Технологические основы создания люминесцентного сенсора для определения тяжелых металлов в белках
На правах рукописи
НАУМОВА Екатерина Викторовна
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО СЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В БЕЛКАХ
| Специальность: | 05.27.01 – Твердотельная электроника, радиоэлектронные компоненты, микро- и нано - электроника, приборы на квантовых эффектах |
А в т о р е ф е р а т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Саратов 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.»
| Научный руководитель: | Мельников Геннадий Васильевич доктор химических наук, профессор |
| Официальные оппоненты: | Сысоев Виктор Владимирович доктор технических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.», профессор кафедры физики Перепелицын Юрий Николаевич кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, ФГБУН «Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН», Саратовский филиал, старший научный сотрудник лаборатории субмикронной электроники (СФ-3) |
| Ведущая организация: | ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» |
Защита состоится «10» октября 2013 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.242.01 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.» по адресу: 410054, Саратов, ул. Политехническая, 77, Саратовский государственный технический университет, корпус 1, ауд. 319.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.».
Автореферат разослан «____» сентября 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Димитрюк А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Одним из перспективных направлений молекулярной электроники является разработка биосенсоров, принцип действия которых основан на квантовых эффектах. Большая часть биосенсоров основана на использовании ферментов (энзимов) – биологических катализаторов, ускоряющих реакции в живом организме и отличающихся эффективностью действия, специфичностью и регулируемостью. Биосенсоры способны высокоселективно распознавать определенные молекулы и преобразовывать эту информацию в первичный сигнал. Регистрацию такого первичного сигнала производят с использованием электрических, оптических или других преобразователей, что позволяет получить легко обрабатываемый электрический сигнал. Наиболее широкое применение такие молекулярные сенсоры находят в медицине для определения глюкозы, молочной кислоты, холестерина, фруктозы, этанола и др., а также в экологическом мониторинге при обнаружении загрязнителей окружающей среды.
Развитие новых поколений функциональных элементов оптоэлектроники связано в основном с использованием различных наноразмерных и наноструктурированных материалов с заданными свойствами. При формировании таких материалов используются полупроводниковые нанокристаллы – квантовые точки (КТ). КТ обладают более значительным квантовым выходом люминесценции и фотохимической стойкостью по сравнению с молекулярными красителями. Большие перспективы связаны с применением биосенсоров для определения тяжелых металлов в белках.
Комплексообразование альбумина с тяжелыми металлами препятствует выполнению им его основных функций, в связи с этим целесообразно своевременное определение ионов тяжелых металлов в белках плазмы крови. Для определения механизмов взаимодействия «белок – тяжелый металл» используют различные методы: атомно-абсорбционное определение металлов в крови (Ф.А. Чмиленко), рентгеновского рассеяния (C.A. Blindauer, I. Harvey, K.E. Bunyan, A.J. Stewart, D. Sleep, D.J. Harrison, S. Berezenko, P.J. Sadler, Е. А. Порай-Кошиц), спин резонансной спектроскопии (A. Banerjee, S. Lahiri) и метод динамического светорассеяния (Г.П. Петрова и др.)
Использование люминесцентного сенсора, являющегося чувствительным элементом портативного фосфориметра, позволяет контролировать наличие ионов тяжелых металлов, присутствующих в биологических образцах, что востребовано в медицинской диагностике и при осуществлении экологического мониторинга.
Таким образом, актуальным является изучение взаимодействия различных люминесцентных зондов с белками и тяжелыми металлами, разработка технологических основ создания люминесцентного сенсора на основе молекулы белка, а также приборного обеспечения в виде портативного фосфориметра, основанного на регистрации фосфоресценции и флуоресценции люминесцентного сенсора для определения тяжелых металлов.
Цель работы – разработка технологических основ создания активного элемента люминесцентного сенсора на основе молекулы белка (создание надмолекулярных комплексов «белок-ТМ-эозин» и «белок-ТМ-пирен», а также «белок-квантовая точка» в растворах и в пленках) для осуществления контроля тяжелых металлов в биологических образцах и исследование его фотофизических свойств, а также проведение исследований конструктивных основ создания прибора – портативного фосфориметра для определения ионов тяжелых металлов в водных растворах.
Основные задачи работы:
- Разработать технологические основы создания люминесцентных сенсоров для микро- и наноэлектроники на основе полярных и неполярных зондов, нековалентно связанных с макромолекулами белка.
