«ОТЧЕТ О НАУЧНОМ ИССЛЕДОВАНИИ № 11.G34.31.0036 от «25» ноября 2010 г. (промежуточный – 1 этап) ...»

Метод клинического и патоморфологического анализа заболеваний (макроуровень). В 1970-е г. методы патофизиологических исследования рыб получили широкое развитие в связи с участившимися случаями их массового отравления вследствие загрязнения природных водоемов. Методы клинического и патолого-анатомического обследования организмов, применяемые в ветеринарии и медицине, были использованы для обследования рыб с целью оценки последствий токсичного загрязнения водоемов. О.Н. Крылов [33] и Н.М. Аршаница [34] предложил схему описания симптомов отравления рыб и пятибалльную систему оценки тяжести их заболеваний. В настоящее время получено много данных о воздействии различных групп токсикантов на жизнедеятельность рыб, а также о многочисленных биохимических, физиологических и морфологических нарушениях, возникающих в организмах под их воздействием.

Метод клинического и патологоанатомического обследования организма применяется для массового обследования рыб в зонах загрязнения. Визуальное определение признаков интоксикации организма (макродиагностика) проводится в первый час после отлова рыбы [35]. При внешнем осмотре обращют внимание на интенсивность окраски (состояние пигментных клеток - меланофоров); целостность плавниковой каймы и лучей; общее содержание слизи на теле рыбы; состояние чешуйного покрова, жаберных крышек, ротовой полости, анального отверстия; на случаи гиперемии, подкожных кровоизлияния или появления язв, гидремии тела; деформацию костей черепа и скелета, а также состояние хрусталика и роговицы глаза. При открытых жаберных крышках обследуют жабры, отмечают их цвет, наличие и количество слизи, состояние жаберных лепестков (срастание, слипание, расширение или истончение).

При вскрытии брюшной полости исследуют состояние мышц (цвет, консистенция, кровоизлияния, прикрепление к костям), наличие эксудата в брюшной полости, количество полостного жира, его цвет и консистенция. Отмечают топографическое расположение внутренних органов (печень, почка, гонады, селезенка, сердце, желудок, кишечник), их размер, цвет, консистенцию, характер краев, кровоизлияния, очаги некроза. Осматривают слизистые на вскрытых желудках и кишечниках. Исследуют головной мозг, обращают внимание на кровенаполнение сосудов, их цвет и консистенцию.

Важным аспектом диагностики здоровья особей в зоне загрязнения является определение степени поражения организмов. Например, в очагах загрязнения до 70 % особей может быть в состоянии, близком к летальному порогу, при невысокой токсичной нагрузке - столько же, но нарушения в организме рыб могут быть незначительными и не угрожать жизни. Для оценки состояния организма рыб на основе клинического и патологоанатомического обследования эксперты предлагают различные балльные системы [34, 36, 37]. На основе их обобщения при макродиагностике состояния рыб предлагается выделять 3 стадии заболевания (0 - здоровые особи):

1 - отклонения от нормы незначительные и не представляют угрозу для жизни организма;

2 – отклонения средней тяжести, характеризующие критическое состояние организма;

3 – ярко выраженные симптомы интоксикации, свидетельствующие о неизбежной гибели организма.

Общий индекс заболеваний рыб (Z) в конкретной зоне загрязнения может быть определено выражением:

Z = (1N1 + 2N2 + 3N3 ) / Ntot:

N1, N2, N3 - соответственно число рыб на 1-й, 2-й и 3-й стадиях заболеваний, Ntot – общее количество исследованных рыб в локальной зоне загрязнения, включая здоровые особи, а усиливающий коэффициент (1, 2 и 3) отражает степень тяжести интоксикации. Если в водоеме все рыбы не имеют признаков токсикозов, то Z = 0. Значение будет повышаться как при увеличении числа больных, так и при повышении тяжести заболевания.

S.M. Adams et al. [38] вводят понятие - индекс оценки здоровья организма (HAI). Определение индекса проводится на основе обследования группы рыб, обитающих в загрязненных и фоновых условиях, что созвучно с нашими предложениями. Морфологические отклонения от нормы определяются визуально и общий индекс здоровья определяется по сумме баллов для органов. Этот метод аналогичен предложенному позднее Ю.С. Решетниковым [37] методу оценки состояния организма рыб, при котором нарушения в каждом органе суммируются. Однако в случае, если изменения наблюдается незначительные в 3-4 жизнеобеспечивающих системах, особи могут существовать, но тяжелые патологии одного органа могут привести к летальному исходу. Бесспорно, все рассмотренные методы могут быть отнесены к разряду полуколичественных, поскольку окончательные значения зависят от квалификации эксперта. С другой стороны – выделить отклонения от нормы и 3 стадии заболеваемости можно и при небольших навыках работы и ошибка в этом определении минимальная. Но, как показано на нашей схеме, необходимы биохимические и патогистологические дополнительные исследования, которые позволяют более точно установить как диагноз, так и стадию заболеваемости.

Биохимические методы (микроуровень) особенно значимы, когда необходимо выявить механизмы, ответственные за развитие тех или иных аномалий в организме. Показано, что при слабых дозах токсикантов у рыб из природных водоемов происходит активизация физиологических систем рыб для детоксикации. Н.Н. Немовой и Р.У. Высоцкой [8] предложен обобщенный биохимический показатель БИИ, о котором упоминалось выше, и который отражает нарушение метаболизма у рыб под воздействием токсичных веществ.

