии серотонина и ацетилхолина. Однако ПД действия в первичных афферен-тных нейронах, вызываемые применением гистамина, обратимо подавляя-ются под влиянием блокатора Са2+-каналов. Подавление импульсной активности и отдельных фаз ПД на применяемые медиаторы происходит после применения дефенсина NP-1 и цефотаксима. Можно полагать, что оба антибиотика могут оказывать действие на воротные механизмы Na+- и Са2+-ионных каналов. Наиболее сильное влияние дефенсин NP-1 и цефотаксим оказывают на чувствительность первичных афферентных нейронов к действию гистамина и интерлейкина-1.

Кроме того, с помощью метода локальной фиксации потенциала исследовано действие другого дефенсина NP-5 на мембрану клеток спинальных ганглиев крыс. Оно приводит к снижению эффективного заряда активационной воротной системы медленных (тетродотоксин-нечувствительных) натриевых каналов и сдвигу вольт-амперной характеристики вправо, в сторону деполяризацинного роста мембранного потенциала. По нашим оценкам действующая концентрация (Кд) может составлять 1x10-6 моль/л. Стало быть, дефенсин NP-5 может модулировать возбудимость медленных Na+-каналов. Обнаруженные эффекты указывают на возможное существование в мембране сенсорного нейрона молекулярной мишени дефенсина NP-5 – не идентифицированного пока мембранного рецептора, связанного с медленными натриевыми каналами.

Таким образом, дефенсины NP-1 и NP-5 оказывают обратимое воздействие на работу тетродотоксин-чувствительных и тетродотоксин-нечувствительных Na+-ионных каналов.

РАЗРАБОТКА, СИНТЕЗ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КРЕАТИНА, СПОСОБНЫХ ПРОНИКАТЬ ЧЕРЕЗ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ БАРЬЕР

И УВЕЛИЧИВАТЬ МОЗГОВОЕ СОДЕРЖАНИЕ ВЫСОКОЭНЕРГЕТИ-ЧЕСКИХ ФОСФАТОВ: РЕАЛИЗАЦИЯ НОВОГО ПОДХОДА К ПРОФИ-ЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ ИНСУЛЬТОВ И ИШЕМИИ МОЗГА

С.А.Поленов 1), М.В.Ленцман 1), В.О.Муровец 1), Д.Э.Коржевский 2), А.И.Артемьева 1), А.А.Савохин 1), Н.Л.Изварина 1), В.А.Отеллин 2), С.В.Буров 3), П.П.Якуцени 4)

1) Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия

2) Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия. 3) Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия. 4) Политехнический университет, Санкт-Петербург, Россия

По последним данным (Всемирный Конгресс по инсульту, 2006 г., Кейп-Таун, ЮАР) в настоящее время инсульт выходит на второе место по смертности во всем мире. По данным ВОЗ, смертность от цереброваскулярных заболеваний в 2005 г. составила 5,7 миллионов; к 2015 году ожидается рост этой цифры до 6,5, а к 2030 году – до 7,8. Только в США стоимость лечения инсультов и его последствий скоро составит 2.2 миллиарда долларов. Существующие методы лечения инсульта можно подразделить на две категории – реканализацию, т.е. восстановление кровотока в ишемической области, и нейропротекцию, направленную на защиту клеток от гибели. В настоящее время единственным одобренным методом лечения инсульта с подтвержденной эффективностью является внутривенное применение активатора плазминогена (Brown, 2004; Stroke, 35:147-150). Эффективная нейропротекция, несмотря на огромное число исследований, так и остается не найденной (Broderick and Hacke, 2002).

Сейчас хорошо известно, что энергетический статус является ключевым фактором в цепи биохимических событий, т.н. «ишемическом каскаде», ответственном за нейрональные повреждения. Гипоксия приводит к истощению запасов высокоэнергетических соединений в клетках, в частности фосфокреатина (ФКр) и АТФ, что приводит к их гибели.

В наших предыдущих исследованиях на срезах мозга in vitro применение Кр повышало уровень ФКр и АТФ в среде и защищало нейроны от аноксического повреждения. В последующих работах на in vivo моделях глобальной ишемии мозга у крыс нами было использовано интрацеребровентрикулярное (и.ц.в.) введеним Кр с целью достижения его максимального накопления в ткани мозга. Результаты показали выраженное защитное действие Кр как на основе гистологических и неврологических показателей (Lensman et al., 2006; Brain Res., 1114:187-194). Вместе с тем Кр плохо проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что является одной из главных проблем успешной нейропротекции в клинике. Задачей следующего этапа стало создание новых аналогов Кр со способностью проникать через ГЭБ, сохраняя при этом высокое сродство к фосфокиназе.

Нами была проделана работа по компьютерному моделированию и симуляции и на этой основе осуществлен синтез более десяти оригинальных модификаций Кр и проведено их тестирование на нескольких моделях ишемии мозга. Три из этих веществ продемонстрировали выраженный противоишемический эффект при парентеральном введении. Нейропротекторное действие было подтверждено как на основе гистологических критериев, так и на основе данных широкого неврологического и поведенческого тестирования.

Наши результаты являются первой в своем роде и, причем, успешной попыткой применения новых аналогов креатина как нейропротекторов, и открывают путь к абсолютно новому подходу к профилактике и лечению инсультов и ишемии мозга. (Работа выполнена при поддержке РФФИ-ОФИ (№ 05-04-08072), Программ Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» и «Поддержка инноваций» 2007 г., Программ С-Пб НЦ РАН 2006-2007 гг.).

НАНОРАЗМЕРНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НОСИТЕЛИ

ДЛЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ

А.Р. Хохлов1,2), А.И. Барабанова1), Е.В. Корчагина2), В.С. Вележева1), Т.Г.Смирнова 3), Л.Н. Черноусова3), А.С. Андреева2), В.Г. Бабак1), О.Е.Филиппова2)

1) Институт элементоорганических соединений им. Несмеянова РАН, Москва

2) Физический факультет Московского государственного университета, Москва

3) ЦНИИ туберкулёза РАМН, Москва

Туберкулез является одним из наиболее опасных инфекционных заболеваний. Одна из проблем в лечении туберкулеза состоит в необходимости поддержания постоянной высокой концентрации противотуберкулезного препарата не только в кровотоке, но и в местах персистенции возбудителя болезни – макрофагах. В настоящее время лечение туберкулеза направлено на уничтожение микобактерий туберкулеза только в кровотоке, поэтому оно малоэффективно и требует серьезной химиотерапии с использованием чрезвычайно высоких дозировок лекарственных препаратов в течение длительного времени (нескольких месяцев). Целью настоящей работы является создание новых противотуберкулезных препаратов, активных против резистентного туберкулеза, а также носителя для них, способствующего проникновению препарата в клетки макрофагов и обеспечивающего таким образом его адресную доставку в места персистенции возбудителя болезни.

Проведен поиск новых противотуберкулезных препаратов в ряду пиридазино[4,3-b]индолов. Обнаружено соединение GS-1, обладающее высокой активностью в отношении возбудителя туберкулеза, включая и штаммы, устойчивые к «традиционным» противотуберкулезным препаратам рифампицину и изониазиду. Предложено два разных типа полимерных носителей для указанного препарата. Одним из них являются наночастицы хитозана и его гидрофобного производного, самопроизвольно образующиеся в водных растворах за счет гидрофобных взаимодействий. Методом динамического светорассеяния показано, что гидродинамический радиус наночастиц составляет порядка 150 нм.

