« ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи Коляда Олег Николаевич ...»
Таким образом, при инфекционном процессе функциональная декомпенсация неспецифической реактивности у облученных крыс нарастала. По-видимому, усугубление имеющегося дисбаланса в цитокиновом соотношении IFN-/IL-4 привело к негативным последствиям – диссеминации инфекции и ухудшению клинической картины.
Резюме. У необлученных животных при кандидозном сепсисе концентрации цитокинов IL-4 и IFN- прогрессивно нарастали на протяжении первой недели, что соответствует параметрам обычного развития инфекционного процесса. Напротив, у облученных крыс их рост был менее выраженным, что, вероятно, указывает на депрессивное воздействие выбранного режима облучения на противоинфекционную защиту.
У инфицированных облученных крыс наблюдались гораздо более высокие уровни циркулирующих иммунных комплексов по сравнению с необлученными животными, что, по всей видимости, связано с нарушением функции элиминации со стороны фагоцитарных клеток и системы комплемента.
Раздел 3.3 Корригирующая эффективность метилглюкамина акридонацетата и дипептида глутамил-триптофана в отношении иммунологической реактивности облученных крыс с острым экспериментальным диссеминированным кандидозом.
Учитывая отсутствие у облученных животных признаков достаточной активации моноцитарно-макрофагальной системы и усугубление дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов в ответ на кандидозную инфекцию, для коррекции выявленных нарушений антиинфекционной резистентности, индуцированных фракционированным облучением, были выбраны препараты – метилглюкамина акридонацетат и дипептид глутамил-триптофан.
Метилглюкамина акридонацетат является низкомолекулярным индуктором -, - и -интерферонов в органах и тканях, богатых лимфоидными элементами. Этот препарат обладает широким спектром биологической активности, что используется для повышения эффективности терапии хронических инфекционных заболеваний, однако, конкретные механизмы реализации его иммунотропного потенциала изучены недостаточно. Суточная доза препарата в наших исследованиях составляла 10 мг/кг массы тела.
В качестве иммуномодулятора сравнения использовали дипептид глутамил-триптофан – синтетический аналог тимотропных препаратов зобной железы, который способствует дифференцировке CD4+-лимфоцитов и нормализует соотношение их эффекторных и регуляторных популяций. Кроме того, препарат имеет радиопротекторные свойства и способность угнетать развитие серотонинового и гистаминового отека, свидетельствующее о его возможной эффективности в условиях гиперергического воспаления, индуцированного длительной поляризацией адаптивного иммунного ответа. Суточная доза препарата в наших исследованиях составляла 1 мкг/кг массы тела.
Раздел 3.3.1. Влияние метилглюкамина акридонацетата и дипептид глутамил-триптофана на концентрацию сывороточных цитокинов.
Результаты исследования влияния метилглюкамина акридонацетата на уровень сывороточных цитокинов при коррекции патогенетических нарушений течения инфекции Candida albicans сведены в таблице 3.3.1
Таблица 3.3.1
Влияние метилглюкамина акридонацетата на уровень сывороточных цитокинов при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс
| Группы | V | I | VI | II | VII | III | VIII | IV | |
| IFN-, пг/мл | M | 28,43 | 16,1 | 282,33 | 181,7 | 252,33 | 116,6 | 44,33 | 20,3 |
| m | 10,1 | 5,3 | 17,8 | 48,9 | 22,5 | 30,9 | 4,7 | 8,5 | |
| IL-17, пг/мл | M | 30,4 | 42,2 | 40,5 | 67,4 | 218,23 | 273,5 | 30,63 | 17,7 |
| m | 12,6 | 5,6 | 30,4 | 9,1 | 32,5 | 47,2 | 9,5 | 4,1 | |
| IL-10, пг/мл | M | 45,4 | 37,9 | 11,2 | 17,7 | 23,13 | 16,4 | 2,0 | 3,1 |
| m | 8,9 | 6,6 | 7,8 | 2,6 | 5,6 | 3,6 | 1,3 | 0,6 | |
| IL-4, пг/мл | M | 29,7 | 21,1 | 122,3 | 102,1 | 72,23 | 57,9 | 41,2 | 35,8 |
| m | 10,2 | 2,6 | 22,5 | 2,5 | 7,3 | 3,3 | 5,1 | 4,2 | |
| IFN-/ IL-10 | 0,6 | 0,4 | 25,2 | 10,3 | 10,9 | 7,1 | 22,2 | 6,6 | |
Примечание: 3 - р<0,05, по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции.
