На правах рукописи

Дзугкоев Сергей Гаврилович

механизмы формирования эндотелиальной дисфункции, сопровождающие патологию висцеральных органов при сахарном диабете. Перспективы коррекции.

14. 03. 03. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Ростов-на-Дону – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра Российской академии наук и Правительства Республики Северная Осетия – Алания

Защита состоится «_____» ___________2013 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.03 на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29)

Автореферат разослан «______» ____________2013 года

Учёный секретарь

диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Хаишева Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

Широкий интерес современной медико-биологической науки к проблеме сахарного диабета (СД) объясняется его значительной распространенностью в мире, где в настоящее время насчитывается более 300 млн. больных СД и по прогнозам ВОЗ к 2030 году ожидается увеличение числа больных до 438 млн. Растущая распространенность, частота и тяжесть сосудистых осложнений приводят к инвалидизации и преждевременной смертности трудоспособного населения (Науменко Л.В., Кузнецова В.А., Спасов А.А., 2010; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2011; Курбанов Э.Ю., Сергеев В.Г., 2011). Особенностями сосудистых осложнений являются микроангиопатии – повреждение мелких сосудов почек, сетчатки глаза и периферической сосудистой системы. Данные ряда авторов (Белкина Л.М., Терехина О.Л., Смирнова Е.А.; 2010) также свидетельствуют, что наличие СД типа 1 сопряжено с высоким риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, в первую очередь, ишемической болезни сердца (ИБС).

Изучение функциональных и биохимических механизмов развития сосудистых осложнений СД остается одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной и клинической медицины. Среди нескольких гипотез, объясняющих патогенез сосудистых диабетических поражений, особое место занимает развитие окислительного стресса, вследствие повышенной генерации активных метаболитов кислорода (АМК) и нарушения антиоксидантной защиты (АОЗ) клеток (Волчегорский И.А., Рассохина Л.М., Мирошниченко И.Ю., 2010). Фактором риска в условиях окислительного стресса становится эндотелиальная дисфункция, основными механизмами которой могут быть изменения активности и/или экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), сниженный синтез оксида азота (NO) из L-аргинина, сниженная чувствительность гладкомышечных клеток (ГМК) к NO или усиленная его деградация за счет взаимодействия с активными формами кислорода (АФК), включая супероксид-анион и другие продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ). Эффективность образования NO зависит от наличия субстрата – L-аргинина, транспорт которого подвержен негативному влиянию окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛНП) (Судаков Н.П., Никифоров С.Б., Пушкарев Б.Г., 2010). Другой причиной низкой биодоступности NO может быть повышенный уровень в плазме крови ассиметричного диметиларгинина (АДМА) – эндогенного конкурентного ингибитора eNOS (Joutouzas K, Riga M, Stefanidi E et al., 2008). Учитывая важную роль нарушения NO-продуцирующей функции эндотелия в условиях окислительного стресса в развитии сосудистых осложнений СД, необходим новый методологический подход патогенетической терапии диабетических ангиопатий, основанный на применении препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами и способностью нормализовать метаболизм NO (Тюренков И.Н., Воронков А.В., Слиецанс А.А., 2010; Черноморцева Е.С., Покровский М.В., Титарева Л.В., 2010). Из литературных данных известно, что основная утечка супероксиданион радикала О2- при СД происходит на уровне III комплекса дыхательной цепи, а применение SKQ1 и коэнзима Q10 способствует восстановлению ультраструктуры митохондрий и улучшению функции кардиомиоцитов. L-карнитин способствует транспорту ацилов жирных кислот в митохондрии, их последующему окислению и образованию восстановленных коферментов для дыхательной цепи.

Другой препарат – селективный анксиолитик афобазол, синтезированный в ГУНИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, обладает способностью позитивно модулировать продукцию NO, ингибируя индуцибельную изоформу NO-синтазы и стимулируя конститутивную эндотелиальную NO-синтазу (NOS-3) и одновременно обладает антиоксидантными свойствами (Середенин С.Б., Воронин М.В., 2010).

Изучение влияния эндогенных регуляторов и митохондриально-ориентированных антиоксидантов – коэнзима Q10, L-карнитина, а также афобазола на биохимические и функциональные показатели сосудистой системы является весьма актуальным. Более того, в доступной литературе отсутствуют данные о биохимических маркерах эндотелиальной дисфункции и влиянии эндогенных регуляторов эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), антиоксидантов и афобазола на гемодинамику и структурно-функциональную организацию жизненно важных органов – почки, печень, миокард при экспериментальном сахарном диабете (модель СД типа 1).