- Изучить функциональные и эксплуатационные характеристики сенсоров методами спектрального анализа и кинетической спектроскопии.
- Исследовать процессы тушения флуоресценции сенсоров тяжелыми металлами с помощью модернизированной установки на базе спектрометра ДФС-24.
- Определить константы скорости тушения фосфоресцентных состояний сенсора методами импульсной фосфориметрии и математического моделирования.
- Исследовать особенности процессов тушения электронно-возбужденных синглетных состояний неполярного зонда – пирена методами флуоресцентной спектроскопии в буфере сывороточного альбумина человека.
- Исследовать взаимодействие полупроводниковых квантовых точек ZnCdS с молекулами САЧ и БСА.
- Исследовать тушение люминесценции квантовых точек ионами тяжелых металлов в САЧ.
- Разработать и создать портативный импульсный фосфориметр для регистрации интенсивности фосфоресценции и определения времени жизни фосфоресцентных состояний сенсора.
- Провести технические исследования прибора – портативного фосфориметра.
Методы исследования
В основе работы люминесцентного сенсора лежит разработанный люминесцентно-кинетический способ определения наличия ионов тяжелых металлов в водных растворах (Наумова Е.В. и др. Патент на изобретение РФ № 24311132 (2011), бюл. № 28). Изучение характеристик люминесцентных сенсоров осуществлялось методами спектрального анализа и кинетической спектроскопии.
Белковые пленки готовились по известным технологиям: на специально подготовленные кварцевые подложки наносили раствор сывороточного альбумина человека и равномерно распределяли по поверхности подложки, затем полученную пленку высушивали. В качестве аналитического сигнала использована флуоресценция введенных в пленку наномаркеров: квантовых точек ZnCdS.
Изучение спектров поглощения и люминесценции сенсоров проводилось методами абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии.
Эксперименты по регистрации функциональных и эксплуатационных характеристик, а также кинетики люминесценции сенсора на основе молекулы белка проводились на специально разработанном портативном импульсном фосфориметре (Наумова Е.В. и др. Пат. РФ № 24311132 (2011), бюл. № 28).
Научная новизна:
- Разработанный уникальный люминесцентно-кинетический способ (Наумова Е.В. и др. Пат. РФ № 24311132 (2011), бюл. № 28) обеспечил определение наличия ионов тяжелых металлов в растворах белка.
- Математическая модель процессов тушения люминесценции зондов, связанных с молекулами белка, под действием ионов тяжелых металлов позволила уточнить константы скорости тушения фосфоресценции, что обеспечивает повышение точности определения концентрации ионов тяжелых металлов в белках.
- Исследования процессов тушения флуоресценции и фосфоресценции полярных и неполярных люминесцентных зондов, связанных с сывороточным альбумином человека (САЧ) в фосфатном буфере рН 7,4, позволили обнаружить влияние структурных изменений белков, под действием солей тяжелых металлов, на процессы тушения синглетных и триплетных состояний зондов, а также эффект экранировки зарядов белков ионами солей тяжелых металлов. Определены константы Штерна-Фольмера тушения флуоресценции антрацена и пирена и фосфоресценции эозина, а также константы скорости тушения триплетных состояний эозина.
- Впервые полученная зависимость индекса полярности пирена в САЧ от концентрации нитрата таллия позволяет определять структурные изменения в белках под действием ионов тяжелых металлов.
- Установлено, что флуоресценция квантовых точек ZnCdS чувствительна к наличию белков в водных растворах. Полученные результаты свидетельствуют об эффективном взаимодействии квантовых точек ZnCdS с сывороточным альбумином человека и БСА.
- Определены константы тушения флуоресценции КТ нитратом меди. Возрастание константы тушения от 0,04·104 М-1 в воде до 0,14·104 М-1 в САЧ можно объяснить концентрирующим действием САЧ.
Практическая значимость и реализация результатов.
Полученные результаты исследований фотофизических процессов дезактивации энергии электронного возбуждения сенсора под действием тяжелых металлов и атомов в люминесцентных сенсорах (красителях и КТ) позволяют разработать новые методы создания сенсоров для определения экотоксикантов.
Созданные сенсоры и приборное обеспечение в виде портативного импульсного фосфориметра, предназначенные для осуществления контроля содержания ТМ в биологических объектах, востребованы в медицинской диагностике и в экологическом мониторинге объектов окружающей среды
Основные результаты и положения, выносимые на защиту:
- Технология создания люминесцентных сенсоров на основе надмолекулярных комплексов «белок-ТМ-эозин» и «белок-ТМ-пирен», а также «белок-квантовая точка», позволяющая определять наличие ТМ в водных растворах белка.