К однозначно негативным последствиям применения метилглюкамина акридонацетата у облученных животных нужно отнести усуглубление имеющегося дисбаланса в цитокиновом профиле: соотношение IFN-/ІL-10 у инфицированных животных (группа VIІ) возросло с 7,1 до 10,9, за счет умеренного увеличения уровня IL-10 – до 23,1±5,6 пг/мл против 16,4±3,6 пг/мл в контроле (в 1,4 раза)– и повышения уровня IFN- до 252,3±22,5 пг/мл по сравнению со 116,6±30,9 пг/мл у контрольных животных (т.е.в 2,2 раза). У неинфицированных животных (V группа) этот эффект был менее заметным: соотношение IFN-/IL-10 возросло с 0,4 до 0,6 за счет повышения уровня IFN- до 28,4±10,1 пг/мл с 16,1±5,3 пг/мл у крыс без иммунокоррекции.
Кроме того, возрастал уровень IL-4 у инфицированных крыс, получавших метиглюкамина акридонацетат (72,2±7,3 пг/мл против 57,9±3,3 пг/мл в контроле), при том, что у животных без коррекции он составлял 21,1±2,6 пг/мл против 29,7±10,2 пг/мл. Это, очевидно, только содействовало углублению дисбаланса в цитокиновом профиле. При этом ожидаемого уровня стимуляции функций фагоцитов у инфицированных облученных животных не наблюдалось.
При изучении действия оппозитного иммуномодулятора - дипептид глутамил-триптофана мы получили данные, указывающие на то, что к наиболее существенным положительным изменениям в иммунном статусе облученных животных на фоне его введения (табл. 3.3.2) можно отнести наличие тенденции к уменьшению дисбаланса в цитокиновом профиле, более выраженное у облученных животных с генерализованным сепсисом: соотношение IFN-/IL-10 у инфицированных животных уменьшилось с 7,1 до 6,1, за счет увеличения уровня IL-10 до 30,1±12,6 пг/мл против 16,4±3,6 пг/мл в контроле и умеренного повышения уровня IFN- – до 182,2±8,9 пг/мл против 116,6±9,6 пг/мл в контроле. Аналогичный эффект наблюдался и у необлученных животных: соотношение IFN-/IL-10 уменьшилось с 10,3 до 5,8 за счет достоверного повышения уровня IL-10 к 35,3±2,2 пг/мл от 17,7±2,1 пг/мл в контроле и умеренного повышения уровня IFN- до 203,6±5,1 пг/мл со 181,7±4,1 пг/мл в контроле.