Другим носителем являются нанокапсулы из поли(лактид-со-гликолида) и полиметакрилатных сополимеров типа Eudragit RL и RS, содержащих 5 и 2 мол.% катионных триметиламмониевых групп, соответственно, получаемые методом эмульгирования с последующим испарением органического растворителя. Средний размер нанокапсул был наименьшим для Eudragit RL и Eudragit RS (320 и 380 нм соответственно) и увеличивался до 490 нм для поли(лактид-со-гликолида). Эффективность капсулирования для Eudragit RL и Eudragit RS составляла около 50 % и 40 % соответственно. В настоящее время проводятся исследования кинетики высвобождения препарата из нанокапсул в условиях, моделирующих среду организма.

Изучено влияние полимерной матрицы на противотуберкулезную активность GS-1 двумя методами: (1) по росту микобактерий в жидкой питательной среде, содержащей исследуемые препараты, и (2) по контролю за размножением микобактериальных клеток (редупликацией микобактериальной ДНК) методом полимеразной цепной реакции. В первом методе оценивали действие препарата на «свободные» микобак-терии, а во втором случае – на микобактерии, фагоцитированные макро-фагами. Показано, что наночастицы вызывают усиление противотубер-кулезной активности GS-1, что особенно ярко выражено в случае микобактерий, захваченных макрофагами. Это позволяет предположить, что наночастицы способствуют проникновению препарата внутрь макрофагов. Более того, обнаружена высокая антимикобактериальная активность этих препаратов при испытании на клиническом штамме Mycobacterium tuberculosis № 70V, устойчивом к основному противо-туберкулезному препарату – изониазиду. Полученные результаты показывают, что данное направление исследований является весьма перспективным для создания новых противотуберкулезных препаратов.

СОЗДАНИЕ ОПТИМИЗИРОВАННОЙ ПРОТИВОБОЛЕВОЙ

И ПРОТИВОЗУДОВОЙ ТЕРАПИИ ДЛЯ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ, ПОЛУЧАЮЩИХ ХРОНИЧЕСКИЙ ГЕМОДИАЛИЗ, И БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ I ТИПА

Н.Н. Шестакова1), Н.П. Ванчакова2)

1)Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, 2)Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова

Благодаря современному медико-техническому уровню процедур гемодиализа и достижениям фармакологии значительно увеличилась продолжительность жизни больных хронической почечной недостаточностью (ХПН) и больных сахарным диабетом (СД). Однако сформировался новый круг проблем, обусловленных поздними осложнениями этих основных заболеваний. Согласно клиническим исследованиям более половины больных ХПН, а также больные СД испытывают скелетно-мышечные боли и зуд. Психическое состояние таких больных часто осложнено депрессией, чувством тревоги, что в свою очередь негативно отражается на эффективности их лечения. Согласно современной концепции такие больные нуждаются в корректирующей психотропной терапии. Известно, что некоторые антидепрессанты обладают противоболевой эффективностью. Природа зуда до конца неизвестна, однако есть основания полагать, что зуд – это проявление особого типа боли.

Нами разработана технология выявления и отбора среди антидепрессантов препаратов, обладающих способностью управлять синдромом зуда у больных ХПН. Используя методы теоретического конформационного анализа пространственных структур препаратов и клинические данные, мы показали, что эффективность препарата для управления синдромом зуда зависит от наличия в его структуре специфически организованной пространственной группировки: двух взаимоцентрированных ароматических колец, расположенных под углом 1200. Был сформулирован, клинически проверен и запатентован структурный критерий отбора in silico противозудных препаратов среди антидепрессантов. Моделирование in silicо позволило определить, что выявленная пространственная группировка способна образовывать комплексы с ионами натрия. Было выдвинуто предположение о роли описанной пространственной группировки в структуре молекулы антидепрессанта как способе приобретения ею новых дополнительных химических и физических свойств за счет положительного заряда, следовательно, и дополнительной физиологической активности. Условиям критерия удовлетворяли следующие антидепрессанты: миансерин, тианептин, амитриптилин, миртазапин, имипрамин, мапротилин, тразодон.

Нами впервые была клинически подтверждена эффективность миансерина и тианептина для управления синдромами боли и зуда у больных ХПН и СД 1 типа. Отмечено, что для мужчин наиболее эффективен миансерин, а для женщин – тианептин. Напротив, циталопрам, в структуре которого ароматические кольца расположены в иной ориентации, не проявил значимой эффективности для управления синдромами боли и зуда.

Отобранные эффективные препараты в настоящее время используются при лечении больных ХПН и СД 1 типа в клиниках СПГМУ. Разработанная комплексная терапия позволяет без увеличения количества назначаемых препаратов значительно улучшить качество жизни больных ПН и СД 1 типа.

4. Современные проблемы радиобиологии

РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К МОДИФИКАЦИИ ИНДУЦИРОВАННОЙ

РАДИАЦИЕЙ ХРОМОСОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ

УПРАВЛЕНИЯ КАНЦЕРОГЕННЫМ РИСКОМ

С.Г.Андреев1), Ю.А.Эйдельман1), А.В.Алещенко1), И.В.Сальников1), Л.П.Семенова1), А.В.Севанькаев2), И.К.Хвостунов2), В.С.Пятенко2), О.Н.Коровчук2), Е.А.Красавин3), Р.Д.Говорун3), О.В.Комова3), Е.А.Насонова3), Н.Л.Шмакова3), Л.А.Мельникова3), А.В.Борейко3), В.Н.Чаусов3), Н.Н.Вейко4), А.В.Ермаков4), Е.С.Ершова4), С.В.Костюк4)

1) Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва

2) Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск

3) Объединенный институт ядерных исследований, Дубна

4) Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Целью проекта является поиск возможностей модификации радиационно-индуцированной хромосомной нестабильности (РИХН) путем воздействия на системы поддержания стабильности генома (репарации повреждений ДНК, синтеза ДНК, окислительно-восстановительного гомеостаза). Известно, что двойные разрывы (ДР) ДНК, индуцированные ионизирующим излучением, приводят к образованию хромосомных аберраций (ХА) как непосредственно после облучения, так и в потомках облученных клеток, фенотип РИХН. Для -излучения основной вклад в образование ДР вносят продукты радиолиза воды, в т.ч. активные формы кислорода (АФК). Однако вклад в повреждения ДНК могут вносить и эндогенные АФК, не образованные непосредственно в треках электронов. Для оценки вклада эндогенных АФК в индукцию ХА получены данные о модификации зависимости доза-эффект в диапазоне доз -облучения 1сГр-2 Гр для ХА в первом митозе в клетках карциномы молочной железы cal51 в условиях действия ингибиторов АФК: DMSO, перехватчика свободных радикалов ОН, и PD 98059, ингибитора erk1-протеинкиназы (белка, предотвращающего радиационно-индуцированный окислительный стресс).

