На правах рукописи
Калашникова Светлана Александровна
гОРМОНАЛЬНАЯ
ДИЗРЕГУЛЯЦИЯ КАК КОМПОНЕНТ
ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОТОКСИКОЗА
(морфофункциональное исследование)
14.00.15 – патологическая анатомия
14.00.16 – патологическая физиология
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва - 2009
Работа выполнена в Государственном учреждении «Волгоградский
научный центр Российской академии медицинских наук
и Администрации Волгоградской области» и
Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Волгоградский государственный
медицинский университет Федерального агентства
по здравоохранению и социальному развитию»
Научные консультанты:
член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, Писарев Вячеслав Борисович
профессор
доктор медицинских наук, Новочадов Валерий Валерьевич
профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Туманов Владимир Павлович
профессор
доктор медицинских наук Филатов Владимир Васильевич
доктор медицинских наук, Яковлев Михаил Юрьевич
профессор
Ведущая организация: Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук»
Защита состоится «_28__» _сентября__________ 2009 года в __14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
Автореферат разослан «_19_» мая_ 2009 года.
Ученый секретарь
диссертационного Совета, А.И. Щёголев
доктор медицинских наук,
профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность.
В последнее десятилетие в теоретической медицине и клинической практике выделено новое направление – нейроиммуноэндокринология [Акмаев И.Г., 2001, 2003; Гриневич В.В., 2003, 2007; Кветной И.М., с соавт., 2005; Кузнецов С.Л. с соавт., 2008; Zhang H. et al., 2003; Mosiienko H.P., 2007]. Благодаря новому интегрированному подходу к исследованию пато- и морфогенеза многих заболеваний, это направление позволило значительно расширить представления о природе ряда важнейших болезней и разработать ряд эффективных подходов к их диагностике и лечению [Крыжановский Г.Н. с соавт., 2004; Бобынцев И.И., Северьянова Л.А., 2005; Евсеев В.А., 2007; Cai Z. et al., 2007; Oertel Y.C., 2008].
В рамках комплексного исследования механизмов развития хронического эндотоксикоза (ЭТ), осуществлявшегося под руководством чл.-корр. РАМН В.Б. Писарева, ранее были установлены патогенетические моменты этого патологического процесса и его морфологические проявления [Новочадов В.В., Писарев, 2005; Писарев В.Б. с соавт., 2008; Зарипова И.В., 2008], метаболические особенности [Новочадов В.В., 2001; Марков Д.Е., 2004] и аспекты вегетативной дизрегуляции [Фролов В.И., 2004; Богачев А.А., 2005].
Основу хронического ЭТ составляет неконтролируемый перенос по организму эндогенных токсических соединений в весьма умеренных концентрациях, но в течение длительного времени с повреждением клеток-мишеней, органов и тканей и реакциями на него [Яковлев М.Ю., 2002, 2005; Мишнёв О.Д., с соавт., 2003; Гаджиева Х.К. с соавт., 2006; 3айратьянц О.В., Кaктypский Л.В., 2008; Sharshar T. et al., 2003; Yamaga J. et al., 2003].
В пато- и морфогенезе такого процесса современные исследования выделяют два взаимосвязанных между собой звена: собственно токсическое воздействие на эндотелий сосудов, клетки паренхиматозных органов и внеклеточный матрикс, где доминирует эндотоксиновая агрессия как результат увеличения количества ЛПС и нарушений антиэндотоксинового иммунитета [Яковлев М.Ю. с соавт., 2000, 2006; Аниховская И.А. с соавт., 2005] и цитокиновое - системный воспалительный ответ на эндогенную интоксикацию [Еськов А.П. с соавт., 2003; Гусев Е.Ю. с соавт., 2006].
Формирование подобного сложного патологического процесса немыслимо без развития нейроэндокринной дизрегуляция, в организме должны присутствовать ее признаки в виде гормонального дисбаланса и морфологических проявлений на уровне эндокринных органов и в точках приложения действия гормонов. Имеющиеся в литературе сведения о морфологии и функции органов эндокринной системы при остром ЭТ единичны и противоречивы [Востриков С.М. с соавт., 2004; Глумов В.Я., Филатов В.В., 2005; Висмонт Ф.И. с соавт., 2007; Touchette K.J., et al. 2002; Watanobe H. 2002; Wang Y., et al., 2000, 2004], а при хроническом процессе – практически отсутствуют [Денисов А.Г., 2005, 2008; Зайратьянц О.В., 2006; Полякова Л.В., 2008; Serdiuk S.E. et al., 2005; Cooper D.S., 2007]. С этих позиций, актуальным представляется комплексное исследование органов эндокринной системы при хроническом ЭТ в сопоставлении с маркерами эндогенной интоксикации, гормональным профилем и морфологическими изменениями в органах-мишенях эндогенной интоксикации.
Цель работы – установить закономерности морфологических изменений в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе и участия развивающиейся на этой основе гормональной дизрегуляции в его пато- и морфогенезе.
Задачи исследования.
1. Изучить основные патоморфологические изменения, развивающиеся в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе, выделить и охарактеризовать ведущие процессы, лежащие в их основе.
2. Установить структурные основы, последовательность и сравнительную выраженность патологии адреналовой, тиреоидной, гонадной эндокринных осей и паравентрикуло-инсулярного пути при хроническом эндотоксикозе.
3. Сопоставить морфологические изменения в органах-мишенях эндогенной интоксикации, особенности гормонального профиля и динамику интегральных показателей эндотоксикоза в периферической крови с выходом на математическое моделирование патологических изменений.
4. Выявить иммуногистохимическими методами распределение маркеров ФНО-зависимого апоптоза в отдельных железах внутренней секреции и определить роль этого процесса в механизмах устранения эндокриноцитов при хроническом эндотоксикозе.
5. Выявить распределение NOS-3 и определить роль эндотелиальной нитроксидсинтазы в сосудистом механизме повреждения эндокриноцитов и патологическом ремоделировании отдельных желез внутренней секреции при хроническом эндотоксикозе.
6. Показать стереотипные ультраструктурные изменения в эндокриноцитах различных желез внутренней секреции при развитии хронического эндотоксикоза и выявить особенности в зависимости от их принадлежности к различным регуляторным осям.
7. Оценить возможность уменьшения тяжести эндокринопатии и общих проявлений эндотоксикоза при введении экспериментальным животным эстрогенов или тиреостатиков.
Научная новизна.
Сформирована концепция об участии основных эндокринных органов в пато- и морфогенезе основных патологических изменений в печени и почках, а также участии выявленных гормональных сдвигов в развитии компенсаторных и приспособительных процессов в этих органах.
Впервые для объяснения механизмов и динамики развития хронического ЭТ, субстрата формирующейся полиорганной патологии, был применен подход, основанный на анализе характера и механизмов гормональной дизрегуляции. Показана роль мультигландулярной эндокринопатии в формировании недостаточности печени и почек при хроническом ЭТ.
С помощью современных методов морфологического исследования показано, что ФНО-зависимый апоптоз при хроническом ЭТ является одним из ведущих механизмов устранения эндокриноцитов в гипофизе, щитовидной железе и яичниках. Установлено, что в механизмах повреждения и гибели эндокриноцитов надпочечников, гонад и инсулярного аппарата при хроническом ЭТ существенную роль играет гиперэкспрессия эндотелиальной нитроксидсинтазы, опосредующая избыточную васкуляризацию желез внутренней секреции, хронический тканевой отек и повреждение сохранившихся эндокриноцитов, а также стромальную пролиферацию.
Сопоставление гормонального профиля и структурных изменений в гипоталамусе, гипофизе, щитовидной железе, инсулярном аппарате поджелудочной железы, надпочечниках, яичниках и семенниках в динамике хронического ЭТ позволило обосновать основные закономерности, очередность и сравнительную интенсивность разрушения основных гормональных осей при этом патологическом процессе.
