Федеральное государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина»

УДК 544.7 № госрегистрации 01200961265 Инв. № 59-11-04

«УТВЕРЖДАЮ» Ректор ФГОУ ВПО МГАВМиБ, академик РАСХН, профессор ______________Ф.И. Василевич «___» апреля 2010 г.

ОТЧЕТ о научно-исследовательской работе

Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области коллоидной химии и поверхностных явлений.

по теме:

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК И СОЗДАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ КОЛЛОИДНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ И ЗООТЕХНИЧЕСКИХ

НАПРАВЛЕНИЙ

(промежуточный этап №3)

«Теоретические и экспериментальные исследования

коллоидно-химических свойств БКС»

Государственный контракт от «07» июля 2009 г. № 02.740.11.0270 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы

Мероприятие 1.1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров.

Руководитель проекта,

академик РАСХН, д.с/х.н., проф. ___________ Н.А. Балакирев

«__» апреля 2010 г.

Москва 2010

Список основных исполнителей

Проректор по НР,академик РАСХН, д.с/х н., проф.	____________ подпись, дата	Н.А. Балакирев
Зав. кафедрой, д.х.н., д.б.н., проф	____________ подпись, дата	С. Ю. Зайцев
Проф., д.х.н	____________ подпись, дата	М. С. Царькова
Доцент, к.х.н.	____________ подпись, дата	Л.А. Фролова
Доцент, к.х.н.	____________ подпись, дата	О.С. Белоновская
Доцент, к.б.н.	____________ подпись, дата	А.А. Лисицына
Зав. уч. лабораторией, к.б.н.	____________ подпись, дата	И.В. Милаёва
Аспирантка	____________ подпись, дата	Е. Н. Зарудная
Аспирант	____________ подпись, дата	В. В. Бондаренко
Аспирант	____________ подпись, дата	А. Н. Тимонин
Аспирант	____________ подпись, дата	М.Н. Шапошников
Студентка	____________ подпись, дата	Н.А. Довженко
Студентка	____________ подпись, дата	Д.О. Соловьева
Инженер	____________ подпись, дата	Е.В. Баннова
Нормоконтролер	____________ подпись, дата	Е.Ю. Любинская
Старший лаборант	____________ подпись, дата	Н.С. Епихина

Реферат

Отчет 120 с., 7 ч., 64 рис., 78 табл., 34 источника.

Ключевые слова: биохимические коллоидные системы, мембраны, мембранные коллоидные системы, тонкие пленки, полимеры, иммобилизованные ОМС, иммобилизованные ферменты, супрамолекулярные ферментные комплексы, коллоидно-химические свойства, белки, полиэлектролиты, физико-механические свойства, динамическое поверхностное натяжение, модельные системы, сыворотка крови.

Объекты исследования и разработки. Анализ научно-технической литературы и других материалов, относящихся к методам исследования биологических жидкостей, изучение оборудования для определения динамического поверхностного натяжения (ДПН) биологических жидкостей, программного обеспечения для анализа тензиограмм (графиков зависимости поверхностного натяжения от времени). Изучение методик измерения ДПН биологических жидкостей, модификация их для работы с сывороткой крови животных. Изучение ДПН сыворотки крови свиней в зависимости от возраста и физиологического состояния. Определение корреляционных связей между значениями ДПН и биохимическим составом сыворотки крови свиней. Изучение каталитической активности комплексов липазы из разных источников с синтетическими полимерами. Разработка методов получения и получение тонких полимерных пленок. Создание хемосенсорных материалов на их основе и определение с их помощью катионов тяжёлых металлов (Hg2+ и Ag+) спектральными методами. Сравнительный анализ полученных спектров поглощения и флуоресценции.

Цели работы по третьему этапу

• Выбор методов исследований биологических жидкостей; техническое обеспечение и разработка экспериментального оборудования;
• Разработка методики измерения динамического поверхностного натяжения (ДПН) биологических жидкостей животных и освоение специального программного обеспечения для определения параметров ДПН;
• Изучение состава и свойств биологических жидкостей свиней под воздействием внешних факторов;
• Изучение каталитических свойств липаз в комплексах с синтетическими полимерами;
• Разработка методов и получение МКС для определения тяжёлых металлов (Hg2+ и Ag+) спектральными методами. Сравнительный анализ спектров поглощения и флуоресценции хемосенсорных материалов на основе таких МКС;
• Разработка программы внедрения результатов НИР в образовательный процесс;
• Анализ и обобщение полученных на 3 этапе результатов НИР.

Метод и методология проведения работы включали: анализ научно-технической литературы и других материалов путём изучения печатных и электронных, отечественных и зарубежных изданий, относящихся к методам исследования биологических жидкостей животных, разработка и описание методики и технической реализации проведения исследований ДПН, проведение работ по измерению ДПН, биохимическому анализу сыворотки крови свиней разного возраста и физиологического состояния, анализ полученных данных ДПН с помощью программы ADSA, расчёт коэффициентов корреляции между данными ДПН и биохимическими показателями; получение комплексов липазы из разных источников с синтетическими полимерами, определение каталитической активности; получение тонких полимерных пленок с катионами тяжёлых металлов ( Hg+2 и Ag+), изучение их физико-химических свойств (оптической плотности, влагопоглощения, твердости и др.); сравнительный анализ спектров.

