« ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи Коляда Олег Николаевич ...»
Непосредственное применение цитокинов или их антагонистов, так же как и лечение in vitro иммунными клетками, при котором последние вводятся в кровоток пациента, а также транспорт генов (к примеру, транспорт гена, кодирующего TNF) – все это лишь немногие из стратегий, которые получают все большее распространение. Следует, однако, осознавать, что цитокины плейотропны по своим свойствам и что следует учитывать побочные эффекты (которые могут быть фатальными), наблюдающиеся при клинических испытаниях цитокиновой или антицитокиновой терапии. У здорового человека разные цитокины эффективно взаимодействуют друг с другом, несмотря на их плейотропизм и обилие, но искусственное введение дополнительного количества определенного цитокина может нарушить это равновесие, что объясняет тот факт, что при применении цитокиновой терапии возникают сложные проблемы с дозировкой и временем введения [154 - 160].
Другим терапевтическим подходом является поиск иммуностимулирующих и адьювантных свойств у экзогенных молекул, натуральных (к примеру, бактериального происхождения) либо полу- или полностью синтетических. Спектр возможностей здесь неограничен, и поиск подобных агентов облегчается широким спектром тестов in vitro и in vivo, которые позволяют выявить и проанализировать имеющиеся иммуностимулирующие свойства, такие как повышение сопротивляемости к инфекциям, отторжение пересаженных опухолей, повышение продукции антител либо генерирование реакций гиперчувствительности замедленного типа против разнообразных антигенов [ 153, 158].
Конечно же, следует осознавать, что свойства различных иммуностимулирующих веществ экзогенного происхождения должны, по большому счету, реализовываться за счет их взаимодействий (либо уже выявленных, либо еще требующих прояснения) с системой цитокинов, и, таким образом, противоречий между прямым и непрямым подходом нет. Явным преимуществом экзогенных иммуностимуляторов является то, что, по сравнению с полипептидами иммунной системы, некоторые из них имеют меньшую молекулярную массу, являются синтетическими и обладают легко выявляемыми фармакокинетическими характеристиками, например, циклоферон стимулирует в организме человека выработку собственного интерферона, что способствует защите организма от инфицирования вирусами и другими инфекционными агентами, ингибированию роста злокачественных клеток. Препарат является индуктором смешанного иммунного ответа Th1/Th2, повышает функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, активирует фагоцитоз [153].
Решение проводить биологические и клинические исследования экзогенных иммуностимуляторов может получить еще одно обоснование, если рассмотреть ситуацию с антагонистами этих лекарств – иммуносупрессивными препаратами. В то время как область фармакологической иммуностимуляции все еще на ранней стадии развития, иммуносупрессивная терапия стала частью повседневной практики. Она применяется либо для того, чтобы предотвратить отторжение аллогенных трансплантатов почек, сердца, легких и печени, либо при лечении разнообразных аутоиммунных состояний, таких как ревматоидный артрит, инсулинозависимый диабет, красная волчанка, болезнь Крона, и, возможно, в будущем других состояний [159-161]. За исключением моноклональных антител к маркеру Т-лимфоцитов CD3, все иммуносупрессивные препараты, используемые в медицинской практике либо проходящие клинические испытания, – молекулы экзогенного происхождения или являющиеся вторичными метаболитами бактерий (как циклоспорин, макролиды рапамицин и такролимус, 15-дезоксиспергуалин, микофелонат) (153).
В Европе, к примеру, некоторые препараты бактериального происхождения продаются на рынке исключительно в качестве противоинфекционных иммуностимуляторов. Эти бактериальные иммуностимуляторы принимаются либо перорально, либо интраназально. Удивительным представляется тот факт, что эти же препараты проявляют иммуномодулирующие свойства, которые потенциально могут быть полезны при лечении аутоиммунного заболевания – ревматоидного артрита [162].
Из всех бактериальных продуктов, оказывающих стимулирующее влияние на функции иммунной системы за счет взаимодействия с макрофагами, моноцитами и лимфоцитами, наиболее мощными по своему влиянию являются липополисахариды (ЛПС). Они выполняют широкий спектр биологических функций: усиливают резистентность лабораторных животных к бактериальным, вирусным, грибковым и паразитарным инфекциям, вызывают некроз опухолей, причем все эти эффекты сопровождаются повышением продукции и высвобождением разнообразных цитокинов, таких, IL-1, IL-6, TNF, тимические пептиды [27, 162].
Производные нуклеиновых кислот представляют собой другой источник иммуностимулирующих агентов, представленных пиримидинонами, производными гуанозина, производными инозин-5’-метилмонофосфата и гипоксантина.
Все эти исследования были проведены in vivo, и очень немногие желательные эффекты были продемонстрированы in vitro. Оказывается, что первичными эффекторными клетками, активируемыми пиримидинонами, являются макрофаги и NK-клетки [162].
Ряд описанных выше соединений способен оказывать особый тип иммуностимулирующего влияния, а именно проявлять адъювантную активность. Последняя заключается в способности существенно усиливать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ на твердые или растворимые антигены. Это свойство представляет значительный практический интерес для разработчиков вакцин человека и животных, так как очищенные антигены, входящие в состав вакцин, обладают низким уровнем иммуногенности как таковой. Более того, часть лиц слабо реагирует на определенные виды вакцин, что справедливо для вакцин против гепатита В или вируса гриппа у пожилых людей [46,153].
Существует более мягкий подход, однако он применим только к живым микроорганизмам. Данная методика заключается в создании при помощи генной инженерии линий микроорганизмов, которые экспрессируют ген определенного цитокина, благодаря чему достигается усиление иммунного ответа. Также можно упомянуть работу Dempsey et al., которые показали, что вакцинация мышей рекомбинатным модельным антигеном (лизоцимом куриного яйца), связанным с компонентом C3 системы комплемента, вызывает 10000-кратное усиление гуморального и клеточного иммунных ответов по сравнению с одиночным введением антигена. Это позволяет считать С3, являющийся природным адьювантом системы врожденного иммунитета, способным влиять на развитие приобретенного иммунитета[35, 36]..
Строго говоря, гормоны тимуса, а также туфтизин (тетрапептид, полученный от части Fc молекулы иммуноглобулина) относятся к природным эндогенным иммуномодуляторам. Ряд подобных пептидов может быть создан при помощи химического синтеза или же экстрагироваться из тимуса крупного рогатого скота, а затем использоваться в различных областях в клинике. Природа и применение в терапии синтетических пептидов тимуса широко обсуждается в литературе [28, 31, 162-164].