В качестве потенциальных модификаторов РИХН изучалось влияние ингибиторов репликативного и репаративного синтеза ДНК, арабинозидцитозина (Ара-Ц) и оксимочевины, на динамику ХА в ряду клеточных поколений. Для клеток СНО-К1 проведен анализ всех типов хромосомных и хроматидных аберраций, идентифицируемых без кариотипирования, одновременно с измерением кинетических кривых роста, митотического индекса и выживаемости клеток при введении ингибитора. Обнаружено влияние ингибиторов на выход аберраций хромосомного типа в клетках 2-3 митоза, а также существенное увеличение выхода хроматидных аберраций, в особенности в клетках 1 митоза. Показано повышение уровня ХА в первые циклы деления после облучения (1-3) по сравнению с ожидаемым на основе элиминации клеток за счет нестабильных ХА. Для выяснения причин повышенной частоты ХА во 2-3 митозе были проведены эксперименты по изучению ключевых факторов, вовлеченных в образование ХА: репарации ДР ДНК (визуализация ДР ДНК в клетках с помощью антител к гистону Н2АХ, определение кинетики репарации ДР ДНК методом «ДНК-комет») и пространственного расположения хромосом в интерфазных ядрах (FISH-мечение локуса 1q12 хромосомы 1) в различные сроки после облучения. Полученные данные свидетельствуют о повышенном уровне ДР по сравнению с контролем в клетках 2-3 и большего числа генераций. Высокий уровень ХА по сравнению с контрольным также обнаружен на временах, много больших 3 генераций (порядка 30), после облучения клеток как в стационарной, так и логарифмической фазах. Введение Ара-Ц и оксимочевины в первом цикле деления не влияет на динамику ХА после облучения в стационарной фазе, однако приводит к увеличению частот ХА в отдаленные сроки после облучения в логарифмической фазе. Результаты экспериментов интерпретируются в рамках развиваемых теоретических представлений о механизмах РИХН, основанных на индукции и трансмиссии повреждений ДНК в ряду клеточных поколений.

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ АНТИМУТАГЕНОВ

НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ГЕНОМА ОТ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ

В.А. Александрова1), Г.Н. Бондаренко1), Л.Ф. Бокша1), Г.П. Снигирева2),

Н.Н. Новицкая2)

1)Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН, Москва

2)Российский научный центр «Росмедтехнологий», Москва

Известно, что фенольные антиоксиданты (АО) находят широкое применение в качестве лечебных средств при различных заболеваниях, в том числе, в случае свободнорадикальной патологии, вызванной радиационным поражением. Однако существенным недостатком ряда фенольных АО является их плохая растворимость в воде, быстрый метаболизм, малая биодоступность к ответственным мишеням и др., что снижает их защитную эффективность.

Ранее на синтетических полимерах нами было показано, что сочетание гидрофильной матрицы поликатионной природы и структурных фрагментов фенольных АО, включенных в боковую цепь полимера, приводит к значительному усилению антимутагенной эффективности, что было подтверждено в тестах in vitro и in vivo. Однако синтетические поликатионы, используемые нами ранее в качестве модельных систем для разработки макромолекулярных антимутагенов, относятся к числу небиодеградируемых полимеров, что существенно ограничивает возможность их использования для защиты биологических объектов от ионизирующей радиации.

Данный проект направлен на преодоление указанных недостатков и посвящен разработке новых водорастворимых макромолекулярных анти-мутагенов на основе нетоксичного биодеградируемого поликатиона – хи-тозана и антиоксидантов растительного происхождения – флавоноидов. В качестве биологически активных веществ полифенольного типа из группы флавоноидов в работе были использованы эффективные ингибиторы радикальных реакций – кверцетин (Кв) и дигидрокверцетин (ДГКв).

Структуру синтезируемых конъюгатов хитозана с Кв или ДГКв подтверждали с использованием методов УФ- и ИК-Фурье-спектороскопии. Об отсутствии в конъюгатах примесей «несвязанных» с полимером АО судили по данным гель-хроматографического анализа. Синтезирован и охарактеризован ряд водорастворимых конъюгатов хитозана, содержащих Кв или ДГКв в количестве от 1 до 5% масс.

Для оценки антимутагенной эффективности конъюгатов хитозана с АО использовали цитогенетический метод, позволяющий анализировать частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови. В результате исследований, проведенных на первом этапе, показано, что конъюгаты хитозана проявляли выраженную (~50 %) антимутагенную эффективность (при введении вещества до или сразу после облучения в дозе 2 Гр). При этом сами конъюгаты не проявляли мутагенных эффектов даже при максимальной их концентрации в среде. Следует также отметить, что снижение частоты возникновения некоторых типов аберраций хромосом (парные фрагменты, атипические моноцентрики) достигало 75-85 % при использовании в качестве антимутагена – конъюгатов хитозана с АО растительного происхождения.

ДИНАМИКА ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ГИСТОНА Н2АХ КАК НОВЫЙ МАРКЕР ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА

НА РАДИАЦИОННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГЕНОМА

Н.В. Томилин, М.П. Светлова, Л.В. Соловьева, Д.И. Фирсанов, В.М.Михайлов

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Фосфорилирование Н2АХ в хроматине (образование фН2АХ) служит маркером двойных разрывов ДНК (ДР), которые образуются в клетках после воздействия ионизирующей радиации (ИР), и часто приводят к клеточной гибели или хромосомным перестройкам (ХП). Скорость образования фН2АХ отражает эффективность системного ответ клеток на повреждения генома и связана, по-видимому, с вероятностью злокачественной трансформации клеток. Выявлена корреляция между скоростью элиминации фН2АХ в культивируемых клетках, которая происходит медленнее, чем репарация ДР, и клеточной радиочувствительностью, однако молекулярный механизм этой элиминации не установлен и остается неизвестным, как быстро и равномерно происходит элиминация фН2АХ в облученных тканях. В данном проекте предусмотрены как фундаментальные исследования механизма образования и элиминации фН2АХ в клеточном ядре (раздел 1), так и исследования вариаций в скорости образования и элиминации ф-Н2АХ в различных клетках животных и человека (раздел 2), а также разработка и освоение простых методов иммунологической детекции ф-Н2АХ в различных биологических материалах (раздел 3). В 2007 году в исследованиях по разделу 1 установлено, что фосфорилирование гистона Н2АХ рядом с ДР в клеточном ядре приводит к торможению транскрипции, что не связано с преимущественным образованием фокусов ф-Н2АХ в факультативном или конституивном гетерохроматине, но может быть обусловлено прямым связыванием РНК полимеразы II ф-Н2АХ. Предложена гипотеза, согласно которой торможение транскрипции в участках хроматина, содержащих ф-Н2АХ, способствует формированию гибкого скаффолда, скрепляющего концы ДНК, уменьшает их диффузионную подвижность и подавляет неправильные (эктопические) воссоединения концов комплексом XRCC4-LIG4. Таким образом, торможение транскрипции рядом с ДР может быть важным антикластогенным фактором, подавляющим хромосомные перестройки, которые возникают вследствие неправильных (эктопических) воссоединений разрывов хромосом. В исследованиях по разделам 2 и 3 нами разработан новый простой метод анализа ДР в клетках мозга и других тканей из облученных экспериментальных животных. В этом методе отпечатки срезов на предметных стеклах фиксируют формальдегидом и окрашивают антителами на ф-Н2АХ, а также красителями ДНК (DAPI). Через 1 час после облучения в дозе 5 Гр 34 % ядер отпечатков головного мозга показывают присутствие ф-Н2АХ, тогда как в контроле таких ядер имеется ~2 %. Через 24 часа после облучения основная часть ф-Н2АХ элиминируется из клеток мозга (остается 7.4 % меченых ядер), что обусловлено, вероятно, репарацией ДНК и элиминацией ф-Н2АХ хроматин-ремоделирующими комплексами. Необходимо, однако, отметить, что элиминация ф-Н2АХ и восстановление структуры хроматина происходит, повидимому, медленнее, чем зашивание ДР, которое в основном завершается через 6 часов после облучения. Остается также открытым вопрос о полноте восстановления структуры хроматина и его исходного эпигенетического состояния в поврежденных участках, что необходимо изучить в дальнейших исследованиях.