Цель работы: получить комплексные данные о биохимических и функциональных механизмах развития эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете типа 1, а также метаболических и гистологических изменениях висцеральных органов для разработки способов патогенетической коррекции.

Задачи исследования

1. Определить роль NO-продуцирующей системы: концентрации суммарных метаболитов оксида азота, уровня экспрессии eNOS в эндотелии аорты в механизмах развития эндотелиальной дисфункции у крыс с моделью СД типа 1.
2. Показать особенности нарушения метаболизма оксида азота, участие в этом процессе L-аргинина и L-NGаргинина, метилового эфира (L-NAME) при экспериментальном сахарном диабете в условиях окислительного стресса.
3. Установить характер метаболических нарушений и структурных повреждений сосудистой системы и висцеральных органов (почки, сердце, печень) при экспериментальном сахарном диабете. Показать влияние коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола на биохимические и гистологические показатели этих систем.
4. Выявить изменения биохимических показателей нарушений углеводного, белкового и липидного обменов у больных сахарным диабетом типа 1 с сосудистыми осложнениями: нефропатия, периферические ангиопатии. Показать выраженность нарушений функциональной способности почек и микроциркуляторной гемодинамики в зависимости от степени компенсации обмена веществ.
5. Разработать и применить технологию коррекции выявленных нарушений с использованием эндогенных регуляторов eNOS: L-аргинина, L-NAME, а также их комбинации с антиоксидантами: Q10, L-карнитином и афобазолом при СД в эксперименте.
6. Исследовать влияние комплексной терапии с коэнзимом Q10 на биохимические и функциональные показатели у диабетических больных с нефропатиями и периферическими ангиопатиями с различной степенью компенсации обмена веществ.

Научная новизна

Впервые в работе использован комплексный подход к исследованию механизмов формирования эндотелиальной дисфункции и ее роли в гемодинамических нарушениях, биохимических и гистологических изменениях висцеральных систем: почек, печени, миокарда. Вскрыты патобиохимические механизмы нарушения метаболизма NO в условиях окислительного стресса, установлен характер изменения экспрессии eNOS при СД в эксперименте и показано участие в этом механизме L-аргинина и ингибитора eNOS L-NAME - аналога АДМА; изучены корреляционные взаимосвязи этих показателей с интенсивностью ПОЛ, активностью ферментов АОС и концентрацией NOx.

Впервые установлен органо-системный характер окислительного стресса и нарушений, вызванных изменением гомеостаза NO в этих условиях, патогенетической основой которых является эндотелиальная дисфункция. В клинике у больных СД типа 1 с нефропатией и периферическими ангиопатиями различной степени компенсации (декомпенсированные, субкомпенсированные, компенсированные формы) установлена роль СРО и нарушения метаболизма NO в механизмах развития этих сосудистых осложнений. Разработана и применена технология оптимизации традиционного лечения инсулином в комбинации с метаболически корригирующим препаратом - коэнзимом Q10.

Результаты фундаментальных исследований позволили установить участие и взаимосвязь нарушений метаболизма оксида азота и показателей окислительного стресса, а также метаболических, функциональных и гистологических механизмов развития сосудистых осложнений СД. На основании сравнительного анализа экспериментальных и клинических данных, полученных фундаментальных знаний, сформирована концепция о механизмах развития сосудистых осложнений СД, а также разработан новый методологический подход, направленный на восстановление NO-продуцирующей функции эндотелия и энергообразования в клетках висцеральных органов. Новизна исследований подтверждается полученными патентами на изобретение (4) и одного свидетельства о государственной регистрации программы для ЭВМ.