- Установлено возрастание интенсивности люминесценции КТ ZnCdS с увеличением концентрации САЧ и БСА в растворе, связанное с эффективным взаимодействием белков с поверхностью КТ. Тушение люминесценции КТ ионами меди позволяет создать принципиально новые активные элементы электронных сенсоров для медицинской диагностики и экологического мониторинга.
- Результаты по исследованию процессов тушения флуоресценции и фосфоресценции полярного зонда эозина, а также флуоресценции неполярных зондов пирена и антрацена в САЧ и БСА, свидетельствующие о проникновении ионов тяжелых металлов таллия, свинца, цезия, меди и др., а также тяжелого атома йода в полярные и неполярные микрообласти белков.
- Методика, основанная на возрастании индекса полярности пирена в САЧ при увеличении концентрации ТМ, связанного с изменением структуры белков под действием ионов тяжелых металлов.
- Установлено изменение чувствительности интенсивности и кинетики затухания фосфоресценции люминесцентного зонда – эозина к наличию ионов тяжелых металлов, используемое при разработке перспективных оптических методов определения наличия ионов тяжелых металлов и атомов в биологических средах.
Личный вклад соискателя заключается в участии при обсуждении постановки задач исследования, при проведении экспериментов, обработке и обобщении полученных результатов.
Гранты. Разработки по теме диссертационного исследования поддержаны следующими грантами: УМНИК «Разработка макета импульсного фосфориметра для определения наличия тяжелых металлов в водных растворах» – октябрь 2010, грант РФФИ 10-02-00159-а «Исследование триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами, связанными с биополимерами» – 2010-2011, конкурс молодежных инновационных проектов КУМИР «Люминесцентный сенсор для контроля тяжелых металлов в медицинской диагностике» – март 2012, грант РФФИ №12-02-31196 «Особенности синглет-синглетного переноса энергии и тушения тяжелыми металлами возбужденных состояний люминесцентных зондов, связанных с биополимерами» – июнь 2012.
Достоверность и обоснованность полученных результатов обусловлены использованием в экспериментах стандартной измерительной аппаратуры и подтверждаются воспроизводимостью экспериментальных данных, полученных с использованием современных спектральных методов. Полученные результаты не противоречат существующим воззрениям на физико-химические процессы взаимодействия ТМ с белками и на процессы тушения возбужденных состояний люминесцентных зондов тяжелыми металлами.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, МГУ, 2007, 2008), Симпозиуме «Нанофотоника» (Московская обл., г.Черноголовка, 2007), Международной научной конференции «Математические методы в технике и технологиях» (Саратов, СГТУ, 2008; Псков, ППУ, 2009), International conference «Organic nanophotonics» (ICON – RUSSIA 2009) (St. Petersburg, 2009), Международной научной конференции «Проблемы управления, передачи и обработки информации АТМ-ТКИ-50» (Саратов, СГТУ, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновации и актуальные проблемы техники и технологий» (Саратов, СГТУ, 2009; Саратов, СГТУ, 2010), Второй Всероссийской школе-семинаре студентов, аспирантов и молодых ученых по направлению «Наноинженерия» (Москва, МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2009), конференции «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, СГТУ, 2011), Международной конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2012), 4-м Съезде биофизиков России (г. Нижний Новгород, 2012), ICIT (Саратов, СГТУ, 2012).
Публикации. Материалы, отражающие основное содержание работы, изложены в 25 публикациях, в том числе 3 в изданиях, включенных в перечень периодических изданий ВАК РФ. По теме диссертации получены патенты РФ № 24311132, № 118755 и свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2013615068.
Структура и объем диссертационной работы. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованной литературы из 141 наименования, изложена на 113 страницах, содержит 29 рисунков, 6 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность и поставлена цель работы, определены основные задачи исследования, приведены научная новизна полученных результатов, их практическая ценность и апробация.
В первой главе рассмотрены различные конструкции оптоэлектронных приборов, их особенности, достоинства и недостатки. Приведена классификация существующих биосенсоров. Определены основные тенденции развития портативных приборов люминесцентного анализа для решения задач медицины и экологии. Приведен обзор существующих результатов по исследованию процессов тушения возбужденных состояний люминофоров, а также процессов взаимодействия тяжелых металлов с белками.