Биохимические изменения рассматриваются как наиболее чувствительные суборганизменные биомаркеры нарушения в организме. При нарастании антропогенного стресса, организм реагирует сменой (переходом) от фазы нормального состояния, через обратимую к необратимой фазе с летальным исходом. Биохимические методы позволяют выявлять измеения в обмене веществ в организме, наступающие, как правило, до появления физиологических, морфологических и других отклонений от нормы, дают возможность выявить границы адаптационных способностей и на этой основе делать выводы о степени устойчивости и чувствительности видов [39]. Согласно R. Lee et al. [40] биохимические показатели способны отразить эффекты на обратимой стадии физиологических нарушений. Однако многие природные условия, как и индивидуальное физиологическое состояния организма, способно повлиять на биохимический статус организма, что ограничивает их использование в корреляциях с показателями загрязнения водной среды. На биохимические и физиологические показатели влияют особенности реакции различных фенотипических групп, видов, время пребывания в токсичной среде, сезонные вариации, а также размеры, возраст, стадии зрелости особей и т.д. Поэтому, чаще биохимические показатели используются в экспериментальных исследованиях, когда известны все заданные условия и можно корректно интерпретировать данные [41, 40].

Поэтому, при исследовании влияния токсичных веществ в натурных условиях отмечается, что в эколого-биохимическом мониторинге должна использоваться система тестов [8], необходимо учитывать возможное влияние ряда других экзогенных и эндогенных факторов. Приведенный анализ показывает и высокую значимость биохимических методов в диагностике состояния организмов, но и сложность его использования в рутинном мониторинге состояния водных объектов.

Метод гистологического анализа (микроуровень) важен для выявления нарушений морфофункциональной организации органов и тканей, дегенеративных процессов и установления по ним диагноза заболевания рыб. Кусочки органов и тканей с видимыми изменениями отбираются и фиксируются общепринятыми в гистологии методами. Необходимым условием является также отбор проб от здоровых особей для установления «нормы» физиологического состояния.

Гистологический метод является наиболее общим инструментом для выявления дисфункций органов и тканей [42, 43, 31]. Гистопатологические изменения органов и тканей животных, включая рыб, являются следствие нарушения физиологических и биохимических функций в организме, и очень значимым индикатором токсичного стресса. Они позволяют идентифицировать орган поражения и выделить специфическую функцию–мишень по отношению к тем или иным токсикантам. В натурных условиях этот метод часто используется для оценки последствий для живых организмов долговременного загрязнения водоема [42]. Для определения последствий действия токсичного агента созданы каталоги и сводки гистопатологических изменений органов и тканей рыб под действием токсичных агентов, краткий обзор которых представлен в последующих разделах. Важным условием в этих исследованиях является установление нормы физиологического состояния органа и тканей. Это позволяет отличать их от инфекционных заболеваний. Еще раз отметим, что в экотоксикологических исследованиях биологические изменения сопоставляются с химической информацией о наличии токсикантов.

C.J. Sindermann [44] в 1979 г. опубликовал первый каталог, в котором сделал обзор патологий клеточного строения органов и тканей под воздействием токсикантов. В последующие годы, количество исследований и обзорных работ в этой области резко нарастало. Появились работы, показывающие тесные корреляции заболеваемости рыб с нарастающим загрязнением. Многими ученными было предложено использовать структурные нарушения в тканях как биомаркеры воздействия токсичных веществ [45, 46, 47, 26, 48, 49, 42, 50, 23, 44].

D.E.Hinton [49] подчеркивал, что гистологический метод, использованный в отдельности или в сочетании с физиологическим или биохимическими методами, позволяет оценить изменения физиологического статуса организма под воздейсвием токсичного агента (ex-situ). Однако этот метод не используется широко в мониторинге вследствие его сложности. К тому же, гистопатологическая информация, использованная в приложении к пониманию эффектов воздействия, имеет качественную направленность. Повреждения оцениваются на основе качественной терминологии (т.е. присутствуют или отсутствуют), или на основе полуколичественных методов, например: значительная гиперплазия, число или снижение числа слизистых клеток и др. За исключение канцерогенных заболеваний, многие отклонения от нормы можно измерить количественными параметрами. Более 30 лет медицина развивает методологию количественного описания в двух– или трехмерном пространстве, которая называется морфометрией или стереологией.

В медицине уже получили развитие компьютерные технологии учета поврежденных клеток на гистологических срезах, например учет числа абнормалий или нарушенных клеток, органелл на количество просмотренный полей, поскольку изначально, этот метод был применен в биомедицинской практике, затем перенесен в биологию [31]. Внедрению количественных оценок предшествовала разработка сложной обучающей программы, к тому же на результаты такого анализа может оказать влияние других факторов, например, число просмотренных полей, количество и качество срезов и т.д.

Возможно, что полученные данные числа абнормалий можно использовать в доза-эффектных зависимостях. Однако в научной литературе не приводятся конкретные результаты, где число тех или иных абнормалий позывало степень поражения всего организма. Для оценки состояния организма на основе гистологического анализа делаются заключения: незначительные, средние и сильные повреждения. Как и в случае клинического и патоморфологического исследования организма, частотно-абнормальный учет является также полуколичественным методом. Основное значение гистопатологических методов в выявлении и понимании неоспоримого эффекта действия токсичных веществ на организм. Будущее развитие и использование количественных методов может только улучшить наше понимание реакции организма на токсичные вещества на клеточном и тканевом уровне.