Тимомодулин и тимостимулин представляют собой очищенные экстракты тимуса телят и получили довольно широкое применение в практике, в особенности в Италии. Тимомодулин содержит смесь низкомолекулярных белков (менее 10 ma). Считается, что эти препараты улучшают течение хронических инфекционных заболеваний, таких как хронический бронхит и рецидивирующие педиатрические инфекции (165).
Таким образом, одной из возможных сфер применения иммуностимулирующих препаратов является лечение инфекционных заболеваний, особенно в случае лиц, иммунная система которых не функционирует оптимально, в частности, у маленьких детей, пожилых людей и иммуноскомпрометированных пациентов. В этой сфере применяются разнообразные лизаты бактерий (некоторые из них могут выступать в качестве вакцин), химически очищенные бактериальные гликопротеины, экстракты растений и химически синтезированные препараты. Также в этом контексте используются пептиды тимуса тимомодулин и тимостимулин.
Тимозин 1 (Т1) является природным пептидом тимуса. Авторы предположили, что Т1 может влиять на баланс иммунитета и толерантности, находящийся под контролем ДК и тем самым влиять на формирование клеток Treg. Для этого оценивали влияние Т1 на образование ДК из клеток костного мозга мышей или предшественников периферической крови человека Полученные ДК оценивались на проявление экспрессии IDO и способность управлять праймингом Th1/Treg in vitro и in vivo против A. fumigatus и аллоантигенов [28, 31- 33, 164 - 168].
Авторы исследовали относительную способность ДК, сформировавшихся в присутствии Т1, индуцировать антигенспецифический прайминг Th1/Treg в CD4+-T-лимфоцитах селезенки в ответ на конидии Aspergillus. Показано, что Т1 повышает уровень прайминга CD4+-T-клеток, синтезирующих IFN-/IL-10 клетками костного мозга, а также количество IL-10 в присутствии FL-ДК. Блокада активности IDO или снижение количества B220+CD11c+ клеток из популяции костномозговых дендритных клеток, обработанных Т1, полностью прекращали активацию Treg. Таким образом, можно заключить, что клетки фенотипа CD11c+B220+ являются ключевыми компонентами, обеспечивающими толерогенное влияние Т1. Блокада IDO 1-метилтриптофаном предотвращала активацию IL-10-синтезирующих клеток, но не имела влияния на клетки, синтезирующие IFN-, что указывает на наличие причинно-следственной связи между активностью IDO и праймингом IL-10-синтезирующих клеток [164, 166].
Гистопатологические исследования показали, что у мышей, которым вводили костномозговые ДК, обработанные предварительно Т1, наблюдалось снижение рекрутинга провоспалительных клеток в легких и локальных воспалительных реакциях по сравнению с мышами, которым вводили обычные костномозговые ДК. Эти данные показывают, что введение дендритных клеток костномозгового происхождения извне связано с развитием тяжелой воспалительной токсичности, уровень которой снижается при обработке донорских клеток Т1. Также стоит отметить, что при использовании ДК, обработанных Т1 не только снижалась активность реакции «трансплантат против хозяина», но и увеличивалась сопротивляемость мышей-реципиентов к инфекции, в отличие от животных, которым вводили стволовые и дендритные клетки без дополнительной обработки [164 - 168].
Дипептид L-глутамил-L-триптофан, как и другие пептиды, состоящие из левовращающих изомеров аминокислот, относится к числу малотоксичных соединений, специфически фиксируясь на мембране тимоцита и усиливает трансмем-бранный обмена Са++. Под его влиянием происходит активация систем вторичных посредников. Представленные данные свидетельствуют том, что тимоген не только тимомимети-ческий иммуномодулятор, но в не меньшей степени полифункциональный биорегулятор, выполняющий, как и другие короткие пептиды, функцию стартового сигнала в пептидном регуляторном каскаде. Эти представления позволяют понять способность тимогена одно-временно индуцировать различные эффекты, направленность которых определяется ви-дом клеток-мишеней и характером имеющихся повреждений [33, 163 - 168].
Изучение патофизиологических механизмов течения инфекций на фоне радио-индуцированного иммунодефицита могут способствовать совершенствованию оценки состояния гомеостаза организма и эффективности терапевтического вмешательства [2,3,12, 13,29].
В Национальном Институте Аллергии и Инфекционных болезней (NIAID) и Национальном Онкологическом институте (NCI) было запущено ряд программ, которые проводятся на стандартизованных экспериментальных моделях животных для сравнения эффективности препаратов, разрабатываемых для профилактики и лечения радиационных поражений, согласно требованиям FDA [1, 5, 35, 36).4].
Вышеизложенное обуславливает актуальность проведения исследований комбинированного влияния небольших доз радиации и инфекции на организм. Определение оптимальных уровней продукции цитокинов для сопротивления бактериальной инфекции поможет в разработке потенциальных терапевтических стратегий для лечения инфекционных заболеваний на фоне радиационного повреждения.
Таким образом, возникает необходимость исследований механизмов формирования радиационно-индуцированных изменений иммунологической реактивности при инфекционном процессе и патогенетически обосновать принципы их коррекции.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены на 162 крысах-самцах популяции Вистар массой 180-200 г., которые были разделены на следующие группы: І – облученные крысы (36 особей); II – инфицированные крысы (36); ІІІ – облученные и инфицированные крысы (36); ІV – интактные крысы (6); V – облученные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VI – инфицированные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VIІ – облученные и инфицированные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VIІІ – интактные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); ІХ – облученные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6); Х – инфицированные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6); ХІ – облученные и инфицированные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6); ХІІ – интактные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6).
Подопытных животных, которые были выращены в виварии ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины», содержали на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде по десять – двенадцать голов в стандартных металлических клетках. Для устранения влияния сезонных и суточных колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в осенний сезон, в утренние часы. Исследования осуществлялись согласно принципам Хельсинской декларации, принятой Генеральной ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (1964 – 2000 гг.), Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине (1997 г.), соответствующих положений ВОЗ, Международного совета медицинских научных обществ, Международного кодекса медицинской этики (1983 г.), Национальных «Общих этических принципов исследований на животных» (Украина, 2001 г.), которые согласованы с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 18.03.1986). Все болезненные и стрессовые процедуры выполняли под легким эфирным наркозом, умерщвление животных осуществляли путем декапитации с предварительным введением раствора тиопентала натрия.
