На правах рукописи
ВОРОНКОВ АНДРЕЙ ВЛАДИСЛАВОВИЧ
ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ
14.03.06. фармакология, клиническая фармакология
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации
на соискание ученой степени доктора медицинских наук
ВОЛГОГРАД 2011
Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации»
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор
Тюренков Иван Николаевич
Официальные оппоненты: ЗДН РФ, доктор медицинских наук,
профессор Р.С. Мирзоян
ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор К.М. Резников
доктор медицинских наук,
профессор В.А. Косолапов
Ведущая организация: «НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН» г.Санкт- Петербург
Защита состоится «6» октября 2011 г. в 1100 часов
на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской федерации» (Россия, 400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской федерации» (400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).
Автореферат разослан «_____»_______________2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук А.Р. Бабаева
Актуальность темы
В настоящее время считается общепризнанным, что в основе развития сердечно–сосудистой патологии различного генеза важную роль играет дисфункция эндотелия (ЭД) (Петрищев Н.Н., 2003; Ярек-Мартынова И.Р., Шестакова М.В., 2011; Ding H., 2010; Potenza M.A., 2010; Maltais S., et all., 2011). Эндотелий рассматривается как самостоятельная мишень терапевтического воздействия для коррекции различных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Исходя из этого, актуальной проблемой экспериментальной и клинической фармакологии является поиск веществ с эндотелиопротекторным действием (ЭПД) как среди известных препаратов, так и новых соединений (Карпов Ю.А. 2010).
К настоящему времени установлено ЭПД препаратов, уменьшающих влияние РААС и СНС на сердечно-сосудистую систему (иАПФ, b-блокаторы и т.д.); снижающих уровень ХСобщ, ХСЛПНП, ХСЛПОНП (особенно статины); регулирующих работу Ca2+ каналов (блокаторы Ca каналов), что очевидно связано, как с прямыми эндотелий зависимыми механизмами действия так и их опосредованным комплексным фармакологическим влиянием (Luscher T.F., Noll G., 1995; Aikawa M., 2010; Egashira K., 2010; Jorge P.A., 2010). Многие из проведенных экспериментальных и клинических исследований по изучению ЭПД сердечно-сосудистых средств достаточно противоречивы и не дают однозначного ответа по направленности и выраженности действия препаратов из этих фармакологических групп. Это обусловлено тем, что многие как экспериментальные, так и клинические исследования выполнены с использованием различных методов оценки функционального состояния эндотелия (биохимических, функциональных, инвазивных, неинвазивных и т.д.), клинические же работы, кроме этого, отличаются выбором больных, различных по возрасту, тяжести заболевания, сопутствующим патологиям, протоколам исследований.
Можно предполагать, что вещества с ГАМК–ергической активностью ограничивающие симпатические влияния на сердце и сосуды, уменьшающие активность РААС, обладающие при этом антиоксидантной и антигипоксантной активностью (Перфилова В.Н., 2009; Тюренков И.Н., 2008; Narahashi T., 1999; Harrison 2000), могут улучшать функцию эндотелия (Недвицкий П.И., 2000; Ishide T., 2005). Однако изучение влияния ГАМК–ергических средств на эндотелий практически не выполнялось.
Учитывая важную роль в развитии ЭД оксидативного стресса, можно предположить, что и антиоксиданты также могут воздействовать на различные звенья развития ЭД: на систему синтеза и биодоступности NO, гемореологические параметры крови, липидный и углеводный обмен, воспаление, пролиферацию (Насибуллин Р.С.,2010; Yamamoto, M.2008; Schiffrin E. L., 2010; Wallace T. C., 2011). Поэтому поиск высоко активных эндотелиопротекторов среди антиоксидантов, в том числе и флавоноидов, вполне оправдан.
На основании изложенного представилось целесообразным провести комплексное сравнительное изучение ЭПД ряда сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, лекарственных средств, обладающих антиоксидантной активностью в том числе и флавоноидов в условиях ЭД различного генеза.
Целью исследования является разработка методологии поиска веществ с эндотелиопротекторным действием и проведение сравнительного изучения эндотелиотропных свойств, сердечно-сосудистых средств и веществ с различными механизмами действия.
Задачи исследования
- Провести тестирование эндотелия различных сосудистых регионов в условиях нормы и экспериментальной патологии (при недостаточности половых гормонов, экспериментальном сахарном диабете, хирургической травме).
- Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях ЭСД и НПГ.
- Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия, гемореологию и основные параметры гемостаза в условиях ЭСД и НПГ.
- Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на углеводный, липидный и гормональный статус животных с ЭСД и НПГ.
- Изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированныхпроизводных ГАМК, флавоноидов и препаратов сравнения на противовоспалительную функцию эндотелия при ЭСД и НПГ.
- Дать морфологическую оценку состояния эндотелия при ЭСД и НПГ и изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения на морфологическую структуру эндотелия.
- Изучить механизм эндотелиопротективного действия наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения у животных с ЭСД и НПГ с помощью иммуногистохимического исследования, с оценкой уровня экспрессии e-NOS, эндотелина-1, каспазы -3, nF-kB, рецепторов TREIL.
- На основании сравнительного изучения влияния на эндотелиальную функцию средств из различных фармакологических групп в условиях нормы и экспериментальной патологии, дать оценку методологии к подходам оценки эндотелиальной функции/дисфункции и эндотелиопротективного действия фармакологически активных соединений.
Новизна исследования
Впервые разработан комплексный подход изучения эндотелиотропных эффектов биологически активных веществ, обоснована возможность моделирования эндотелиальной дисфункции с помощью стрептозотоцин индуцированного сахарного диабета и экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов.
Впервые выполнено сравнительное комплексное изучение влияния представителей различных фармакологических групп, среди сердечно-сосудистых средств, в сопоставимых условиях,: -адреноблокаторов (небиволол, бисопролол), ингибиторов АПФ (лизиноприл), антагонистов кальциевых каналов (нифедипин), статинов (симвастатин), гипариноида сулодексида, ряда производных ГАМК (фенибут, пикамилон, РГПУ-189, РГПУ-147), веществ, обладающих антиоксидантной активностью (мексидол, предуктал, дибикор), а также флавоноидов (гесперидин, диосмин, кверцетин и флавицин), на вазодилатирующую, антитромботическую функции, на углеводный, липидный обмен и гормональный статус при ЭСД и НПГ. Показано их неоднозначное эндотелиопротекторное действие.