В работе использованы следующие физико-химические методы исследования:

измерение ДПН методом максимального давления в пузырьке; биохимический анализ; корреляционный анализ; потенциометрическое титрование; определение твердости полимерной пленки; измерение спектров поглощения; измерение спектров флуоресценции.

Результаты работы

1. Проведен детальный анализ научно-технической литературы и других материалов, относящихся к методам исследования биологических жидкостей животных и разработаны основы технического обеспечения исследований ДПН.

2. Разработана методика измерения ДПН биологических жидкостей животных. Освоено программное обеспечение (программа ADSA) для анализа полученных тензиограмм.

3. Изучены ДПН и биохимический состав сыворотки крови свиней разного возраста и физиологического состояния.

4. Изучены каталитические свойства липазы из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus в комплексе с синтетическими полимерами (ПАМА, ПСС) и влияние температуры на активность липазы в них.

5. Разработаны методы получения и получены МКС для определения тяжёлых металлов (Hg2+ и Ag+) спектральными методами. Получены спектры поглощения и флуоресценции хемосенсорных материалов на основе таких МКС. Проведён сравнительный анализ спектров. Изготовлен и испытан экспериментальный образец, что подтверждено протоколом испытаний.

6. Разработана программа внедрения результатов НИР в образовательный процесс.

7. Проанализированы и обобщены полученные на третьем этапе результаты НИР.

Рекомендации по внедрению результатов НИР

Разработка методик и создание биохимических коллоидных систем с использованием современных методических и инструментальных достижений позволит решить ряд актуальных фундаментальных проблем в области коллоидной химии и поверхностных явлений, а также прикладных задач биомедицины и экологии, нано- и биотехнологии, ветеринарии и зоотехнии. Биохимические коллоидные системы на основе мембран и тонких пленок позволят создать нанокомпозитные материалы для хемосенсорных устройств биологического контроля катионов биогенных металлов и малых органических молекул в воде и биологических жидкостях.

Все вышеизложенное является неотъемлемой частью научно-технического прогресса в развитии животноводства на современном этапе и будет реализовано в данной НИР на базе достижений коллоидной химии.

Выполнение НИР обеспечит достижение научных результатов мирового уровня в решении многих актуальных фундаментальных и прикладных проблем химии и биологии, медицины и экологии, нано- и биотехнологии, ветеринарии и зоотехнии; позволит завершить создание комплексной системы подготовки высококвалифицированных специалистов (от бакалавров и магистров до кандидатов и докторов наук), обладающих особыми компетенциями по профилю данной НИР, что приведет к формированию эффективного и жизнеспособного научного коллектива.

Область применения полученных результатов.

Результаты проекта должны быть включены в образовательную программу ФГОУ ВПО МГАВМиБ и использоваться в образовательном процессе на базе научного кадрового потенциала, лабораторного и испытательного оборудования научно-образовательного центра ФГОУ ВПО МГАВМиБ, в том числе в процессе проведения настоящих научно-технических работ.

Новые МКС, разработанные на основе полимеров разного типа, могут найти применение в медицине человека и животных, экологии, нано- и биотехнологии и т.д. Полученные на данном этапе результаты являются ключевыми для успешного выполнения всего проекта.

Прогнозные предположения о развитии объекта исследования.

В процессе проведения НИР должны быть разработаны технологические параметры МКС и методические рекомендации по их использованию для различных областей применения, в том числе: экспериментальные образцы; методики испытаний экспериментальных образцов; технологии получения биохимических коллоидных систем.

В ходе выполнения НИР будут получены результаты интеллектуальной деятельности (статьи, патенты и т.д.); учебно-методические комплексы, включающие учебно-методические пособия, указания и рекомендации; примерные и рабочие учебные программы, практикумы по дисциплинам «Биохимия мембран», «Физическая и коллоидная химия», «Кинетика и термодинамика ферментативных реакций», «Энзимология», «Биоэнергетика», «Бионанотехнология» и другие.