Облучение животных
Фракционированное тотальное облучение животных осуществляли в течение трех суток с интервалом 24 ч на рентгеновской диагностической установке РУМ - 17 на протяжении 40 сек. Напряжение было 90 кВ, сила тока 40 мА, алюминиевый фильтр 0,5 мм, кожно - фокусное расстояние 48 см. Суммарная доза – 1,5 Gy (ежедневная – 0,5 Gy).
Инфицирование животных
Для моделирования инфекционного процесса применяли культуру штамма Candida albicans, который был получен от больного острым гастроэнтероколитом до проведения этиотропной терапии и хранился в музее живых микроорганизмов лаборатории специфической профилактики капельных инфекций ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины».
Приготовление микробной суспензии Candida albicans с определенной концентрацией микробных клеток проводили при помощи электронного прибора Densi – La - Meter (Pliva - lachema а.s., Чехия) по шкале Mcfarland согласно инструкции к прибору. С поверхности агаровой среды стерильным изотоническим раствором NaCl смывали суточную тест-культуру и доводили до необходимого для проведения опытов количества единиц оптического стандарта плотности по Mcfarland. Число живых микроорганизмов (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом на питательные среды. Синхронизация культур перед проведением опытов достигалась путем одноразового воздействия низкой температуры (40 С) в течение 30-ти минут.
Приготовление питательных сред осуществлялось согласно ДСТУ 10.444.1 - 84 (СТСЭВ 3833 – 82) «Приготовление растворов, реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе» и в соответствии с инструкциями фирм-производителей.
Выбор дозы заражения были определены экспериментальным путем, описанным в патенте Украины на полезную модель «Способ получения модели генерализованного кандидоза» [169] и является оптимальной для достижения минимального уровня летальности опытных крыс, что является необходимым для получения модели генерализованного кандидоза.
Инфицирование крыс проводили путем внутривенного введения в хвостовую вену 0,5 мл суспензии указанного штамма Candida albicans, с концентрацией микробных клеток 5х106 КОЕ/мл. Животным контрольной группы внутривенно вводили 0,5 мл стерильного изотонического раствора NaCl.
Постановка эксперимента
После завершения облучения (на 3-и сутки) группа облученных и группа необлученных животных были инфицированы путем внутривенного введения культуры Candida albicans в дозе 2,5х106 КОЕ. Животных декапитировали на 1-е, 2-е, 3-и сутки после инфицирования и на 10-е, 17-е и 28-е сутки после начала облучения. В качестве контроля были интактные крысы, животные с инфекционным процессом без предварительного облучения и облученные крысы без последующего инфицирования. Последним внутривенно вводили 0,5 мл стерильного изотонического раствора NaСl. Наблюдение в группе неинфицированных облученных животных осуществлялось на протяжении 28-ми суток. Наблюдение в группах инфицированных животных осуществлялось на протяжении двух недель после инфицирования.
Разработанная модель была использована для оценки возможностей коррекции полученного типа дефекта антиинфекционной реактивности и терапевтической эффективности иммунотропных препаратов с широким спектром возможных биологических эффектов.
Учитывая характерные признаки индуцированного нарушения структуры антиинфекционной резистентности (в частности, дисбаланс цитокинов и недостаточный уровень активации иммунокомпетентных клеток периферической крови и перитонеальных макрофагов в ответ на инфекцию), в качестве средств коррекции был выбран препарат, среди фармакологических эффектов которого указана способность влиять на эффективность процессов фагоцитоза, – индуктор интерферона метилглюкамина акридонацетат, и препарат, нормализующий функциональное состояние иммунной системы, – дипептид глутамил-триптофан. Препараты вводили внутримышечно, начиная со следующего дня после инфицирования, один раз в сутки, курсом 5 суток. Разовая доза составляла для метилглюкамина акридонацетат 10 мг/кг и для дипептид глутамил-триптофана 200 мг/кг массы тела в сутки соответственно.
Микробиологические методы исследования
С целью микробиологического исследования органов крыс (кровь, сердце, печень), последние в асептических условиях препарировали, взвешивали (вес каждой пробы для посева составлял 1 г), затем измельчали в стерильных условиях в биологическом гомогенизаторе, вносили в накопительные среды, инкубировали в течение 18-ти часов при температуре 370 С. Для определения количества микроорганизмов 1 г исследуемого материала переносили в асептических условиях в биологический гомогенизатор и растирали, добавляя 1 мл изотонического раствора NaCl, затем готовили ряд последовательных десятикратных разведений. 0,1 мл гомогената из каждого разведения высеивали на элективную агаризованную среду ВСА. Дальнейшее исследование и идентификация изъятых культур микроорганизмов, которая осуществлялась по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам, проводились общепринятыми методами [46-49].
Определение количества микроорганизмов. Концентрацию микроорганизмов в 1 г исследуемого материала определяли путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ/г), с учетом количества посевного материала и разведения, по формуле:
,
где Х – число КОЕ/г исследуемого материала;
10 – постоянный коэффициент при посеве 0,1 мл гомогената;
N – количество колоний;
m – разведение (в 10, 100, 1000 раз и т. п.).
Для удобства полученные результаты выражали в десятичных логарифмах числа микроорганизмов на 1 г исследуемого материала – lg КОЕ/г - и интерпретировали следующим образом [4, 5]:
I степень – до 0,5 lg КОЕ/г;
ІІ – 0,51-1,5 lg КОЕ/г;
ІІІ – 1,51-2,5 lg КОЕ/г;
ІV – больше 2,5 lg КОЕ/г.
Контроль качества питательных сред проводили согласно рекомендациям фирм-производителей, которые изложены в сертификатах к продукции, а также в соответствии с Информационным письмом МЗ Украины №05.4.1/1670 «Бактериологический контроль питательных сред», Киев, 2000.
Иммунологические методы исследования
Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови
Концентрацию TGF- в сыворотке крови оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием диагностической иммуноферментной тест-системы R&D Systems, Inc.,
IL-17 – при помощи тест-системы производства Life Science Inc.,
IFN- – используя тест систему производства PBL Biomedical Laboratories,
IL-10 и IL-4 – при помощи диагностических тест-систем производства фирмы Abcam.
Принцип метода на примере определения TGF- заключается в следующем.
На первой стадии анализа исследовательские и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизованными антителами. TGF-, который содержится в образцах, связывается с иммобилизованными антителами (с добавлением буферного раствора). Материал, который не связался, удаляется путем отмывки. TGF-, который связался с антителами, взаимодействует при инкубации с коньюгатом (поликлональные антитела к TGF- коньюгированные с пероксидазой хрена).