Научно-практическая значимость

Результаты изучения динамики показателей активности про- и антиоксидантных систем и их роли в нарушении механизмов регуляции гомеостаза NO и развитии эндотелиальной дисфункции (ЭД) при СД в эксперименте и клинике имеют общее медико-биологическое, а также клиническое значение для понимания патогенеза сосудистых осложнений СД и направленного поиска адекватных способов оптимизации профилактики и лечения нефро- и ангиопатий. Получены фундаментальные данные о роли доноров NO и ингибиторов eNOS, в частности L-аргинина и L-NAME, а также эндогенных антиоксидантов - коэнзима Q10, L-карнитина, а также афобазола в регуляции метаболических и гемодинамических изменений в эксперименте при СД. Проведенные клинические исследования свидетельствуют об эффективности комплексного лечения с коэнзимом Q10 у больных СД-1 (субкомпенсированная форма) с нефропатией и периферическими ангиопатиями. Эти данные подтверждают его антиоксидантную роль и позволяют рекомендовать системное применение антиоксидантных препаратов для профилактики и лечения в субкомпенсированной стадии развития сосудистых осложнений СД.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сахарный диабет в клинике и эксперименте характеризуется нарушением метаболизма оксида азота в условиях окислительного стресса, который приобретает системно-органный характер и сопровождается нарушением структурной и функциональной организации внутренних органов (почки, печень, сердце).
2. Причинами нарушения гомеостаза оксида азота являются: дефицит субстрата - L-аргинина, повышение в крови эндогенного ингибитора eNOS – ассиметричного диметиларгинина, угнетение экспрессии eNOS, снижение биодоступности оксида азота и нейтрализация его активными формами кислорода.
3. Сосудистые осложнения сахарного диабета в клинике и эксперименте характеризуются нарушением системной гемодинамики, повышением модуля упругости, реографического индекса, упруго-эластических свойств и снижением пульсового кровенаполнения микроциркуляторных сосудов, развитием периферических ангиопатий.
4. Применение эндогенного регулятора экспрессии eNOS - L-аргинина приводит к угнетению окислительного стресса, повышению концентрации NO в плазме крови и экспрессии eNOS, сопровождающиеся ускорением микроциркуляторной гемодинамики, вследствие снижения упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки в микроциркуляторном русле. В противоположность этому, L-NAME – аналог эндогенного ингибитора eNOS АДМА, способствует повышению концентрации МДА и снижению содержания оксида азота, что проявляется нарушением микроциркуляторной гемодинамики.
5. Использование препаратов метаболической коррекции – коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола при ЭСД способствует угнетению ПОЛ, активации АОС, увеличению концентрации NO в плазме крови, вследствие повышенной доступности субстрата - L-аргинина для NO-продуцирующего фермента, угнетению активности эндогенного ингибитора фермента и повышенной экспрессии NOS-3.
6. Применение эндогенных антиоксидантов и афобазола, угнетающих окислительный стресс при ЭСД, вызывает повышение активности Na,K-АТФазы в гомогенатах почек, печени, миокарда, снижение активности ферментов: АлАТ, АсАТ, ГГТП и экскреторного – щелочной фосфатазы в плазме крови, а также частичное восстановление гистологической структуры внутренних органов.
7. У больных СД типа 1 с диабетической нефропатией (субкомпенсированная форма) комплексная терапия с коэнзимом Q10 способствует компенсации процесса метаболизма, снижению степени протеинурии, повышению трансмембранного транспорта воды, электролитов и снижению в сыворотке крови концентрации креатинина и мочевины. Применение коэнзима Q10 с базисной терапией у диабетических больных с периферическими ангиопатиями вызывает увеличение пульсового кровенаполнения в сосудах нижних конечностей, реографического индекса и модуля упругости на фоне компенсации обмена веществ.

Личный вклад автора

Автор самостоятельно разработал методические подходы к решению поставленной цели и задач, выполнил экспериментальные и клинические исследования, провел математическую и статистическую обработку и анализ с обобщением полученных результатов.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ 2010); I Региональной междисциплинарной конференции молодых ученых «Наука–обществу» (Владикавказ, 2010); II международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011); Международном научном форуме «Наука и общество», Физиология и медицина 21 века, 6 Петербургская встреча лауреатов Нобелевской премии (Санкт-Петербург, 2011); V региональной научно-практической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2011); на VII MEZINRODNI VDECKO-PRAKTICKA KONFERENCE «VDECKY POKROK NA PRELOMU NYSYACHALETY». (Praha, 2011); Х конференции молодых ученых и специалистов СОГМА (Владикавказ, 2012); XI конференции молодых ученых и специалистов СОГМА «Молодые ученые - медицине» (Владикавказ, 2012); 8 международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», г. Судак (Крым, Украина) 2012г; 9 международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения», Астрахань 2013г.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 23 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертации используются в лекциях и научных исследованиях на кафедре биохимии и клинико-лабораторной диагностики ГБОУ ВПО Астраханской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России и кафедре общей и клинической биохимии с клинико-лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО Самарского государственного университета и в научно-исследовательской работе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия – Алания.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 281 страницах, иллюстрирована 52 таблицами (из них 46 в приложении) и 58 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка литературы, содержащего 412 источников (189 отечественных и 223 зарубежных).