СОДЕРЖАНИЕ

Реферат ………………………………………………………………………………….………….	3
3.1 Выбор методов исследований биологических жидкостей; техническое обеспечение и разработка экспериментального оборудования …………………………………...……….	10
3.1.1. Гематологические исследования крови животных	11
3.1.2. Биохимические исследования сыворотки крови животных	14
3.1.2.1. Факторы, влияющие на биохимические показатели сыворотки крови животных	20
3.1.3. Метод сканирующей электронной микроскопии клеток крови.	32
3.1.4. Метод люминесцентной микроскопии крови	35
3.1.5.Реологические исследования сыворотки крови животных	37
3.1.6. Методы измерения поверхностного натяжения сыворотки крови	38
3.2 Разработка методики измерения динамического поверхностного натяжения (ДПН) биологических жидкостей животных и освоение специального программного обеспечения для определения параметров ДПН ……………………………………………..	43
3.2.1. Методика измерения ДПН сыворотки крови животных	38
3.2.2. Анализ тензиограмм с помощью программы ADSA	47
3.3 Изучение состава и свойств биологических жидкостей свиней под воздействием внешних факторов ………………………………………………………………………………..	50
3.3.1. ДПН сыворотки крови свиней в зависимости от возраста и физиологического состояния…………………………………………………………………………………………….	53
3.3.2. Некоторые биохимические показатели сыворотки крови свиней разного возраста и в разном физиологическом состоянии………………………………………………………………	57
3.3.3. Корреляционная зависимость данных ДПН и биохимического анализа сыворотки крови свиней………………………………………………………………………………………...	58
3.4 Изучение каталитических свойств липаз в комплексах с синтетическими полимерами ………………………………………………………………………………………..	62
3.4.1. Влияние полиэлектролитного окружения на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus	63
3.4.2. Влияние температуры на активность липаз в комплексе с синтетическими полиэлектролитами.	67
3.4.2.1. Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиньи в комплексе с полиэлектролитами при увеличении температуры	68
3.4.2.2. Изменение активности липазы из гриба Mucor javanicus в комплексе с полиэлектролитами при увеличении температуры	70
3.5 Разработка методов и получение МКС для определения тяжёлых металлов (Hg2+ и Ag+) спектральными методами. Сравнительный анализ спектров поглощения и флуоресценции хемосенсорных материалов на основе таких МКС………………………..	73
3.5.1. Разработка методов и получение МКС для определения катионов тяжелых металлов (Hg2+ и Ag+).	73
3.5.2. Сравнительный анализ спектров поглощения и флуоресценции хемосенсорных материалов на основе МКС	80
3.6 Разработка программы внедрения результатов НИР в образовательный процесс……………………………………………………………………………………………..	109
3.7 Анализ и обобщение полученных на 3 этапе результатов НИР	117
Список использованных источников………………………………………………………….	118

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

МКС - мембранные коллоидные системы

ФКС – ферментные коллоидные системы

БКС – биохимическая коллоидная система

НКМ - нанокомпозитные материалы

ОМС - оптические молекулярные сенсоры

ЦАБ - целлюлозы ацетатбутират

ПВБ – поливинилбутираль

ПС – полистирол

PSt (англ.) – полистирол

ПВХ – поливинилхлорид

ПСС – полистиролсульфонат

ПАМА - полидиаллилдиметиламмоний хлорид

ЦАГФ целлюлозы ацетатгидрофталат

УФ-область – ультрафиолетовая область

КРС – крупный рогатый скот

СОЭ – скорость оседания эритроцитов

АСТ - аспаратаминотрансфераза

АЛТ - аланинаминотрансфераза

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЩФ – щелочная фосфатаза

КК - креатинкиназа

ЛГ – лютеинизирующий гормон

ГДГ - Глютаматдегидрогеназа

ФСГ – фолликулостимулирующий гормон

ГТГ – гонадотропный гормон

ТТГ - тиреотропный гормон

СТГ – соматотропный гормон

РЭМ - растровый или сканирующий электронный микроскоп

ЭЖК – эстерифицированные жирные кислоты

НЭЖК – неэстерифицированные жирные кислоты

ЛС - лекарственные средства

АГ - антигены

АТ - антитела

ПН - поверхностного натяжения

ДПН - динамического поверхностного натяжения

УЗ - ультразвука

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ССА - свиной сывороточный альбумин

3.1. Выбор методов исследования биологических жидкостей; техническое обеспечение и разработка экспериментального оборудования.

Отв. исполнители: зав. кафедрой ФГОУ ВПО МГАВМиБ, проф. д.х.н, д.б.н. С.Ю. Зайцев; д.х.н. М.С. Царькова, к.б.н. О.С. Белоновская, к.б.н. И.В. Милаёва, асп. Е.Н. Зарудная, студ. Н.А. Довженко, студ. Д.О. Соловьёва

В разные периоды в организме человека и животных классифицируется большое количество различных биологических жидкостей (кровь, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, околоплодные воды, молоко и др.), исследование которых может дать ценную информацию о физиолого-биохимическом состоянии организма. В диагностических исследованиях чаще всего используют венозную и периферическую кровь как биологическую жидкость, объединяющую все органы и ткани и наиболее полно отражающую протекающие в организме процессы.

По сравнению с другими биологическими жидкостями количество крови по отношению к массе тела достаточно велико, у разных видов животных оно составляет от 4 до 10% (таблица 1).

Таблица 1 – Количественное содержание крови по отношению к массе тела в %.

Вид животного	Данные №1 [1]	Данные №2 [2]
Лошадь	-	9,8
КРС	7,7	8,0
Овца	8,0	8,0
Коза	6,2	6,2
Свинья	4,5	-
Кролик	6,2	7-8,5
Курица	8,0	8,1
Утка	-	8,0
Голубь	9,2	9,2
Морская свинка	-	4,1
Собака	7,2	-
Кошка	6,5	-

Больше всего крови в организме лошади (9,8%) и голубя (9,2%), 8% крови по отношению к массе тела у жвачных животных (овца, крупный рогатый скот) и у птиц (курица, утка). У козы по сравнению с овцой содержание крови ниже на 23% и составляет всего 6,2% от массы тела. Низкие значения этого показателя у плотоядных (собака 7,2%, кошка 6,5%), только у некоторых пород собак по данным Голикова А.Н. количество крови может достигать 9% от массы тела. В 2 раза ниже, чем у других животных количество крови по отношению к массе тела у свиньи и морской свинки.