Анализ ультраструктурных изменений в эндокриноцитах основных эндокринных органов при хроническом ЭТ подтвердил стереотипность внутриклеточных реакций на повреждение, а также выявил дополнительные признаки, зависящие от типа секреции, ангиоархитектоники железы и ее нагруженности при данной патологии.
Показано, что применение эстрогенов и тиреостатическая терапия способны корректировать гормональный дисбаланс и уменьшать выраженность эндогенной интоксикации и повреждения печени и почек при хроническом ЭТ.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные расширяют современные представления о хроническом ЭТ с позиций вовлечения в его развитие механизмов эндокринной дисфункции. Они мотивируют врачей клинической практики на поиски скрытой эндокринной патологии у лиц с хроническими заболеваниями, сопровождающимися эндогенной интоксикацией. С другой стороны, на основании работы обосновывается поиск хронической эндогенной интоксикации в эндокринологии, как возможной причины заболевания.
Метод разделения эндокриноцитов по результатам радиальной морфометрии на классы (гиперфункционирующие, нормально функционирующие, с гипофункцией и истощенные) приемлем для любых исследований в области эндокринологии для скрининга направления и выраженности изменений под действием экзо- или эндогенных стимулов.
Ряд гормональных воздействий (введение эстрогенов, тиреостатиков) может быть использовано для модификации общепринятых моделей хронических токсин-индуцированных процессов с доказанной модуляцией ими развивающейся органопатологии в экспериментальной медицине.
Использование материалов работы при преподавании физиологии, патофизиологии, патологической анатомии и эндокринологии в высших учебных заведениях позволяет повысить качество подготовки современного врача.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Ключевыми патоморфологическими изменениями в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе являются мозаичное сочетание участков повреждения, гибели, атрофии и гипертрофии эндокриноцитов, сосудистых реакции и пролиферации стромы.
2. Степень повреждения эндокриноцитов при хроническом эндотоксикозе и характер компенсаторных процессов в конкретной железе зависит от ее исходного функционального состояния, вовлеченности в системные механизмы адаптации к токсическому процессу при общей тенденции к субкомпенсированной гипофункции и стромальной пролиферации с частичным замещением объема утраченных эндокриноцитов.
3. Результатом структурных изменений в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе является мультигландулярный гормональный дисбаланс, представляющий собой взаимосвязанную последовательность нарушений основных вертикальных эндокринных осей, внутриосевых взаимоотношений.
4. Классические вертикальные регуляторные эндокринные оси при развитии хронического эндотоксикоза повреждаются в различной степени: максимальная дизрегуляция, патология периферических желез и разрушение внутриосевых взаимоотношений свойственно гонадной оси, менее выраженная патология – тиреоидной оси и инсулярному пути, и минимальные изменения – адреналовой оси.
5. Существенное значение в механизмах устранения функционирующих эндокриноцитов желез внутренней секреции имеют ФНО-зависимый апоптоз и сосудистый механизм, опосредованный через эндотелиальную нитроксидсинтазу, которая экспрессируется в эндотелии сосудов этих желез.
6. Применение тиреостатиков и эстрогенов способно ослаблять уровень эндогенной интоксикации, и связанную с ним тяжесть патологии печени и почек при хроническом эндотоксикозе.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на II Общероссийской конференции «Проблемы морфологии» (Сочи, 2003); научной конференции «Новые технологии в медицине» (Волгоград, 2004); V Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Кисловодск, 2004); V Российском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004); Всероссийском симпозиуме «Эндотоксикоз: природа, диагностика и принципы коррекции» (Волгоград, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); II Всероссийской конференции «Клинико-морфологические аспекты эндокринопатий» (Белгород, 2006); VII общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2006); II съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006); II Всероссийской конференции «Новые информационные технологии в медицине» (Волгоград, 2007); международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей в норме и при воздействии антропогенных факторов» (Астрахань, 2007); IX Международном конгрессе Ассоциаций морфологов (Бухара, 2008); Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Д.А. Жданова (Москва, 2008).
Апробация работы осуществлена на расширенном заседании сотрудников отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области, кафедр патологической анатомии и патологической физиологии Волгоградского государственного медицинского университета 20 октября 2008 года. По теме диссертации опубликовано 49 научных работ, в том числе 14 публикаций в журналах, действующего «Перечня … ВАК».
Внедрение результатов работы.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр факультетской терапии, патологической анатомии, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета, кафедры семейной медицины Ульяновского государственного университета. Практические рекомендации используются в работе ГУ «Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области», Волгоградского областного патологоанатомического бюро, ГУЗ «Волгоградское областное бюро СМЭ», Областном онкологическом центре Ульяновской области.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 305 страницах машинописного текста, содержит 87 таблиц, иллюстрирована 59 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Список литературы содержит 334 источника (211 на русском и 123 – на иностранных языках).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа носила экспериментальный характер и была выполнена с использованием 141 белых нелинейных крыс обоего пола (в том числе 21 – контрольные группы различных серий опытов). Протокол экспериментов составлен в соответствии с действующими нормативными документами в области биоэтики и правил лабораторной практики, программа экспериментов была согласована с Локальным независимым этическим комитетом по этической экспертизе диссертационных исследований (протокол № 18-2006 от 20 ноября 2006 года).
Использовали две модели хронического ЭТ: у 36 крыс с преимущественным поражением печени [Писарев В.Б. с соавт., 2002], у 36 - с преимущественным поражением почек [Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005]. Токсический гепатит и нефропатия в сочетании с печеночной и почечной недостаточностью воспроизводятся в этих моделях к 30 сут эксперимента, а к 90 сут удается воспроизводить более выраженные нарушения, связанные с формированием цирроза печени и нефросклероза.
Отдельная часть исследования была посвящена проведению патогенетической терапии, направленной на уменьшение тяжести хронического ЭТ путем целенаправленного изменения гормонального дисбаланса. Коррекция тиреостатическими препаратами осуществлялась с помощью препарата Тиамазол per os 24 крысам-самцам в дозе 20 мг/кг/сут в течение 5 дней и поддерживающей дозой 10 мг/кг массы животного 1 раз в 7 дней [Centero B.A., et al., 1996]. Гиперэстрогенемию вызывали 24 крысам-самкам путем внутримышечного введения 0,1% масляного раствора Эстрадиола из расчета 50 мкг/кг/сут в течение 7 дней с поддерживающей дозой 50 мг/кг массы животного 1 раз в 5 дней [Дедов И.И., с соавт., 2002.]
Морфологическим доказательством наличия хронического ЭТ являлись признаки прогрессирующего повреждения печени и почек с развитием в них компенсаторных процессов: хронического гепатита/гепато-фиброза и дисметаболической нефропатии/нефросклероза.
В качестве лабораторно-биохимических показателей ЭТ в плазме крови крыс определяли вещества средней молекулярной массы (ВСММ), олигопептидов [Малахова М.Я., 1995] и концентрацию продукта свободнорадикального окисления липидов - малонового диальдегида (МДА). В гомогенатах печени и почек определяли активность ацилазы, как маркера токсического повреждения [Фролов В.И. с соавт., 1991]. Эти исследования подтвердили, что во всех случаях у крыс развивалась хроническая эндогенная интоксикация (табл. 1).