Таблица 3.3.2
Влияние дипептида глутамил-триптофана на уровень сывороточных цитокинов при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс
| Группы | IX | I | X | II | XI | III | XII | IV | |
| IFN-, пг/мл | M | 32,13 | 16,1 | 203,1 | 181,7 | 182,23 | 116,6 | 30,2 | 20,2 |
| m | 15,6 | 5,3 | 15,6 | 48,9 | 8,9 | 30,9 | 15,8 | 8,5 | |
| IL-17, пг/мл | M | 20,33 | 42,2 | 45,3 | 67,4 | 103,4 | 273,5 | 14,5 | 17,7 |
| m | 17,6 | 5,6 | 23,4 | 9,1 | 32,6 | 47,2 | 5,9 | 4,1 | |
| IL-10, пг/мл | M | 50,4 | 37,9 | 35,33 | 17,7 | 30,13 | 16,4 | 7,23 | 3,1 |
| m | 15,6 | 6,6 | 10,4 | 2,6 | 12,6 | 3,6 | 1,3 | 0,6 | |
| IL-4, пг/мл | M | 15,2 | 21,1 | 89,2 | 102,1 | 41,23 | 57,9 | 20,5 | 35,8 |
| m | 6,7 | 2,6 | 15,4 | 2,5 | 15,9 | 3,3 | 16,4 | 4,2 | |
| IFN-/ IL-10 | 0,6 | 0,4 | 5,8 | 10,3 | 6,1 | 7,1 | 4,2 | 6,5 | |
Примечание: 3 - р<0,05, по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции.
Кроме того, у облученных и инфицированных животных, лечение дипептидом глутамил-триптофаном привело к уменьшению уровня IL-4 – 41,2±3,3 пг/мл против 57,9±3,7 пг/мл в контроле, у инфицированных животных без предварительного облучения – 89,2±3,8 пг/мл против 102,1±3,1 пг/мл, что, очевидно, свидетельствует о противовоспалительном эффекте препарата.
Что касается продукции IL-17, то наблюдалось ее уменьшение у животных ХІ группы до 211±0,3 пг/мл против 273,5±3,9 пг/мл в контроле, (p < 0,05).
Раздел 3.3.2. Влияние метилглюкамина акридонацетата и глутамил-триптофана на активность фагоцитов.
При исследовании влияния метилглюкамина акридонацетата на показатели неспецифической иммунологической реактивности при инфекции Candida albicans мы получили результаты, приведенные в таблице 3.3.3.
Таблица 3.3.3
Влияние метилглюкамина акридонацетата на показатели неспецифической реактивности при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс
| Группы | V | I | VI | II | VII | III | VIII | IV | |
| ФИмф, % | M | 49,33 | 41,7 | 77,5 | 74,7 | 65,43 | 55,8 | 51,3 | 52,8 |
| m | 4,3 | 3,9 | 6,8 | 7,1 | 5,6 | 4,6 | 5,4 | 5,1 | |
| ФЧмф | M | 5,13 | 3,2 | 15,13 | 13,4 | 8,43 | 7,4 | 7,8 | 9,5 |
| m | 1,7 | 0,4 | 1,6 | 1,5 | 0,9 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | |
| ФИнф, % | M | 52,13 | 44,7 | 77,5 | 73,4 | 61,3 | 65,4 | 71,3 | 62,8 |
| m | 5,3 | 4,1 | 6,9 | 6,5 | 5,5 | 5,6 | 8,4 | 5,4 | |
| ФЧнф | M | 6,43 | 5,2 | 10,53 | 12,4 | 6,4 | 7,4 | 9,8 | 8,5 |
| m | 0,5 | 0,4 | 1,2 | 1,4 | 0,8 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | |
Примечание: 3 - р<0,05, по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции.
У облученных животных, которым вводили метилглюкамина акридонацетат, на 7-е сутки после инфицирования наблюдалось статистически достоверное повышение уровня активации макрофагов: ФИ макрофагов был увеличен до 49,3±4,3% по сравнению с 41,7±3,9% у животных без иммунокоррекции, а ФЧмф у животных исследуемой группы было 5,1±1,7 ед. против 3,2±0,4 ед. у крыс контрольной группы.
Влияние метилглюкамина акридонацетата на фагоцитарную активность макрофагов выражалось в статистически недостоверной тенденции к увеличению у необлученных и достоверном росте у крыс VII группы. Для необлученных крыс (VI группа) ФИмф составлял 77,5±6,8% против 74,7±7,1 % в контроле, ФЧмф – 15,1±1,6 ед. против 13,4±1,5 ед. Для облученных крыс (VIІ группа) ФИмф составлял 65,4±5,6% против 55,8±4,6% в контроле, ФЧмф - 8,4±0,9 ед. против 7,4±0,6 ед.