Метод гематологического анализа (микроуровень) используется для выявления токсикозов рыб на ранних стадиях, поскольку система кроветворения является чрезвычайно чувствительным индикатором изменений, которые происходят в организме рыб. Система кроветворения рыб реагирует на токсичное воздействие большим разнообразием форм патологических проявлений. Токсичные вещества влияют не только на содержание гемоглобина, но изменяют лейкоцитарную формулу и состав красной крови.

Однако ее реакция не специфична для конкретных заболеваний, она отражает как интоксикацию организма, так и заболевания различной этиологии. Изменения показателей крови проявляются ранее по сравнению с внешними симптомами патологических заболевания организма.

Гематологический анализ проводят по у живой рыбы по общепринятым методикам [51]. Кровь отбирают на анализ из хвостовой артерии или жаберной дуги. Определяют концентрацию гемоглобина, скорость осаждения эритроцитов, содержание эритроцитов и лейкоцитов в крови, по мазкам крови - состав красной крови и лейкоцитарную формулу, наличие патологических форменных элементов. Могут использовать и другие показатели, известные в гематологии. При интоксикации возрастает амплитуда концентраций гемоглобина в крови. На мазках крови обнаруживают полихромазию и анизацитоз, появление аномального деления клеток, могут появляются в массе патологические и разрушенные формы [52, 16, 33].

Физиологические методы (функциональные методы). Нахождение организма в сублетальных условиях является стрессом, ответная реакция формируется вовлечением многих физиологических систем в процесс. Измерения функций организма, таких как дыхание и ионная регуляция, часто используется для выявления сублетальных эффектов. Изменение в дыхании измеряются или потреблением кислорода, или высвобождением радиоактивного углерода. Выдерживание организма в токсичной среде увеличивает скорость потребление кислорода [54]. Но эти методы более приемлемы для экспериментальных исследований. Нарушения поведения также может быть использовано в нарушениях физиологического состояния организма.

Особое значение при оценке экологического благополучия водоема имеет исследование биоразнообразия паразитов, регулирующая роль которых и участие в поддержании экологического равновесия не вызывает сомнений. Специфика изучения разнообразия паразитических организмов заключается в том, что одновременно с ними исследуется разнообразие разноименных хозяев в составе паразитарных систем [55]. В этой связи весьма продуктивной оказалась концепция паразитарных сообществ и их многоуровневой организации [56, 57]. В оценке видового разнообразия сообществ паразитов нашли применение стандартные экологические индексы. Наряду с традиционными показателями инвазированности хозяев индексы разнообразия и структура паразитарных сообществ с успехом используются как индикаторы состояния популяций хозяев и экосистем [58, 59, 60]. Сообщества гельминтов тесно взаимосвязаны с сообществами своих хозяев, образуя гельминто-гостальные комплексы [61]. Поскольку компоненты комплекса связаны взаимными регуляторными влияниями, потеря разнообразия одного из компонентов комплекса неизменно отражается на состоянии других. На современном этапе на ход микроэволюционных процессов значительное влияние оказывает антропогенный фактор [62]. Одним из существенных факторов, способных повлечь сильные изменения в биоразнообразии свободноживущих форм, является паразитарное загрязнение. Проникновение вида паразита на новую территорию может повлечь уничтожение некоторых чувствительных видов хозяев. В связи с мощным и разновекторным воздействием антропогенных факторов на компоненты паразитарных систем, нарушается равновесие в паразитарных системах, сложившееся в процессе длительной естественной коадаптации паразитов и хозяев [63]. Поэтому наряду с другими группами животных паразиты могут служить индикаторами состояния окружающей среды и популяций их хозяев. Сама по себе паразитологическая обстановка свидетельствует о степени экологического благополучия той или иной территории. Исследования по использованию паразитологических данных как индикаторов экологической обстановки появились достаточно давно. В настоящее время большое количество работ посвящено изучению изменений паразитофауны под влиянием промышленных выбросов, эвтрофикации, урбанизации, радиации на разные группы паразитов [64, 65, 66, 67, 68].

Опыт использования биоиндикаторов для оценки загрязнения водоемов Западной Сибири. Биоиндикационные исследования по водным экосистемам охватывают северную и южную часть Тюменской области. Количество работ немногочисленно. По северу области проводятся мониторинговые исследования по общему состоянию Обского бассейна и в частности: Обской и Тазовской губ, Средней и Нижней Оби и ее притоков. Имеется ряд публикаций, связанных с разработкой нефтяных месторождений [69, 70, 71].

По югу Тюменской области биоиндикационные исследования связаны с биогенной и токсической нагрузкой пестицидов или тяжелых металлов, привносимых с территории индустриальной Свердловской области, на озера и водотоки. Имеются публикации по главным водным артериям юга – рек Туры и Ишим и их притокам [72, 73, 74, 75]. Проведены исследования по загрязнению и экологическому состоянию озер, расположенных в сельскохозяйственной зоне северной и средней лесостепи [76, 77], а также по экологическому состоянию озер и речных экосистем в окрестностях города Тюмени и на его территории [72, 78, 79], свидетельствующие о том, что крупные города с их промышленностью и инфраструктурой являются беспрецедентным примером сильного комплексного загрязнения водной среды.

Использование показателей состояния популяций мелких грызунов и их биоразнообразия. Мелкие млекопитающие являются удобными модельными объектами, позволяющими проследить изменения в окружающей среде под воздействием различных факторов. В частности они удобны при изучении вопроса как острого, так и хронического загрязнения и водосборных площадей, и самих водоемов и водотоков, где в качестве видов-индикаторов выбираются соответственно либо типично наземные, либо околоводные и водные виды.