Таблица 1
Биохимические показатели выраженности хронического ЭТ у крыс-самцов
(на примере модели с преимущественным поражением печени, M±m)
| Показатели | Контрольная группа | Сроки эксперимента | ||
| 30 сут | 60 сут | 90 сут | ||
| ВСММ, усл. ед. Олигопептиды, мг/л МДА, ммоль/л Ацилаза печени, мккат/г белка Ацилаза почек, мккат/г белка | 0,16± 0,02 115,5 ± 13,8 5,33 ± 0,43 27,91 ± 1,93 35,61 ± 2,90 | 0,43 ± 0,05* 268,5 ± 29,8* 11,40 ± 0,94* 9,06 ± 0,87* 35,61 ± 2,90 | 0,49± 0,05* 289,4 ± 30,5* 10,53 ± 1,25* 7,58 ± 0,73* 18,21 ± 1,78* | 0,51 ± 0,06* 291,0 ± 36,4* 11,08 ± 1,35* 5,97 ± 0,68* 13,61 ± 1,45* |
Примечание. *Р<0,05 по сравнению с крысами контрольной группы
Поскольку течение и исход различных патологических процессов во многом определяются уровнем реактивности организма [Крыжановский Г.Н., 2001, 2004; Акмаев Г.Н., 2003], которая существенно зависит от пола, в сериях по исследованияю гонадной показатели развития хронического ЭТ раздельно проанализированы для крыс-самцов и самок. В последующем при сопоставлениях они выражались в процеснтах от соответствующих исходных величин.
Подготовку материала для патоморфологического исследования эндокринных органов - паравентрикулярного ядра гипоталамуса (PV), гипофиза, щитовидной железы (ЩЖ), надпочечников, яичников/семенников, поджелудочной железы проводили с помощью общепринятых методик [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Коржевский Д.Э., 2005].
Для прямого морфометрического исследования был использован компьютерный комплекс «Видеотест-Морфо» (Россия). Подсчитывали численную плотность и объемные доли (ОД) отдельных структур, показатели размеров и их соотношения [Автандилов Г.Г., 2002].
Степень повреждения эндокриноцитов оценивали по соотношению неизмененных клеток, эндокриноцитов, находящихся в состоянии повышенной функциональной секреции, крайнего истощения, повреждения или некроза (свыше 1000 клеток на одну железу). Результаты дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН [Новочадов В.В., 2005]. Он реализован в виде программного приложения «Radiana», позволяющий представить распределение яркости в радиальном и секторальном направлениях в единицах RGB виде матрицы данных MS Excel с расчетом коэффициентов этой функции.
Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием наборов антител фирмы «Novocactra Laboratories Ltd» (Великобритания);
- TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand, клон 27В12),
- каспаза-3 (Caspase-3, клон JHM62);
- эндотелиальная нитроксидсинтаза (NOS-3, клон RN5).
Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода. По степени экспрессии клетки относили к одному из классов: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004].
Для проведения ультрамикроскопического исследования животных подвергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора параформа на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембуталовым наркозом. Дофиксацию производили в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в 1%-ном растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4). Материал заливали в смесь эпона и аралдита, ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-8800. После контрастирования в 2,5%-ном растворе уранилацетата в течение 40 минут и 0,3%-ном растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронных микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопленок «ФТ-40».
Для оценки функционального состояния органов эндокринной системы при хроническом ЭТ были определены концентрации гормонов в сыворотке крови с учетом наличия определенных эндокринных осей:
- адреналовой оси: АКТГ – кортизол.
- тиреоидной: ТТГ – Т3 и Т4 (общий и свободный), тиреоглобулин.
- гонадной: ФСГ, ЛГ, пролактин - тестостерон, эстрадиол, прогестерон.
- паравентрикуло-инсулярного пути: инсулин.
Исследование проводили методом ELISA с использованием спектрофотометра Stat Fax 2100 и вошера Stat Fax 2600 (AWARENESS Technology, USA) c помощью тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) и «DRG» (Germany).
Статистическая обработка проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами с помощью программных пакетов EXCEL 7.0 (Microsoft, USA) и АРКАДА (Диалог-МГУ, Россия). При регрессионном анализе выявлены наиболее значимые показатели, определение которых целесообразно для оценки влияния эндокринной дизрегуляции на выраженность изменений в данном органе при ЭТ [Платонов А.Е., 2000; Петри А., Сабин К., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Морфологические изменения в паравентрикулярном ядре гипоталамуса крыс при хроническом эндотоксикозе.
Исследования PV при хроническом ЭТ были проведены нами совместно с В.И. Фроловым (2004). Полученные результаты выявили наличие однонаправленных изменений в моделях с преимущественным поражением печени и почек. В PV преобладали нейроны с вакуолизированной цитоплазмой, ядра нередко были деформированы и смещены к периферии клетки, в некоторых из них отсутствовали ядрышки. Среди сохранившихся нейронов выявлялись единичные клетки-тени, нейронофагия сочеталась с набуханием и частичной фрагментацией окружающих проводников, вблизи поперечных срезов полнокровных капилляров и венул отчетливо обнаруживались зоны периваскулярного отека.
В динамике ЭТ происходило уменьшение ОД нейронов, более выраженное в модели с преимущественным поражением печени (P<0,05). На 90-е сут эксперимента достоверно уменьшался средний размер ядер нейронов (примерно на 20% в обеих моделях). Выявленные изменения сопровождались увеличением коэффициента микроглия/нейрон. Полученные данные соответствуют полученным ранее доказательствам достаточно высокой чувствительности PV к разнообразным экзогенным повреждениям, что в первую очередь определяется функциональной нагруженностью ядра и слабостью его исходного микроглиального представительства [Писарев В.Б., 1990; Гуров Д.Ю., 2005; Потанин М.Б., 2008].
При исследовании распределения яркости методом радиальной морфометрии были выявлены четыре типа нейронов (рис. 1).
Рис. 1. Радиальная морфометрия нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса. Четыре типа клеток в зависимости от характера функции радиального распределения яркости перикариона. По оси абсцисс – относительное расстояние от границы ядра до внешней границы перикарина.
Нейроны I типа характеризовались монотонным нарастанием яркости от центра ядра к периферии с пиком яркости на 76-84% расстояния от ядра до плазмалеммы. Такие нейроны по всем остальным морфологическим признакам были отнесены к неповрежденным. Нейроны II типа отличались монотонным снижением яркости от ядра к периферии перикариона, пик яркости выявлялся на расстоянии 0-20% от границы ядра. Эти клетки соответствовали нейронам, находящимся в состоянии раздражения (функциональной стимуляции). Для нейронов III типа отличием от предыдущих являлось наличие «двугорбой» кривой. Пики яркости были расположены на расстоянии от ядра в пределах 41-75% и 86-94%. Такие нейроны имели все признаки истощения при гистологическом исследовании. Наконец, нейроны IV типа имели распределение яркости в виде обращенной параболы, с монотонным нарастанием и последующим снижением от центра ядра к периферии. Пик яркости располагался в пределах 50-75% расстояния от ядра до внешней границы перикариона. Эти клетки гистологически выглядели как грубо измененные нейроны и клетки-тени.
В PV животных контрольной группы были обнаружены нейроны II (42,6%), III (37,5%) и IV типов (19,9%). При ЭТ выявлено уменьшение в 1,8 раза нейронов III типа (P<0,001), увеличение нейронов IV типа (в 1,4 раза, P<0,05) и появление до 5% клеток I типа. Полученные данные явились дополнительным доказательством двунаправленности изменений нейронов PV при эндотоксикозе: наряду с появлением большого процента поврежденных и гибнущих клеток обнаруживаются нейроны с явлениями функциональной стимуляции и внутриклеточной перестройки.
Естественно, большинство изменений в PV гипоталамуса при хронических интоксикациях хорошо описаны и выглядят достаточно стереотипно [Туманов В.П., с соавт., 2003; Филатов В.В., Глумов В.Я., 2003; Писарев В.Б. с соавт., 2006; Евсеев В.А., 2007; Watanobe H., et al., 2003; Zhang W., 2003; Wu Y.H. et al., 2006; Doyon C. et al, 2007], но в рамках настоящего исследования они характеризуют тот морфологический субстрат центральных механизмов гормональной дизрегуляции, который участвует во всех последующих эндокринных изменениях при хроничексом ЭТ.
Морфофункциональные изменения гипофиза крыс при хроническом эндотоксикозе.