ИЗМЕРЕНИЕ РЯДА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА КАК ВЕРОЯТНЫХ БИОМАРКЕРОВ ОТДАЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ НИЗКОДОЗОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ

Е.Б. Бурлакова, А.Н. Голощапов, С.М. Гуревич, Г.П.Жижина, Т.М.Заварыкина, Г.Ф.Иваненко, А.И.Козаченко, Л.Г. Наглер, Ю.А.Трещенкова, Л.Д.Фаткуллина

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Целью настоящей работы является изучение биомаркеров отдаленных последствий облучения человека в малых дозах, а именно, показателей антиоксидантного статуса организма. Проведено измерение содержания в периферической крови витамина Е, восстановленного глутатиона, глутатионпероксидазы и глутатинредуктазы, уровня МДА в эритроцитах как маркера эффективной дозы ИР, гемолиза эритроцитов и времени вращательной корреляции спиновых зондов как показателя текучести липидов мембран этих клеток. Были исследованы образцы крови 34 человек в возрасте 40-45 лет, не подвергавшихся воздействию ионизирующей радиации (ИР), и 35 пациентов той же возрастной группы, получивших малую дозу ИР 5-6 лет назад.

Обнаружено, что по большинству изученных параметров группа облученных лиц отличается от группы «контроля». Так, показано снижение содержания в плазме крови витамина Е и повышение уровня восстановленного глутатиона на отдаленные сроки после облучения. В эритроцитах обнаружено повышение содержания глутатионпероксидазы (ГП), супероксиддисмутазы (СОД), и напротив, снижение уровня глутатионредуктазы (ГР) и гемолиза этих клеток. В мембранах эритроцитов выявлена интенсификация процессов перекисного окисления липидов (по содержанию МДА), которая сопровождается изменением микровязкости мембран; в лимфоцитах – индукция однонитевых и двунитевых разрывов ДНК. Кроме того, проведенное измерение активности (А) антиоксидантных ферментов: СОД, ГР и ГП в эритроцитах у групп лиц разного возраста в интервале 25-65 лет показало, что в контроле АСОД сохранялась постоянной во всем исследованном возрастном интервале; АГП с возрастом до 35 лет практически не менялась, а от 35 до 55 лет снижалась почти вдвое. АГР в контрольной группе сохранялась постоянной до 50 лет, а затем возрастала.

Облучение приводит к изменению характера возрастных зависимостей активности антиоксидантных ферментов, а именно, к снижению активностей СОД и ГП в возрасте 40-45 лет. АГР у возрастных групп 25-40 лет оставалась постоянной на уровне контроля, а затем плавно снижалась, примерно в 2,5 раза к 65 годам. В норме СОД, ГП и ГР функционируют взаимосвязано, причем соотношение активностей АСОД/АГП и АГР/АГП сохраняется постоянным, обеспечивающим поддержание стационарной концентрации активных форм кислорода. У облученных молодых людей отношение АСОД/АГП оказалось выше, чем в контроле соответствующего возраста, почти в 3 раза, что указывает на наличие дисбаланса в антиоксидантной системе, характерного для стареющего организма.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что наиболее чувствительным звеном антиоксидантной системы человека к действию малых доз радиации являются ферменты глутатионового цикла. Прогноз отдаленных последствий действия низкоинтенсивного облучения в малых дозах указывает на то, что к группам повышенного риска можно отнести детей, молодых людей в возрасте 30 лет и людей старшего возраста.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ, МОДЕЛИРУЮЩЕГО РАДИАЦИОННЫЕ НАГРУЗКИ В УСЛОВИЯХ АВИАЦИОННЫХ ПОЛЕТОВ В АТМОСФЕРЕ НА ВЫСОТЕ 10 КМ,

НА МЫШАХ IN VIVО

С.И.Заичкина 1), О.М.Розанова 1), А.Х.Ахмадиева 1), Г.Ф.Аптикаева 1),

Е.Н.Смирнова 1), С.П.Романченко 1), В.Н.Пелешко 2)

1)Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

2)ГНЦ РФ Институт физики высоких энергий, Протвино

Целью настоящего проекта являлось изучение особенностей действия низкоинтенсивного излучения, моделирующего радиационные нагрузки в условиях авиационных полетов в атмосфере на высоте около 10 км, в области доз 0.5–16 сГр при средней мощности дозы 0.43 cГр/сут в клетках костного мозга мышей с помощью микроядерного теста. Были изучены дозовая зависимость, адаптивный ответ (АО) и генетическая нестабильность (ГН) в F1 и F2 поколениях мышей, рожденных от самцов, облученных дозами 0.5 и 16 сГр. Исследовали также генетическую нестабильность в клетках костного мозга мышей F2 и F3 поколений, рожденных от самцов, предварительно облученных этим же излучением в дозах 21.5 и 31.5 сГр (1 cГр/сут). Облучение мышей линии SHK проводилось круглосуточно в поле излучения за верхней бетонной защитой Серпуховского ускорителя протонов с энергией 70 ГэВ (У-70 ИФВЭ) в течение времени, необходимого для накопления доз, равных 0.5; 2; 5; 9 и 16 сГр. Для выявления адаптивного ответа через 24 ч соответствующие группы мышей облучались выявляющей дозой 1.5 Гр (1 Гр/мин) рентгеновского излучения. Исследование генетической нестабильности проводили на мышах F1 и F2 поколений, рожденных от самцов, облученных в дозах 0.5 и 16 сГр, а также F2 и F3 поколений, полученных от самцов, облученных дозами 21.5 и 31.5 сГр. Для определения уровня цитогенетического повреждения через 28 ч после облучения животных забивали методом цервикальной дислокации и по стандартной методике готовили препараты костного мозга.

В результате проведенных экспериментов было показано, что облучение мышей в дозах 0.5–16 сГр приводило к росту цитогенети-ческих повреждений и не индуцировало АО в клетках костного мозга. У самцов F1 и F2 поколений, рожденных от самцов, облученных дозами 0.5 и 16 сГр, спонтанный уровень цитогенетических нарушений был такой же, как у самцов, рожденных от необлученных родителей. У мышей, рож-денных от самцов, облученных самой низкой дозой 0.5 сГр как в F1, так и в F2 поколениях не наблюдалось изменения в радиочувствительности, в то время как в F1 отсутствовал АО при облучении по стандартной схеме, но индуцировался во втором поколении. Однако у мышей, рожденных от самцов, облученных в дозе 16 сГр, наблюдалось повышение чувствительности к дополнительному облучению в дозе 1.5 Гр и отсутствие индукции АО как в F1, так и в F2 поколениях, что указывает на генетическую нестабильность. У мышей F2 и F3 поколений, полученных от самцов, облученных дозами 21.5 и 31.5 сГр, как и было нами ранее показано в F1 поколении, сохранялась ГН, которая проявлялась в отсутствии АО. Полученные данные могут быть использованы для оценки отдаленных последствий действия низких доз хронического воздействия излучений с высокими значениями ЛПЭ и радиационных рисков при долговременных авиационных и пилотируемых космических полетах, а также для разработки теоретических основ адаптационной медицины.