Проведенные нами исследования влияния нефтяного загрязнения на мелких млекопитающих Среднего Приобья Тюменской области показали [80], что под воздействием различных антропогенных факторов (и нефтяного загрязнения, в частности) слабой степени исходное сообщество млекопитающих чаще всего увеличивает показатели видового разнообразия и обилия; увеличение степени антропогенной нагрузки ведет к закономерному снижению отмеченных выше показателей, при сильных нагрузках приводя к полной гибели сообществ.

Изменения экстерьерных и интерьерных параметров мелких млекопитающих импактных территорий как правило свидетельствуют о повышении двигательной активности животных, интенсивности их метаболизма, напряженности энергетического обмена, нарастании стрессовости ситуации и токсическом влиянии различных загрязнителей (нефтепродуктов, тяжелых металлов, радионуклидов и др.). В шкурках полевок с территории нефтезагрязненного водосбора имеется тенденция к накоплению большинства из 12 определенных микроэлементов (Al, Ba, V, Fe, Mn, Cu, Ni, Sn, Pb, Sr, Ti и Cr) по сравнению с контролем в 2,5-4 раза, а по уровню железа, меди, никеля, свинца и хрома животные с загрязненной территории достоверно отличаются от фона. В то же время, уровень ванадия и стронция ниже у животных с нефтезагрязненной территории, что пока не находит объяснения [81].

Одинаковый уровень нарушенности среды у одних групп животных (например, у грызунов) может вызывать гомеостатические реакции организма, а у других (у насекомоядных) - приводить к патологии. При этом самки демонстрируют большую чувствительность к факторам загрязнения среды, чем самцы. Неблагополучие общей экологической обстановки на нарушенных территориях приводит к снижению доли половозрелых особей среди сеголеток, к увеличению резорбции эмбрионов. Все это обусловливает существенное снижение эффективности репродуктивных процессов при дистрессовых нагрузках. Увеличение количества эмбрионов, приходящегося на одну беременную самку, при стрессовых нагрузках обеспечивает практически фоновую (контрольную) успешность размножения.

При воздействиях, приводящих к существенному снижению в биогеоценозах роли видов-эдификаторов [82], наблюдаются коренные перестройки состава и структуры сообществ млекопитающих на фоне относительной стабильности морфофизиологических характеристик популяций; при сохранении же эдификаторных свойств и общего облика ценоза под возмущающим действием каких-либо факторов структура сообщества млекопитающих долгое время остается стабильной, что достигается путем напряжения морфофизиологических характеристик популяций составляющих ее видов, и лишь при достижении нагрузкой дистрессовых величин отмечается резкое изменение состава сообщества и его структурных характеристик. Популяции доминирующих видов мелких млекопитающих нефтезагрязненных территорий имеют тенденцию к увеличению доли самцов и доли сеголеток по сравнению с популяциями фоновых местообитаний.

Наибольшие различия между сообществами млекопитающих и популяциями доминирующих видов импактной и фоновой территорий по всем показателям отмечаются в годы высокой численности животных, минимальные - в годы депрессии. Под воздействием загрязнения на первых этапах восстановительной сукцессии на месте сообществ млекопитающих с высоким биологическим разнообразием формируются более бедные, а на месте сравнительно бедных - более богатые.

Показатели морфофункционального состояния организма рыб. Для оценки экологического состояния Обь-Иртышского бассейна были проведены исследования морфофункционального состояния половых желез, печени и жаберного аппарата у ряда видов сиговых, карповых и окуневых рыб из разнотипных водоемов разных природно-климатических зон, которые показали высокую надежность их оценки с применением гистологических методов [32, 9] биоиндикации.

Жаберный аппарат первым подвергается воздействию экотоксикантов различной природы, и потому цитоморфологические характеристики жаберного эпителия являются важнейшими индикаторами состояния окружающей водной среды. Проявляющиеся в нем отклонения можно рассматривать в качестве следствия морфофункциональных изменений адаптационного характера – от изменения длины респираторных ламелл, увеличения толщины афферентной зоны (дистанции «кровь-среда»), количества и размеров респираторных клеток, до формирования «чехла» на поверхности жаберных лепестков как морфофункционального барьера, препятствующего интоксикации. В жабрах рыб из загрязненных водоемов отмечены гиперплазия и гипертрофия эпителия филаментов (первичного) и ламелл (вторичного), хронические застойные явления в жаберных лепестках, кровоизлияния, сосудистые изменения. Установлена адгезия филаментов и респираторных ламелл, некроз эпителиальных клеток и редукция ламелл, их отечность, вызванная повышением капиллярной проницаемости. Наибольшие патологические изменения выявляются у сиговых рыб в период их зимовки в Обской губе и нерестовой миграции в загрязненную Среднюю Обь. Количественная оценка приводится в численности (%) рыб, обладающих отклонениями в жаберном эпителии, составляющими 5 % и более его поверхности. В отличие от сиговых, отклонения в жаберном аппарате у карповых рыб выявлена в наиболее загрязненных участках притоков Средней Оби или в водоемах вблизи промышленных зон и жилищной застройки.

Печень, являясь одним из основных органов, принимающих активное участие в процессах модификации и детоксикации ксенобиотиков, в условиях токсичных нагрузок накапливает загрязняющие вещества и сама подвергается патологическим изменениям. Проводимые исследования на рыбах из бассейна Оби показали, что в их печени отмечаются гиперемия и очаговый стаз крови в венозных сосудах и капиллярной сети. Застойная гиперемия нередко сопровождается дистрофией, жировой дегенерацией паренхимы, отеками и водянкой. Отмечаются также разлитые и очаговые кровоизлияния, структурные изменения гепатоцитов и деструкция печеночной ткани, инфильтрация органа лимфоидными клетками, скопления эозинофильных клеток, находящихся в различной степени распада и др. В наибольшей мере выявленные отклонения проявляются в конце летнего периода, т.е. при завершении сезона роста у целого ряда видов печень и другие исследуемые органы имели различные нарушения.