Содержание работы

Работа выполнена в период с 2008 по 2013 гг. на базе отдела патобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия – Алания (экспериментальная часть) и на базе Республиканского эндокринологического диспансера РСО-Алании (клиническая часть).

Материалы и методы исследования

Эксперименты проводили в хронических опытах, в одно и тоже время суток, сезоны года. Провели 15000 исследований, включая биохимические (определение концентрации глюкозы, гликированного Hb (HbС1) в сыворотке крови, МДА, ГП в эритроцитах, активности СОД, каталазы, Na+,К+-АТФ-азы, концентрации ЦП, суммарных метаболитов NO, экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), общего белка, мочевины, креатинина, активности ферментов: АсАТ, АлАТ, ГГТП, щелочной фосфатазы, показателей обмена ХС: ОХС, ХС ЛВП, ХС ЛНП, ТАГ, содержания Na, K в сыворотке крови и моче, функциональные (характер кровотока в магистральных артериях и в сосудах микроциркуляции), гистологические исследования у животных и клинические исследования у больных СД типа 1 с нефро- и ангиопатиями различной степени компенсации обмена веществ и функционального состояния почек (водо-, электролито- и азотовыделительная функции почек), исследование кровотока в сосудах нижних конечностей – реовазография с помощью диагностической системы «Валента». По реовазограмме определяли следующие показатели: реографический индекс, модуль упругости, время максимального систолического наполнения, диастолический индекс, венозный отток.

Экспериментальные исследования проводили на 310 крысах-самцах линии Wistar одной возрастной группы (10-14 месяцев), массой 175-220 гр интактных и с аллоксановым сахарным диабетом. Моделирование аллоксанового диабета производилось внутрибрюшинным введением 5% водного раствора аллоксана, синтезированного в отделе патобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия – Алания в дозе 15-18 мг/100гр массы на фоне 24-48-часового голодания.

Развитие диабета контролировали по уровню глюкозы крови, который определяли глюкозооксидазным методом. Модель считали состоявшейся при повышении сахара крови и диуреза более чем в 2 раза. Животных брали в опыт по окончании остротоксического периода действия аллоксана, т.е. спустя 14 дней с момента развития экспериментального сахарного диабета. В качестве объектов исследования использовали сыворотку, плазму крови, эритроциты, гомогенаты коркового и мозгового вещества почечной ткани, печени и миокарда, мочу, эндотелий аорты, а также ткани почек, печени и миокарда для гистологического исследования.

В эксперименте определяли: состояние липидного обмена по уровню общего холестерина (ХС), ХС ЛНП, ХС ЛВП в крови и интенсивность перекисного окисления липидов в эритроцитах, почках, печени и миокарде по концентрации гидроперекисей и вторичного продукта – малонового диальдегида (методом Аsacawa T., 1980). О состоянии антиоксидантной системы судили по активности супероксиддисмутазы, определяемой методом аутоокисления адреналина, каталазы (М.А. Королюк и соавт., 1988) и концентрации церулоплазмина в сыворотке крови. Активность Na+,K+-АТФ-азы определяли по методу Scow JC. (1957). Удельную активность фермента рассчитывали на мг белка в час (мкмоль/Рн/мг белка/час). Белок в пробах определяли по методу Lowry OH. (1951). Определяли концентрацию стабильных суммарных конечных метаболитов оксида азота (NO2- и NO3-, NOХ) в сыворотке крови и уровень экспрессии eNOS в эндотелии аорты (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., Литинская О.А. 2004).