В ходе моделирования хронического ЭТ выявлены сходные изменения в обеих моделях, более выраженные при сочетанном введении ЛПС и ТХМ. На 30-е сут хронического ЭТ при окраске по Маллори в аденогипофизе преобладали базофилы с просветлениями в цитоплазме, в ряде случаев - пикнотическими ядрами. В некоторых аденоцитах выявлено набухание, явления вакуольной дегенерации. По мере увеличения длительности эксперимента увеличивалось количество хромофобных клеток. Нарушения в аденогипофизе на 90-е сут ЭТ характеризовались более выраженными стромально-сосудистыми изменениями: на фоне увеличения периваскулярного отека и полнокровия обнаружен набухший эндотелий с признаками повреждения. Клеточные элементы распределены неравномерно, среди хромофильных клеток превалировали базофилы, в отдельных клетках которых обнаружены признаки дегенерации и вакуолизации цитоплазмы.
При морфометрии аденогипофиза выявлено достоверное снижение объемной доли (ОД) базофилов к 60-м сут хронического ЭТ (в 1,4 раза – при моделировании ЭТ с развитием гепатофиброза; в 1,45 раза – при ЭТ с развитием нефросклероза). На 90-е сут экспериментального ЭТ происходило дальнейшее уменьшение объемной доли базофилов по сравнению с количеством базофилов в аденогипофизе крыс контрольной группы (в 1,7 и в 1,3 раза соответственно, P<0,05). При этом по мере увеличения длительности ЭТ у животных обеих экспериментальных групп увеличивалось количество вакуолизированных базофилов. Обращало на себя внимание достоверное увеличение ОД соединительной ткани (Р<0,05) и ОД ацидофильных аденоцитов на всем протяжении эксперимента (табл. 2).
Таблица 2
Морфометрические показатели аденогипофиза у крыс при хроническом ЭТ
(модель с преимущественным поражением печени, M±m)
| Объемная доля, % | Контрольная группа | Сроки эксперимента | ||
| 30 сут | 60 сут | 90 сут | ||
| Ацидофилы Базофилы Хромофобы Строма Сосуды | 39,03±1,66 21,00±1,09 32,07±0,4 2,1±0,11 5,8±0,13 | 38,14±1,58 18,06±1,38 31,2±2,13* 6,1±0,09* 6,5±0,11* | 47,05±1,75*# 14,81±1,08*# 17,58±1,18*# 7,1±0,11* 13,46±0,18*# | 45,34±1,47* 12,11±1,71*# 19,64±1,11* 9,8±0,14*# 13,11±0,09* |
Примечание: здесь и далее * - Р<0,05 по сравнению с крысами контрольной группы; # - Р<0,05 по сравнению с предыдущим сроком эксперимента
Иммуногистохимичексое исследование выявило прирост экспрессии эндотелиальной нитроксидсинтазы (NOS-3) в клетках аденогипофиза (в 7,3 раза при хроническом ЭТ с преимущественным поражением печени, в 5,11 раз - при ЭТ с преимущественным поражением почек). Достоверно увеличилась доля эндотелиоцитов, гиперэкспрессирующих NOS-3 (в 3,87 и в 2,39 раза), и доля клеток с умеренной экспрессией фермента (в 2,95 и в 1,93 раза, соответственно). Был показан прирост экспрессии TRAIL в аденоцитах, а при исследовании каспазы-3 было зарегистрировано увеличение доли иммунопозитивных клеток до 80% среди всех аденоцитов (P<0,05) на 90-е сут эксперимента. Нарастание экспрессии маркеров ФНО-зависимого апоптоза в динамике хронического ЭТ убедительно свидетельствует о достоверном участии данного механизма апоптоза в рассматриваемом патологическом процессе.
При изучении ультраструктуры на 30-е сут ЭТ изменения были обнаружены преимущественно в адренокортикотропоцитах аденогипофиза. В них уменьшалось число везикул, митохондрии были увеличены в размерах, с просветлением матрикса и небольшим количеством крист. Цистерны ЭПС были значительно расширены с образованием вакуолеоподобных полостей. В остальных аденоцитах выраженных изменений не отмечалось. В дальнейшем уже во всех выявленных аденоцитах обнаруживалось расширение цистерн на фоне снижения числа секреторных гранул. Уменьшение размеров митохондрий, просветление митохондриального матрикса, деградация крист и увеличение секрета выявлены на фоне вакуолей, образованных цистернами ЭПС.
При морфометрии электронограмм выявлялось увеличение фактора формы ядра, указывающее на увеличенную инвагинацию кариолеммы и свидетельствующее об активации внутриядерных процессов трансляции. Уменьшение ОД митохондрий и отношения яркости матрикса митохондрий к яркости цитоплазмы в системе RGB по мере увеличения длительности хронического ЭТ являлось косвенным отражением внутриклеточного энергодефицита. ОД везикул к окончанию эксперимента (90-е сут) уменьшилась в 1,75 раза по сравнению с группой сравнения (P<0,05).
Изменения в гипофизе, как органе центральной гормональной регуляции, при хронических дисметаболических процессах и интоксикации, описывались достаточно подробно [Филаретов А.А., 1996; Мхитаров В.А. с соавт., 2000; Акмаев И.Г., 2001, 2007; Григоренко А.А. с соавт., 2002; Fernandes G.A. et al., 2002; Beishuizen A., Thijs L.G., 2003]. Применительно к концепции настоящего исследования важным является выявленное сочетание более выраженного повреждения и гибели базофилов аденогипофиза при наличии гипертрофии ацидофилов, в совокупности рассматриваемое как субстрат гипофизарных механизмов гормонального дисбаланса при хроничсеком ЭТ.
Морфологические изменения надпочечников и дисбаланс гормонов адреналовой оси у крыс при хроническом эндотоксикозе.
В надпочечниках крыс на 30-е сут хронического ЭТ (более – в пучковой и сетчатой зонах коркового вещества) выявлялись многочисленные эндокриноциты с мелкоглыбчатым распадом ядерного хроматина, резкой вакуолизацией и делипоидизацией цитоплазмы. Участки повреждения были окружены зонами рыхлой соединительной ткани, с признаками гиалиноза и кальциноза. Обнаружено уменьшение объема всех зон коркового вещества. Увеличение ОД мозгового вещества было обусловлено выраженной гипертрофией клеток, в цитоплазме которых наблюдалась резкая вакуолизация цитоплазмы. К 90-м сут развивалась выраженная атрофия коркового вещества, максимально измененной выглядела сетчатая зона. Наблюдаемое увеличение ОД соединительной ткани в корковом веществе, была расценено как адаптационная перестройка.
При морфометрии выявлены различия в интенсивности повреждения эндокриноцитов между зонами коркового вещества и мозговым веществом надпочечника. ОД клубочковой зоны надпочечника на 30-е сут ЭТ уменьшалась, а в последующем превышала аналогичные значения в контрольной группе в 1,2 и 1,46 раза, соответственно (P<0,05). Средний объем ядер эндокриноцитов увеличивался в 1,57 раза, а ядерно-цитоплазматичское отношение оказывалось повышенным только на относительно ранних сроках развития ЭТ, а к 90-м сут не имело достоверных отличий от показателей в контрольной группе. Сопоставление данных изменений позволяет трактовать их как проявление функционального напряжения клеток клубочковой зоны с развитием истощения по мере развития хронического ЭТ.
Аналогичные, но выраженные в большей степени изменения регистрировались в пучковой зоне надпочечника (табл. 3).