Достоверное повышение фагоцитарной активности нейтрофилов под влиянием метилглюкамина акридонацетата было выявлено лишь у облученных крыс, не подвергавшихся инфицированию: ФИ нф – 52,1±5,3% против 44,7±4,1% в контроле, а ФЧнф – 6,4±0,5 ед. против 5,2±0,4 ед. В обеих группах инфицированных животных под влиянием метилглюкамина акридонацетата фагоцитарная активность нейтрофилов имела статистически недостоверную тенденцию к увеличению. У крыс с диссеминированным кандидозным сепсисом, получавших метиглюкамина акридонацетат, ФИнф составлял 77,5±6,9% против 73,4±6,5% у группы сравнения, а ФЧнф – 10,5±1,2 ед. против 12,4±1,4 ед. Аналогично, для облученных и инфицированных животных, леченных метилглюкамина акридонацетатом, ФИнф составлял 61,3±5,5% против 65,4±5,6% в контрольной группе, ФЧнф – 6,4±0,8 ед. против 7,4±0,7 ед.
При введении дипептид глутамил-триптофана фагоцитарная активность макрофагов статистически достоверно повышалась именно у облученных животных, которые имели наиболее низкий исходный уровень этого показателя. У облученных крыс без генерализованного сепсиса ФИмф составлял 54,7±4,2% против 41,7±3,9% в группе сравнения, ФЧмф - 7,1±0,8 ед. против 3,2 ± 0,4ед.; у облученных животных с инфекционным процессом ФИмф был 64,7±5,8% против 55,8±4,6%; ФЧмф – 10,3±1,1 ед. против 7,4±0,6. Аналогичный, но менее выраженный эффект стимуляции был у инфицированных необлученных животных: ФИмф составлял 85,8±7,9% против 74,7±7,1%, а ФЧмф – 16,5±2,1 ед. против 13,4±1,5 ед. (табл. 3.3.4).
Таблица 3.3.4
Влияние дипептида глутамил-триптофана на показатели иммунологической реактивности при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс
| Группы | IX | I | X | II | XI | III | XII | IV | |
| ФИ, мф, % | M | 54,73 | 41,7 | 85,83 | 74,7 | 64,73 | 55,8 | 77,6 | 52,8 |
| m | 4,2 | 3,9 | 7,9 | 7,1 | 5,8 | 4,6 | 5 | 5,1 | |
| ФЧ, мф | M | 7,13 | 3,2 | 16,53 | 13,4 | 10,33 | 7,4 | 7,2 | 9,5 |
| m | 0,8 | 0,4 | 2,1 | 1,5 | 1,1 | 0,6 | 1,5 | 0,8 | |
| ФИ, нф, % | M | 54,83 | 44,7 | 79,8 | 72,4 | 74,73 | 65,4 | 77,6 | 62,8 |
| m | 4,5 | 4,1 | 6,3 | 7,1 | 7,8 | 5,6 | 5,0 | 5,4 | |
| ФЧ, нф | M | 6,13 | 5,2 | 14,3 | 12,4 | 10,33 | 7,2 | 7,2 | 8,5 |
| m | 0,7 | 0,4 | 2,4 | 1,2 | 1,1 | 0,7 | 1,5 | 0,9 | |
Примечание: 3 - р < 0,05, по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции.
Дипептид глутамил-триптофан оказывал достоверное стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов во всех исследованных группах, кроме инфицированных необлученных крыс, которые имели наиболее высокий исходный уровень этого показателя. У облученных крыс, подлежавших коррекции глутамил-триптофаном, ФИнф составлял 54,8±4,5% против 44,7±4,1% в группе сравнения, ФЧнф – 6,1±0,7 ед. против 5,2±0,4 ед.; в группе инфицированных животных, предварительно не облученных, ФИнф был 79,8±6,3% против 72,4±7,1%, ФЧнф – 14,3±2,4 ед. против 12,4±1,2 ед.; у облученных и инфицированных крых ФИнф составлял 74,7±7,8% против 65,4±5,6%, ФЧнф – 10,3±1,1 против 7,2±0,7.