Несвязавшийся коньюгат удаляется путем отмывки. На третьей стадии связавшийся коньюгат №1 взаимодействует при инкубации с коньюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количество связавшегося коньюгата № 2 определяют в цветной реакции с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением раствора стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм на иммуноферментном анализаторе. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству присутствующего в образце TGF-.
Диапазон измеряемых концентраций составляет 0–2000 пг/мл.
Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови
Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), проводилось стандартным методом преципитации 3,5 % раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) (м.м. 6000) (Applichem Gmb) с последующей спектрометрией, в единицах оптической плотности (е. о. п.) по методике, описанной в монографии [170].
Для этого сыворотку крови крыс разводили изотоническим раствором NaСl в соотношении 1:25. Разбавленную сыворотку смешивали с 3,5 % раствором ПЭГ в соотношении 1:1.
Для проведения реакции преципитации пробирки оставляли на 18 часов в холодильнике при температуре 4 С, потом центрифугировали на протяжении 15-ти минут при 1500 об./мин и сливали надосадочную жидкость. Далее осадок растворяли в 2,5 мл 0,1 % NaОН, ресуспендировали и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Пробы замеряли на спектрофотометре при длине волны 280 нм, в качестве контроля использовали 0,1 % раствор NaОН. Уровень ЦИК выражали в МЕ.
Определение уровня общего комплемента в сыворотке крови
Комплементарную активность сыворотки крови определяли по следующей методике [170].
Подготовка сыворотки для исследования. Забор крови проводили без антикоагулянтов, пробы выстаивались 1 час при комнатной температуре, центрифугировались (10 минут при 1000 g), во время чего отделялась сыворотка.
Титрование комплемента. Исследуемая сыворотка разводилась рабочим буфером в отношении 1:2. Разведенную сыворотку в количестве 0,5 мл смешивали с 2,55 мл рабочего буфера, что соответствует разведению 1:12,2. В остальных пробирках готовили ряд разведений в соответствии с таблицей 2.1.
Таблица 2.2
Схема титрования комплемента
| Номера пробирок | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Разведение (1: 20) | 12,2 | 15,2 | 18,5 | 24,5 | 30,5 | 38,0 | 47,5 | 59,5 | 75 | 93 | 0% гемо-лиза | 100% гемо-лиза |
| Реагенты (мл) | ||||||||||||
| Рабочий Буфер | - | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | - |
| Сыворот-ка 1:12,2 | 0,4 | 1,6 | смешивают и переносят по 1,6 мл в последующие пробирки | - | - | |||||||
| Рабочий Буфер | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | - |
| Дист. Вода | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 1,2 |
| Гемоли-тическая система | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 |
В пробирку № 12, где должен быть 100 % гемолиз, добавляли следовые количества сапонина. Все пробы инкубировали на водяной бане в течение 45 минут при 37° С. Затем центрифугировали 10 минут при 800 g и измеряли оптическую плотность надосадочной фракции в 11-й пробирке (0% гемолиз).
Обработка результатов. Результаты определения оптической плотности корригируют по значению оптической плдотности контроля (пробирки 11 и 12). Рассчитывали процент гемолиза. Для построения графической зависимости использовали логарифмическую бумагу. Значение каждого разведения сыворотки (12,2, 15,2, 18,5 и т. д.) отмечали на оси абсцисс. На оси ординат откладывали соответствующий процент гемолиза. Получаемые точки соединяли и по графику тут же определяли разведение сыворотки, при котором наступает 50% гемолиз. Число гемолитических единиц в 1 мл сыворотки рассчитывали по формуле:
СН50/мл=a/x
а — фактор первоначального разведения сыворотки (равен 12,2),
х—объем сыворотки, вызывающий 50% гемолиз.
Определение фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата
На протяжении 1-2 минут массировали животному живот. Затем отбирали жидкость из брюшной полости и вносили ее в пенициллиновые флаконы с покровными стеклышками и фосфатно-солевым буфером.
Флаконы с жидкостью ставили на один час в термостат при температуре 37 С. Отделение макрофагов от других клеток осуществляли за счет их прилипающей способности к стеклу. Жидкость отбирали, стеклышки промывали изотоническим раствором NaCl и добавляли суспензию латекса в концентрации 3 х 106 мл или культуры Candida albicans с определенной концентрацией микробных клеток по методике, описанной в монографии [170].
Снова выдерживали в термостате при температуре 37 С на протяжении 30-ти минут. Затем стеклышки доставали, промывали, высушивали, фиксировали клетки метанолом и окрашивали по методу Романовского-Гимзы.
Определение фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов проводили по подсчету фагоцитарного числа - индекса Райта (ИР) и фагоцитарного индекса - индекса Гамбургера (ИГ).
При микроскопическом исследовании окрашенных препаратов подсчитывали 200 макрофагов или нейтрофилов, регистрируя количество фагоцитирующих клеток (фагоцитарное число, ФЧ), а также количество поглощенных ими микробных тел или латексных частиц (фагоцитарный индекс, ФИ).
Определение антител к Candida albicans
Антитела к Candida albicans выявляли при помощи тест–системы CAND-TECTM. Принцип измерения состоит в том, что частицы латекса одинакового размера, покрытые специфическими антителами к Candida, будут агглютинировать в присутствии антигена Candida. В данном случае чувствительный латекс покрыт кроличьими антителами к Candida. В ходе измерения одновременно идет постановка позитивного и негативного контроля наравне с исследуемой сывороткой для проверки корректной работы системы. Образцы считаются позитивными при наличии агглютинации латекса.
Статистические методы
Статистическую обработку полученных количественных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Office 2010, а также программы Biostat 2003. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, согласно современным требованиям к проведению анализа медицинских данных.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Раздел 3.1 Влияние фракционированного тотального низкодозового рентгеновского облучения на показатели иммунологической реактивности.
В целом, облучение представляет собой сложный процесс организма, в котором задействованы межклеточные реакции в иммунной системе и передача сигналов в иммуннокомпетентных клетках [2, 3, 47, 48].
Подраздел 3.1.1. Содержание цитокинов, отвечающих за поляризацию Th1/Th2-специфического иммунного ответа, в сыворотке крови.