Для проведения анализа уровня экспрессии, аорты извлекали, промывали физиологическим раствором и помещали в специальные пластиковые пробирки типа «Эппендорф», которые хранили в жидком азоте. Затем аорты перетирали с жидким азотом в фарфоровой ступке, переносили в микроцентрифужную пробирку, трижды промывали фосфатным буфером, рН 7.4 и осадок после центрифугирования (10 мин. при 1000 x g) собирали в 100 мкл лизирующего буфера. Полосу, соответствующую eNOS, детектировали в соответствии с ее молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Пленку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. Результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы Х к интенсивности полосы, принятой за контроль на каждой пленке. Аорта и сосуды микроциркуляции экспериментальных крыс подвергались гистологическому исследованию микроскопически. Количественную оценку гистологических изменений проводили по методу Автандилова с помощью цифрового фотоаппарата “Nikon”, совмещенного с микроскопом.

Для изучения гемодинамики у наркотизированных животных исследовали кровоток в магистральных сосудах – брюшной аорте (БА), нижней полой вене (НПВ), почечных артериях (ПА) и микроциркуляторном звене допплерографически с помощью ультразвукового портативного допплерографа ММ-Д-Ф фирмы «Минимакс» СП(б), использовали 6 основных точек локации.

Обследовано 69 больных с СД типа 1, из них 30 больных с диабетической нефропатией и 39 человек с СД типа 1 с явлениями периферической диабетической ангиопатией и метаболическими нарушениями различной степени компенсации до, после базисной и комплексной терапии и 20 здоровых лиц без сахарного диабета, составивших контрольную группу. Длительность заболевания сахарным диабетом составила в среднем 9,461±1,285 лет, возраст больных варьировал от 18 до 46 лет (в среднем 30,205±1,367 лет). Среди обследованных: 40 мужчин и 29 женщин, больных сахарным диабетом типа 1.

Диагностику, оценку степени тяжести СД и фазы компенсации проводили по клинико-лабораторным критериям в Республиканском эндокринологическом диспансере РСО-Алания в соответствии с рекомендациями эндокринологического научного центра РАМН. Для анализа биохимических показателей забирали образцы крови у больных с СД, которые были разделены на 3 группы в зависимости от степени компенсации обмена веществ: декомпенсированные больные - до лечения (n=22 чел.); больные с субкомпенсированной формой СД, получавшие базисную терапию препаратами инсулина короткого действия (актрапид) и промежуточного действия (протапид, монотард, хумулин) (n=25 чел.); больные с субкомпенсированной формой СД, получавшие комплексное лечение: препараты инсулина + коэнзим Q10 по 2 капсулы по 0,5 гр. (Эвалар ЗАО) в день во время еды (n=22). Концепцию и идеологию работы определял дизайн исследования (рис.1.).

На каждого пациента формировалась карта сбора информации и компьютерная база данных с оцифрованными вазограммами и результатами биохимических и функциональных исследований. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики, принимая во внимание коэффициент вариации динамических рядов, и оценивали корреляцию, учитывая ее достоверность по стандартным таблицам (Л.С. Каминский), с использованием компьютерной программы статанализа «STATISTIKA 6.0 for Windows».

Рисунок 1. Дизайн экспериментально-клинических, лабораторных и функциональных исследований при сахарном диабете.

Результаты исследования и их обсуждения

На фоне стойкой гипергликемии и повышения концентрации гликированного гемоглобина при ЭСД и у больных СД типа 1 происходит нарушение аэробных процессов окисления, образование АФК, особенно супероксид анион радикала (O2-) на уровне III компонента ЦПЭ и развитие системного окислительного стресса. В хронической стадии аллоксанового диабета отмечается повышение концентрации МДА в эритроцитах, гомогенатах коркового, мозгового вещества почечной ткани, печени и миокарда, снижение активности СОД, увеличение активности каталазы, концентрации церулоплазмина в сыворотке крови (табл.1). У крыс с ЭСД на фоне развившегося оксидативного стресса выявлено снижение концентрации суммарных метаболитов NO (табл.1). Корреляционный анализ показал наличие отрицательной сильной связи между повышением МДА в крови и снижением концентрации суммарных метаболитов NO (r=-0,74). Сниженная продукция NO может быть связана со следующими причинами: 1) взаимодействием NO с супероксиданион-радикалом (О2-) с образованием пероксинитрита, причем О2- значительно активнее реагирует с NO, чем скорость реакции дисмутации (О2-) СОД с образованием пероксида (Н2О2); 2) нарушением доступности субстрата - L-аргинина для эндотелиальной NO-синтазы (еNOS) и повышением в крови ингибитора еNOS; 3) с низким уровнем экспрессии и активности фермента еNOS и с нарушением биодоступности NO; 4) с изменением гистологической структуры эндотелия.