Гистологическое состояние органа описывается на срезах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну с докраской эозином. Количественная оценка качественных отклонений в развитии и функционировании гепатоцитов печени дается по их количеству на единицу поля, ядер и ядерно-плазматическому отношению (%) в мерах площади, рассчитываемому с использованием программного обеспечения AxioVision Release 4.7.1.

Состояние репродуктивной системы рыб оценивается на разных стадиях зрелости ее эффекторного звена – половых желез. Яичники характеризуются визуально, а на гистологических препаратах рассчитывается соотношение (%) половых клеток разных генераций, размеры и состояние ооцитов старшей генерации, наличие атретических тел и у фертильных особей – степень дегенерации опустевших фолликулов, позволяющая оценить уровень репарационных процессов. В семенниках измеряются диаметры ампул (семенных канальцев), наличие митозов сперматогониев, соотношение половых клеток разных состояний (%), усредненное по трем полям в пределах гистологического среза во фронтальной проекции.

Используя данный методический подход, было установлено, что у сиговых рыб в современных условиях Обь-Иртышского бассейна свойственны некоторые особенности гаметогенеза, проявляющиеся в замедлении оогенеза в превителлогенный период, более продолжительном у муксуна и в меньшей степени у пеляди. Для части особей в ходе овариальных циклов характерен пропуск очередного нерестового сезона по причине пониженной репарационной активности репродуктивной системы. Формирования очередной генерации половых клеток резервного фонда у этих видов в период зимовки не происходит. Встречающиеся патологические изменения гонад редки и приходятся на время пребывания пеляди в Нижней Оби.

Для самцов этих видов вариабельность в состоянии гонад проявляется в большей степени. У муксуна в период зимовки отмечена митотическая активность сперматогониев, начало формирования сперматогониального фонда, а волна сперматогенеза приходится на начало летнего нагула. В это же время формируется сперматогониальный фонд у пеляди. Динамика сперматогенеза у одних особей ряпушки в период зимовки характеризуется более быстрым восстановлением генеративной функции, у других – длительным пребыванием в IV стадии зрелости. В целом, нарушения гонад у сиговых рыб в наибольшей степени выявлены у неполовозрелых особей или у пропускающих нерест рыб.

У карповых и окуневых рыб в загрязненных притоках Средней Оби выявленные нарушения гонадо- и гаметогенеза проявляются преимущественно в замедлении полового созревания (плотва, елец, язь, окунь), ослаблении паторезистентности, резорбции ооцитов фазы вакуолизации, реже отмечается атрезия превителлогенных ооцитов.

Таким образом, использование гистологических методов биоиндикации состояния рыб Обь-Иртышского бассейна, позволило сделать заключение о о неудовлетворительном состоянии качества вод и «Здоровья» континуума экосистем в пределах Средней Оби. В то же время, учитывая повышенную миграционную активность сиговых рыб, требуется внесение определенных корректив на использование их в качестве биоиндикаторов, ибо в течение сезона они могут находиться не только в разных биотопах, но и в разных широтных зонах разных водоемах – Обской губе, в соровой системе и магистрали Нижней и Средней Оби, в уральских притоках Нижней Оби. В этом отношении эти виды следует рассматривать в качестве интегрального критерия благополучия/неблагополучия экосистемы Оби [83, 84].

Использования индекса разнообразия паразитоценозов. Влияние антропогенных факторов (в частности, урбанизации) на паразитофауну рыб изучено на примере р. Туры в районе г. Тюмени [85, 9], являющегося источником мощного химического и физического загрязнения водных экосистем. Использование в качестве интегрального показателя паразитологической ситуации индекса разнообразия паразитоценозов показало, что несмотря на достоверно более высокую зараженность плотвы в зимне-весенний период в черте г. Тюмени по сравнению с летним периодом и с другими пунктами, свидетельствующем о менее благоприятных условиях зимовки рыб в черте города, на биоценотическом уровне паразитоценоз рыб реки Туры стабилен на всем исследованном участке. Преобладание в паразитофауне рыб реки Туры трематод (15 из 18 обнаруженных видов) обусловлено обилием моллюсков – их промежуточных хозяев и преобладанием видов рыб – бентофагов, заражение которых происходит при поедании моллюсков или активно проникающими церкариями трематод. Преобладание в паразитофауне рыб личинок трематод, заканчивающих свой жизненный цикл в рыбоядных птицах, характерно для евтрофных водоемов [86], что наряду с обнаружением в гельминтофауне рыб из реки Туры паразитов-индикаторов эвтрофикации, указывают на наличие этого процесса в обследованном водоеме. Высокая степень пространственной сопряженности популяций промежуточных и окончательных хозяев обуславливает стабильность паразитарных систем трематод в изменяющихся внешних условиях.