ОЦЕНКА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ НА ОСНОВЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

Г.М. Попова, Ю.О. Дружинин, В.Н. Степанов, И.Ф. Дятчина1), И.А.Альбицкий, А.Н. Богомазова, Е.И. Новикова, Н.Н. Новицкая, Г.П.Снигирёва2)

1)Институт проблем управления им. В.А. Трапезников РАН, Москва.

2)ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Росздрава», Москва

Одним из чувствительных методов, которые могут применяться для оценки индивидуальной радиочувствительности онкологических больных, проходящих лучевую терапию, является метод «комет». В рамках Программы РАН «Фундаментальные науки медицине» на 2006 г. для определения чувствительности данного метода, была разработана программа-анализатор кометообразных структур, позволяющая наглядно и эффективно определять и выделять неповрежденные и поврежденные ядра, а также оценивать морфометрические параметры изображений «комет».

В процессе работы программа – анализатор «комет» подверглась модернизации, повысившей скорость и удобство проведения анализа. Была добавлена программа поддержки камер стандарта PVCAM для прямого захвата изображения и предусмотрена возможность изменения масштаба просмотра изображения «комет».

На основе анализатора изображений микрообъектов был организован морфометрический мониторинг препаратов комет, который позволил оценить состояние репарационного аппарата клеток крови онкологических больных перед прохождением лучевой терапии. Были обследованы 31 пациент с диагнозом «рак предстательной железы». На больших выборках «комет» с помощью морфометрических параметров их изображений удалось установить связь между эффективностью репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК и наличием или отсутствием поздних лучевых повреждений. Проведенные исследования показали, что существует достоверная связь между клиническими осложнениями (поздний лучевой ректит) и показателями эффективности репарации в клетках крови. Показано, что наибольшую прогностическую значимость имеет показатель, характеризующий долю отрепарированных повреждений ДНК спустя 60 мин после облучения образцов крови in vitro.

В процессе исследований было выявлено, что на результаты анализа методом «комет» оказывают существенное влияние ряд факторов (условия проведения электрофореза и предподготовки препаратов), которые необходимо учитывать для повышения надежности, достоверности и воспроизводимости полученных результатов. С этой целью в рамках настоящего проекта были выполнены экспериментальные исследования по оценке влияния условий проведения анализа методом «комет» на воспроизводимость его результатов.

Для верификации полученных с помощью метода «комет» резуль-татов, а также для выбора наиболее чувствительного теста индивиду-альной радиочувствительности, основанном на изучении репарационной способности клеток, начаты исследования с помощью иммуногисто-химического метода с использованием антител к фосфорилированному гистону -H2AX и белку Rad50. В докладе будут представлены результаты проведенных экспериментальных исследований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВЛИЯНИЯ ГЕЛИОГЕОФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА БИОСИСТЕМЫ

В.В. Леднев, Н.А. Белова, Л.К. Сребницкая, А.М. Ермаков

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

Задачи проекта на отчетный период: (1). Выяснить механизмы биологического действия крайне слабых переменных магнитных полей (КС ПеМП) сравнимых по амплитуде с природными периодическими магнитными пульсациями типа Рс-1. (2). Провести сравнительное изучение влияния природного радиоактивного фона на биологические и физико-химические системы, помещенные внутри экранов выполненных из парафина, полиэтилена и свинца.

Для решения задачи (1) мы изучили зависимость величины биоэффектов КС ПеМП от частоты поля (0-6000 Гц) при постоянной амплитуде (ВАС = 192 нТл) и от амплитуды поля (30-500 нТл) при постоянной частоте (fАС = 1000 Гц). Величину биоэффектов оценивали по изменениям скорости регенерации плоских червей (планарий), скорости развития гравитропической реакции в сегментах стеблей льна, а также скорости генерации активных форм кислорода в суспензии перитонеальных нейтрофилов мышей. Наиболее детальные исследования были выполнены с использованием регенерирующих планарий.

Согласно теории, величина биоэффектов зависит от значения пара-метра ВАС/f, где - гиромагнитное отношение для данного типа магнит-ного момента, а ВАС и f соответственно, магнитная индукция и частота переменного магнитного поля. Максимальные величины биоэффектов КС ПеМП ожидаются при значениях параметра ВАС/f = 0.9 и 2.75, в то время как при ВАС/f = 1.8 эффект должен отсутствовать. Экспериментально на-блюдаемые положения максимумов и минимумов биоэффектов совпадают с теоретическими предсказаниями при значении = 14000 Гц/мкТл. Отсюда следует, что первичными мишенями КС ПеМП данного типа являются магнитные моменты, создаваемые орбитальным движением электронов в атомах (диамагнитными токами). Полученные данные свидетельствуют о возможности прямого воздействия периодических пульсаций типа РС 1 геомагнитного поля на здоровье человека.

Для решения задачи (2) мы провели сравнительное изучение динамики изменения электрофизических свойств (рН, удельная электропроводность) воды различных типов, находящихся в открытых и закрытых сосудах, а также в экранах, выполненных из парафина и свинца. Электрофизические показатели воды, находящиеся в открытых сосудах, т.е. в контакте с воздухом не достигают равновесных значений (ожидаемых согласно закону Генри) и непрерывно изменяются в течение, по крайней мере, 4-5–дневного периода наблюдений. В то же время электрофизические показатели воды, находящейся в закрытых сосудах, (крышками от чашек Петри, пленкой парафильма) практически не изменяются. В частности, величина электропроводности дистиллированной воды в открытых сосудах через 4-5 суток увеличивается примерно на 1000 %; при одновременном снижении величины рН примерно на единицу. Помещение открытых сосудов с водой в парафиновый или свинцовый экраны предотвращает какие-либо существенные изменения электрофизических свойств воды. Аналогичные исследования были проведены нами с водопроводной водой, а также с водными растворами солей двухвалентного железа и меди. Совокупность полученных данных позволяет предположить, что наблюдаемые изменения электрофизических показателей водных растворов, находящихся в прямом контакте с воздухом обусловлено непрерывным растворением в воде ряда аэроионов и, в первую очередь аэроионов, образующихся в результате взаимодействия окислов серы и азота с парами воды. Наблюдаемые эффекты являются лабораторным аналогом загрязнения природных водоемов в результате воздействия так называемых кислотных дождей.