Впервые выявлена высокая эндотелиопротективная активность и комплексно изучено влияние нового производного ГАМК – соединения РГПУ-189 и флавоноида - флавицина на вазодилатирующую, антитромботическую, противовоспалительную и пролиферативную функции эндотелия при ЭСД и НПГ.
По выраженности эндотелиопротекторного действия РГПУ-189 и флавицин превосходят небилет, конкор, мексидол, предуктал, дибикор, нифедипин, фенибут, пикамилон, производное ГАМК - РГПУ-147 и флавоноиды, приближаясь по выраженности действия к Сулодексиду.
Впервые установлено усиление активности е-NOS, снижение эндотелина-1, а так же снижение экспрессии основных генетических маркеров запускающих апоптоз (каспаза-3, «доменов смерти», NF-kB) у животных с ЭСД и НПГ, под влиянием соединения РГПУ-189и флавоноида флавицина, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия.
Научно-практическая ценность работы
Используемый комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки степени ЭД (вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования NO системы, дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ.
Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, позволит более дифференцированно их использовать при лечении больных с различной кардиологической патологией, а на основе флавоноидов и производных ГАМК – разработать лекарственные средства для лечения ЭД различного генеза.
Полученные данные об эндотелиопротективном действии производных ГАМК и флавоноидов свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки на основе соединения РГПУ-189 и флавицина эндотелиопротекторов для применения в качестве средств профилактики и лечения сосудистых осложнений различного генеза, обусловленных ЭД.
Реализация результатов.
На основании данных диссертационного исследования разработана дальнейшая программа целенаправленного поиска веществ с сердечно-сосудистыми и эндотелиотропными свойствами среди структурных аналогов ГАМК (кафедра органической химии Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И.Герцена (г. Санкт-Петербург)), предложен план поиска веществ флавоновой природы для профилактики и лечения сосудистых осложнений, обусловленных СД и НПГ (Пятигорская фармацевтическая академия).
Разработанная комплексная морфофункциональная система поиска и доклинического фармакологического изучения веществ с эндотелиопртективной активностью используется в научно-исследовательской работе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета (ВолгГМУ), НИИ фармакологии ВолгГМУ, кафедрах фармакологии ВолгГМУ и Пятигорской государственной фармацевтической академии. Полученные в ходе исследования результаты оформлены в виде методического пособия «Новая медицинская технология: Использование высокочастотной ультразвуковой допплерографии для изучения влияния фармакологических веществ на региональное кровообращение и эндотелиальную функцию (подписано в печать 04.2010)
Полученные результаты о эндотелиопротекторных свойствах новых производных гамма-аминомасляной кислоты и флавоноидов, а так же сравнительная эндотелиопротекторная активность сердечно-сосудистых средств и веществ, обладающих антиоксидантной активностью, включены в раздел учебных программ курса фармакологии на кафедрах фармакологии и биофармации ФУВ, фармакологии, клинической фармакологии и интенсивной терапии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре биохимии и микробиологии, кафедре органической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, кафедрах фармакологии Воронежской медицинской академии, Ростовского государственного медицинского университета, Белгородского государственного университета. Материалы работы оформлены в виде информационных писем “Изучение эндотелиопротекторных свойств флавоноидов при экспериментальном сахарном диабете”, «Эндотелиопротективные свойства производных ГАМК при недостаточности половых гормонов» которые используются в учебном процессе и научной работе кафедры фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств НИИ фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010). По материалам настоящей работы получен 1 патент Российской Федерации на изобретение.
Положения, выносимые на защиту:
- Стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет в большей степени, а экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводят к выраженным нарушениям всех функций эндотелия. Операционная травма так же приводит к эндотелиальным нарушениям, однако они носят кратковременный и обратимый характер. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные патологические модели для моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте.
- Используемый в работе комплексный морфо-функциональный подход к изучению вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия, позволяет оценить стабильность и мощность функционирования NO системы и выраженность ЭД, а также может использоваться для изучения эндотелиотропных эффектов исследуемых веществ и различных патологических воздействий на эндотелий.
- Сердечно-сосудистые средства, гепариноид – сулодексид, производные ГАМК, флавоноиды и вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, в разной степени выраженности проявляют эндотелиопротективную активность, что проявляется в улучшении вазодилатирующей, антитромботической функций эндотелия. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия все исследуемые соединения можно расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) > Диротон Симвагексал Небилет > РГПУ-189 > Флавицин РГПУ-147 > Кверцетин Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин Фенибут Дибикор, а по степени влияния на антитромботическую функцию эндотелия изучаемые соединения можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) Симвагексал РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147 Флавицин > Кверцетин Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут Гесперидин Дибикор > Диосмин Предуктал > Пикамилон.
- РГПУ-189 и флавицин выражено улучшают противовоспалительную, антипролиферативную функции эндотелия, уменьшают метаболические нарушения у животных с ЭСД и НПГ (снижают гипергликемию, гиперхолестеринемию, индекс атерогенности), в большей степени эти эффекты выражены у флавицина. Эндотелиопротективное действие отмеченных веществ очевидно обусловлено угнетением экспрессии маркеров апоптоза (TRАIL, каспаза-3, nF-kB), снижением эндотелина-1 и усилением активности е-NOS.
- Вессел Дуэ Ф по совокупности всех проведенных исследований оказал наиболее выраженное эндотелиопротекторное действие по сравнению со всеми исследуемыми веществами. Полученные результаты позволяют рекомендовать Вессел Дуэ Ф в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндотелиотропных эффектов изучаемых лекарственных препаратов.
- Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и производных ГАМК на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза, свидетельствуют о целесообразности применения Весел Дуэ Ф, диротона, симваГЕКСАЛА, небилета, мексидола, для комплексной терапии сердечно-сосудистых заболеваний, профилактики и лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и НПГ. Результаты исследований позволяют рекомендовать проведение дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их основе новых препаратов с эндотелиопротекторной активностью.
- Проведенное тестирование вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожно мышечная область) позволяет говорить о том, что направленность эндотелиального ответа одинакова во всех областях, но выраженность разная. Результаты исследования дают возможность экстраполировать полученные в ходе эксперимента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой области и на другие регионы с разным типом эндотелия.