Кровь представляет собой коллоидную систему и состоит из форменных элементов (клеток) и жидкой части (плазмы). Методы исследования цельной крови называются гематологическими методами исследованиями, а жидкой части – биохимическими.

3.1.1. Гематологические методы исследования крови животных.

Гематология является наукой, занимающейся самым распространенным скрининговым неспецифическим методом исследования цельной крови. Она изучает качественный и количественный состава компонентов крови и включает определение: количества и качественных характеристик эритроцитов; содержание гемоглобина в эритроцитах; определение отношения объема плазмы крови и форменных элементов крови (гематокрит); содержание тромбоцитов; содержание общего количества лейкоцитов и процентное соотношения их отдельных форм (лейкоцитарная формула); исследование скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Изменение гематологических показателей происходит при воспалительных процессах, инфекционных, гематологических и др. заболеваниях.

Гематологические показатели существенно отличаются в зависимости от возраста и породы животного (таблица 2). Удельный вес крови может изменяться у лошадей от 1,040 до 1,064 в зависимости от направления использования и породы, у молодых (до 3 лет) животных он может быть ниже - 1,038. Значения рН крови для всех лошадей находятся в слабощелочной области (рН=7,4) и изменяются незначительно. Количество эритроцитов больше у лошадей, имеющих повышенную физическую нагрузку и интенсивно подвергающихся тренингу – скаковых (выше на 10-70%) и рысаков (выше на 15-40%). Тяжеловозы и неулучшенные лошади имеют средние значения этого показателя близкие к содержанию эритроцитов в крови жеребят. Диаметр эритроцитов у всех групп лошадей отличается незначительно и равен 4,5-5,8 мкм. Максимальные значения РОЭ (реакция оседания эритроцитов) выше у жеребят при времени оседания до 30 минут, а к 60 минутам становятся такими же, как у взрослых животных.

Содержание гемоглобина в крови жеребят значительно (на 15-25%) ниже, чем у взрослых животных. Максимальные значения (выше на 10-20%) у рысаков и скаковых лошадей. Максимальные и минимальные значения цветного показателя 0,7 и 1,3 получены также для скаковых лошадей, у остальных групп животных они отличаются незначительно 0,93-1,08. Больше всего лейкоцитов в крови жеребят, этот показатель у них выше на 3-4% по сравнению с взрослыми животными.

Таблица 2- Гематологические показатели крови лошадей.

Показатели	Значения	Автор
Общее количество крови	9,7-9,9	Викторов К.Р., 1935
Удельный вес крови Жеребят от 8 мес. до 3 лет	1,038-1,063	Ергаев М., Хрусталёв С., Сидоров В.П., 1936
Взрослые рысаки	1,046-1,064
Тяжеловозы	1,040-1,054
Неулучшенные лошади	1,045-1,055
рН крови	7,3-7,5	Кудрявцев А., 1944
Количество эритроцитов в 1 мм3 (в тыс.) Жеребята	6250-9550	Хрусталёв С., Сидоров В.П., 1932
Взрослые рысаки	7103-11070
Тяжеловозы	6800-8719
Неулучшенные лошади	6075-9497
Скаковые	8000-12000	Неводов О., 1927
Диаметр эритроцита (в микронах) Рысаки	4,6-5,5	Хрусталёв С., Сидоров В.П., 1932
Тяжеловозы	4,5-5,8
Неулучшенные лошади	4,6-5,8
РОЭ У жеребят через 15 мин	21,0-66,0	Ергаев М.. 1930
30 мин	37,0-71,5
60 мин	55,0-75,0
У взрослых лошадей через 15 мин	21,0-56,0	Васильев А.В., 1948
30 мин	37-61
45 мин	53-72
60 мин	55-75
2 часа	63,5-75,5
24 часа	63-116
Гемоглобин по Сали (в%) Жеребята	42-67	Ергаев М, Хрусталёв С, Сидоров В.П., 1936
Рысаки	67-102
Тяжеловозы	67-87
Неулучшенные лошади	60-90
Скаковые	70-90	Неводов О., 1927
Цветной показатель Рысаки	0,93-1,05	Хрусталёв С., Сидоров В.П., 1932
Тяжеловозы	0,93-1,08
Неулучшенные лошади	0,95-1,07
Скаковые	0,7-1,3	Неводов О., 1927
Количество лейкоцитов в 1 мм3 Жеребята	6800-14000	Ергаев М, Хрусталёв С., Сидоров В.П., 1936
Взрослые рысаки	8000-10362
Тяжеловозы	7250-10013
Неулучшенные лошади	7150-11562

Таким образом, у лошадей можно определить следующие средние значения гематологических показателей: общее количество крови 9,8, удельный вес крови 1,038- 1,064 (1,051), рН крови 7,4, количество эритроцитов 6250-12000 (9125) тыс., диаметр эритроцитов 4,5-5,8 (5,15) мкм, РОЭ через 15 мин. 21,0-56,0 (38,5), 30 мин. 37,0-61,0 (49,0), 60 мин 55,0-75,0 (65,0), гемоглобин 42-102 (72,0) %, цветной показатель 0,7-1,3 (1,0), количество лейкоцитов 6800-14000 (10400).