Экологическая обстановка Западной Сибири, являющейся высоко эндемичным очагом описторхоза, в последние годы существенно изменилась из-за производственной деятельности человека, приводящей к загрязнению окружающей среды, главным образом, тяжелыми металлами, радионуклидами и нефтепродуктами, которые, поступая в водоемы, включаются в круговорот веществ, они могут длительно сохраняться в воде, куммулироваться в донных отложениях, мигрировать по пищевой цепи вплоть до рыб и их паразитов. Изменение эпизоотической обстановки по описторхозу под влиянием урбанизации в нефтепромысловом районе показано на примере популяции язя, обитающего р. Обь в районе г. Сургута [87, 88]. Язь из реки Обь в черте города имеет более высокие показатели инвазированности личинками O. felineus (до 95 % со средним значением интенсивности инвазии до 313 личинок на особь), чем язь, отловленный выше города по течению. Это можно объяснить высоким уровнем зараженности местного населения. Причем зараженность населения с поселках не меньше, чем в городе, но здесь имеет значение разница в общем количестве населения в городе и загородных территориях. Резкое возрастание инвазированности хозяев специфическим паразитом является показателем критического состояния популяции хозяина, маркером его неблагополучия.

Таким образом, использование методов биоиндикации для оценки состояния водных экосистем на территории Тюменской области может свидетельствовать о значительном ухудшении качества вод на юге региона в окрестностях крупных городов, но особенно - в нефтедобывающих районах Среднего Приобья.

4.2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР И МЕТОДЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ

В силу высокой научной и практической значимости проблема оценки качества вод привлекает большое количество исследователей. Система мониторинга качества вод в России, как и в большинстве других стран мира, позволяет только дать оценку превышения отдельных компонентов (чаще токсикантов) к их лимитирующим показателям - предельно-допустимым концентрациям (ПДК) для водных объектов, в основном, подвергающихся воздействию стоков. ПДК (или критические уровни загрязнения) практически не учитывают специфику формирования качества вод, их зональные и ландшафтно-географические особенности, а также поведение антропогенно-привнесенных элементов в различных условиях, сопутствующие факторы, а также природную уязвимость водных экосистем к действию загрязнения и их комбинированные эффекты.

Загрязнение водного объекта оценивается на основе установления кратности превышения измеренных концентраций отдельных элементов и веществ к их ПДК или числа случаев с превышением ПДК. В Государственном докладе о состоянии окружающей среды [1], как и в ряде научных публикаций, на многих страницах идет констатация фактов, в какой водной системе и по каким элементам превышено ПДК. При этом не всегда ясно, сколько веществ и элементов было измерено в каждом конкретном случае, на фоне каких природных условий и в какой комбинации они оказывают вредное воздействие на биологические системы. И тем более не ясно – насколько эти превышения опасны для живых организмов и жизнедеятельности человека?

ПДК достаточно условны и существенно различаются в различных странах, несмотря на унифицированные методы по их установлению. Например, в России [2], по сравнению с другими странами: Канада, США, страны ЕС [3, 4, 5], неоправданно низкие значения для Cu, V, Mn и др., тогда как нормативы для Cd, As, Pb и Al завышены. Не совпадают ПДК и по ряду токсичных органических соединений. ПДК не учитывают природные условия водного объекта, в водах которых действуют загрязняющие вещества. Известно, что токсичные свойства элементов зависят не только от их концентрации в воде, но от форм их нахождения, содержания кальция в воде, гумусовых кислот, рН, температуры, комбинаций с другими металлами [6]. ПДК не учитывают взаимодействие между элементами при комплексном загрязнении вод, в условиях которого токсичные свойства ряда элементов могут взаимно усиливаться или нивелироваться. Например, комбинация Zn, Cu и Cr для рыб во много раз токсичнее, чем каждый элемент в отдельности [7]. Приведенный анализ показывает значимость учета специфических физико-химических характеристик природных вод при нормировании содержания загрязняющих веществ. В России, на большой территории (от Арктики до Аридной зоны) для всех типов вод используются одни и те же значения ПДК. Поэтому система ограничений загрязнения водоемов, основывающаяся на ПДК, не дает научной основы для объективной оценки качества вод и экологического состояния водоема. Более адекватную оценку качества вод как среды обитания дают биологические методы оценки качества вод.

Методические основы биотестирования качества вод. Биотестирование направлено на оценку потенциальной опасности поступающих в водоем загрязняющих веществ (или конкретных стоков, загрязненных вод) по данным экспериментальных лабораторных определений (ex situ). Этот метод позволяет выявить летальные и сублетальные концентрации потенциальных загрязняющих веществ, а также сточных вод производств или загрязненных вод из водоемов для живых организмов (тест-объектов) в лабораторных условиях.

В основе метода – экспериментальное установление концентраций загрязняющих веществ, которые вызывают наиболее значимые и легко определяемые нарушения у водных организмов – смертность, выживаемость, физиологические или патологические нарушения. Пороговое значение, вызывающее видимые отклонения от нормы у наиболее чувствительной группы организмов, принимается как ПДК опасного вещества [8, 9, 10]. В качестве биотестов используются организмы различных систематических групп: бактерии, водоросли, беспозвоночные, рыбы. Основная масса токсикологических исследований выполняется на уровне организмов. Эти опыты позволяют изучить воздействия отдельных токсичных веществ (или сточных вод) на гидробионтов различных систематических групп.