Доступность субстрата для NO-синтазы мы определяли в специальной серии экспериментов при ежедневном введении L-аргинина в течении 4-х недель диабетическим и интактным крысам в дозе 10 мг/кг веса тела. Данные показали уменьшение степени выраженности дисбаланса в системе СРО-АОС и одновременно статистически достоверное повышение концентрации суммарных метаболитов NO в сыворотке крови (табл.1). Введение же интактным и диабетическим крысам ингибитора еNOS – NG-аргинина, метилового эфира (L-NAME) вызвало возрастание содержания метаболитов ПОЛ по данным концентрации МДА в эритроцитах при одновременном снижении активности СОД в эритроцитах и сыворотке крови. При этом отмечается снижение концентрации суммарных метаболитов NO на фоне введения L-NAME интактным крысам (табл.1). Активация СРО на фоне ингибитора еNOS – L-NAME может быть обусловлена так называемым «разобщением» оксидазного и редуктазного доменов еNOS, когда фермент вместо NO продуцирует АФК. Причиной этому является недостаточность восстановленных коферментов данного энзима, в частности тетрагидробиоптерина (ВН4) в условиях окислительного стресса (Marletta M.A., II Cell 1994; Vasguez-Vival J, Kalyanaraman B, Martasek P. Free Radic Res, 2003). Все эти изменения могут влиять на уровень экспрессии NOS-3 в эндотелии аорты. Результаты исследования уровня экспрессии eNOS в эндотелии аорты у диабетических крыс под влиянием L-аргинина и L-NAME показали, что субстрат энзима L-аргинин повышает уровень экспрессии eNOS, тогда как L-NAME – снижает (рис.2).

Рисунок 2. Экспрессия eNOS в эндотелии аорты на фоне L-аргинина и L-NAME у крыс с СД.

Примечание: А – метчики; В – эндотелий (стандартная полоса для пересчета); 1-2 - L-NAME; 3-4 ЭСД + L-NAME; 5-6 аргинин; 7-8 ЭСД + L-аргинин.

Анализ данных допплерографии выявил повышение сосудистого тонуса и нарушение микроциркуляции, на что указывают реографические показатели, характеризующиеся более высокими значениями индекса Гослинга, повышением плотности сосудистой стенки (PI) и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурсело (RI), отражающий общее периферическое сосудистое сопротивление (ОПСС), у животных с ЭСД был выше, чем в контроле. Снижение средней и систолической скоростей кровотока в микроциркуляторных сосудах отражает нарушение гемодинамики. В соответствии с нашими данными можно считать, что эти функциональные изменения являются следствием нарушенного метаболизма NO и интенсивности образования метаболитов ПОЛ, влияющих на проницаемость и тонус сосудов. Не исключается развитие морфологических изменений: гистологическая картина микроциркуляторных сосудов у крыс с СД подтвердила наличие повреждения эндотелия, присутствие очаговой эксфолиации эндотелия, расширение щелей между сохранившимися дистрофически измененными эндотелиоцитами. На транспорт L-аргинина в эндотелиальную клетку могут оказывать влияние окисленные ЛНП (оЛНП). Их содержание в хронической стадии аллоксанового диабета повышается. Гиперхолестеринемия и гипер--липопротеинемия способствуют повреждению эндотелия сосудов вследствие атерогенеза. Существует отрицательная корреляционная связь между содержанием NO и концентрацией ЛНП (r= -0,68) и между МДА и NO (r= -0,65). Это способствует уменьшению эндотелийзависимой вазодилатации. Полученные результаты созвучны с литературными данными, свидетельствующими о торможении оЛНП высвобождения NO эндотелиальными клетками (Chin J.H., Azhar S., Hoffman B.B. 1982; Plane F, Bruckdorber K.R., Kerr P. et al., 1992; Zulli A., Widdop B., Hare D.L. et al., 2003).