На основе выполненного в главе критического анализа существующей литературы по выбранной теме научных исследований определена цель работы и сформулированы задачи исследования.
Во второй главе приведено описание методов исследования и используемых материалов. Люминесцентный сенсор выполнен на основе макромолекулы белка, в качестве которого выбран сывороточный альбумин человека (САЧ), и молекулы полярного или неполярного люминесцентных зондов, либо зонда в виде квантовой точки ZnCdS. В качестве неполярных зондов были выбраны полициклические ароматические углеводороды: антрацен и пирен. Полярным зондом служил эозин. Квантовая точка выбрана на основе полупроводниковых нанокристаллов ZnCdS. Макромолекула белка реагирует структурными изменениями на присутствие в исследуемом биологическом образце ионов тяжелых металлов. Структурные изменения в белках регистрировались по наблюдаемому процессу тушения фосфоресценции и флуоресценции зондов ионами тяжелых металлов.
В третьей главе приведены уравнения, описывающие процессы дезактивации триплетных состояний люминесцентных зондов, находящихся в водной фазе и в глобуле белка. Системы дифференциальных уравнений составлены на основании формализма химической кинетики с учетом неоднородного распределения люминесцентных зондов в микрогетерогенной белковой среде. Моделирование кинетики затухания фосфоресценции люминесцентного сенсора осуществлялось в среде Matlab.
Поскольку интенсивность фосфоресценции пропорциональна концентрации триплетных состояний, скорость затухания фосфоресценции молекул зондов можно рассматривать как скорость дезактивации триплетных состояний зондов. Скорость процессов дезактивации триплетных состояний зондов, находящихся в глобулярной и водной фазах, в присутствии ионов тяжелых металлов, а также скорость изменения концентрации ионов таллия в глобулярной микрофазе можно представить следующими уравнениями:
-[d(мAT)]/dt=k_[мAT] –k+[AT][M]+kфсм[мAT]+kTlм[мAT][мTl+]+kQм[мAT][Q]
-[dAT]/dt = k+[AT][M] - k_[мAT]+ kTlв[AT][Tl+] + kQв[AT][Q]
([d(мTl+)]/dt) = kвх [М][Tl+] - kвых[мTl+],
где [мAT], [AT] – концентрации молекул зонда – эозина в триплетном состоянии в глобуле белка и в водной микрофазе соответственно; [мTl+], [Tl+] – концентрации молекул тушителя таллия в белковой микрофазе и в водной макрофазе соответственно; k_, k+ – константы скорости выхода и входа молекул зонда из глобулы и в глобулу белка соответственно; [M] – концентрация глобул белка; kфсм – константа скорости затухания фосфоресценции триплетных состояний эозина в глобуле белка; kTlм, kTlв – константы скорости тушения триплетных состояний молекул зонда таллием в глобуле белка и в водной макрофазе соответственно; kQм[Q], kQв[Q] – псевдомономолекулярные константы скорости тушения примесями, преимущественно это концентрация остаточного кислорода в глобуле белка и в водной макрофазе соответственно; [Q] – концентрация остаточного кислорода; kвх, kвых – константы входа ионов таллия в глобулярную микрофазу и выхода в водную макрофазу соответственно.
Используя скорректированное значение константы скорости мономолекулярных процессов дезактивации энергии триплетных состояний kмон = 300 с-1, а также изменяя константу скорости тушения триплетных состояний эозина в белковой микрофазе (kTlМ) в интервале (3·104– 105 ) М-1с-1 (при больших значениях константы наблюдаем расхождение результатов моделирования), получено семейство зависимостей, по форме близких к экспоненциальным. Экспериментальные данные для растворов САЧ + эозин + ТМ (на рис. 1 выделено «*») максимально приближены к результатам моделирования с наибольшей погрешностью 4,3%. Скорректированное таким образом значение константы скорости тушения триплетных состояний эозина в белковой микрофазе (kTlМ) позволяет получить более достоверное значение концентрации тяжелых металлов в исследуемых растворах при учете неоднородного распределения молекул тушителя в исследуемом растворе САЧ.
 |
| Рис. 1. Моделирование кинетики затухания фосфоресценции молекул зонда - эозина в глобулярной фазе в присутствии ионов ТМ |
Моделирование временной зависимости изменения концентрации молекул зонда, входящего в состав люминесцентного сенсора, в триплетном состоянии при возбуждении импульсами светодиода и импульсной лампы осуществляли в Matlab.