Таблица 3
Морфометрические показатели пучковой зоны коркового вещества
надпочечников крыс при хроническом ЭТ
(модель с преимущественным поражением печени, M±m)
| Показатели | Контрольная группа | Сроки эксперимента | ||
| 30 сут | 60 сут | 90 сут | ||
| ОД зоны, % Средний объем ядер, мкм3 Ядерно-цитоплазма-тическое отношение | 18,22±0,08 23,19±0,48 0,125±0,011 | 12,30±0,08* 23,00±1,19 0,171±0,017* | 19,01±0,15*# 19,58±1,09*# 0,123±0,010# | 25,39±0,16*# 16,43±0,94*# 0,078±0,009*# |
Сетчатая зона коркового вещества при количественном анализе была наименее измененной. Ее ОД в общем объеме паренхимы органа практически не изменялась, а колебания среднего ОД ядер имели ту же динамику, что и в других зонах коркового вещества. Увеличение ядерно-цитоплазматического отношения в сетчатой зоне сохранялось до 60-х сут, что свидетельствовало о более поздних сроках развития декомпенсации и истощения этих клеток при хроническом ЭТ.
В мозговом веществе надпочечника регистрировались качественно отличные изменения. ОД мозгового вещества к 30-м сут ЭТ была увеличенной, а затем уменьшалась. Параллельно увеличивались ОД ядер и ЯЦО, что свидетельствовало о постепенном нарастании функциональной активности сохранившихся медуллярных эндокриноцитов на поздних сроках эксперимента. Обращало на себя внимание неоднородность повреждения ткани надпочечника: зоны с наличием относительно высокого процента клеток с повышенной функциональной активностью и низким содержанием дистрофически измененных и/или некротизированных клеток мозаично чередовались с участками выраженных альтеративных изменений.
При радиальной морфометрии эндокриноцитов основные патологические изменения заключались в значительном снижении вариабельности интенсивности окраски по секторам и уменьшении тангенса угла кривой яркости цитоплазмы. Интенсивность выявленных изменений увеличивалась в ряду пучковая зона < клубочковая зона < сетчатая зона.
При иммуногистохимическом выявлении эндотелиальной нитроксидсинтазы в надпочечниках объемная плотность иммунопозитивных клеток при хроническом ЭТ была выше, чем в контроле, они совпадали по локализации с участками максимального повреждения и стромальной пролиферации. Начиная с 30-х сут эксперимента, в надпочечниках выявлялось увеличение экспрессии TRAIL и каспазы-3, оно было максимально выражено на 60-е сут хронического ЭТ, независимо от модели и сохранялось до окончания опыта.
При ультрамикроскопическом изучении эндокриноцитов пучковой зоны коркового вещества надпочечника на 30-е сут хронического ЭТ обнаружено резкое снижение количества липидосодержащих везикул. Оставшиеся везикулы были электронно-прозрачными, при этом часть из них было увеличена в размерах и вакуолизирована. На 60-е сут везикулы в спонгиоцитах оказывались значительно меньше, они были более однородными по размеру, неравномерно заполнены умеренно электронно-плотным содержимым (концентрирующимся в центре) и окруженным светлым ободком. Увеличение количества рибосом свидетельствовало об усилении синтетических процессов в клетке. К окончанию эксперимента (90-е сут) часть эндокриноцитов не содержало везикул, в других спонгиоцитах внутреннее пространство везикул было заполнено содержимым слабой электронной плотности. В премембранном слое везикул обнаруживались мелкие гранулы, выстилавшие везикулы изнутри, по типу «ожерелья». Обращало на себя внимание уменьшение количества крист в митохондриях и просветление митохондриального матрикса. Уменьшение ОД везикул зарегистрировано на ранних сроках эксперимента (30-е сут) в 1,53 раза по сравнению с контрольной группой и достоверное снижение ОД везикул на 90-е сут ЭТ (в 2,36 раз по сравнению с предыдущим сроком эксперимента) в сочетание с уменьшением активности митохондрий являлось доказательством истощения эндокриноцитов.
Итак, в условиях хронического ЭТ наблюдается длительно существующее повреждение эндокриноцитов, преимущественно коркового вещества органа, приводящее в итоге к атрофии надпочечников и частичному стромальному замещению утраченного объема паренхимы. Частично эти процессы реализуются через ФНО-опосредованный апоптоз эндокриноцитов NO-зависимые механизмы индукции стромальной пролиферации
При исследовании гормонов адреналовой оси у животных с хроническим ЭТ было зарегистрировано незначительное увеличение уровня АКТГ на 30-е сут с последующим повышением до 90-х сут эксперимента (рис. 2).
При этом наибольший скачок АКТГ на 90-е сут – в 6,9 раза, был обнаружен у животных модели хронического ЭТ с преимущественным поражением почек, в то время как у крыс с преимущественным поражением печени уровень изучаемого гормона увеличивался в 5,5 раза (P<0,05).
Рис. 2. Гормоны адреналовой оси в сыворотке крови крыс при хроническом ЭТ. За единицу принято значение показателя в контрольной группе животных.
Уровень кортизола в крови на 30-е сут хронического ЭТ был максимальным и превышал показатель в контроле в 4,39 раза, затем начинал падать, так что на 90-е сут эксперимента, несмотря на высокое содержание АКТГ, уровень кортизола был в 1,6 раза ниже, чем у животных контрольной группы (P<0,05).
В ходе корреляционного анализа установлено, что у интактных животных уровень кортизола находился в сильной корреляционной зависимости от уровня АКТГ (R=0,89), на 30-е сут хронического ЭТ связь между гормонами ослабевала (R=0,69), а к 90-м сут можно было говорить о полном разобщении связи между гормонами (R=0,15).
Среди всех эндокринных осей, адреналовая изучена при хронических воздействиях в связи с классической концепцией стресса и выделением стессорной составляющей этих процессов [Бажанова Е.Д., Теплый Д.Л., 2004; Данилов Г.Е. с соавт., 2004; Бобынцев И. И., с соавт., 2007; Кузнецов С.Л. с соавт., 2008; Dallman M.F. et al., 2004; McCormick C.M. et al. 2007; Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007]. Полученные собственные данные детализируют механизмы формирования и субстрат гормональной дизрегуляции адреналовой оси при развитии хронического ЭТ.
Морфологические изменения щитовидной железы и дисбаланс гормонов тиреоидной оси у крыс при хроническом эндотоксикозе.
В щитовидной железе выявлялось мозаичное нарушение гистоархитектоники органа. По мере увеличения длительности ЭТ структурные преобразования в ЩЖ характеризовались фазовыми изменениями и не имели принципиальных особенностей в различных моделях. На ранних сроках хронического ЭТ железа сохраняла нормопластический тип строения и характеризовалась снижением количества фолликулярных тироцитов, развитием вакуольной дистрофии и десквамацией отдельных клеток в просвет фолликула. По мере увеличения сроков ЭТ происходило ремоделирование ткани щитовидной железы по макрофолликулярному типу с образованием малочисленных гнездных очагов с микрофолликулярной трансформацией и стромальным замещением объема утраченной паренхимы.
Количественные показатели подтверждали и детализировали описанные качественные изменения (табл. 4).
Для определения функциональной активности эндокриноцитов ЩЖ был использован оригинальный метод радиальной морфометрии [Калашникова С.А. с соавт., 2007]. У крыс контрольной группы в железе преобладали клетки, находящиеся в состоянии физиологической секреции (II тип).
Таблица 4
Морфометрические показатели ЩЖ у крыс при хроническом ЭТ
(модель с преимущественным поражением печени, M±m)
| Показатели | Интактные животные | Сроки эксперимента | ||
| 30 сут | 60 сут | 90 сут | ||
| Средний наружный диаметр фолликула, мкм Высота фолликулярного эпителия, мкм ОД коллоида, % ОД фолликулярного эпителия, % ОД интерфолликулярного эпителия, % ОД стромы, % ОД сосудистого русла, % | 125,4±11,7 31,0±9,1 18,7±0,4 74,9±3,1 3,9±0,1 1,1±0,1 1,3±0,1 | 118,9±27,6 25,1±5,7* 17,9±0,9 72,4±9,1 4,5±0,1 2,4±0,1 2,9±0,1 | 115,1±27,8* 29,8±18,3* 19,9±1,2 50,2±7,4*# 4,3±0,1 16,0±1,1*# 9,5±0,9*# | 91,3±5,2*# 16,5±2,5*# 10,5±0,9*# 60,9±2,3* 5,2±0,9* 18,5±1,9*# 14,9±1,2*# |
Клетки с гипосекрецией (I типа) составляли всего 1,0%. При хроническом ЭТ в обеих моделях достоверно нарастало число эндокриноцитов с повышенной секрецией (III тип, P<0,05). К 90-м сут хронической эндогенной интоксикации количество клеток с гиперсекреторной активностью уменьшалось, одновременно нарастало до 12,5% число клеток в состоянии повреждения и функционального истощения (IV тип, P<0,01).