Бактерии включаются в минерализацию органического вещества и круговорот биогенных элементов. Они имеют короткий цикл жизни и быстро реагируют на изменения окружающей среды, что позволяет быстро выявить токсичные свойства веществ. В качестве критериев используют показатели ингибирования роста и дыхания микроорганизмов, энзимной активности и др. Для биоиндикации наиболее часто используются бактерии родов Pseudomonas, Klebsiella, Escherichia, Aeromonas, Bacillus, Vibrio, Tiobacillus, Cirobacter. Токсичность тяжелых металлов или других сточных вод часто устанавливают по нитрификационной способности Nitrobactеr и по люминееценции Fotobacterium posphoreum. Для установления мутагенных свойств используются биотесты на Salmonella typhimurium и Esherichia coli [9, 11, 12]

Водоросли широко используют в биотестировании качества вод. Это наиболее простой и легкодоступный тест. Наиболее часто используемые виды – Selenastrum capricornutom, Ankistrodesmus falcatus, Chlorella vulgaris, Chlamymonas reinhardii, Scenedesmus acutus, Anabaena flosaquae, Skelonotonema costatum, Thalassiosira pseudonana. Техника проведения биотестирования на водорослях отражена в [9, 10, 11, 13]. Регистрируют два наиболее распространенных параметра – число клеток и первичную продукцию в экспозиции с токсичным веществом и в контроле. Часто используют другие параметры, такие как морфология клеток, изменения их ультраструктуры, процессы фиксации азота и др.

Беспозвоночные также удобны в биотестировании. Они быстро адаптируются к лабораторным условиям и чувствительны к токсичным веществам. Daphnia magna, Daphnia pulex, Ceriodaphnia affinis, C. reticulata, Gamerus fasciatus, Hyalella azteca, Pontoporea affinis, Chironomus tentans, Orconectis nais, Crassostrea virginica -распространенные тест-объекты для определения как острой, так и хронической токсичности вод. Для работы с дафниями применяют 24 часовой острый и 21-дневный хронический тесты, учитывают смертность и рассчитывают концентрацию вещества, вызывающую 50%-ную гибель особей (LC50). В более продолжительных экспериментах определяют снижение воспроизводства организмов. В последние годы на беспозвоночных исследуются физиологические, морфологические и генетические последствия хронического воздействия токсикантов [9, 10, 11, 13].

Рыбы используются в тех случаях, когда необходимо понимание механизмов действия токсикантов. Для биотестировании среди пресноводных видов используются радужная форель (Parasalmo mykiss), золотая рыбка (Carassius auratus), карп (Cyprinus carpio), гуппи (Poecilia reticulata), черный толстоголов (Pimephales promelas). Для повышения чувствительности тест-объектов целесообразно использовать ранние стадии развития рыб – эмбрионов и личинок. Однако наиболее значимый результат может быть получен на молоди сиговых рыб [14], в отличиe от более токсикорезистентных карповых – C. auratus и C. carpio. В остром эксперименте определяют летальную и полулетальную концентрацию конкретных загрязняющих веществ. В хроническом эксперименте возможно выявление физиологических, биохимических, генетических и морфологических изменений у рыб под влиянием тех или иных токсичных веществ. Наиболее распространенными тестами являются такие показатели, как потребление кислорода, ритм сердцебиения, поведение, выживаемость, а также в длительных экспериментах - рост, созревание и успешность воспроизводства [9, 11, 15, 16]. Гистологический анализ и цитометрия кардиомиоцитов сердечной мышцы, клеток почек, нейронов головного и спинного мозга, эпителиоцитов кишечника, ооцитов и сперматоцитов в развивающихся гонадах предоставляет возможность количественной оценки протекающих изменений под влиянием интоксикации [17].

Niimi (1990) [18] предложено использовать более 13 биохимических тестов для выявления токсичных эффектов и стресса у рыб, например, ингибирование ряда ферментов и энзимов – оксигеназы, дегидрогеназы, холинестеразы и др. Детальное описание протокола проведения и стандартизации условий постановки экспериментов на рыбах по биотестированию токсикантов приводится в [16].

К достоинствам биотестирования можно отнести сравнительно быстрое получение информации о токсичности отдельных веществ или сточных вод производств в целом. Информация, полученная на основе биотестирования и отраженная в нормативах ПДК, позволяет определить относительный вклад различных веществ в формирование экотоксикологической ситуации в водоеме. Однако не ясно, насколько правомерен перенос полученных результатов экспериментов в лабораторных условиях на природные объекты. Поведение загрязняющих веществ в природных водоемах и их токсикологические свойства могут значительно отличаться от их действия в аквариумах; могут проявляться комбинированные как синергетические, так и антагонистические эффекты. В лабораторных условиях сложно определить поступление ядов по пищевым цепям и их кумулятивные эффекты. К тому же отдельные организмы, используемые в эксперименте, имеют мало общего с природными популяциями и сообществами

Опыт использования биотестов для оценки загрязнения водоемов Западной Сибири. Для оценки качества загрязненых вод в регионе использовали различные модельные тест-объекты: водоросли, макрофиты, дафний, моллюсков и млекопитающих. Ответные реакции объектов оценивали как по изменению численности особей, их жизнеспособности, плодовитости, изменению морфологических и физиолого-биохимических показателей [19].

В частности, с помощью модельных тест-объектов оценивали степень загрязненности воды в реке Ишим.

Растения. В качестве объекта для исследования были выбраны зеленые водоросли Chlorella vulgaris (ФР.1.39.2001.00284) [20]. Верховье р. Ишим, приуроченное к северным территориям Казахстана, зарегулировано рядом водохранилищ, на его водосборе расположены промышленные производства, загрязнение от которых поступает в русло реки и с речным стоком переноситься на территорию Тюменской области. Основными загрязняющими веществами являются нефтепродукты, фенолы и пестициды. На границе Казахстана с Тюменской областью отмечается повышенная концентрация нефтепродуктов (до 11 ПДК), фенолов (до 6 ПДК). В пределах Тюменской области загрязнения воды нарастает. Следует отметить, что р. Ишим является единственным транзитным водостоком в юго-восточной аридной части области и источником хозяйственно – питьевого водоснабжения г. Ишим и 24 сел Ишимского, Абатского и Казанского районов [21].