Апробация работы
Материалы работы докладывались и обсуждались на 5-ой научно-практической конференции «Методы исследования регионального кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2005); на II международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007); на 13 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007); Научно-практической конференции «Диагностика и коррекция нарушений регионального кровообращения и микроциркуляции в клинической практики» (Саратов, 2008); на 14 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2008); на VIII съезде кардиологов южного федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Новые подходы и перспективы» (Ростов-на-Дону, 2009); 56-ой региональной научно-практической конференции Волгоградского государственного медицинского университета «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранении волгоградской области» (Волгоград 2009); Научно практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); II Всероссийском научно-практическом семинаре “Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии” (Волгоград, 2010). По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе 21 работ в журналах, рекомендуемых ВАК, получен 1 патент на изобретение №2374699 от 27 ноября 2009 года.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 493 источника, из них 189 отечественных и 304 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста, содержит таблиц –27, рисунков –55, схем – 1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнено на 1090 крысах самках и самцах, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Животные были получены из питомников «Столбовая», «Рапполово». Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе доклинических исследований ВолгГМУ (протокол № 54-2007 от 28.04.2007).
Исследование было проведено с помощью комплексного морфо-функционального подхода, используемого для оценки эндотелиальной дисфункции (ЭД) и эндотелиотропного действия (ЭПД) веществ. Комплексный морфо-функциональный подход включал в себя определение вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной и антипролиферативной функций эндотелия. При изучении эндотелиопротекторного действия на животных с ЭСД дополнительно оценивались нарушения в углеводном и липидном обмене, с целью оценки влияния соединений на развитие ЭД. Кроме этого, у всех групп животных с экспериментально-вызванной недостаточностью половых гормонов определялся уровень половых гормонов в плазме крови.
ЭД на всех этапах исследования моделировалась двумя патологиями стрептозотоцин-индуцированным СД и недостаточностью половых гормонов (НПГ).
Экспериментальный сахарный диабет (ЭСД) вызывали введением стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг внутривенно в хвостовую вену. Через 72 часа производили количественное определение глюкозы в крови ферментативным (глюкозооксидазным методом) с измерением величины оптической плотности надосадочной жидкости в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 на спектрофотометре (ПЭ-5400В, ЭКРОС) с использованием наборов «Глюкоза ФКД» (Россия). За 18 часов до введения цитотоксина крысам ограничивали доступ к пище при свободном доступе к воде. В дальнейшее исследование отбирали животных с уровнем сахара крови 12-15 ммоль/л и выше, то есть крыс с развившимся СД (Баранов В.Г., 1983).
Недостаточность половых гормонов (НПГ) как модель нарушения функции эндотелия воспроизводилась путем экстирпации матки с придатками у крыс самок. Исследование проводилось на крысах-самках, рандомизированных по массе (180-210 гр.) и возрасту (половозрелые – 3 месяца) (патент на изобретение №2374699). С целью оценки изменения уровня гормонов в исследуемых группах при моделировании недостаточности половых гормонов был использован иммуноферментный анализ (ИФА) с помощью автоматического ридера Elx800 и с использованием наборов: Прогестерон ELISA EIA-1561, Пролактин ELISA EIA-1291, Фолликулостимулирующий гормон ELISA EIA-1288, Эстрадиол ELISA EIA-2693 (DRG Instruments GmbH, Германия).
Контроль эффективности кастрации производился с использованием цитологического метода определения стадии полового цикла у самок. Для анализа разного уровня эндогенных эстрогенов после операции были выбраны три наиболее характерные фазы полового цикла: диэструс, проэструс и эструс. Определение фаз полового цикла (диэструс, проэструс, эструс) у интактных крыс проводили с помощью характерных морфологических признаков по влагалищным мазкам согласно описанию Я. Д. Киршенблата.
Все проведенные нами исследования проходили тремя блокаи в несколько этапов.
В первом блоке, на первом этапе работы, проводили сравнительное изучение вазодилатирующей функции эндотелия сосудов головного мозга, печени, почек и кожно- мышечной области, на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота у интактных животных. На втором этапе работы оценивалась выраженность и продолжительность эндотелиальной дисфункции у животных с экспериментально вызванными - сахарным диабетом, недостаточностью половых гормонов и операционной травмой (операционным стрессом), как патологии сопутствующей хирургической кастрации (для исключения ее влияния на развитие эндотелиальных нарушений). В ходе проведения второго этапа исследований использовались методические приемы, позволяющие оценить вазодилатирующую и антитромботическую функции эндотелия (таблица 1).
Дальнейшие эксперименты проводились еще двумя отдельными блоками. Так, во втором и третьем блоке исследований изучалось эндотелиопротективное действие сердечно-сосудистых средств: ингибиторов АПФ, антагонистов кальциевых каналов, статинов, сулодексида, флавоноидов, производных ГАМК у животных с ЭСД и НПГ (3 этап) (таблица 1).