Для выяснения роли дисфункции эндотелия в развитии нарушений висцеральных органов (почки, печень, миокард) мы исследовали в них показатели ПОЛ, активность мембранного фермента – Na,K-АТФ-азы, а также органоспецифических ферментов в сыворотке крови: АлАТ, АсАТ, ГГТП и экскреторного фермента – щелочной фосфатазы у крыс в хронической стадии аллоксанового диабета. Результаты активности Na,K-АТФ-азы висцеральных органов показали, что в условиях окислительного стресса у крыс с ЭСД статистически достоверно снижается активность Na,K-АТФ-азы в обоих слоях почечной ткани, в гомогенатах печени и миокарда. Активность Na,K-АТФ-азы остается сниженной при ЭСД на фоне введения L-NAME и несколько повышается под влиянием L-аргинина. Увеличение активности АлАТ, АсАТ, ГГТП свидетельствуют о повышенной проницаемости мембран гепатоцитов и кардиомиоцитов в результате ПОЛ, изменяющего структуру фосфолипидов и, по мере активации этого процесса, превращающего фосфолипиды в лизофосфолипиды. Повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови свидетельствует о нарушении экскреторной функции печени. Биохимические нарушения проницаемости сосудистой системы и цитоплазматических мембран внутренних органов сопровождались гистологическими изменениями в почках, печени и миокарде. Развивается очаговый экссудативный и продуктивный экстра- и интракапиллярный гломерулонефрит. В миокарде имеет место очаговая дистрофия с мелкими фокусными очагами некроза в кардиомиоцитах, исчезновение поперечной исчерченности в участках кардиомиопатии. В печеночной ткани выявлена жировая дистрофия групп гепатоцитов и признаки микроангиопатии в виде гиперемии, плазматического пропитывания стенок сосудов, лимфогистиоцитарной инфильтрации микроциркуляторного русла долек и портальных трактов, экстравазаты.

Т.о., длительно прогрессирующий процесс при декомпенсированном СД приводит к полиорганным нарушениям (нефропатия, кардиопатия, гепатопатия), обусловленным биохимическими и структурными изменениями русла капилляров, артериол, венул и мембран клеток органов. В условиях выраженных метаболических изменений, сопровождающихся активацией перекисных процессов, страдает система, ответственная за продукцию NO и развивается дисфункция эндотелия.

Для коррекции дисбаланса ПОЛ - АОЗ, нарушений метаболизма NO и гемодинамических изменений экспериментальным животным вводили, соответственно, коэнзим Q10 (группа №7), L-карнитин (группа №10) и афобазол (группа №13) в различных вариантах: на фоне эндогенных регуляторов экспрессии eNOS – L-аргинина + коэнзим Q10 (группа №8), афобазол (группа №14) и L-карнитин (группа №11) и на фоне L-NAME + коэнзим Q10 (группа №9), афобазол (группа №15) и L-карнитин (группа №12) и в виде монотерапии. В контрольных исследованиях вводили эндогенные регуляторы интактным крысам. Полученные нами результаты свидетельствуют о существенном угнетении ПОЛ по данным снижения концентрации МДА в крови под влиянием коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола и их комбинации с L-аргинином. Однако, и на фоне L-NAME эндогенные антиоксиданты вызвали угнетение интенсивности ПОЛ и снижение концентрации МДА в крови. При сравнительном анализе результатов ингибирования ПОЛ наиболее эффективным является коэнзим Q10 и его комбинация с L-аргинином.

Анализ активности ферментов антиоксидантной системы показал достоверное возрастание активности СОД в сыворотке крови и эритроцитах, а исходно повышенная активность каталазы и концентрации церулоплазмина достоверно снизились. Характер изменения активности ферментов АОС на фоне коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола в комбинации с L-NAME был аналогичен, но эффективность препаратов была менее значимой. Повышение активности СОД во всех вариантах исследований сопровождается ингиброванием накопления супероксиданиона, образованием Н2О2, разрушающейся каталазой (Chang JM, Kuo MC, Kuo HT, Chiu YW, Chen HC., 2005). С другой стороны, это препятствует образованию пероксинитрита, предупреждая при этом повреждение эндотелия сосудов (Ванин А.Ф., 2000).

На фоне лечения в 9-ти вариантах исследований у экспериментальных крыс с СД статистически достоверно повысилась концентрация суммарных метаболитов оксида азота в сыворотке крови, причем наиболее значимо на фоне коэнзима Q10 и его комбинации с L-аргинином. Коэнзим Q10, L-карнитин и афобазол частично устранили действие ингибитора eNOS – L-NAME, однако концентрация NOx в сыворотке крови была ниже сравнительно с данными на фоне монотерапии коэнзимом Q10, L-карнитином и их комбинации с L-аргинином.