Нормальное функционирование иммунной системы возможно только за счет поддержания определенного баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Изменения в экспрессии и продукции цитокинов часто являются маркером воздействия неблагоприятных факторов на иммунологическую реактивность. Посредством цитокинов гомеостатическая система организма реализует свою реакцию на внешнее воздействие. Поэтому исследования экспрессии генов и продукции цитокинов могут дать информацию о состоянии иммунологической реактивности и о патологических процессах, происходящих в иммунной системе и в организме. Сегодня мы имеем возможность оценивать экспрессию генов интерлейкинов, которые, с одной стороны, продуцируются разными субпопуляциями Т-хелперов (Thl и Th2), а с другой – осуществляют регуляцию различных эффекторных популяций иммунокомпетентных клеток: интерлейкины Th1 – эффекторов ГЗТ, Th2 – антителопродуцентов [19, 46, 47, 51].
Целью данного раздела исследования была проверка предположения о том, что системный рост уровней TGF, индуцированный низкими дозами фракционированного рентгеновского излучения, в комплексе с повышением синтеза IL-10, создает условия для поляризации CD4+-T-эффекторных механизмов специфического иммунного ответа в направлении Th1/Th2.
В ходе исследования иммунологической реактивности в ответ на фракционированное рентгеновское облучение была проанализирована динамика цитокинового профиля, отвечающего за поляризацию Th1/Th2- специфического иммунного ответа (табл. 3.1.1).
Таблица 3.1.1
Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели иммунологической реактивности крыс
| Показа-тель | Ед. изм. | Сутки эксперимента | Конт-роль | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 10 | 17 | 28 | ||||
| TGF- | пг/мл | M | 986,21 | 1212,41 | 1347,81 | 1319,5 | 829,21 | 211,1 | 198,1 |
| m | 185 | 229 | 275,9 | 362,4 | 396,2 | 18,8 | 32,3 | ||
| IL-10 | пг/мл | M | 4,7 | 8,3 | 5,1 | 39,91 | 21,81 | 3,1 | 3,1 |
| m | 1,2 | 3,9 | 2,4 | 6,6 | 10,4 | 1,6 | 0,6 | ||
| IFN- | пг/мл | M | 18,8 | 16,4 | 10,61 | 16,1 | 19,6 | 23,8 | 20,3 |
| m | 6,7 | 7,2 | 6,6 | 5,3 | 5,4 | 7,7 | 8,5 | ||
| IL-4 | пг/мл | M | 32,6 | 29,7 | 29,1 | 21,11 | 32,6 | 33,2 | 35,8 |
| m | 4,7 | 5,8 | 6,7 | 2,6 | 4,3 | 5,1 | 4,2 | ||
Примечание: 1 - р<0,05, по сравнению с интакными животными.
После облучения в выбранном режиме выраженное и стабильное повышение сывороточного уровня TGF- наблюдалось на протяжении, по крайней мере, 17-ти суток. Максимальные уровни этого показателя, более чем в 6 раз превышающие его значение у интактных животных (198,1±32,3 пг/мл), отмечены на 3-и и 10-е сутки после облучения (1347,8±275,9 и 1319,5±362,4 пг/мл, соответственно).
Кроме того, к параметрам цитокинового профиля, колебания которых были достоверными, принадлежит и уровень IL-10, рост которого зафиксирован на 10-е (37,9±6,56 пг/мл) и 17-е (21,8±10,4 пг/мл) сутки исследования по сравнению со значением у интактных крыс (3,1±0,6 пг/мл).
Приведенные выше данные свидетельствуют о наличии условий для угнетения индукции основных эффекторных механизмов (Th1, Th2). Однако, достоверное снижение уровня одного из маркерных цитокинов Th1-лимфоцитов – IFN- – наблюдалось лишь на 3-и сутки (10,6±6,6 пг/мл) по сравнению с контрольными значениями (20,3±8,5 пг/мл).
Как указывалось, Th2-лимфоциты являются преимущественными продуцентами противовоспалительных цитокинов, к которым относится и IL-4, угнетение продукции которого наблюдалось на 10-е сутки (21,1±5,6 пг/мл против 35,8±4,2 пг/мл в контроле). В конце 4-й недели наблюдения существенных отличий при сравнении с показателями интактных животных не отмечалось.
Местная продукция IL-4 Th2-клетками ведет к сильной клональной пролиферации и экспансии активированных В-клеток. Он выступает в качестве антагониста IFN- при воздействии на макрофаги, Т-хелперы [19, 47, 48].
Таким образом, существенный интерес представляет изучение в этих условиях клеточных и гуморальных факторов неспецифической иммунологической реактивности [19, 47, 48].
Раздел 3.1.2. Фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов.
Для исследования параметров клеточного звена неспецифической реактивности нами были взяты показатели активности фагоцитирующих клеток, динамика которых представлена в таблице 3.1.2, установлено, что после облучения в выбранном режиме фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов на протяжении первой недели наблюдения имела лишь тенденцию к снижению, и только на 10-е сутки достигла достоверной разницы по сравнению с контрольной группой (41,7±3,9% против 52,8±5,1%, соответственно). При этом фагоцитарное число макрофагов достоверно снижалось по сравнению с интактной группой уже на 3-и сутки (3,9±0,3 ед. против 9,5±0,8 ед. в контроле), а минимальный его уровень наблюдался на 10-е сутки (3,2±0,4 ед.) с последующим восстановлением до нормальных значений.
Таблица 3.1.2
Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели клеточного звена неспецифического иммунного ответа крыс
| Показа-тель | Ед. изм. | Сутки эксперимента | Конт-роль | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 10 | 17 | 28 | ||||||||||
| ФИ мФ | % | M | 48,6 | 43,2 | 46,8 | 41,71 | 49,3 | 51,9 | 52,8 | ||||||
| m | 4,2 | 9,6 | 4,5 | 3,9 | 2,3 | 4,7 | 5,1 | ||||||||
| ФЧ мФ | ед | M | 9,1 | 8,3 | 3,91 | 3,21 | 7,7 | 8,5 | 9,5 | ||||||
| m | 0,7 | 1,2 | 0,3 | 0,4 | 1,3 | 0,9 | 0,8 | ||||||||
| ФИ нФ | % | M | 57,4 | 55,8 | 53,61 | 44,71 | 57,6 | 60,4 | 62,8 | ||||||
| m | 6,1 | 8,3 | 4,4 | 4,1 | 5,9 | 4,2 | 5,4 | ||||||||
| ФЧ нФ | ед | M | 7,3 | 6,8 | 5,71 | 5,21 | 7,4 | 8,3 | 8,5 | ||||||
| m | 1,2 | 2,3 | 2,3 | 0,4 | 1,5 | 1,3 | 0,9 | ||||||||
Примечание: 1 - р<0,05, по сравнению с интактными животными.