Иммуногистохимичексое исследование выявило увеличение процентаэндотелиальных клеток, гиперэкспрессирующих нитроксидсинтазу в ЩЖ крыс при хроническом ЭТ с преимущественным поражением печени в 5,1 раза к 90-м сут эксперимента, в модели с преимущественным поражением почек - в 3,7 раза. На 30-е сут эксперимента наблюдалось 5-кратное увеличение частоты экспрессии TRAIL, а к окончанию эксперимента (90-е сут) иммунопозитивные клетки располагались сплошным тонким слоем по периметру фолликула с преимущественной локализацией лиганда на апикальной поверхности тироцитов. Параллельно выявлено увеличение экспрессии каспазы-3: на 30-е сут хронического ЭТ иммунопозитивными оказывались до 80% тироцитов. На 60-е сут апикальная часть фолликулярных клеток давала иммунопозитивное окрашивание в виде маргинальной полоски по всему периметру фолликула. К 90-м сут до 15% эндокриноцитов были резко иммунопозитивными, уменьшены в размерах, с пикнотичным ядром.
При ультрамикроскопическом исследовании фолликулярных эндокриноцитов максимальные изменения были зарегистрированы в ЭПР, тотальное расширение цистерн, деформация и уменьшение электронной плотности которого свидетельствовало о повреждении синтетического аппарата эндокриноцитов под действием эндогенных токсических соединений. По-видимому, выявленные нарушения возникают не на уровне начального синтеза тиреоглобулина, а в процессе его транспортировки в аппарат Гольджи и непосредственно в нем, при формировании конечного тиреоглобулина [Юкина Г.Ю. с соавт., 2004].
Достоверно увеличение фактора формы кариолеммы регистрировалось, начиная с 60-х сут ЭТ, уменьшение эффективного объема ядра реализовалось за счет многочисленных инвагинаций кариолеммы. Отношение яркостей эу- и гетерохроматина по мере увеличения срока эксперимента снижалось практически линейно в 1,7 раза к 90-м сут (P<0,01). Аналогичная тенденция выявлена при изучении отношения яркостей эухроматина и матрикса цитоплазмы в системе RGB. ОД митохондрий после небольшого увеличения к 60-м сут эксперимента (в 1,17 раз больше, чем в контрольной группе, P<0,05), снижалась, и к 90-м сут была несколько ниже, чем в контрольной группе. Аналогичной была динамика отношения яркостей митохондрий и цитоплазмы, что косвенно отражало истощение их функции к 90-м сут ЭТ. Данное утверждение подтверждалось увеличением, а затем уменьшением ОД везикул в динамике эксперимента.
Таким образом, сопоставление структурных изменений на различных уровнях при хроническом ЭТ свидетельствовало о значительной тканевой перестройке в ЩЖ и наличии морфологического субстрата гормональной дисфункции фолликулярных эндокриноцитов.
При хроническом ЭТ выявлены существенные изменения профиля гормонов тиреоидной оси в сравнении с животными контрольной группы (рис. 3).
Рис. 3. Гормоны тиреоидной оси в сыворотке крови крыс при хроническом ЭТ. За единицу принято значение показателя в интактной группе животных.
По мере нарастания сроков эксперимента у крыс зарегистрировано незначительное снижение ТТГ, уровень которого к 90-м сут эксперимента снизился в 1,6 раза (P<0,05). Уровень трийодтиронина менялся незначительно: повышался к 60-м сут в 1,2 раза, и снижался в 1,3 раза на 90-е сут экспериментального ЭТ. Максимальный подъем Т4. был зарегистрирован на 30-е сут ЭТ, когда его общее содержание повышалось в 2,5 раза. В дальнейшем уровень тироксина снижался, но и на 90-е сут его количество по-прежнему превышало аналогичные значения в контроле в 1,4 раза (P<0,05). Содержание тиреоглобулина к 30-м сут хронического ЭТ было в 4,0 раза ниже, чем в контрольной группе, на 90-е сут - в 2,7 раза (оба P<0,001).
При корреляционном анализе установлено усиление связи между ТТГ и периферическими тиреоидными гормонами на 30-е сут опыта. Наиболее сильными были взаимосвязи ТТГ с общим трийиодтиронином и общим тироксином (R=0,81 и R=0,99, соответственно). К 90-м сут эксперимента связь ТТГ – Т3 отсутствовала, а с Т4 и его свободной фракцией была сильной и отрицательной. Таким образом, происходящие в ходе хронического ЭТ изменения, затрагивали как вертикальные, так и горизонтальные связи.
Полученные нами данные не противоречат имеющимся в литературе сведениям о характере структурно-функциональных преобразований фолликулярного эпителия ЩЖ при хроническом воздействие токсических агентов [Хмельницкий О.К. с соавт., 2000; Раскоша О.В., Ермакова О.В., 2006; Лунькова Л.К. с соавт., 2007]. В то же время, сопоставление отдельных механизмов (ФНО-зависимого апоптоза, эндотелиальной дисфункции и связанного с ней стромального замещения утраченных паренхиматозных элементов, появление автономно секретирующих эндокриноцитов) раскрывает ряд новых моментов в развитии тиреоидного дисбаланса при хроническом ЭТ.
Морфологические изменения семенников и дисбаланс гормонов гонадной оси у крыс-самцов при хроническом эндотоксикозе.
На 30-е сут хронического ЭТ выявлены незначительные морфологические изменения инкреторного аппарата мужских половых желез. Отмечено увеличение клеток объема интерстициальной ткани в межканальцевых пространствах за счет гиперплазии гландулоцитов и относительное количество клеток Лейдига, приходящихся на один семенной канатик. ОД интерстициального эпителия увеличивалась в течение всего эксперимента, к 90-м сут хронического ЭТ превышая значения в контрольной группе в 1,2 раза.
Наибольшие изменения при хроническом ЭТ, независимо от модели, касались нарушения сперматогенеза. В динамике эксперимента выявлялось все большее число канальцев, не содержавших зрелых сперматозоидов, к 90-м сут ЭТ появлялись канальцы со слущенным эпителием, уменьшалось количество светлых (делящихся) сперматогоний, часть сперматоцитов имели пикнотические ядра. Индекс сперматогенеза снижался в 1,72 раза по сравнению с контрольными показателями (P<0,01).
Таким образом, основными изменениями в семенниках крыс при хроническом ЭТ, являлись уменьшение делящихся сперматогоний и зрелых сперматозоидов при сохранении сперматогенного эпителия и гландулоцитов. По-видимому, местные факторы регуляции обеспечивают защиту и обусловливают относительно меньшее повреждение семенников эндогенными токсическими соединениями, по сравнению с другими органами эндокринной системы.
Данные, полученные при изучении половых гормонов в сыворотке крови самцов, свидетельствовали о вовлеченности гонадной оси в общий пейзаж нарушений гормонального профиля при хроническом ЭТ (рис. 4).
Рис. 4. Гормоны гонадной оси в сыворотке крови крыс-самцов при хроническом ЭТ. За единицу принято значение показателя в контрольной группе животных.