Раздел 3.3.3. Влияние метилглюкамина акридонацетата и глутамил-триптофана на комплементарную активность, содержание ЦИК и титр специфических иммуноглобулинов к C. albicans в сыворотке крови и степень контаминации внутренних органов.
Недостаточность достигнутого уровня стимуляции фагоцитарных функций подтверждается и стабильностью в концентрации ЦИК в обеих группах инфицированных животных. Так, концентрация ЦИК у всех крыс, учавствовавших в эксперименте, была достоверно выше по сравнению с интактными животными. У животных с кандидозным сепсисом без предварительного облучения, на фоне введения метилглюкамина акридонацетата, наблюдалось статистически недостоверное снижение ЦИК до 125,2±9,5 МЕ против 131,0±8,4 МЕ у животных без иммунокоррекции. У аналогичных, но предварительно облученных животных – уровень ЦИК составлял 148,4±11,0 МЕ против 154,0±7,1 МЕ в группе сравнения (табл. 3.3.5).
Таблица 3.3.5
Влияние метилглюкамина акридонацетата на показатели ЦИК и системы комплемента при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс
| Группы | V | I | VI | II | VII | III | VII1 | IV | |
| ЦИК, МЕ | M | 91,3 | 95,0 | 125,2 | 131,0 | 148,4 | 154,0 | 93,5 | 85,0 |
| m | 2,6 | 4,5 | 9,5 | 8,4 | 11,0 | 7,1 | 9,2 | 5,3 | |
| Комплемент, гем. Ед. | M | 89,7 | 94,8 | 67,23 | 58,8 | 45,63 | 39,8 | 101,4 | 96,6 |
| m | 6,9 | 8,1 | 5,7 | 4,7 | 3,5 | 2,9 | 9,3 | 8,1 | |
Примечание: 3 - р<0,05 по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции.
Метилглюкамина акридонацетат оказал негативное влияние и на активность комплемента в сыворотке крови в условиях сепсиса, как у животных, подвергшися предварительному облучению (45,6±3,5 гем. ед.), так и не подвергшихся (67,2±5,7 гем. ед.) (против 96,6±8,1 гем. ед. у интактных животных).
На фоне введения дипептида глутамил-триптофана статистически достоверно снижалось количество циркулирующих иммунных комплексов в обеих группах инфицированных животных: 100,0±8,1 МЕ против 131,0±8,4 МЕ в Х группе и 123,8±9,7 МЕ против 154,0±7,1 МЕ в ХІ группе. В этих же группах наблюдалось повышение комплементарной активности сыворотки крови: 78,5±6,8 гем. ед. против 58,8±4,7 гем. ед. в Х группе и 61,5±6,3 гем. ед. против 39,8±2,9 гем. ед. в ХІ группе животных (табл. 3.3.6).
Таблица 3.3.6
Влияние дипептида глутамил-триптофана на показатели иммунологической реактивности при инфекции Candida albicans у облученных и необлученных крыс
| Группы | IX | I | X | II | XI | III | XII | IV | |
| ЦИК, МЕ | M | 84,3 | 91,7 | 100,03 | 131,0 | 123,83 | 154,0 | 90,8 | 85,0 |
| m | 7,4 | 4,5 | 8,1 | 8,4 | 9,7 | 7,1 | 7,4 | 6,3 | |
| Комплемент, гем.ед. | M | 98,4 | 94,8 | 78,53 | 58,8 | 61,53 | 39,8 | 94,2 | 96,6 |
| m | 8,7 | 8,1 | 6,8 | 4,7 | 6,3 | 2,9 | 7,0 | 8,1 | |
Примечание: 3 - р < 0,05 по сравнению с животными, не подвергавшихся иммунокоррекции.