Таблица 3 - Содержание клеток крови у разных видов животных [25].

Вид животных	Эритроциты, млн/мкл	Лейкоциты, тыс/мкл	Тромбоциты, тыс/мкл
КРС	5,0-7,5	4,5-12,0	260,0-700,0
Буйволы	6,5-9,0	5,0-9,0	-
Овцы	7,0-12,0	6,0-14,0	250,0-500,0
Козы	12,0-17,0	6,0-12,0	250,0-500,0
Свиньи	6,0-7,5	8,0-16,0	180,0-300,0
Лошади	6,0-9,0	7,0-12,0	200,0-500,0
Ослы	5,0-7,0	7,0-9,0	200,0-500,0
Верблюды	9,5-12,0	6,0-10,0	200,0-400,0
Олени северные	6,5-8,5	5,0-7,0	200,0-500,0
Собаки	5,2-8,4	8,5-10,5	250,0-550,0
Кошки	6,6-9,4	10,0-20,0	100,0-500,0
Песцы	4,9-11,4	3,5-14,0	215,0-525,0
Соболя	9,0-13,6	4,0-10,0	150,0-400,0
Норки	7,7-13,1	2,5-10,5	190,0-380,0
Кролики	4,5-7,5	6,5-9,5	125,0-250,0
Куры	3,0-4,0	20,0-40,0.	32,0-100,0
Утки	3,0-4,5	20,0-40,0	35,0-80,0
Гуси	2,5-3,5	20,0-30,0	35,0-80,0
Индейки	2,5-3,5	20,0-40,0	30,0-70,0
Цесарки	3,0-4,2	20,0-40,0	50,0-90,0
Перепёлки	3;2-4,4	16,0-29,9	ср. 132,0
Голуби	3,0-1,0	10,0-30,0	10,0-35,6
Обезьяны	5,0-6,0.	6,0-9,0	100,0-400,0
Морские свинки	4,5-6,0	7,0-13,0	80,0-160,0
Мыши белые	8,0-11,0	6,0-13,0	200,0-400,0
Крысы белые	5,5-11,0	6,0-23,0	200,0-600,0
Лягушки	0,3-0,6	2,0-20,0	100,0-300,0

В соотношении разных групп клеток крови есть видовые особенности (таблица 3). Больше всего эритроцитов в крови коз (выше на 40-60%), меньше всего у морских свинок (ниже на 20-30%), у птиц и земноводных количество эритроцитов ниже на 20-70%, чем у млекопитающих. Размеры эритроцитов тоже отличаются в широких пределах. Самые большие в диаметре эритроциты кур, а самые маленькие – овец. Толщина изменяется не так значительно от 1,6 у коз до 2,7 у кур (таблица 4). Максимальное количество лейкоцитов содержится в крови кошек (выше в 2 раза), минимальное – в крови соболей (ниже на 20-40%), у птиц содержание лейкоцитов выше, чем у млекопитающих в 3-4 раза. Меньше всего тромбоцитов у голубей. Изменения количества тромбоцитов по видам животных не так заметны, как для других клеток крови, но у птиц тромбоцитов на порядок меньше, чем у млекопитающих.

Таким образом, количество клеток крови и их размеры существенно изменяется в зависимости от вида и класса, к которому относится животное.

Таблица 4 - Основные размеры эритроцитов здоровых животных [25].

Вид животных	Размеры эритроцита
	Диаметр, мкм	Толщина, мкм	Поверхность, мкм 2	Объем мкм 3/фл
КРС	4,8-6,4	2,2	82,0	56,0
Овцы	4,3-5,2	1,8	60,5	31,0
Свиньи	5,2-6,0	2,1	83,4	58,0
Лошади	4,0-7,5	1,9	68,6	50,0
Собаки	5,0-9,0	1,8	82,7	70,0
Кролики	5,5-7,0	1,7	81, 0	68,0
Куры	6,0-11,0	2,7	182,0	127,0
Козы	3,9-4,8	1,6	53,0	25,0

3.1.2. Биохимические методы исследования сыворотки крови животных.

Биохимические исследования получили широкое распространение ещё в первой половине ХХ века и на сегодняшний день являются наиболее популярным методом лабораторной диагностики общего состояния организма людей и животных. Они позволяют получать данные об изменении физиолого-биохимического состава сыворотки крови, выявлять изменение гормонального фона, недостаток макро-, микроэлементов и др.

Рисунок 1 - Внешний вид биохимического анализатора CHEM-7.