Эндотелиопротекторные свойства изучались среди:
- сердечно-сосудистых средств: ингибитор АПФ – лизиноприл (диротон, «Гедеон Рихтер А.О., Будапешт – Венгрия») - 5мг/кг; b - блокаторы – небивалол (небилет, «Berlin-Chemie», Берлин, Германия)– 2,5мг/кг, и бисопролол (конкор «Nykomed», МеркКГаА, Германия для Никомед) – 5мг/кг; антагонист кальциевых каналов – нифедипин (BalkanpharmaR) – 10мг/кг; гипохолестеринимический препарат –симвастатин ( симваГЕКСАЛ,
Таблица 1 - Дизайн проведения экспериментов
| 1 блок | 1 этап гетерогенность эндотелия # | Вазодилатирующая функция эндотелия | доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, N-L-аргинина) |
| 2 этап изучение эндотелиальной дисфункции при ЭСД, НПГ* и ХТ.** | Вазодилатирующая функция эндотелия | -доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, L-аргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности NO-синтазной системы при многократном введении АЦХ) | |
| Антитромботическая функция эндотелия | -скорость образования тромба (артериальный тромбоз) - измерение вязкости крови -оценка агрегации тромбоцитов - тромбиновое время - протромбиновое время -активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) -содержание фибриногена -определение фактора Виллебрандта | ||
| 2-ой и 3-й блок* | 3 этап Изучение эндотелиопротективного действия исследуемых веществ при ЭСД и НПГ | Вазодилатирующая функция эндотелия | -доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, L-аргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности NO-синтазной системы при многократном введении АЦХ) |
| Антитромботическая функция эндотелия | -скорость образования тромба (артериальный тромбоз) - измерение вязкости крови -оценка агрегации тромбоцитов - тромбиновое время - протромбиновое время -активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) -содержание фибриногена -определение фактора Виллебрандта | ||
| Оценка метаболических эффектов | -уровень глюкозы в крови -липидный спектр (ХСобщ, ХСЛПВП, ХСЛПНП ТГ, индекс атерогенности) | ||
| Оценка гормонального статуса у животных с НПГ | -уровень эстрогенов | ||
| Противоспалительная функция эндотелия | -уровень СРБ | ||
| Антипролиферативная функция эндотелия | -морфометрическая оценка мозговых сосудов с наличием признаков пролиферации, а так же воспаления, тромбообразования | ||
| Структурные изменения эндотелиоцитов | - ультраструктурная оценка эндотелиальных повреждений | ||
| Определение уровня е-NOS и эндотелина-1, TRAIL, NF-kB, каспаза-3 | - иммуногистохимическая оценка по степени экспрессии и уровню оптической плотности антител |
Примечание: #-исследование проведено на интактных животных; *- исследование проведено через 4 недели после ЭСД и НПГ; **-исследование проведено в течении 4-х дней после оперативного вмешательства
HEXAL, Германия) – 10 мг/кг. Дозы препаратов выбраны на основе литературного анализа многочисленных экспериментальных исследований, в которых эти вещества проявили высокую эндотелиопротекторную, антигипертензивную, противоишемическую и гипохолестеринемическую активность.
- производных ГАМК: РГПУ-147 (50мг/кг), РГПУ-189 (15мг/кг), фенибут - (25мг/кг), пикамилон (ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА») - 100мг/кг. Использовались наиболее эффективные дозы данных веществ, выявленные при изучении нейропротекторной, антистрессорной, антиишемической и кардиотропной активности данных соединений. Вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия)[1].
- веществ, обладающих антиоксидантными свойствами: мексидол (“НПК Фармасофт”, Россия) в дозе 100 мг/кг; предуктал МВ (триметазидин, “Servier”, Франция) в дозе 6 мг/кг; дибикор (таурин “ПИК-ФАРМА ПРО”) в дозе 168 мг/кг.
- индивидуальных флавоноидов: кверцетин (фирмы Merck), а также флавицин, диосмин, полученные из надземной части растения рода Vicia, сем. Fabaceae) и гесперидин, полученный из кожуры цитрусовых, выделенные на кафедре органической химии Пятигорской фармацевтической академии под руководством доктора фармацевтических наук, профессора Э.Т. Оганесяна, за что выражаем ему искреннюю благодарность. Все флавоноиды вводились в дозе - 100мг/кг, способ введения - per os.
Так же был исследован Сулодексид (Весел Дуэ Ф)– 30 ЕВЛ (единицы высвобождения липопротеинлипазы) (Аlfa Wassermann, Италия) (Комелягина Е.Ю., 2005). Способ введения всех перечисленных веществ - per os, в течении месяца, в первую половину дня. В качестве растворителя использовали 0,9% раствор хлорида натрия. Контрольным группам животных: интактным, ложнооперированным (ЛО), а также животным с НПГ и ЭСД вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме.
Оценка вазодилатирующей функции эндотелия осуществлялась путем регистрации изменений скорости кровотока (СК) при модификации синтеза эндогенного оксида азота введением ацетилхолина (АЦХ) (0,01 мг/кг), L-аргинина (300 мг/кг), нитро-L-аргинина («Acros organics», США) (10 мг/кг). Для оценки эндотелионезависимой вазодилатации (ЭНЗВД) в/в вводили нитроглицерин (НТГ) (МТХ, Москва) (0,007 мг/кг). Для оценки мощности и стабильности NO-синтазной системы был использован метод многократного (10-кратного) введения АЦХ в фиксированной дозе (0,01 мг/кг). СК регистрировали в теменной области мозга крыс, в проекции среднемозговой артерии с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 (рабочая частота 25МГц, диаметром 0,3 см) и компьютерной программы ММ-Д-КMinimax Doppler v.1.9. (Санкт-Петербург, Россия), которая дополнительно позволяла анализировать периферическое сопротивление (индекс Пурселло) и эластичность мозговых сосудов (индекс Гослинга).
Оценка антитромботической функции исследуемых соединений осуществлялась с помощью комплексного подхода для оценки как сосудисто-тромбоцитарного, так и плазменного (коагуляционного) гемостаза. Артериальный тромбоз вызывался по методике Angelillo-Scherrer A., 2004. Показатели вязкости крови изучались на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия), показатели агрегации тромбоцитов на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов фирмы "Биола" (г. Москва) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. (1989). Тромбиновое время (ТВ), протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и содержание фибриногена определяли хронометрически на анализаторе показателей гемостаза АПГ2-01 “МИНИЛАБ 701” с использованием наборов НПО «Ренам» (Россия). Определение фактора Виллебранда проводилось на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "Биола" (наборы “Ренам” для определения фактора Вллебранда).
Оценка липидного профиля (ХСобщ, ХСЛПВП, ХСЛПНП, ТГ) осуществлялась с использованием ферментативных колориметрических тестов “Ольвекс Диагностикум”), значение концентрации ХСЛПНП вычисляли по формуле Фридвальда (1972), индекс атерогенности (ИАТ) по А.Н. Климову (1999). Уровень глюкозы в плазме крови крыс определялся глюкозооксидантым способом с использованием набора «Глюкоза-ФКД» (Россия).
Противовоспалительная функция эндотелия оценивалась по уровню С-реактивного белка (СРБ) с помощью набора реагентов для качественного и полуколичественного определения СРБ в сыворотке крови методом латекс-агглютинации (”Ольвекс Диагностикум”).
Антипролиферативная функция эндотелия оценивалась с помощью комплексного морфологического подхода, основанного на морфометрической оценке параметров эндотелиальных клеток (размеры ядер (ус.ед.) и ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО)), степени сосудистых и эндотелиальных нарушений на базе компьютерной системы «ВидеоТестМорфо-4» (Россия), по соотношению интимы/медии эндотелиальной выстилки, признаков пролиферации сосудистой стенки и воспалительной инфильтрации в микроциркуляторном русле, а также явлений периваскулярного и перицеллюлярного отёка.