Что касается фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа нейтрофилов, то здесь динамика была более выраженной. Так, достоверного снижения количество фагоцитирующих нейтрофилов (ФИнф) облученных крыс достигло на 3-и сутки (53,6±4,4%) по сравнению с контролем (62,8±5,4%) и минимума – на 10-е сутки (44,7 ± 4,1 %). Для показателя поглотительной способности нейтрофилов (ФЧнф) была характерна та же динамика: 5,7±2,3 против 8,5±0,9 ед. в группе интактных животных на 3-и сутки и 5,2±0,4 против 8,5±0,9 ед. – на 10-е. К 17-м и 28-м суткам эксперимента значения вышеуказанных показателей также восстанавливались до контрольных.
Макрофаги, активированные IFN-, выполняют функции эффекторных клеток в защитных и повреждающих реакциях воспалительного процесса. При этом макрофаги синтезируют и секретируют широкий спектр цитокинов, обладающих эффекторной и регуляторной активностью, расщепляющие ферменты и супероксидные радикалы. Регулирующим цитокином для макрофагов является IL-10 – антагонист IFN-. Его продуцентами могут быть моноциты/макрофаги, T-клетки. Ингибирующим цитокином является и TGF-, эффекты которого зависят как от его концентрации, так и от присутствия других цитокинов [59].
Раздел 3.1.3. Активность комплемента и уровень ЦИК в сыворотке крови.
Для характеристики состояния гуморального звена неспецифической реактивности положены показатели активности системы комплемента сыворотки крови, колебания которой на протяжении всего периода наблюдений имели лишь характер тенденций (были статистически недостоверными) по сравнению с этим показателем у контрольных животных, за исключением 3-х суток (74,3±7,6 гем. ед. против 96,6±8,1 гем. ед.).
Как показано в таблице 3.1.3, недостаточный уровень функционирования макрофагов и нейтрофилов отразился и на механизмах элиминации патогена, что проявилось в повышении уровня ЦИК с достоверным максимумом на 3-и (97,8±9,6 МЕ) и на 17-е сутки - 95,0±4,5 МЕ, при 85,0±5,3 МЕ в контрольной группе.
Таблица 3.1.3
Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели гуморального звена неспецифического иммунного ответа крыс
| Показа-тель | Ед. изм. | Сутки эксперимента | Конт-роль | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 10 | 17 | 28 | ||||
| ЦИК | МЕ | M | 91,3 | 96,2 | 97,81 | 95,01 | 110,51 | 87,2 | 85,0 |
| m | 10,1 | 12,6 | 9,6 | 4,5 | 15,3 | 5,4 | 5,3 | ||
| Компле-мент | гем.ед. | M | 85,6 | 78,9 | 74,31 | 94,8 | 88,9 | 94,7 | 96,6 |
| m | 9,2 | 17,9 | 7,6 | 8,1 | 10,2 | 6,9 | 8,1 | ||
Примечание: 1 - р<0,05, по сравнению с интактными животными.
Резюме. Фракционированное рентгеновское облучение приводит к системному росту уровня TGF-, что, в комплексе с усилением синтеза IL-10, создает условия для угнетения эффекторных механизмов Th1/Th2- специфического иммунного ответа, проявляющегося снижением уровней сывороточных цитокинов IFN- и IL-4. Наряду с этим наблюдается нестойкий, носящий преимущественно характер тенденций, дефицит в системе неспецифической иммунной защиты.
Раздел 3.2. Нарушения иммунологической реактивности под влиянием предварительного фракционированного тотального низкодозового рентгеновского облучения при остром экспериментальном генерализованном кандидозе.
Описанные в предыдущем разделе результаты влияния фракционированного тотального рентгеновского облучения на крыс указывают на признаки скрытой функциональной недостаточности неспецифической реактивности иммунной системы, что при дополнительной функциональной нагрузке, в нашем случае – экспериментальном генерализованном кандидозном сепсисе, может усиливать дефект антиинфекционной резистентности в различной степени выраженности.
Внутривенное введение штамма C. albicans (ATCC 885 - 653) в сублетальной дозе (2,5х106 КОЕ/мл) интактным крысам линии Вистар обеспечивало развитие септического состояния с диссеминацией и персистенцией возбудителя во внутренних органах. Элиминация возбудителя, по результатам бактериологического исследования внутренних органов, наблюдалась на протяжении 5-ти – 7-ми суток с момента инфицирования. Уровень летальности при этой модели не превышает 3%.
Раздел 3.2.1. Содержание цитокинов, отвечающих за поляризацию Th1/Th2-специфического иммунного ответа, в сыворотке крови.
В результате микробиологических, серологических и иммунологических исследований нами были получены результаты, представленные в таблицах 3.2.1 – 3.2.5.
Исследование показателей сывороточного цитокинового профиля (табл. 3.2.1) позволило продемонстрировать определенные отличия в процессах индукции Th-эффекторных механизмов формирования специфического иммунного ответа.
Таблица 3.2.1
Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на уровень сывороточных цитокинов у крыс на модели острого диссеминированного кандидоза
| По-каза-тель | Ед. изм | Груп-пы | Сутки эксперимента | Конт-роль (M±m) | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 10 | 17 | 28 | |||||
| IFN- | пг / мл | II | M | 95,81 | 176,41 | 426,21 | 181,71 | 23,8 | 7,51 | 20,3±8,5 |
| m | 25,2 | 91,7 | 212,8 | 48,9 | 16,4 | 4,5 | ||||
| III | M | 47,71;2 | 78,71;2 | 99,51;2 | 116,61;2 | 85,61;2 | 63,81;2 | |||
| m | 19,7 | 49,6 | 24,9 | 30,9 | 23,9 | 26,3 | ||||
| IL-17 | пг/мл | II | M | 79,51 | 130,41 | 127,21;2 | 67,41;2 | 51,81;2 | 14,72 | 17,7±4,1 |
| m | 5,6 | 11,7 | 34,9 | 9,1 | 8,9 | 3,7 | ||||
| III | M | 83,31 | 149,91 | 215,81 | 273,61 | 241,31 | 89,31 | |||
| m | 18,7 | 27 | 49,3 | 47 | 42,9 | 35,7 | ||||
| IL-10 | пг/мл | II | M | 2,41;2 | 3,11 | 1,81 | 17,71;2 | 4,12 | 2,21;2 | 3,1±0,6 |
| m | 1,1 | 0,3 | 0,4 | 2,6 | 3,4 | 0,9 | ||||
| III | M | 6,31 | 10,7 | 18,91 | 16,41 | 11,11 | 5,7 | |||
| m | 1,9 | 17,6 | 14,1 | 3,6 | 4,6 | 2,4 | ||||
| IL-4 | пг/мл | II | M | 90,51 | 99,11 | 148,31 | 102,11 | 88,41 | 62,31 | 35,8±4,2 |
| m | 10,5 | 12,2 | 16,4 | 2,5 | 3,6 | 6,6 | ||||
| III | M | 51,41;2 | 85,61;2 | 92,11;2 | 57,91;2 | 82,71;2 | 79,31;2 | |||
| m | 14,5 | 6,4 | 10,3 | 3,3 | 2,5 | 7,1 | ||||
Примечания: 1 – достоверность отличий от интактной группы животных; 2 – достоверность отличий от группы животных, не подвергавшихся облучению.