Для биохимического анализа можно использовать полуавтоматический биохимический анализатор CHEM-7 (Erba Mannheim, Германия), он позволяет выполнять как стандартные биохимические исследования (кинетика, по двум точкам, конечная точка), так и турбодиметрические и коагулологические анализы и дает возможность выбора из 10-ти типов расчёта результатов (абсорбция, линейная и нелинейная калибровка по 1 и 2-ум точкам, многоточечная калибровка, кинетика и коагулология). Во время проведения стандартных исследований измеряет оптическую плотность (ОП) на выбранной длине волны и рассчитывает значение концентрации путем умножения ОП на рассчитанный фактор. Фактор определяется на основании закона Бугера-Ламберта-Бера, согласно которому оптическая плотность определяется как с использованием значения ОП одного калибратора с известной концентрацией. Полученные значения фактора и рассчитанной концентрации выводятся на дисплей прибора и экран компьютера для последующего использования.

В литературе в большом количестве представлены данные биохимического анализа, но у разных авторов наблюдаются значительные колебания нормативных значений для животных. Это, по-видимому, связано с влиянием на биохимический состав крови таких факторов как порода, содержание, кормление, эксплуатация и др. Поэтому, при исследовании биохимических показателей большое значение уделяется не только количественным, но и относительным значениям для данной группы животных, а также комплексному анализу значений, полученных для отдельных биохимических показателей.

Химический состав сыворотки крови очень сложен. Из неорганических веществ в сыворотке содержится около 90% воды и около 1% соли (таблица 5).

Таблица 5 - Химический состав крови в % [15].

Показатели	Свиньи		КРС		Лошади		Овцы	Козы	Собаки
	Тел. 43,6	Сыв. 56,4	Тел. 32,6	Сыв. 67,4	Тел. 39,8	Сыв. 60,2
Вода	27,2	51,8	19,3	61,6	24,4	55,1	91,7	90,8	92,4
Тв. остаток	16,3	4,6	13,10	0,58	15,4	0,5	8,3	9,2	7,6
Гемоглобин	14,2	-	2,09	-	12,6	-	-	-	-
Белок	8,4	3,8		0,48	0,2	0,43	6,8	7,8	6,0
Сахар		0,07	0,1	0,07		0,09	0,1	0,1	0,2
Холестерин	0,02	0,02	0,1	0,08	0,03	0,03	0,09	0,1	0,07
Лецитин	0,15	0,08	-	0,1	0,2	0,1	0,2	0,17	0,2
Жир	-	0,1	-	0,06		0,05	0,1	0,06	0,1
Жирн. к-ты	0,003	0,04	0,002		0,002	0,036	0,07	0,06	0,1
Фос. к-та из нукл. к-ты	0,004	0,001	0,07	0,0009	0,005	0,001	0,007	0,007	0,008
Натрий		0,02	0,02	0,3	-	0,3	0,4	0,4	0,4
Калий	0,22	0,01	0,05	0,02	0,1	0,02	0,03	0,02	0,02
Железо	0,07	-	-	-	0,6	-	-	-	-
Кальций	-	0,007	0,0006	0,008	-	0,007	0,01	0,01	0,01
Магний	0,006	0,002	0,06	0,003	0,004	0,003	0,004	0,004	0,004
Хлор	0,06	0,2	0,02	0,24	0,02	0,02	0,4	0,4	0,4
Фосф. к-та	0,9	0,01	0,01	0,016	0,09	0,02	-	-	-
Неорг.фосф. к-та	0,07	0,03	0,006	0,006	0,08	0,005	0,02	0,02	0,02

Главное место среди солей принадлежит хлориду натрия, содержание натрия в сыворотке крови 139,2-148,7 ммоль/л, а хлора – 109-112 ммоль/л. Это в 10-15 раз больше, чем содержание других солей. K, Ca и Mg находятся в крови в форме хлоридов, фосфатов и карбонатов. Концентрации этих солей в сыворотке крови животных разных видов отличается незначительно, а их соотношение поддерживается постоянным (таблица 6, 7).

Таблица 6 – Содержание минеральных веществ в сыворотке крови животных [18].

Вид животного	Натрий, ммоль/л	Калий, ммоль/л	Кальций, ммоль/л	Магний, ммоль/л	Хлор, ммоль/л
КРС	139,2	4,3	2,5	1,2	112
Лошадь	139,2	4,6	2,5	1,2	109
Свиньи	145,7	5,1	2,5	1,2	112
Овцы	139,2	4,3	2,5	1,4	112

Таблица 7 – Содержание железа, цинка и меди в крови коров [10].

Объект исследований	Железо, мкмоль/л	Цинк, мкмоль/л	Медь, мкмоль/л
Цельная кровь	6708	5460	11,7
Сыворотки крови	134	131	-
Лейкоциты	71,7	120,1	-

В плазме крови до 7-8% всех веществ приходится на белки, которых содержится несколько десятков видов: сывороточный альбумин, различные типы глобулинов, фибриноген и другие (таблица 8).

Таблица 8 – Белки сыворотки крови животных [26].