На 30-е сут ЭТ уровень ФСГ увеличился в 2,7 раза, ЛГ – в 2,3 раза, а пролактина – в 2,2 раза (P<0,05), эти изменения сохранялось или несколько нарастали (ФСГ) в дальнейшем. Содержание тестостерона в сыворотке крови самцов уменьшалось, более интенсивно – в модели с преимущественным поражением печени: в 5,9 раз, по сравнению с контрольной группой (P<0,001). Уровень тестостерона в крови интактных крыс имел умеренную отрицательную связь с ФСГ (r=-0,95), в то время как между ЛГ и пролактином связь была слабой. На 30-е сут хронического ЭТ произошло резкое усиление связей со всеми гипофизарными гормонами, которые несколько ослабевали на 60-е сут патологического процесса. К 90-м сут ЭТ были сформированы сильная отрицательная связь ФСГ-тестостерон (r=-0,98) и сильная положительная связь ЛГ-тестостерон (R=0,97).
Исследования морфологии семенников, мужской гонадной оси и сперматогенеза при хроническом стрессе и интоксикациях являются единичными [Галимов Ш.Н. с соавт., 1999; Hadid R. et al., 1995; Papadopoulos A.D., Wardlaw S.L., 2000]. В рамках рассматриваемой концепции мы пришли к выводу о максимально высокой чувствительности рассматриваемых эндокринных органов к действию эндогенных токсичексих соединений.
Морфологические изменения яичников и дисбаланс гормонов гонадной оси у крыс-самцов при хроническом эндотоксикозе.
На ранних сроках ЭТ (30-е сут) структурные преобразования в ткани яичника у крыс характеризовались незначительной гиперемией и отдельными периваскулярными кровоизлияниями в корковое вещество яичника. В дальнейшем по мере нарастания сроков ЭТ уменьшалось число примордиальных, первичных, вторичных фолликулов. Третичные фолликулы не обнаруживались. Выявлялось значительное количество кистозно-атрезирую-щихся фолликулов и активное разрастание паренхиматозных элементов, представленных эпителиальными и соединительнотканными (текальными) элементами. Обращали на себя внимание уплощенные клетки внутреннего слоя гранулезы со скудным содержанием эозинофильной цитоплазмы.
При иммуногистохимическом исследовании в эндотелии сосудов яичника в динамике ЭТ выявлялся прирост экспрессии нитроксидсинтазы. Участки микроциркуляторного русла, содержащие большое количество эндотелиоцитов, гиперэкспрессирующих NOS-3, располагались очагами, преимущественно на удалении от примордиальных и первичных фолликулов. Количество иммунопозитивных клеток к TRAIL неуклонно возрастало к 90-м сут эксперимента, охватывающего не только клетки гранулезы, а в отдельных случаях - теку коркового вещества и паренхиму яичника. При этом распределение иммунопозитивных клеток к каспазе-3 было неравномерным. Как известно, на протяжении эстрального цикла гибель клеток путем апоптоза и их регенерация происходят в строго регулируемой последовательности и зависят от стадии цикла. Подавляющее большинство фолликулов в яичнике подвергаются атрезии посредством ФНО-зависимого апоптоза, который происходит в основном в клетках гранулезы [Кузнецова И.В., Коновалова В.Н., 2004; Van Delft M.F., Huang D.C., 2006].
На ультрамикроскопическом уровне в фолликулярных эпителиоцитах на всех сроках эксперимента ядра были представлены преимущественно эухроматином с большим количеством ядрышек, матрикс митохондрий имел высокую электронную плотность. Внутриклеточные органеллы имели признаки пониженной секреторной функции. При морфометрии выявлялось незначительное уменьшения фактора формы, увеличение яркости эухроматина по отношению к гетерохроматину (в 1,37 раза по сравнению с интактной группой) и цитоплазме (в 1,1 раза), P<0,05. Увеличение объемной плотности митохондрий и их яркости по отношению к цитоплазме было максимальным на 60-е сут ЭТ и превышало таковой показатель в группе контрольных животных в 1,17 и в 1,63 раза, соответственно. Уменьшение ОД везикул по сравнению с контрольной группой (в 1,87 раза к 90-м сут) свидетельствовало о снижение секреторной активности.
Изменения гормонов гонадной оси у самок с хроническим ЭТ с преимущественным поражением печени были более выраженными, чем у животных с ЭТ с преимущественным поражением почек. Так, уровень ЛГ на 30-е сут эксперимента увеличился в 2,3 и в 1,6 раза, к окончанию эксперимента (90-е сут) – в 2,5 и в 1,9 раза соответственно. Уровень пролактина на 90-е сут ЭТ превышал интактный в 2,1 раза у самок с преимущественным поражением печени, и в 1,7 раза – у животных с преимущественным поражением почек. Содержание эстрадиола и прогестерона достоверно снижалось в обеих экспериментальных группах (рис. 5).
Рис. 5. Гормоны гонадной оси в сыворотке крови крыс-самок при хроническом ЭТ. За единицу принято значение показателя в интактной группе животных.
При хроническом ЭТ происходила реверсия взаимозависимости гипофизарных гормонов. К 90-м сут ЭТ изначально сильная положительная связь ФСГ – ЛГ трансформировалась в сильную связь, противоположную по знаку (r = -0,93), в то время как исходно отрицательная средняя по силе корреляция между ЛГ и пролактином к окончанию эксперимента становилась сильной положительной (r = 0,75). Часть связей, существовавших в гонадной оси крыс контрольной группы, при развитии хронического ЭТ утрачивалась (ФСГ – эстрадиол и ЛГ – эстрадиол). В других случаях произошло усиление ранее малозначимых связей (ФСГ – прогестерон, ЛГ – прогестерон). К 90-м сут были нарушены как вертикальные, так и горизонтальные связи, что свидетельствовало о существенных нарушениях, происходящих в гонадной оси крыс-самок при хроническом ЭТ.
Замещение стромой фолликулярных эндокриноцитов в яичнике при ЭТ, на наш взгляд, представляет собой результат патологического ремоделирования фолликула, происходящего на фоне дисбаланса половых гормонов, а морфологические изменения в яичниках, в свою очередь, являются субстратом усугубления гормонального дисбаланса. Зарегистрированная нами пролактинемия, обнаруживаемая и доминирующая на всех сроках эндогенной интоксикации согласуется с литературными данными, согласно которым введение бактериального ЛПС увеличивает продукцию и выброс пролактина [Besnard N. et al., 2001; De Laurentiis A. с соавт., 2002].
Морфолические изменения инсулярного аппарата и дисбаланс инсулина у крыс при хроническом эндотоксикозе.
В островках поджелудочной железы на 30-е сут ЭТ выявлялся отёк междольковых перегородок с умеренной лимфоцитарной инфильтрацией и очаговыми кровоизлияниями в жировой клетчатке по периферии органа. К 60-м сут в паренхиме железы отмечались участки с выраженным явлением перидуктального и периацинарного склероза. В этих зонах выявлялась пролиферация эпителия выводных протоков и формирование мелких протоков. Отдельные островки были полностью склерозированы. Для других островков было характерно выраженное полнокровие капилляров, в большинстве эндокриноцитов определялась гиперхромия ядер. Эти изменения становились более интенсивными к 90-м сут хронического ЭТ. При морфометрии установлено достоверное уменьшение ОД островков Лангерганса, (на 90-е сут ЭТ - в 1,65 раза по сравнению с показателями в контрольной группе, P<0,05). Соответственно, ОД инсулоцитов в островках снижалась на протяжении всего эксперимента, и к 90-м сут ЭТ была в 1,52 раза меньше, чем у крыс контрольной группы (P<0,05).