Уровень IFN- у необлученных инфицированных крыс (II группа) прогрессивно возрастал на протяжении первой недели. На 1-е сутки он составлял 95,8±25,2 пг/мл, на 2-е – 176,4±91,7 пг/мл, на 3-и – 426,2±212,8 пг/мл. На 10-е сутки он снижался до 181,7±48,9 пг/мл, на 17-е – восстанавливался до нормы – 23,8±16,4 пг/мл, а на 28-е сутки был ниже нормы – 7,5±4,5 пг/мл против 20,3±8,5 пг/мл.
У облученных и инфицированных крыс повышение уровня IFN- было менее выражено, но он оставался статистически достоверно больше значений контрольной группы (интактных крыс) (табл. 3.2.1).
У необлученных животных рост уровня IL-17 зафиксирован уже в первые трое суток после инфицирования. На 1-е сутки он составлял 79,5±5,6 пг/мл, на 2-е – 130,4±11,7 пг/мл, на 3-и – 127,2±34,9 пг/мл. В последующем он снижался: на 10-е сутки – до 67,4±9,1 пг/мл, на 17-е – до 51,8±8,9 пг/мл. На 28-е сутки он составлял 14,7±3,7 пг/мл при норме 17,7±4,1 пг/мл. У облученных крыс продукция IL-17 оставалась на более высоком уровне на протяжении, по крайней мере, четырнадцати суток после инфицирования. На 1-е сутки уровень цитокина в сыворотке крови составлял 83,2±18,7 пг/мл, на 2-е – 149,8±27 пг/мл, на 3-и – 215,7±49,3 пг/мл, на 10-е – 273,5±47 пг/мл, на 17-е – 241,2±42,9 пг/мл. Значения показателя оставались высокими и на 28-е сутки – 89,2±35,7 пг/мл.
Уровень IL-10, который, по данным многих исследований [59-63], положительно коррелирует со степенью тяжести течения системного кандидоза, у облученных животных заметно возрастал после инфицирования. На 2-е сутки он составлял 10,7±17,6 пг/мл, на 3-и – 18,9±14,1 пг/мл, на 10-е – 16,4±3,6 пг/мл, на 17-е – 11,1±4,6 пг/мл, с восстановлением до нормы на 28-е сутки – 5,7±2,4 пг/мл против 3,1 ± 0,6 пг/мл у интактных крыс. В то же время у необлученных животных повышение этого показателя наблюдалось лишь на 10-е сутки после инфицирования – 17,7±2,6 пг/мл – и фактически совпадало с периодом клинической ремиссии.
Что касается динамики IL-4, то у необлученных животных на фоне кандидозного сепсиса его уровень также прогрессивно нарастал на протяжении первой недели с максимальными значениями на 3-и сутки – 148,3±16,4 пг/мл – и на 10-е – 102,1±2,5 пг/мл. У облученных крыс рост уровня IL-4 был менее выраженным: на 3-и сутки он составлял 92,1±10,3 пг/мл, на 10-е – 57,91±3,3 пг/мл.
Раздел 3.2.2. Фагоцитарная активность макрофагов и нейтрофилов.
У необлученных крыс при генерализованнм кандидозном сепсисе (II группа) наблюдалась стремительная стимуляция фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов по сравнению с интактной группой на протяжении 17-ти суток эксперимента, достигая максимума для ФИмф на 3-и сутки (91,2±11,1%), а для ФЧмф – на 17-е (15,7±1,6 ед.). У облученных и инфицированных животных (III группа) наблюдалось уменьшение процента активных макрофагов с первых же суток наблюдения по сравнению с необлученными инфицированными крысами (II группа). Еще более заметными были изменения со стороны поглотительной способности макрофагов, показатели которых были ниже показателей не только группы сравнения (II группы) (4,2±0,7 ед. против 11,3±2,6 ед.), но и интактных животных (4,2±0,7 ед. против 9,5±0,8 ед.) (табл. 3.2.2).
Аналогичная динамика прослеживалась и для функциональной активности нейтрофилов. Наблюдалось закономерное нарастание как поглотительной активности фагоцитов, так и количества фагоцитирующих клеток при диссеминированном кандидозе у необлученных крыс в течение первых 10-ти дней, достигая максимума на 3-и сутки для ФИнф (83,4±8,1 против 79,7±8,2%), а для ФЧнф – на 17-е (14,1±1,7 ед. против 11,4±1,3).