Для определения степени повреждения эндотелия проводилась гистологическая оценка десквамации (циркулирующие эндотелиоциты). Определение количества десквамированных эндотелиоцитов осуществлялось с помощью метода, основанного на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью АДФ (Петрищев Н.Н., 2001; Hladovec J., 1978).
Для электронномикроскопического исследования эндотелия забор фрагментов головного мозга производили с областей, где по данным световой микроскопии наблюдались наибольшие патологические изменения в микроциркуляторном русле, наиболее сильно затрагивающие эндотелиальную выстилку. Фрагмент объемом около 1 мм3 фиксировали в 1 % растворе глютарового альдегида 4 часа, и в течение 2 часов в 1 % растворе четырехокиси осмия на веррналацетатном буфере при температуре + 4° С. Затем материал подвергали дегидратации в серии спиртов возрастающей концентрации, проводили в окиси пропилена и заливали в эпоксидную смолу ERL-4206 (A.Spurr, 1968).
Определение уровня еNOS и эндотелина-1, маркеров апоптоза: каспазы-3, рецепторов TRАIL, NF-kB. Для гистологического исследования под эфирным наркозом производили забор головного мозга крыс. Материал фиксировали в течение 48 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4). После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин.
На роторном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм. В дальнейшем производили окрашивание гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике (депарафинизация в ксилоле, проводка по спиртам убывающей концентрации до воды, окраска гематоксилином Бёмера, дифференцировка солянокислым спиртом, окраска эозином, проводка по спиртам возрастающей концентрации до абсолютного этанола, просветление в ксилоле, заключение в канадский бальзам).
Для выявления степени функционирования эндотелия мозга в условиях стрептозотоцинового сахарного диабета, экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов и эндотелиопротективного действия изучаемых веществ при данных патологиях оценивали оптическую плотность и использовали моноклональные антитела к эндотелину-1 (Endothelin-1 Receptor (ETA), Clone RJT 24, NCL-L-ETA P (HIER)) и моноклональные антитела к эндотелиальной NOS (Nitric Oxid Synthase, Clone RN5, NCL-NOS-3 F P (HIER)), к каспазе 3 (клон JHM62, Novocastra), к рецептору TRAIL - апоптоз-индуцирующий лиганд (клон 27B12, Novocastra), к транскрипционному фактору NF-kB (NF-kappa B p65, BioGenex). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Индекс апопотоза рассчитывали как отношение эндотелиальных клеток с имуногистохимическими признаками апопотоза к нормальным эндотелиоцитам (%). Для достоверности полученных результатов применяли позитивные контроли антигенов (лимфатические узлы, печень при недифференцированном лейкозе), негативные контроли антигенов (предстательная железа, головной мозг) и негативные контроли антител (обработка срезов без нанесения первичных антител).
Для анализа морфологических показателей производили микрофотосъемку цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40, х100 и окуляра х10. Оценивали процентное отношение иммунопозитивных клеток к общему количеству эндотелиальных клеток мозга.
Статистическая обработка результатов исследования: нормальность распределения выполнялась с использованием W критерия Шапиро-Уилка; анализ статистической значимости различий проводился с применением t-критерия Стьюдента; однофакторного дисперсионного анализа, критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони; однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса, критерия Дана для множественных сравнений; дисперсионного анализа повторных измерений, критерия Тьюки; критерия Фридмана для анализа повторных измерений, критерия Ньюмена—Кейлса
Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Office Excel, BioStat 2008 5.2.5.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов.
Проведённый этап исследований позволяет дать суммарную оценку функционирования эндотелия различных сосудистых регионов, как в норме, так и при патологии различного генеза.
Существенно то, что один и тот же датчик, размещенный над тканью органа, регистрирует кровоток в определенной, сопоставимой по массе ткани, а не во всем органе, поэтому возможно корректное сравнение скоростей кровотока или изменений (прироста/падения) кровотока в разных сосудистых регионах.
А.  | Б.  |
 | |
Примечание: АЦХ - прирост кровотока в ответ на введение ацетилхолина; н-Л-арг- падение кровотока в ответ на введение нитро-Л-аргинина.
Рисунок 1. Изменение мозгового, почечного, печеночного кровотока и кровотока в кожно-мышечной области при активации (А) (ацетилхолином) и подавлении (Б) (нLа) синтеза оксида азота.
При введении АЦХ интактным животным скорость мозгового кровотока повышалась на 25%, в почечной ткани на 20%, в сосудах печеночной области (36%), в кожно-мышечной области кровоток увеличился на 19 % от исходного уровня. Введение нитро-L-аргинина приводило к снижению скорости кровотока в проекции среднемозговой артерии на 24,6%, в почке на 18,2%, в печени на 32,2%, в кожно - мышечной области на 16,5% (рисунок 1 А,Б).
Таким образом, введение АЦХ вызывало достоверное по отношению к исходным данным повышение, а нитро-L-аргинина - снижение скорости кровотока во всех изучаемых сосудистых регионах, однако наиболее сильный прирост и падение наблюдались в печеночной ткани, органе с наименьшей исходной скоростью кровотока. Такая сосудистая реакция, возможно, связана с анатомическим строением микроциркуляторного русла печени и нахождением там клеток Купфера, принимающих дополнительное участие в синтезе NO и активирующихся в результате воздействия различных стимулов (Маянский Д.Н., Висе Э., Декер К., 1993). Следует отметить, что регистрация кровотока в печени требует вскрытия брюшной полости и осложняется помехами связанными с близким расположением аорты, задней полой вены и диафрагмы легких. Исходя из этого, нами были выбраны в качестве объекта изучения эндотелиальных функций сосуды мозга т.к. в течение опыта, легче обеспечить регистрацию мозгового кровотока, а полученные в ходе работы результаты свидетельствуют о том, что направленность изменений сосудистого тонуса гетерогенных эндотелиальных областей одинакова.
Оценка влияния ЭСД, НПГ и операционной травмы на эндотелиальную дисфункцию.
У животных с ЭСД и НПГ наблюдается снижение стабильности и мощности эндотелиальной NO-синтазной системы, ослабление эндотелиозависимой вазодилатации на фоне ЭСД и НПГ в 1,7 раза и 2,3 раза, соответственно (Рисунок 2).