РАДИОПРОТЕКТОР ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНДОМЕТОФЕН: МЕХАНИЗМЫ ПОВЫШЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА

К ПРОЛОНГИРОВАННОМУ ОБЛУЧЕНИЮ С НИЗКОЙ МОЩНОСТЬЮ ДОЗЫ, СОЗДАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ И ПОДГОТОВКА

К КЛИНИЧЕСКИМ ИСПЫТАНИЯМ ПРЕПАРАТА

М.К. Пулатова1), В.Л. Шарыгин1), А. Е. Сипягина2), Т.Г. Шлякова3)

1) Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва;

2) НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, Москва;

3) ГНЦ – Институт биофизики ФМБА России, Москва

Потребностью сегодняшнего дня является создание радиопротектора, эффективного в условиях пролонгированного облучения с низкой мощностью дозы. Таким радиопротектором является индометофен (ИМ), созданный усилиями сотрудников ряда Институтов МЗ РФ и РАН. ИМ повышает общую неспецифическую резистентность организма. В 2007 г было продолжено доклиническое изучение ИМ. Установлена роль радиопротектор-индуцированной активации синтезов дезоксирибонуклео-тидов (дНТФ), ДНК и белков в органах животных в механизме формирования радиорезистентности, которая оценивалась по тесту выживаемости животных (собаки, мыши, крысы). Скорость-лимитирующей стадией в синтезе ДНК является синтез дНТФ, катализируемый рибонуклеотидредуктазой (РР). В связи с этим было изучено влияние природных и синтетических антиоксидантов (АО) на РР активность в радиочувствительных органах. Показано, что АО стимулируют синтезы дНТФ, ДНК и белков при их применении в строго определенных дозах. Однако характер ответов этих систем синтезов на действие АО оказался дозовозависимым: большие дозы АО при однора-зовом или многоразовых приемах подавляли синтезы дНТФ, ДНК и белков. Показано также, что ИМ и АО влияют на пулы белков крови Fe3+- трансферрина и Cu2+-церулоплазмина, контролирующих синтез железосодержащей РР в кроветворных органах. Для лекарственных препаратов, содержащих молекулы с амино-, нитро- и нитрозогруппами (потенциальных доноров оксида азота NO) было установлено ингибирующее действие NO на синтез дНТФ, которое является результатом инактивации РР при связывании NO с ионами железа субъединицы М2 РР. Для обеспечения клинических испытаний были проведены две серии синтеза и наработки новых партий субстанции и лекарственных форм ИМ (капсулы, таблетки), а также препараты «плацебо». Проводили контрольный анализ препаратов на микробиологическую чистоту и соответствие их физико-химических свойств паспортным данным. Для всех партий ИМ проводили оценку радиозащитной эффективности в опытах на собаках по тесту выживаемости облученных животных. Партии препаратов, прошедшие контроль и проверку на активность, чистоту и радиозащитную эффективность, будут использованы при проведении клинического изучения ИМ, целью которого является обоснование дозы, оптимально повышающей резистентность организма и не токсичных для человека. Показано, что при создании противолучевых средств, эффективных при пролонгированном облучении в несмертельных дозах, важнейшим фактором является исходная индивидуальная радиочувствительность, определяющая способность организма к восстановлению нарушений и компенсации клеточного состава и функций органов. Зависимость радиозащитной эффективности ИМ от исходного состояния животного была четко выявлена в опытах на собаках. Установлены маркеры периферической крови, позволяющие в эксперименте и клинике с помощью высокочувствительного метода ЭПР на образцах цельной крови контролировать повышение резистентности организма, устанавливать сроки достижения оптимального ее повышения после применения радиопротекторов, что важно для определения времени облучения, дозы препарата и режимов его применения.

КОМПЛЕКСНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСГЕНЕРАЦИОННЫХ ГЕНОМНО-ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ДЕТЕЙ ОБЛУЧЕННЫХ РОДИТЕЛЕЙ. СВЯЗЬ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

С ГЕНОТИПИЧЕСКИМ СТАТУСОМ ОРГАНИЗМА

А.В.Рубанович1, А.В.Агаджанян1, Э.А.Акаева1, Т.В. Елисова1, Э.Л.Иофа1, Л.Н. Костина1, Г.И. Кузнецова1, Н.С. Кузьмина1, Н.Ш. Лаптева1, И.Н.Нилова1, Л.Е. Сальникова1, И.И. Сусков1, В.С. Сускова2, Д.К.Фомин3

1) Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва

2)ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий, Москва

3)ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий», Москва

Проведено комплексное изучение по цитогенетическим и иммуногенетическим критериям состояния генома лимфоцитов у отцов-ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС и их необлученных детей. В обоих поколениях выявлены повышенные частоты аберраций хромосом, генных мутаций (TCR-мутации) и предикторов апоптоза (клетки с иммунофенотипом СD95+). В результате анализа сопряженности между изученными показателями выявлены отличительные особенности, характерные для индукции геномной нестабильности в организме необлученных детей, по сравнению с отцами-ликвидаторами, перенес-шими непосредственное радиационное воздействие.

Проведено исследование зависимости уровня нестабильных хромосомных аберраций и неонкологической заболеваемости от генотипов у 57 ликвидаторов аварии на ЧАЭС. В качестве генов-кандидатов, предположительно влияющих на радиочувствительность, были выбраны высокополиморфные локусы генов детоксикации ксенобиотиков глутатион-S трансфераз (GSTM1, GSTT1, GSTP1) и 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) – гена, участвующего в метилировании и синтезе ДНК. В выборке ликвидаторов в 2006-2007 годах сохраняется повышенная частота нестабильных хромосомных аберраций, которая составляет 0,0140,001, в том числе радиационно-специфических дицентриков и центрических колец – 0,00150,0002 на клетку. Не обнаружено ассоциаций полиморфизма по каждому из отдельно изученных генов с цитогенетическими показателями. Выявлены более высокие частоты хромосомных аберраций у гомозиготных носителей делеции по локусу GSTM1 в сочетании с гомозиготностью по минорным аллелям в локусах MTHFR и GSTP1 (P=0,00002 и P=0,0233, соответственно). Среди больных с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и в группе ликвидаторов, перенесших острые нарушения кровообращения (ОНК), увеличено число гомозиготных носителей минорного аллеля GSTP1 (P=0,014 и P=0,04, соответственно). Двойные гомозиготы по делециям GSTM1 и GSTT1 достоверно чаще встречались среди лиц с доброкачественными новообразованиями (кисты, полипы, P=0,015) и с доброкачественными изменениями щитовидной железы (P=0,017). Этот же генотип оказался протективным для пациентов с наиболее тяжелыми болезнями сердечно-сосудистой системы (острые нарушения кровообращения, P=0,027).

ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРИ И МЕЖГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА НУК-ЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В ОБЛАСТИ ЯДРЫШ-КОВОГО ОРГАНИЗАТОРА У ЧЕЛОВЕКА И ВЫСШИХ ОБЕЗЬЯН

А.П. Рысков, Д.В. Шибалев, К.К. Нечволодов, Н.С. Куприянова

Институт биологии гена РАН, Москва

Рибосомный межгенный спейсер (рМГС) человека содержит в своей центральной части два высоко гомологичных повтора, размером 2 т.п.н., LR1 и LR2. Нами изучалась гетерогенность вариабельных сегментов LR2 (LR2var) в рМГС человека. Определены нуклеотидные последовательности 547 копий LR2var из десяти неродственных геномов человека. Централь-ную часть практически у всех вариантов LR2var занимают протяженные сложные микросателлитные кластеры (G) n (AG) m, с произвольно варьиру-ющими значениями ‘n’ и ‘m’. Нуклеотидные последовательности, фланки-рующие центральный микросателлитный кластер, представлены более чем тридцатью структурными группами, из которых две (A и B) являются основными и шесть (C-H) минорными вариантами. Анализ результатов секвенирования позволяет предположить, что вариабельность LR2var, помимо неточного спаривания цепей за счет соскальзывания в процессе репликации, может возникать за счет неравного кроссинговера и сег-ментарного обмена ДНК между LR1var и LR2var по механизму генной кон-версии. рМГС человека значительно отличается по нуклеотидной после-довательности и распределению регуляторных элементов от рМГС мыши, крысы и Xenopus laevis. Нами амплифицированы, клонированы и секве-нированы фрагменты рМГС человекообразных обезьян Pan troglodytes, Gorilla gorilla и Pongo pygmaeus., размером более 2 т.п.н., непо-средственно предшествующие точке начала транскрипции. Выравнивание вновь полученных нуклеотидных последовательностей высших приматов с ортологичной областью человека показало, что области гомологии меж-ду ними распределяются неравномерно. Между 40952 –41021 п.н. (в соот-ветствии с нумераций нуклеотидов в рДНК человека по U13369) лока-лизован элемент Alu1, и гомология здесь составляет 85 %. Далее, на про-тяжении ~ 350 п.н. гомология не превышает 50 %, и возрастает до преж-него (~85 %) значения вплоть до стартовой точки транскрипции (от 41350 до 43000 п.н.). Значение таких перепадов гомологии должно стать яснее после проведения функционального картирования данного участка рМГС.