Корреляционный анализ продемонстрировал эффективность действия антиоксидантов на интенсивность ПОЛ и активность ферментов АОЗ. Анализ данных показал прямую корреляционную связь между концентрацией МДА и активностью каталазы (r=+0,57; r= +0,62; r= +0,60; р<0,001) и концентрацией церулоплазмина (r= +0,52; r= +0,59; r= +0,58; р<0,001) на фоне коэнзима Q10 и L-карнитина соответственно и обратной связи между уровнем снижения концентрации МДА и повышением активности СОД в эритроцитах крови (r= -0,54; r= -0,59; r= -0,61; р<0,001).

Между концентрацией метаболитов NO и МДА существует отрицательная, сильная корреляционная связь на фоне всех вариантов лечения соответственно (r= -0,59; r= -0,60; r= -0,57; p<0,001).

Таблица №1

Биохимические показатели сыворотки крови на фоне эндогенных регуляторов eNOS и антиоксидантов у крыс с ЭСД

Примечание: 1111) - p<0,001; 111) - p<0,01; 11) - p<0,02; 1) - p<0,05 – достоверность относительно нормы; 2222) - p<0,001; 222) - p<0,01; 22) - p<0,02; 2) - p<0,05 - относительно ЭСД; 3333) - p<0,001; 333) - p<0,01; 33) - p<0,02; 3) - p<0,05 – относительно L-name; 4444) - p<0,001; 444) - p<0,01; 44) - p<0,02; 4) - p<0,05 – относительно ЭСД + L-name; 5555) - p<0,001; 555) - p<0,01; 55) - p<0,02; 5) - p<0,05 – между 7/8,9; 10/11,12; 13/14,15.

Таблица №2

Липидный спектр крови на фоне эндогенных регуляторов eNOS и антиоксидантов у крыс с ЭСД

Примечание: 1111) - p<0,001; 111) - p<0,01; 11) - p<0,02; 1) - p<0,05 – достоверность относительно нормы; 2222) - p<0,001; 222) - p<0,01; 22) - p<0,02; 2) - p<0,05 - относительно ЭСД; 3333) - p<0,001; 333) - p<0,01; 33) - p<0,02; 3) - p<0,05 – относительно L-name и L-аргинина.

Таблица №3

Активность ферментов сыворотки крови на фоне эндогенных регуляторов eNOS и антиоксидантов у крыс с ЭСД

Примечание: 1111) - p<0,001; 111) - p<0,01; 11) - p<0,02; 1) - p<0,05 – достоверность относительно нормы; 2222) - p<0,001; 222) - p<0,01; 22) - p<0,02; 2) - p<0,05 - относительно ЭСД; 3333) - p<0,001; 333) - p<0,01; 33) - p<0,02; 3) - p<0,05 – относительно L-name; 4444) - p<0,001; 444) - p<0,01; 44) - p<0,02; 4) - p<0,05 – относительно ЭСД + L-name; 5555) - p<0,001; 555) - p<0,01; 55) - p<0,02; 5) - p<0,05 – между 7/8,9; 10/11,12; 13/14,15.

Для оценки NО-продуцирующей функции эндотелия мы определяли уровень экспрессии eNOS в экстрактах эндотелия аорты у диабетических крыс на фоне лечения коэнзимом Q10, L-карнитином и афобазолом и их комбинации с L-аргинином и L-NAME. Представленные данные свидетельствуют о повышении уровня экспрессии фермента на фоне лечения антиоксидантами (табл.4). Сравнительный анализ результатов показал, что наибольший уровень экспрессии выявлен на фоне лечения коэнзимом Q10 (рис.3; табл.4). Анализ данных повышения доступности L-аргинина для фермента eNOS показал снижение в сыворотке крови ОХС и ХС ЛНП, а также повышение ХС ЛВП, являющихся антиатерогенными (табл.2).

Рисунок 3. Экспрессия эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) (140 kDa) в аортах крыс на фоне ЭСД при терапии коэнзимом Q10.

Таблица №4

Изменение уровня экспрессии eNOS под влиянием афобазола, коэнзима Q10, L-карнитина и их комбинации с L-аргинином и L-NAME