Эффекторное звено системной противокандидозной защиты обеспечивается не только за счет активации фагоцитов, но и за счет стимуляции синтеза защитных антител (табл. 3.3.7).
Таблица 3.3.7
Сравнительный анализ динамики нарастания титров специфических антител к Candida albicans у животных, которым вводили метилглюкамина акридонацетат и дипептид глутамил-триптофан
| Титры Антител | Необлученные | Облученные | ||||
| ІI группа | VI группа | Х группа | ІІI группа | VII Группа | ХІ группа | |
| 7 сутки | 1:80 | 1:80 | 1:160 | 1:20 | 1:40 | 1:80 |
| 14 сутки | 1:160 | 1:640 | 1:1280 | 1:80 | 1:160 | 1:640 |
На 7-е сутки инфекционного процесса титры специфических антител были вчетверо ниже у облученных крыс III группы (1:20) против (1:80) у необлученных животных II группы, на 14-е сутки различия в титрах антикандидозных антител были вдвое. При этом у облученных животных введение метилглюкамина акридонацетата стимулировало рост антител в 2 раза как на 7-е, так и на 14-е сутки, а дипептида глутамил-триптофана (группа XI) – на 7-е сутки увеличивало в 2 раза, а на 14-е сутки – в 8 раз.
У необлученных крыс при введении дипептида глутамил - триптофана (группа X) на 7-е и 14-е сутки стимуляция происходила в 2 раза. Метилглюкамина акридонацетат в VI группе влияния на титры специфических антител не оказывал.
Течение инфекционного процесса оценивалось по результатам бактериологического исследования элиминации возбудителя (КОЕ log2/г-1) (табл. 3.3.8).
На фоне введения метилглюкамина акридонацетата у необлученных животных на протяжении 1-й недели инфекционного процесса наблюдалась тенденция к снижению степени обсеменения. На протяжении 2-й недели наблюдалось существенное снижение показателей генерализации процесса (50% животных), а плотность культуры Candida albicans во внутренних органах ни в одной из исследуемых групп на 14-е сутки не превышала 50 КОЕ/г.
У облученных животных (VII группа) при 100% генерализации инфекционного процесса на 7-е сутки и высокой степени обсемененности эффект метилглюкамина акридонацетата проявился лишь через 2 недели. При этом он составлял больше 100 КОЕ у 50% животных, меньше 100 КОЕ – у 33,3% и меньше 50 КОЕ – у 16,7%. О положительном влиянии на течение инфекционного процесса используемых иммуностимуляторов свидетельствует отсутствие летальности у облученных животных.
Таблица 3.3.8
Результаты бактериологического исследования течения кандидозного сепсиса у крыс, которым вводили метилглюкамина акридонацетат и дипептид глутамил-триптофан
| Группы животных | Сутки | % животных с генерализованной формой | % животных с различной степенью обсеменения внутренних органов КОЕ log2/г-1). | |||
| 1-20 | 21-50 | 51-100 | >100 | |||
| ІI (n=6) | 7 дней | 100 | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 14 дней | 66,7 | 0 | 0 | 25 | 75 | |
| III (n=6) | 7 дней | 1003 | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 14 дней | 100 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
| VI (n=6) | 7 дней | 100 | 0 | 33,3 | 66,7 | 0 |
| 14 дней | 66,7 | 33,33 | 66,73 | 0 | 0 | |
| VII (n=6) | 7 дней | 100 | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 14 дней | 100 | 0 | 16,7 | 33,33 | 503 | |
| Х (n=6) | 7 дней | 66,73 | 253 | 753 | 0 | 0 |
| 14 дней | 16,73 | 1003 | 0 | 0 | 0 | |
| ХІ (n=6) | 7 дней | 100 | 0 | 0 | 503 | 503 |
| 14 дней | 503 | 33,3 | 66,7 | 0 | ||