Показатели, г/л	КРС	Овцы	Свиньи
Преальбумин	0,08-0,3	-	-
Альбумин	18,0-46,0	15,0-55,0	20,0-78,0
Церулоплазмин	1,3-4,5
Фибриноген (плазма)	4,0-7,0	2,5-4,5	3,5-6,5
-липопротеид	3,2-9,6	-	-
Иммуноглобулин G	3,4-26,5	10,8-30	24,0
Иммуноглобулин G1	10,5-11,6	15,4-21,9	14,0
Иммуноглобулин G2	7,9	5,6-6,8	2,4
Иммуноглобулин А	0,06-0,8	0,05-1,4	2,9
Иммуноглобулин М	0,9-3,2	0,8-8,8	62,0-94,0
Общий белок	60,0-89,0	42,0-97,0	35,0-50,0

Все белки плазмы делятся на группы: ранее предлагалось деление на альбумины и глобулины. Соотношение между ними (белковый коэффициент) является величиной постоянной для данного вида и отличается у животных разных видов (таблица 9). Следует отметить различия в данные о содержании этих белков в сыворотке крови (таблица 9 и 10). У свиней, овец, коз, собак, кроликов и человека белковый коэффициент больше единицы, а у лошадей и крупного рогатого скота и кур – меньше единицы.

Таблица 9 – Соотношение альбуминов и глобулинов [15].

Показатели	КРС	Свиньи	Лошади	Собаки	Куры
Альбумины, г/л	33,3	44,2	28,0	31,7	12,4
Глобулины, г/л	41,7	29,8	47,9	22,6	21,8

По содержанию альбуминов и глобулинов в плазме крови значительные отличия наблюдаются у птиц по сравнению с млекопитающими животными. В крови кур количество альбуминов всего 23 г/л, что в среднем на 45% ниже, чем у млекопитающих, а содержание глобулинов в 3-5 раз выше, чем у других видов животных (таблица 10).

Таблица 10 – Среднее количество альбуминов и глобулинов в плазме крови животных разного вида [14].

Вид животного	Альбумины, г/л	Глобулины, г/л
Лошади	27	46
Крупный рогатый скот	33	41
Свиньи	44	39
Овцы	31	23
Козы	39	20
Собаки	31	72
Куры	23	128

По отношению к общему белку сыворотки крови у человека количество,, -глобулинов почти равное, а у животных – количество -глобулинов выше и может превышать содержание других фракций более чем в 3 раза (овцы в 3,4 раза, морские свинки в 2,6 раза) исключение составляют собаки, в сыворотке крови которых содержание –глобулинов выше почти в 2 раза (таблица 11).

Таблица 11 – Количество альбуминов и глобулинов в % к общему белку сыворотки крови.

Вид животного	Данные №1[1]					Данные №2[11]
	Альбу-мины	Глобулины			Альбу-мины		Глобулины
							общее
Человек	61	14	10	15	-		-	-	-	-
Лошадь	40	16	29	21	36		64	20	10	34
КРС	44	14	11	31	42		58	13	12	33
Овца	42	18	9	31	53		47	18	18	21
Свинья	45	17	18	20	43		57	16	16	25
Кролик	60	7	12	21	-		-	-	-	-
Мор. свинка	56	15	8	21	-		-	-	-	-
Собака	-	-	-	-	60		40	11	19	10

Из других азотсодержащих веществ в крови находятся продукты обмена белков (мочевина до 0,1%, мочевая кислота, пуриновые основания, креатинин, аминокислоты и др.). Количество этих соединений в сыворотке крови зависит от интенсивности процессов диссимиляции, происходящих в организме (таблица 12).

Таблица 12 – Небелковый азот плазмы крови [1].

Вид животного	Показатели, ммоль/л
Лошади	11-17,9
КРС	11-21,4
Овцы	8,9-16,1
Свиньи	8,9-14,3
Собаки	7,3-16,1
Птица	8,9-25

Содержание полипептидного азота, мочевины, мочевой кислоты, креатина на 1,5-3% выше в сыворотке крови свиней и лошадей, что связано, по-видимому, с активными процессами ассимиляции и диссимиляции происходящими у них в организме в связи с интенсивным ростом и физической нагрузкой соответственно (таблица 13).

Таблица 13 – Небелковый азот и его фракции в сыворотке крови животных [26].

Показатели	КРС	Овцы	Свиньи	Лошади
Остаточный азот, г/л	0,2-0,87	0,2-0,51	0,2-0,45	0,2-0,45
Полипептидный азот, г/л	0,035-0,045	0,03-0,04	0,05-0,08	0,05-0,08
Мочевина, ммоль/л	0,83-6,91	1,33-7,14	1,84-9,46	1,84-9,46
Мочевая кислота, ммоль/л	0,00-0,12	0,006-0,11	0,006-0,28	0,006-0,28
Креатин, ммоль/л	0,07-0,12	0,07-0,13	0,12-0,16	0,12-0,16
Креатинин, ммоль/л	0,04-0,18	0,05-0,12	0,04-0,06	0,04-0,06
Аммиак, ммоль/л	0,06-0,12	-	-	-
Аминоазот, г/л	0,04-0,08	0,04-0,06	0,06-0,08	0,06-0,08

Кроме всех веществ, перечисленных выше, в крови находятся гормоны (адреналин, серкетин и др.), ферменты (амилаза, каталаза и др.), иммунные вещества (антитела, лизины, аглютинины, преципитины и др.), витамины, пигменты (таблица 14, 15).