Так же у животных с ЭСД и НПГ наблюдаются нарушения как со стороны коагуляционного (плазменного) гемостаза, так и со стороны сосудисто-тромбоцитарного (Рисунок 3,4).
А)  | Б)  |
Примечание: АЦХ – введение ацетилхолина; НТГ-введение нитроглицерина; nLarg-введение нитроLаргинина; НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)
Рисунок 2. Изменения церебрального кровотока животных с НПГ (А) и с ЭСД (Б) при модификации выделения и синтеза эндогенного оксида азота.
  |   |
  | Примечание: НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни). |
Рисунок 3. Изменения индексов агрегации / дезагрегации тромбоцитов и максимального наклона у животных с недостаточностью половых гормонов и с сахарным диабетом.
Антикоагулянтный и антитромбогенный потенциал сосудистого эндотелия смещается в сторону повышения показателей агрегации тромбоцитов (повышение индекса агрегации тромбоцитов в 1,75 раза при НПГ и 2,25 раза при ЭСД, скорости агрегации в 1,6 раза при НПГ и 1,79 раза при ЭСД, снижение индекса дезагрегации тромбоцитов в 2,86 раза при НПГ и 3,14 раза при ЭСД). Увеличения скорости образования тромба на модели артериального тромбоза в 1,7 раза при НПГ и 2,6 раза при ЭСД (Рисунок 3,4). Под влиянием изучаемых патологий происходит достоверное (Р<0,05) укорочение тромбинового и протромбинового, а также активированного частичного тромбопластинового времени, повышение уровня фибриногена и фактора Виллебранда в крови (Рисунок 9), увеличение вязкости крови на всех скоростях сдвига (Таблица7,8,9).
 |
Примечание: ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни)
Рисунок 4. Скорость образования тромба в сонных артериях у животных с НПГ и ЭСД, при аппликации хлорида железа на адвентицию сосуда.
При оценке вазодилатирующей функции эндотелия при хирургической травме, у интактных животных, отмечено, что в ответ на введение анализаторов СК у животных в первые и четвертые сутки после операции не достоверно отличались друг от друга. Введение же модификаторов синтеза эндогенного оксида азота животным на второй и третий день после операции вызывало повышение скорости кровотока значительно ниже по сравнению со скоростью кровотока животных, тестируемых в первый и четвертый день. Введение L-аргинина животным на вторые и третьи сутки после операции приводило к достоверно значимому усилению кровотока в брюшине в отличии от животных прооперированных в первые сутки. Полученные данные свидетельствуют о физиологически обратимом процессе нарушения эндотелиальной функции при хирургическом вмешательстве (Рисунок 5).
Примечание: 1,2,3,4 - сутки-после проведенного оперативного вмешательства; АЦХ – введение ацетилхолина; Ларг-введение Lаргинина; НТГ-введение нитроглицерина; нЛарг-введение нитроLаргинина;
Рисунок 5. Изменения кровотока брюшины у животных в различные сроки после оперативного вмешательства при модификации синтеза эндогенного оксида азота.
Стоит отметить, что ЭСД (Таблица 2) и НПГ сопровождаются существенным повышением уровня ТГ, ХСЛПНП, ХСобщ и снижением ХСЛПВП, что приводит к увеличению индекса атерогенности (Таблица 2).
Таблица 2. - Влияние ЭСД на показатели липидного спектра крови у животных (ммоль/л)
| Группы животных | ХСобщ | ХС ЛПВП | ХС ЛПНП | ТГ | ИАТ |
| Интакт | 2,58±0,07 | 0,85±0,05 | 1,42±0,09 | 0,68±0,03 | 2,09±0,17 |
| ЭСД | 3,8±0,15** | 0,61±0,03** | 2,83±0,15** | 0,8±0,03* | 5,5±0,46** |
Примечание - * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни).
Существенно то, что активация атерогенных процессов, на фоне ЭСД и НПГ может лежать в основе нарушения эндотелиальной функции и увеличения вязкости крови (Таблица 3) и, соответственно, скорости напряжения сдвига, так как деформабельность эритроцитов прямо коррелирует с гиперглицерхолестеринемией и повышением содержания липопротеидов низкой плотности (Ефимов А.С., 1989; Балашова Т.С., 1996; Patel R. P., Hogg N., Kim-Shapiro D. B., 2011).
Нарушение функции эндотелия при ЭСД и НПГ, кроме всех выше перечисленных патофизиологических сдвигов, сопровождается выраженными патологическими изменениями его морфологического состояния (Загидуллин Ш.З., и д.р., 2010; Ohtani K., Dimmeler S., 2011). При световой и электронной микроскопии, у животных с ЭСД и НПГ, выявлено усиление тромбообразования и лейкоцитарной инфильтрации, увеличение соотношения интима/медиа и количества циркулирующих эндотелиоцитов. Кроме этого, при НПГ в 1,5 раза и при ЭСД в 2,2 раза наблюдалось увеличение С-реактивного белка и, соответственно, усилении провоспалительного статуса эндотелия.
Таблица 3. Влияние ЭСД и НПГ на вязкость крови крыс
| Группы животных | Скорость сдвига, сПз | |||
| 300с-1 | 100с-1 | 50с-1 | 10с-1 | |
| Интакт | 3,64±0,35 | 4,58±0,31 | 6,78±0,41 | 8,41±0,34 |
| ЭСД | 4,95±0,18** | 6,72±0,34** | 9,8±0,67*** | 15,12±0,7*** |
| ЛО | 3,55±0,14 | 4,7±0,32 | 5,91±0,36 | 7,69±0,45 |
| НПГ | 4,15±0,19* | 6,5±0,23** | 7,12±0,34** | 12,01±0,78** |
Примечание НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P0,05); ** - (P0,01); *** - (P0,001); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни).
Проведенный комплексный морфо-функциональный анализ развития и выраженности эндотелиальной дисфункции при ЭСД и НПГ позволяет говорить о высокой валидности предложенных нами моделей формирования нарушений функции эндотелия и адекватности подходов к выявлению эндотелиопротекторной активности фармакологических веществ.
Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиоксидантной активностью и флавоноидов на вазодилатирующую функцию эндотелия у животных с ЭСД и НПГ.