Таблица 3.2.2
Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на показатели неспецифической иммунологической реактивности крыс на модели острого диссеминированного кандидоза
| По-каза-тель | Ед. изм | Груп-пы | Сутки эксперимента | Конт-роль (M±m) | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 10 | 17 | 28 | |||||
| ФИ Мф | % | II | M | 69,61 | 75,41 | 91,21 | 74,71 | 57,8 | 40,31 | 52,8±5,1 |
| m | 7,2 | 8,3 | 11,1 | 7,1 | 6,1 | 4,3 | ||||
| III | M | 37,41;2 | 53,22 | 57,12 | 55,82 | 49,72 | 47,32 | |||
| m | 5,6 | 6,9 | 7,4 | 4,6 | 5,4 | 4,7 | ||||
| ФЧ мФ | ед. | II | M | 11,3 | 12,51 | 14,81 | 13,41 | 15,71 | 9,1 | 9,5±0,8 |
| m | 2,6 | 1,8 | 2,3 | 1,5 | 1,6 | 0,8 | ||||
| III | M | 4,21;2 | 5,91;2 | 6,81;2 | 7,41;2 | 7,91;2 | 8,21 | |||
| m | 0,7 | 1,2 | 1,5 | 0,6 | 0,9 | 0,6 | ||||
| ФИ нФ | % | II | M | 69,81 | 76,81 | 83,41 | 73,41 | 69,5 | 58,1 | 62,8±5,4 |
| m | 3,5 | 8,5 | 8,1 | 6,5 | 6,8 | 5,7 | ||||
| III | M | 61,82 | 70,71 | 79,71 | 65,42 | 62,2 | 51,41 | |||
| m | 7,3 | 6,6 | 8,2 | 5,6 | 6,4 | 5,5 | ||||
| ФЧ нФ | ед. | II | M | 10,81 | 13,31 | 14,11 | 12,41 | 9,2 | 8,8 | 8,5±0,9 |
| m | 1,6 | 1,8 | 1,7 | 1,4 | 1,1 | 0,7 | ||||
| III | M | 9,8 | 10,11;2 | 11,41;2 | 7,21;2 | 10,41 | 9,3 | |||
| m | 1,2 | 1,0 | 1,3 | 0,7 | 0,7 | 0,5 | ||||
Примечания: 1 – достоверность отличий от интактной группы животных; 2 – достоверность отличий от группы животных, не подвергавшихся облучению. * - р<0,05; ** - р<0,01.
Относительная недостаточность активации фагоцитоза нейтрофилов, которая наблюдалась у облученных и инфицированных животных (III группа) относительно аналогичных показателей у необлученных инфицированных крыс (II группа), достигала статистически достоверных значений на 10-е сутки. При этом ФИнф составлял 65,4±5,6% и 73,4±6,5% соответственно.
Раздел 3.2.3. Активность комплемента, уровень ЦИК, титр специфических иммуноглобулинов к C. albicans в сыворотке крови и степень контаминации внутренних органов.
Для характеристики состояния гуморального звена неспецифической реактивности положены показатели активности системы комплемента уровень циркулирующих иммунных комплексов, специфических антител и показатели степени обсемененности внутренних органов C. albicans.
У необлученных животных (табл. 3.2.3) с диссеминированным кандидозным сепсисом (II группа) наблюдалось нарастание уровня ЦИК со 2-х суток (97±8,8 МЕ) и на протяжении всего периода наблюдения. У облученных и инфицированных крыс (III группа) наблюдалось статистически значимое различие по сравнению с показателями группы сравнения с максимальными значениями на 10-е (154±7,1 МЕ) и 17-е (166±15,7 МЕ) сутки, что, по-видимому, связано с нарушением функции элиминации со стороны фагоцитарных клеток и системы комплемента. Так, на 10-е сутки в облученных и инфицированных животных содержание ЦИК составляло 154±7,1 МЕ при 131±8,4 МЕ у необлученных инфицированных крыс и 85±5,3 МЕ у интактных.
Комплементарная активность сыворотки крови снижалась в обеих группах инфицированных животных, по-видимому, за счет усиленного потребления для инактивации циркулирующих иммунных комплексов, а также элиминации патогена по альтернативному пути. Минимальные значения активности комплемента наблюдались на 10-е сутки эксперимента и составляли 39,8±2,9 гем. ед. в группе облученных животных с кандидозным сепсисом по сравнению с 58,8±4,7 гем.ед. у необлученных инфицированных крыс при 96,6±8,1 гем.ед. у интактных (табл. 3.2.3).
Таблица 3.2.2
Влияние фракционированного тотального рентгеновского облучения на уровень циркулирующих иммунных комплексов и систему комплемента крыс на модели острого диссеминированного кандидоза
| По-каза-тель | Ед. изм | Груп-пы | Сутки эксперимента | Конт-роль (M±m) | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 10 | 17 | 28 | |||||
| ЦИК | МЕ | II | M | 88 | 971 | 1101 | 1311 | 1421 | 1051 | 85±5,3 |
| m | 9,3 | 8,8 | 10,5 | 8,4 | 13,2 | 9,4 | ||||
| III | M | 1051;2 | 1291;2 | 1451;2 | 1541;2 | 1661;2 | 1491;2 | |||
| m | 9,8 | 11,6 | 14,9 | 7,1 | 15,7 | 16,9 | ||||
| Комп-ле-мент | гем. ед. | II | M | 91,4 | 74,31 | 62,61 | 58,81 | 68,71 | 89,4 | 96,6±8,1 |
| m | 8,7 | 7,8 | 6,9 | 4,7 | 7,8 | 9,4 | ||||
| III | M | 78,11;2 | 63,51;2 | 54,41;2 | 39,81;2 | 48,51;2 | 69,71;2 | |||
| m | 8,1 | 6,6 | 5,4 | 2,9 | 5,6 | 7,7 | ||||
Примечания: 1 – достоверность отличий от интактной группы животных; 2 – достоверность отличий от группы животных, не подвергавшихся облучению.
У облученных крыс наблюдалась 100% генерализация инфекционного процесса как на 7-е сутки, так и на 14-е сутки (табл. 3.2.4). Уровень элиминации возбудителя, о котором судили по отсутствию положительной динамики степени обсеменения внутренних органов, свидетельствует об усугублении клинического течения инфекции, индуцированном фракционированным облучением, и даже наблюдалась летальность в данной группе животных.
Таблица 3.2.4
Результаты бактериологического исследования течения кандидозного сепсиса у облученных и необлученных крыс
| Группы животных | Сутки | % животных с генерализованной формой | % животных с различной степенью обсеменения внутренних органов (КОЕ log2/г-1) | |||
| 1-20 | 21-50 | 51-100 | >100 | |||
| ІI (n=6) | 7 дней | 100 | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 14 дней | 66,71 | 0 | 0 | 25 | 75 | |
| III (n=6) | 7 дней | 100 | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 14 дней | 100 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Примечание:
1 - р0,05 по сравнению с интактными животными;
При исследовании уровня специфических антител к Candida albicans было установлено, что на седьмые сутки инфекции титры специфических антител были вчетверо ниже у облученных крыс III группы, чем у необлученных животных II группы, – 1:20 против 1:80, на четырнадцатые сутки различия в титрах антикандидозных антител были вдвое (табл. 3.2.5).
Таблица 3.2.5
Сравнительный анализ динамики нарастания титров специфических антител к Candida albicans у облученных и необлученных крыс
| Титры антител | Необлученные, ІI Группа | Облученные, ІІI Группа |
| 7 сутки | 1:80 | 1:20 |
| 14 сутки | 1:160 | 1:80 |