Экспрессия NOS-3 в сосудах панкреатических островков увеличивалась с 3% до 23% к 90-м сут хронического ЭТ, иммунопозитивные эндотелиоциты локализовались преимущественно в капиллярах по периферии островков. При изучении экспрессии TRAIL на ранних сроках эксперимента определялось окрашивание единичных эндокриноцитов и ацинарных клеток (4%), к 90-м сут ЭТ иммунопозитивных инсулоцитов было значительно больше (29%), они располагались диффузно на территории островка. На 30-е сут хронического ЭТ единичные каспазо-позитивные клетки выявлялись на границе с ацинарной тканью, по мере увеличения сроков эксперимента появлялись все более многочисленные клетки с экспрессией каспазы-3 на периферии островков.
При ультрамикроскопии островков Лангенгарса на 30-е сут ЭТ отмечено увеличение количества секреторных везикул в -клетках при незначительном уменьшении количества везикул в -клетках. В дальнейшем в большинстве -клеток выявлялось большое количество секреторных везикул, а количество -клеток продолжало снижаться, в них все чаще обнаруживались признаки пониженной секреторной активности: полиморфизм гранул и появление более крупных везикул. При морфометрии к 30-м сут выявлялись увеличение фактора формы кариолеммы и количества эухроматина в ядре, расцененные как признаки активации ядерного аппарата. Уменьшение ОД митохондрий (в 1,26 раза по сравнению с показателями в контрольной группе) на фоне увеличения их яркости (в 1,1 раза). К 60-м сут ОД митохондрий несколько увеличивалась, а относительная яркость их матрикса оставалась практически на том же уровне, что свидетельствовало о напряженности энергетических процессов в клетке. Секреторная активность -клеток увеличилась, о чем можно судить по достоверному приросту ОД везикул (в 1,53 раза, P<0,05). К окончанию эксперимента (90-е сут) зарегистрировано уменьшение фактора формы, яркости активного хроматина, ОД митохондрий, их относительной яркости и ОД секретируемых везикул. Все это в совокупности расценено как признаки снижения секреторной активности -клеток.
Уровень инсулина при хроническом ЭТ на 30-е и 60-е сут в обеих моделях определялся в пределах 15-20% выше показателей контрольной группы, а к 90-м сут процесса значительно снижался, достигая лишь 2/3 от значений в контроле (P<0,05). У животных контрольной группы имелась сильная обратная корреляционная связь между содержанием АКТГ и инсулина в крови (r = -0,87). На 30-е сут эксперимента происходило ослабление зависимости (r = - 0,51), а к окончанию эксперимента обнаружена уже умеренная положительная связь (r = 0,63).
Таким образом, исследование структурно-функциональных изменений эндокриноцитов поджелудочной железы при действии ЭТС, показало, что процессы повреждения и деструкции носили мозаичный характер и сочетались с процессами регенерации. Отчетливо выраженные изменения в эндокриноцитах сопровождались перестройкой ультрамикроскопического строения -эндокриноцитов и снижением секреции инсулина. Гипоинсулинемия при SIRS и хронических токсических состояних ранее описывалась [Гельфанд Б.Р. с соавт., 2006; Federici M.et al., 2001; Nedungadi T.P. et al., 2006], но нами детализированы отдельные механизмы ее формирования при хроническом ЭТ в составе общей гормональной дизрегуляции.
Математический анализ и моделирование эндокринной дизрегуляции при хроническом эндотоксикозе.
Доказательство участия эндокринной дизрегуляции в пато- и морфогенезе хронического ЭТ было проведено с системных позиций при использовании математического моделирования с использованием корреляционного анализа и построения регрессионных уравнений. В результате корреляционного анализа между гормонами периферической крови, входящих в состав основных гормональных осей, и биохимическими маркерами эндогенной интоксикации выявлено значительное количество сильных и умеренных математических связей (рис. 6).
Рис. 6. Корреляционные связи между маркерами эндогенной интоксикации и профилем гормонов в крови у крыс контрольной группы и при хроническом ЭТ.
У животных контрольной группы гормоны тиреоидной оси не имели значимых корреляционных связей с маркерами эндогенной интоксикации. Для адреналовой оси установлено наличие сильных обратных связей кортизола с ВСММ (-0,85) и МДА (-0,79). Среди гормонов гонадной оси наиболее сильные корреляционные связи обнаружены между ЛГ и олигопептидами (0,77) – у самцов, эстрадиолом и ВСММ (0,84) – у самок.
На 30-е сут ЭТ произошло формирование сильных корреляционных связей между гормонами адреналовой оси и маркерами эндогенной интоксикации. На этом же сроке обнаружены значимые корреляции между гормонами тиреоидной оси: ТТГ, Т3, Т4. Гормоны гонадной оси имели сильные корреляционные связи с ВСММ, олигопептидами и МДА (r в пределах 0,78-0,98 по модулю). В динамике хронического ЭТ часть связей ослабло, однако основные гормоны осей сохраняли сильные связи с одним и более маркером эндогенной интоксикации. На 90-е сут сохранялась общая тенденция в образовании умеренных и сильных корреляционных зависимостей между гормонами эндокринных осей и маркерами эндогенной интоксикации.
Отдельные закономерности выявлены в корреляциях между уровнями гормонов и показателями повреждения печени и почек.
Установлено увеличение числа и усиление ранее существовавших корреляционных связей между гормонами тиреоидной оси и морфометрическими показателями печени и почек по мере увеличения срока эксперимента. Наиболее значимые корреляции: Т4 – ОД соединительной ткани печени (0,86), Т4 – ОД гепатоцитов (-0,84); Т4 – ОД интерстициальной ткани почек (0,88), Т4 – количество склерозированных клубочков (0,95).
Корреляционный анализ между содержанием половых гормонов у самцов и тяжестью ЭТ выявил рост количества и силы связей в ряду: ЛГ – ФСГ – тестостерон – пролактин по мере увеличения сроков ЭТ.
У самок при изучении корреляций между гормонами гонадной оси и морфометрическими показателями печени и почек наиболее сильные связи обнаружены у эстрадиола с ОД гепатоцитов (0,85), ОД соединительной ткани печени (-0,82) и количеством склерозированных почечных клубочков (-0,87).
Аналогичные многочисленные корреляционные связи, имеющие логическое обоснование, были обнаружены при попарном сопоставлении между группами количественных показателей, описывающих изменения в эндокринных органах, гормональном профиле и маркеров ЭТ.
В итоге, корреляционный анализ морфометрических показателей позволил нам на математическом уровне доказать участие различных элементов эндокринной системы в пато- и морфогенезе повреждения печени и почек при хроническом ЭТ (рис. 7).
1,2
- повреждающие влияния - компенсаторные влияния
Рис. 7. Обобщенные представления о влиянии различных структур эндокринной системы на развитие морфофункциональных изменений в печени и почках при хроническом ЭТ.
Одной из задач выполняемого статистического анализа является вычисление величин параметров, прижизненное измерение которых чрезвычайно инвазивно или практически невозможно, но сведения о которых диагностически значимы и весьма информативны. В то же время существуют показатели, с помощью которых оценивается тяжесть хронического ЭТ (биохимические маркеры эндогенной интоксикации) и/или наличие эндокринного дисбаланса (гормональный профиль). Они характеризуются малой инвазивностью при получении, точностью определения, технической простотой и экономической доступностью. Именно эти параметры были использованы для нахождения искомых морфометрических показателей.
Из всей генеральной совокупности в качестве искомых параметров нами отобраны морфометрические показатели эндокринных органов, которые формируют основные гормональные оси, вовлекаемые в патологический процесс при хроническом ЭТ.
После математических преобразований с пересчетом параметров в относительных единицах (Х) и учетом данных корреляционного анализа, в частности, для расчета ОД ацидофилов гипофиза было получено:
Для расчетного определения морфометрических показателей пучковой зоны коркового вещества надпочечников оказалось возможным построить следующую систему уравнений:
1)  2)  3)  4)  |
Для расчета функциональной активности щитовидной железы достаточно измерить параметры Т3своб., Т3общ., ВСММ, Ацилаза почек, МДА, Олигопептиды, Ацилаза почек и решить систему уравнений:
1)  2)  3)  |