У животных с ЭСД и НПГ, диротон, симвагексал, небилет достоверно улучшали вазодилатирующую функцию эндотелия, повышали стабильность системы синтеза NO. Конкор и нифедипин также положительно влияли на вазодилатирующую функцию эндотелия, хотя и в меньшей степени (Таблица 4).
Полученные результаты о положительном влиянии сердечно-сосудистых средств на вазодилатирующую функцию эндотелия подтверждают ранее выполненные исследования (Стрюк Р.И., Воронков Л.Г., 2002, 2003, Jorge PA., 2010; Kalipada Pahan, Weis M, Yamasaki, 2010) и впервые позволяют провести сравнительное ранжирование по данному виду активности как внутри группы сердечно-сосудистых средств, так и между другими классами фармакологических веществ, изучаемых в данном исследовании.
Таблица 4. Изменения кровотока у животных с ЭСД при модификации синтеза NO на фоне введения сердечно-сосудистых средств
| Группы животных | Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в % | |||
| Прирост кровотока | Падение кровотока | |||
| Ацетилхолин | L-аргинин | Нитро-глицерин | N-L-аргинин | |
| Интакт | 44,05±2,35 | 11,24±1,34 | 50,25±3,25 | 37,84±2,23 |
| ЭСД | 12,08±1,41* | 53,19±4,34** | 48,52±2,2 | 17,34±1,9* |
| ЭСД +Вессел Дуэ Ф | 28,54±2,54 | 13,15±1,49 | 47,7±3,27 | 32,03±2,18 |
| ЭСД +Диротон | 24,13±3,19 | 17,32±1,85 | 49,52±2,46 | 31,5±2,29 |
| ЭСД+Симвагексал | 23,45±1,51 | 21,86±2,35 | 46,58±4,09 | 30,6±2,52 |
| ЭСД +Небилет | 22,97±3,11 | 23,91±2,21 | 49,62±3,77 | 29,13±2,5 |
| ЭСД+Конкор | 17,71±2,43 | 36,54±3,93 | 50,19±3,51 | 24,88±1,91 |
| ЭСД +Нифедипин | 14,15±2,03 | 40,81±2,5 | 56,05±4,16 | 19,89±1,52 |
| ЛО | 32,85±4,79 | 9,74±1,21 | 47,7±1,37 | 45,79±6,75 |
| НПГ | 13,81±2,16** | 58,41±6,47** | 51,67±1,87 | 15,03±2,91** |
| НПГ+Вессел Дуэф | 36,85 ±3,78 | 15,23±1,84 | 52,61±1,75 | 27,5±3,09 |
| НПГ +Диротон | 30,28±2,37 | 17,29±2,4 | 51,55±2,07 | 25,7±2,62 |
| НПГ +Симвагексал | 27,35±2,00 | 21,47±1,75 | 48,07±1,68 | 25,53±3,36 |
| НПГ +Небилет | 26,37±2,09 | 20,26±2,1 | 47,91±2,35 | 25,0±2,57 |
| НПГ +Конкор | 19,45±1,73 | 33,37±2,65 | 51,05±1,64 | 21,02±2,92 |
| НПГ+Нифедипин | 16,46±1,29 | 44,53±2,08 | 55,58±1,33 | 17,01±2,05 |
Примечание НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P0,05); **-(P0,01) достоверно по отношению к группе интактных и ЛО животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД и НПГ (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни)
Исследуемые производные ГАМК - соединения РГПУ-189 и РГПУ-147, достоверно улучшают ЭЗВД, фенибут и пикамилон в меньшей степени улучшают вазодилатирующую функцию эндотелия (Таблица 5) у животных с НПГ и ЭСД.
Таблица 5. Изменения кровотока при модификации синтеза NO у животных с ЭСД, получавших производные ГАМК
| Группы животных | Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в % | |||
| Ацетилхолин | L-аргинин | Нитроглицерин | N-L-аргинин | |
| Интакт | 44,05±2,35 | 11,24±1,34 | 50,25±3,25 | -37,84±2,23 |
| ЭСД | 10,23±0,51* | 50,2±4,52** | 50,91±2,15 | -14,05±1,34* |
| ЭСД +РГПУ-189 | 17,61±0,73 | 25,53±2,28 | 53,22±4,25 | -22,86±2,19 |
| ЭСД +РГПУ-147 | 16,23±0,75 | 27,38±2,09 | 47,48±2,74 | -20,59±1,79 |
| ЭСД +Пикамилон | 11,83±0,89 | 40,17±3,48 | 52,37±5,62 | -16,6±1,98 |
| ЭСД +Фенибут | 11,77±0,94 | 41,46±3,21 | 49,45±3,43 | -15,45±1,84 |
| ЛО | 36,24±1,94 | 8,81±0,94 | 46,73±3,01 | -43,88±4,92 |
| НПГ | 12,41±2,1* | 63,54±6,26** | 43,02±3,46 | -13,55±2,93* |
| НПГ +РГПУ-189 | 22,28±3,04 | 27,45±2,58 | 46,38±2,59 | -20,69±2,76 |
| НПГ +РГПУ-147 | 20,73±2,11 | 29,7±2,71 | 43,71±2,71 | -19,47±2,52 |
| НПГ +Пикамилон | 14,82±1,71 | 50,42±5,18 | 49,34±2,5 | -15,89±1,86 |
| НПГ +Фенибут | 14,21±2,07 | 50,07±5,37 | 57,33±4,43 | -14,76±1,33 |
Примечание – обозначения как в таблице 4.