Содержание ферментов значительно варьируется у животных разного вида. Максимальное количество АСТ в сыворотке крови у лошадей в 3-5 раз выше, чем у других видов животных и может достигать уровня 6151,2 нкат/л, количество АСТ в сыворотке крови свиней – в 10-15 раз ниже. Обратная картина наблюдается с количеством АЛТ у лошадей оно минимальное вплоть до нуля, а у свиней максимальное. Содержание ЛДГ может изменяться в широких пределах, самое низкое значение 0,75 мккат/л зафиксировано в сыворотке крови овец, а самое высокое (21,4 мккат/л) у крс. Фермент ГДГ может вообще отсутствовать в сыворотке крови у всех видов животных, при его наличии максимальные наблюдаются в сыворотке крови крс, затем по убывающей можно расположить овец, лошадей и свиней. Сорбитолдегидрогеназа в большом количестве (до 10 раз больше) находится в крови овец, минимальные значения этого показателя у лошадей и свиней.

Таблица 14 – Ферменты сыворотки крови животных [26].

Показатели	КРС	Овцы	Свиньи	Лошади
АСТ, нкат/л	183,4-2667	108,4-2050,4	16,67-816,8	200,0-6151,2
АЛТ, нкат/л	21,7-1000,2	83,4-183,4	83,4-1266,9	0,0-400,1
Альдолаза, нкат/л	45,0-1502,0	-	-	48,3-450,1
ЛДГ, мккат/л	1,98-21,4	0,75-9,7	4,25-11,2	1,78-5,42
ГДГ, нкат/л	0,0-96,7	0,0-76,7	0,0-50,0	0,0-59,3
Сорбитолдегидрогеназа, нкат/л	1,33-180,0	0,0-800,1	3,33-30,0	0,0-80,0
Изоцитратдегидрогеназа, нкат/л	15,0-541,7	-	-	83,4-333,4
Малатдегидрогеназа, мккат/л	1,07-14,8	-	-	-
ЩФ, нкат/л	0,0-2733,8	33,3-4367,5	333,4-1050,2	10,0-6334,6
-глутамилтрансфераза, нкат/л	111,7-483,4	766,8-1033,5	316,8-616,8	0,0-1316,9
КК, нкат/л	0,0-1150,2	-	-	0,0-3217,3
КК активированная, мккат/л	0,0-6,78	0,65-1,63	3,68-29,1	1,92-7,23
Лейцинаминопептидаза, нкат/л	226,7-353,4	-	-	-
Орнитинкарбомоилтрансфераза, нкат/л	17,3-26,0	0,0-233,4	-	-
-амилаза, нкат/л	-	-	-	4084,1-5384,4
Лейцинаминопептидаза, нкат/л	-	-	-	16,67-83,3

Некоторые ферменты специфичны только для сыворотки крови животных отдельных видов животных, так, например, изоцитратдегидрогеназа и КК содержится в сыворотке крови крс и лошадей, малатдегидрогеназа и лейцинаминопептидаза в сыворотке крови лошадей, орнатинкарбомоилтрансфераза в сыворотке крови жвачных, -амилаза, лейцинаминопептидаза в сыворотке крови лошадей.

Таблица 15-Ферменты и метаболиты в сыворотке крови лошадей «полукровных»

пород [20].

Показатели	Лошади
Каталаза, нкат/мкл	138,8-146,4
Пировиноградная кислота, мкмоль/л	66,68-68,46
Альдолаза, МЕ/л	11,64-11,99
Молочная кислота, ммоль/л	0,98-1,01

По содержанию витаминов в сыворотке крови у животных разных видов тоже наблюдаются существенные различия. Больше всего каротина и витамина А содержится в сыворотке крови КРС. Меньше всего витамина Е в сыворотке крови овец (таблица 16).

Таблица 16 – Витамины сыворотки крови животных [26].

Показатели	крс	Овцы	Свиньи	Лошади
Витамин А, мкмоль/л	0,46-6,3	0,25-4,2	0,26-2,41	0,31-0,56
Каротин	0,95-66,5	0,0-0,38	0,0-0,19	0,38-13,3
Витамин Е	3,0-34,5	1,38	2,3-36,0	4,6-25,3
Витамин D	0,1-0,55	0,005-0,077	0,012-0,19
Витамин С, ммоль/л	0,015-0,086	0,023-0,046	0,011-0,09	0,011-0,085
Витамин В1, мкмоль/л	0,15-0,24	-	0,22-0,89	0,067-0,19
Витамин В2	0,084-0,14	-	0,53-1,06	-
Витамин В4, ммль/л	0,33-1,35	-	24,3-64,8	-
Витамин Вс, мкмоль/л	0,04-0,51	-	0,05-0,45	-
Витамин В12, нмоль/л	13,3-31,1	0,37-3,33	0,069	-
Витамин В3, мкмоль/л	-	1,89	1,58-4,77	-