В ходе эксперимента в качестве контроля использовали отстоянную питьевую воду, в вариантах эксперимента использовали воду из створа р.Ишим в месте водозабора, воду из створа реки в 500 м выше места сброса сточных вод, воду из створа реки в месте сброса сточных вод, воду из створа реки в 500 м ниже места сброса сточных вод. Использовали разведение 1:1 и 1:4 для каждого варианта исследования. Отбор проб воды производился согласно ГОСТ Р 51592-2000 [22]. Эксперимент с Ch. vulgaris был поставлен в лабораторных условиях в течение 20 дней. Водоросли культивировали на жидкой питательной среде Прата. Общее количество клеток водорослей подсчитывали в камере Горяева.

В ходе проведенных экспериментов было показано, что снижается коэффициент прироста численности клеток хлореллы к 14 дню содержания в воде, взятой в месте сброса сточных вод и в воде в 500 м после сброса сточных вод. На основе анализа показателей жизнедеятельности водорослей определили классы качества вод по методике С.А. Окиюк [23]. Было установлено, что на протяжении всего эксперимента качество воды из створа реки в месте водозабора не изменилось. Вода относится к 1 классу качества и является чистой водой. Вода из реки в месте сброса сточных вод, а также вода из створа реки в 500 м выше сброса сточных вод и ниже сброса стоков относится к 3 классу качества вод (загрязненная вода).

В другом исследовании тестировали воду реки Пяку–Пур с использованием растений. Исследования проводили в районе пересечения этой реки нефтепроводом «НПС Суторминская - НПС Холмогоры». В месте отбора проб и выше по течению нет крупных населенных пунктов. На качество воды в р.Пяку – Пур оказывают влияние поверхностные стоки из мест нефтедобычи. Химический анализ воды показал превышение в ней ПДК по нефтепродуктам в 3-5 раз, по железу – в 300-320 раз, марганцу в 23-24 раза, фенолам – в 3 раза.

Вода была взята на расстоянии 500 м до нефтепровода, вверх по течению, в месте пересечения реки нефтепроводом, на расстоянии 500 м после нефтепровода, вниз по течению. В качестве тест-объектов использовали следующие растения: элодею (Elodea canadensis), традесканцию белоцветковую (Tradescantia albiflora), семена овсяницы луговой (Festuca pratensis), а также растение из природной среды - осоку береговую (Carex riparia). Все растения элодеи подбирали одного размера. Черенки элодеи брали длиной 5 см с верхушечной точкой роста, без корней и без боковых побегов. В ходе эксперимента у элодеи регистрировали следующие морфометрические показатели: длину главного побега; количество корней; длину корней; длину боковых побегов; количество боковых побегов. В ходе эксперимента у традесканции регистрировали следующие морфометрические показатели: длину черенка; количество корней; длину корней; количество междоузлий; длину междоузлий. У семян овсяницы при проращивании в пробах тестируемой воды анализировали энергию прорастания, лабораторную всхожесть, выживаемость проростков, количество аномалий проростков. У осоки береговой, собранной в прибрежной зоне (на расстоянии не более 10 м от воды) Регистрировали следующие морфометрические показатели: длину листьев; количество корней; длину корней. У всех проанализированных растений определяли содержание пигментов фотосинтеза в спиртовой вытяжке на спектрофотокалориметре «Specol».

У элодеи, традесканции и овсяницы луговой, выращенных в пробах воды из реки до пересечения её с нефтепроводом, увеличивается длина главного побега и общая концентрация пигментов фотосинтеза. При действии воды, взятой в месте пересечения реки нефтепроводом, увеличивается количество корней у элодеи, длина черенка у традесканции длина проростков овсяницы луговой, а так же возрастает общая концентрация пигментов фотосинтеза у элодеи и традесканции. У элодеи и традесканции при выращивании в воде после нефтепровода увеличивается длина главного побега и концентрация всех пигментов фотосинтеза у элодеи и традесканции. В экспериментах на растениях показано, что токсичность речной воды увеличивается вниз по течению реки, от точки забора проб до нефтепровода, до точки забора проб после нефтепровода. У осоки речной, взятой из поймы реки Пяку-Пур, выявлено аналогичное снижение ряда морфофизиологических показателей, что связано с ростом степени загрязнения воды в реке после прохождения нефтепровода. Проведенный анализ в тестах на растениях указывает на загрязнение воды из реки Пяку-Пур,

Нами проведены исследования (Табл. 7) на водных растениях (ряска малая - Lemna minor), прибрежной растительности (осока прибрежная - Carex riparia, ситник расходящийся - Juncus effusus, кипрей узколистный - Epilobium angustifolium) из районов протекания рек севера Тюменской области, реки Туры в г.Тюмени, ряда озер области. У растений исследовали размеры листецов у ряски и высоту растений, суммарную концентрацию пигментов фотосинтеза, количество мертвых клеток (при окрашивании раствором метиленовой сини). У ряски в корешках изучали частоту хромосомных нарушений, окрашивая препараты 2-% ацетоорсеином.

В условиях загрязнения нефтепродуктами у фитоиндикаторных видов – происходило показателей роста и функционирования. Выявлено мутагенное влияние загрязненных проб воды на растения. Следует отметить, что ситник и осока проявляли меньшую чувствительность к действию загрязняющих веществ в воде по сравнению с ряской и кипреем (Табл.7).

Таблица - 7. Морфофизиологические показатели растений при действии проб воды из рек и озер Тюменской области.