Таблица 6. - Изменения прироста кровотока у животных с ЭСД на фоне введения веществ с анитоксидантной активностью
| Группы животных | Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в % | |||
| Ацетилхолин | L-аргинин | Нитроглицерин | N-L-аргинин | |
| Интакт | 39,41±2,24 | 7,48±1,09 | 43,95±2,77 | -35,66±2,11 |
| ЭСД | 11,04±1,58* | 45,56±5,87** | 48,61±3,27 | -15,07±2,17** |
| ЭСД +Флавицин | 18,48±1,93 | 21,89±2,84 | 47,55±3,64 | -23,4±2,3 |
| ЭСД +Диосмин | 14,14±1,61 | 32,92±4,03 | 49,94±4,00 | -18,74±1,76 |
| ЭСД+Кверцетин | 17,2±2,37 | 25,25±3,36 | 50,47±3,03 | -21,52±2,05 |
| ЭСД+Гесперидин | 15,03±1,95 | 34,34±3,06 | 52,48±1,68 | -20,25±1,74 |
| ЭСД +Мексидол | 15,74±1,48 | 29,71±3,51 | 54,85±2,57 | -21,51±1,92 |
| ЭСД+Предуктал | 13,65±1,3 | 36,21±3,62 | 49,92±3,38 | -18,63±1,38 |
| ЭСД +Дибикор | 12,36±1,3 | 38,75±3,54 | 50,17±3,37 | -16,35±1,69 |
| ЛО | 41,79±5,38 | 8,69±1,41 | 48,51±0,98 | -38,09±4,51 |
| НПГ | 14,57±2,03* | 50,22±6,94** | 50,76±1,93 | -13,65±2,27* |
| НПГ +Флавицин | 25,02±2,46 | 20,88±2,48 | 48,94±1,3 | -20,0±2,09 |
| НПГ +Диосмин | 19,0±1,16 | 32,31±3,69 | 47,54±2,33 | -16,3±1,71 |
| НПГ +Кверцетин | 23,92±1,43 | 24,23±1,37 | 50,99±2,21 | -19,5±0,82 |
| НПГ +Гесперидин | 19,51±1,13 | 35,87±2,33 | 45,69±3,3 | -18,67±1,42 |
| НПГ +Мексидол | 20,59±1,4 | 30,69±3,21 | 53,11±1,58 | -19,14±1,73 |
| НПГ +Предуктал | 18,07±1,8 | 38,45±4,07 | 48,3±1,3 | -16,84±1,45 |
| НПГ +Дибикор | 16,5±1,65 | 38,76±4,59 | 47,54±2,33 | -14,72±1,5 |
Примечание – обозначения как в таблице 4.
Среди исследуемых флавоноидов (кверцетин, флавицин, диосмин, гесперидин) и соединений с антиоксидантным действием (мексидол, предуктал и дибикор) наиболее выраженное действие на ЭЗВД оказали флавицин, кверцетин и мексидол. Другие вещества менее выражено улучшали ЭЗВД у животных с ЭСД и НПГ (Таблица 6).
Сравнивая параметры прироста и падения скорости кровотока в ответ на активацию и блокаду синтеза NO у контрольных животных с ЭСД и НПГ без фармакологической поддержки и у животных, получавших изучаемые соединения, можно расположить вещества из разных фармакологических групп в порядке убывания по степени улучшения ЭЗВД в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф > Диротон Симвагексал Небилет > РГПУ-189 > Флавицин РГПУ-147 > Кверцетин Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин Фенибут Дибикор.
Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиокидантной активностью и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия у животных с ЭСД и НПГ.
Так как ЭПД одних и тех же соединений при разных экспериментальных патологиях была сопоставима, а более выраженная ЭД наблюдалась при ЭСД, то в дальнейшем в автореферате нами представлены рисунки и таблицы по изучению ЭПД веществ только в условиях данной патологии.
Сосудистый эндотелий обладает высокой тромборезистентностью и играет важную роль в сохранении жидкого состояния крови и предупреждении тромбозов, обеспечении адекватной потребностям тканей микроциркуляции (Fitzgerald D.J. 2001; Zaheer Z., Robinson T., Mistri A.K., 2011). Поэтому в комплексном изучении эдотелиотропного действия исследуемых соединений мы изучали их влияние на антитромботическую функцию эндотелия.
Изучение влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, на тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз, показало, что все исследуемые соединения обладают способностью повышать антитромбогенный и антикоагуляционный потенциал эндотелия при эндотелиальной дисфункции, вызванной ЭСД (Рисунок 6,7,8,9) и НПГ.
А)  | Б)  |
Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P0,05); **-(P0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни).
Рисунок 6. - Влияние сердечно-сосудистых средств на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД
А)  | Б)  |
Примечание - обозначения, как на рисунке 6.
Рисунок 7. - Влияние производных ГАМК на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД
Стоит отметить, что наиболее выраженное влияние на антитромботическую функцию эндотелия среди сердечно-сосудистых средств проявил Весел Дуэ Ф, симвагексал, из группы производных ГАМК – соединение РГПУ-189 и из флавоноидов – флавицин, которые лишь незначительно уступали по влиянию на антитромботическую функцию эндотелия гепариноиду - Вессел Дуэ Ф (Рисунок 6,7,8,9).
А)  | Б)  |
Примечание - обозначения, как на рисунке 6.
Рисунок 8. - Влияние антиоксидантов на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД
А.  | Б.  |
В.  | Примечание: ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P0,05); **-(P0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни) |
Рисунок 9. Влияние изучаемых веществ на уровень фактора фон Виллебранда у животных с ЭСД
При ЭСД (таблица 7,8,9) и НПГ, оценивалась вязкость крови, и соответственно влияние на этот показатель исследуемых веществ. Все изучаемые соединения в той или иной мере снижали вязкость крови, однако наиболее существенное влияние среди сердечно-сосудистых средств оказал Весел Дуэ Ф, симвагексал, среди производных ГАМК - РГПУ-189, среди флавоноидов – флавицин.
Таблица 7. – Влияние сердечно-сосудистых средств на вязкость крови крыс с ЭСД
| Группы животных | Скорость сдвига, сПз | |||
| 300с-1 | 100с-1 | 50с-1 | 10с-1 | |
| Контроль-интакт | 3,41±0,18 | 4,9±0,25 | 6,4±0,38 | 8,54±0,55 |
| ЭСД | 4,85±0,22* | 6,85±0,56* | 9,51±0,71** | 15,48±0,6** |
| ЭСД+Вессел Дуэ Ф | 3,8±0,21 | 5,1±0,44# | 6,81±0,75## | 9,7±0,72## |
| ЭСД +Симвагексал | 3,85±0,34 | 5,15±0,45# | 7,13±0,41# | 10,03±0,56## |
| ЭСД+Диротон | 3,86±0,41 | 5,25±0,56# | 7,55±0,71 | 10,46±0,82# |
| ЭСД +Небилет | 3,93±0,31 | 5,41±0,53 | 7,87±0,23 | 10,75±0,73# |
| ЭСД + Конкор | 4,08±0,21 | 5,9±0,41 | 8,15±0,23 | 12,31±0,67 |
| ЭСД + Нифедипин | 4,1±0,13 | 6,13±0,31 | 8,41±0,42 | 12,22±0,78 |