Ранее было высказано предположение, что микросателлиты, видоспецифичные для предпромоторной области рДНК человека, могут исполнять роль энхансеров транскрипции. Для проверки этого предположения в качестве мишеней были синтезированы два 40-mer олигонуклеотида, соответствующих наиболее характерным микро-сателлитным мотивам из предпромоторной области рДНК высших приматов и использованы для экспериментов по изменению электрофоретической подвижности белков из экстрактов клеток HeLa (EMSA). Полученные результаты не выявили связывания между двунитчатыми олигонуклеотидами и белками экстракта, тогда как комплексы белков с однонитчатыми олигонуклеотидами (CTTT) 10 и (AGGG) 10 активно образовывались. Белки были идентифицированы методом масс-спектрометрии В. Куровой (лаб. Е.Н. Николаева, Институт биохимической физики РАН) как глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) и каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs), соответственно.

ВЫЯВЛЕНИЕ ПОВЫШЕННОЙ НАСЛЕДСТВЕННОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ С ПОМОЩЬЮ ОЦЕНКИ РЕПАРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА НА КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ

В.М.Михельсон, И.М.Спивак, Т.В.Зимарина, Е.А.Полуботко, Н.В.Томилин

Институт цитологии РАН

Возможность определения наследственной радиочувствительности крайне важна как для людей, у которых в семьях были выявлены больные с синдромами повышенной радиочувствительности, предрасположен-ности к развитию опухолевых заболеваний или для лиц, чья профессиональная деятельность связана с возможными повреждающими воздействиями (врачи-рентгенологи, работники вредных химических производств, атомных станций и пр.). Нами были изучены методом проточной цитометрии и методом электрофореза отдельно взятых клеток (метод комет) набор клеточных штаммов от больных атаксией-телеангиэктазией (АТ) и их кровных родственников и от больных немедуллярным раком щитовидной железы и их кровных родственников. Изменение параметров клеточного цикла после облучения у гетерозиготных носителей АТ и лиц с семейной предрасположенностью к немедуллярному раку щитовидной железы не столь ярко выражены, как у больных, но достоверно отличаются от таковых здорового донора. И в том и в другом случае при облучении у обследованных пациентов G2/M-блок сохраняется в течение нескольких суток после облучения. Если в клетках здорового донора распределение клеток по фазам клеточного цикла быстро восстанавливается, то для гетерозиготных носителей наследственной патологии мы наблюдаем промежуточное состояние, то есть более медленное, чем в контроле, обращение блоков клеточного цикла. Способность к воссоединению разрывов ДНК после облучения в дозе 5 Гр также достоверно снижена в клетках больных по сравнению с клетками здорового донора, но их репаративный потенциал в обоих случаях существенно выше, чем у больных. Если клетки здорового донора способны воссоединить за 2 часа не менее 90 % разрывов ДНК, то в клетках больного немедуллярным раком щитовидной железы количество воссоединенных за это же время разрывов не превышает 20 %, а в клетках члена той же семьи – гетерозиготного носителя – 50 %. Таким образом, использование метода комет и проточной цитометрии является достаточно удобным и адекватным для того, чтобы дискриминировать гетерозиготного носителя заболевания от здорового донора и может быть применено в медицинской практике.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК И ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА

В СЕТЧАТКЕ МЫШЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И МЕТИЛНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ

В.А.Тронов1), М.Ю.Логинова2), Т.А.Белецкая,1) А.Д.Козлова1), Т.Б.Фельдман2)

1)Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Москва

2)Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Спонтанный и индуцированный апоптоз фоторецепторов сетчатки лежит в основе распространенных патологий зрительных органов – дистрофии сетчатки и пигментного ретинита. Существуют экспериментальные доказательства в пользу двух механизмов инициации апоптоза в фоторецепторах. Первый связан с увеличением уровня внутриклеточного кальция и активацией кальпаина и эффекторной каспазы-12, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме. Второй механизм связан с накоплением повреждений ДНК и дефицитом их репарации. Он наименее изучен в клетках сетчатки.

Цель работы состояла в изучении радиационно- и химически-индуцированного апоптоза клеток сетчатки, в котором пусковым событием предполагается повреждение ДНК. Объектом исследования были сетчатка мышей линии СВА (in vivo) и лимфоциты крови человека (in vitro). В качестве генотоксических агентов использовали гамма-облучение и метилнитрозомочевину (МНМ). Для оценки повреждения ДНК и репарации использовали метод ДНК-комет. Частоту апоптотических клеток оценивали по частоте «апоптотических» ДНК-комет, формируемых клетками in vitro спустя >24 ч после введения агента, считая это время достаточным для завершения репаративных процессов, инициированных МНМ в клетках. Дегенеративные изменения сетчатки и признаки апоптоза наблюдали микроскопически на стандартно фиксированных и окрашенных тканевых срезах.

Показано, что в/б введение мышам МНМ (50-70 мг/кг) вызывало деструктивные изменения сетчатки, выражавшиеся в >2-кратном изменении толщины наружного сетчатого и фоторецепторного слоев клеток, в характерной для апоптоза гиперконденсации хроматина и фрагментации ядер клеток фоторецепторного слоя. Гамма-облучение мышей не вызывало таких изменений в сетчатке. Апоптогенная способность МНМ резка снижалась в узком диапазоне доз агента: при дозе 35 мг/кг эффект отсутствовал. Морфологическим изменениям в сетчатке предшествовало формирование в ДНК щелочелабильных сайтов и разрывов, которые представляют собой интермедиаты процесса репарации метилированных оснований. Эффективность репарации зависела от дозы МНМ: в дозе 35 мг/кг (не вызывающей апоптоза в сетчатке) до 80 % возникших повреждений ДНК удалялись к 48 час после введения агента. Уровень репарации после введения МНМ в апоптогенной дозе не превышал 20 %. Мы полагаем, что это снижение репаративной активности связано с ингибированием активности генов, кодирующих белки репарации в результате повреждения самих генов под действием МНМ. Подавление активности ДНК-метилтрансферазы с помощью субстратного ингибитора 06-бензилгуанина увеличивало выход разрывов ДНК, но не изменяло динамику и эффективность репарации в клетках сетчатки. Метоксиамин снижал эффективность эксцизионной репарации модифицированных оснований ДНК в клетках сетчатки и усиливал цитотоксический эффект МНМ на сетчатку мышей in vivo.

Полученные результаты говорят о связи повреждений ДНК с индук-цией апоптоза в клетках сетчатки у мышей под действием МНМ. В то же время наши результаты не исключают того, что цитотоксическое действие МНМ на сетчатку мышей может быть опосредовано репарацией возник-шего обширного повреждения генома, что приводит к энергетическому коллапсу и гибели клеток. Наши дальнейшие исследования путей апоптотического сигналинга в сетчатке проверят эту возможность.

ИНДИВИДУАЛЬНАЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ

И.И. Пелевина1), В.Я. Готлиб1), О.В. Кудряшова1), Н.Ю. Воробьева1), Е.Ю. Лизунова 1), А.Н. Осипов1), А.М. Серебряный2), А.В. Алещенко2), Л.П. Семенова2), В.К. Боженко3), Т.М. Кулинич3), Г.П. Снигирева3)

1)Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва

2)Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва

3) ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Росздрава, Москва

Одним из важнейших методов лечения онкологических больных является лучевая терапия, которая используется самостоятельно или в сочетании с другими агентами. Известно, что чувствительность опухолей одного и того же типа у отдельных больных резко различается, что существенно осложняет разработку общих подходов к лечению. Поэтому выявление показателей, по которым можно было бы определить индивидуальную реакцию отдельных больных на радиационные воздействия, представляется важной проблемой.

Целью настоящей работы является определение индивидуальной чувствительности лимфоцитов крови онкологических больных на проведение курса локальной лучевой терапии и изменений чувствительности лимфоцитов к дополнительному облучению in vitro по сравнению со здоровыми донорами.

Были обследованы пациенты с разными типами опухолей, но детальный анализ был проведен у больных раком предстательной железы. Определяли следующие показатели: поврежденность ДНК и степень ее репарации, гибель клеток по пути апоптоза, частоту клеток с микроядрами (МЯ) и нестабильные аберрации хромосом.

Было обнаружено, что спонтанный уровень двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК), которые определяли методами ДНК-комет, выявления фосфорилированного гистона Н2АХ и включения бромдезоксиуридина, повышен у онкологических больных до лечения по сравнению со здоровыми донорами. Поврежденность ДНК лимфоцитов в процессе лечения еще более возрастает. При дополнительном облучении (в дозе 1Гр) лимфоцитов in vitro у леченых больных радиочувствительность выше, чем у больных, не подвергавшихся лучевой терапии (до лечения).

Эффективность репарации ДР ДНК лимфоцитов до и во время лечения различаются не существенно. Обнаружено возрастание доли лимфоцитов в стадии раннего апоптоза у онкологических больных до лечения (по сравнению со здоровыми донорами) и значительное возрастание доли клеток, гибнущих как по пути апоптоза, так и некроза во время курса лучевой терапии и дополнительного облучения in vitro.

Частота клеток с цитогенетическими повреждениями у большинства онкологических больных по сравнению со здоровыми индивидуумами повышается при лечении. Особенно следует отметить, что частота всех изученных молекулярно-биологических и цитогенетических показателей сильно варьирует у отдельных индивидуумов.

Результаты работы показывают, что у онкологических больных как до, так и во время лечения, отмечается повышение уровня поврежден-ности ДНК, гибели лимфоцитов, частоты клеток с МЯ, а также высокая повреждаемость ДНК при облучении лимфоцитов in vitro. Можно пола-гать, что наблюдаемые у большинства онкологических больных увеличе-ние поврежденности генома лимфоцитов при лечении и повышение доли гибнущих клеток являются показателями эффективности лечения.

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОСАЖДЕНИЯ ЦЕЗИЯ-137 IN SITU МИКРОФЛОРОЙ БАССЕЙНОВ-НАКОПИТЕЛЕЙ НИЗКОАКТИВНЫХ ЖРО ГХК г. ЖЕЛЕЗНОГОРСКА

А.В. Суслов, И.Н. Суслова, В.П. Степанова, Н.А. Суслова

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина

В настоящее время одним из приоритетных направлений в нашей стране является проблема здоровья населения, проживающего в местах с высоким уровнем техногенных загрязнений, а такими являются практически все мегаполисы и промышленные районы. А одним из наиболее перспективных и мягких методов решения проблемы очистки окружающей среды от наиболее опасных загрязнителей, таких как тяжелые металлы и радионуклиды, является метод биоремедиации, т.е. метод, использующий способности как природных, так и созданных методами генной инженерии микроорганизмов осуществлять сорбцию ионов тяжелых металлов и радионуклидов. На основе этого метода во всем мире уже разработаны технологии очистки и выделения самых разнообразных металлов, однако еще нет достаточно эффективных технологий по очистке от радионуклидов, в частности, таких как 137Cs и 90Sr. Для выполнения данной задачи нами была собрана большая коллекция микроорганизмов, обитающих в зонах с экстремальными условиями, как природными (такими как полуостров Камчатка и острова Курильской гряды), так и в различных техногенных местах обитания (технологические воды реактора ВВР-М и цеха водоочистки ПИЯФ, озер-накопителей низкоактивных жидких отходов радиационно-химического производства ГХК г. Железногорска, содержащих до до 3·107 Бк/л ионов 137Cs и 3·107 Бк/л ионов 90Sr).

Около 500 штаммов из этой собранной коллекции нами были проверены на способность расти на твердых и в жидких Д-средах, содержащих различные концентрации тяжелых металлов, до 10 мМ/л солей урана и/или никеля, до 100 мМ/л цезия и/или стронция. Одновременно проводится работа с использованием различных методов, таких как TXRES (Total-Reflection X-Ray Fluorescence Spectrometry), радиометрические и микробиологические эксперименты по определению сравнительных характеристик данных штаммов и эффективности связывания ими ионов исследуемых металлов и радионуклидов. Выделен ряд природных штаммов, способных эффективно связывать при комнатной температуре Ni2+ – металл, который наиболее часто присутствует в технологических отходах. На данных штаммах проведены исследования способности клеток связывать как нерадиоактивный ион никеля, так и его радиоизотоп 63Ni. Более 20 штаммов были отобраны для проведения модельных экспериментов по связыванию 137Cs/90Sr из стандартной ростовой среды и 18 штаммов – 238U. Начата работа по видоопределению отобранных штаммов. Предварительные исследования показали, что часть из них относятся к роду Rhodotorula (видам Rh. minuta и Rh. mucilaginosa), а также роду Candida (Cand. Haemulonii).

На основании полученных результатов нами был отобран ряд штаммов, а именно KII-110-3, KI-20-1a, KI-17-2, KI-17-5-1 и KI-215-4 для натурных экспериментов на ГХК г. Железногорска, обладающих наибольшей эффективностью связывания 137Cs (до 85 %) из модельных ростовых сред, близких по составу к растворам озер накопителей 354а и 365г низкоактивных жидких технологических отходов радиационно-химического производства ГХК.

НАСТОЛЬНЫЙ СВЧ-ЭЦР УСКОРИТЕЛЬ ЭЛЕКТРОНОВ

В ЗЕРКАЛЬНОЙ МАГНИТНОЙ ЛОВУШКЕ – ГЕНЕРАТОР НЕПРЕРЫВНОГО ТОРМОЗНОГО (ХАРАКТЕРИСТИЧЕСКОГО)

РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В ЭНЕРГЕТИЧЕСКОМ ДИАПАЗОНЕ 0,05 – 0,5 МэВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

В РАДИОБИОЛОГИИ МАЛЫХ ДОЗ

К.Ф. Сергейчев1), Д.М. Карфидов1), Н.А. Лукина1),

Л.Н. Шишкина2), М.А. Смотряева2), М.А. Климович2)

1)Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН

2) Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 |

5

| 6 | 7 |   ...   | 8 |