Проведенные исследования показали, что для изучения кинетики затухания фосфоресценции необходимо выбирать импульсные источники с очень коротким фронтом спадания интенсивности свечения порядка нескольких мкс. Время релаксации таких источников излучения меньше времени затухания длительного свечения фосфоресценции. В нашем случае для изучения кинетики затухания фосфоресценции зондов с помощью установки импульсного флуориметра нами выбран импульсный лазер ЛТИПЧ-8, время вспышки которого составляет 20 мкс. Для портативного фосфориметра использован светодиод, работающий в импульсном режиме.
Моделирование работы электрической схемы с микропроцессорным управлением осуществлялось в симуляторе Proteus. Светодиод LB-P200G3C-H5 оптической ячейки работал в импульсном режиме с частотой 250 Гц на длине волны 515-530 нм и величиной светового потока 120-130 лм, что эквивалентно напряжению 0,7-0,8 В на выходе фотодиода SD 5421 – 002. Длительность импульса составляла 10-6 с. При моделировании импульсного сигнала светодиода без исследуемого образца производился подбор параметров элементов усилительного каскада фотодиода таким образом, чтобы минимизировать влияние переходных процессов в схеме на полезный сигнал фосфоресценции люминесцентного сенсора, при обеспечении режима максимального усиления. Время переходного процесса составило около 20 мкс, что при учете времени жизни фосфоресценции порядка 3 мс не оказывает существенного влияния на качество регистрации полезного сигнала.
В четвертой главе описана методика проведения экспериментов, описаны экспериментальные установки, а также приведены основные результаты.
С целью определения влияния микроокружения молекул люминесцентного зонда - эозина на его люминесцентные характеристики предварительно были получены спектры люминесценции эозина в воде и фосфатном буфере сывороточного альбумина человека (рис. 2). Молекула люминесцентного зонда тонко реагирует на изменение своего микроокружения изменением интенсивности и времени жизни люминесценции. По кинетике затухания фосфоресценции эозина определены константы скорости затухания фосфоресценции и времена жизни триплетных состояний эозина.
 |
| Рис. 2. Спектры флуоресценции эозина (С = 410-6 М): 1 – в водном растворе фосфатного буфера рН 7.4; 2 – в растворе фосфатного буфера САЧ; 3 – спектр фосфоресценции эозина в буфере САЧ |
По смещению максимумов в спектрах флуоресценции в воде (рис. 2, спектр 1, max = 541 нм) и в САЧ (рис. 2, спектр 2, max = 552 нм), а также по увеличению интенсивности и времени жизни триплетных состояний эозина при переходе от водных растворов ( =0,77 mс) к растворам сывороточного альбумина человека ( =3,1 mс) можно предположить, что эозин эффективно связывается с белками. Регистрацию фосфоресценции эозина осуществляли на специально созданном импульсном спектрофлуориметре в обескислороженных растворах.
Построив зависимости константы скорости затухания фосфоресценции k фосф от концентрации ионов тяжелых металлов [Q] и убедившись, что они носят линейный характер (рис. 3), применяли уравнение Штерна-Фольмера kфосф – (kфосф)о = kq[Q] для определения константы скорости тушения фосфоресцентных состояний эозина (табл.1). Погрешность аппроксимации при этом составила примерно 19 с-1. Значения константы скорости (kq) тушения фосфоресценции определялись как угловой коэффициент зависимости величины (kфосф) от концентрации тушителя - ионов тяжелых металлов [Q].
 |
| Рис. 3. Зависимость константы скорости затухания фосфоресценции эозина (С=4 мкМ) от концентрации тушителей: нитрат таллия (1) и йодида цезия (2) в САЧ (С САЧ=1 мг/мл) в фосфатном буфере рН 7,4 |
| Таблица 1. Эффективные константы Штерна-Фольмера тушения флуоресценции (Kqфл), фосфоресценции (Kqфосф) и константы скорости (kq) тушения триплетных состояний эозина в САЧ |
По результатам из-мерений интенсивности флуоресценции эозина в зависимости от концент-рации ионов тяжелых металлов построены зависимости Штерна-Фольмера и определены константы тушения ионами тяжелых метал-лов электронно-возбуж-денных синглетных состояний эозина в САЧ (табл.1). Значения константы тушения (Кq) флуоресценции определялись как угловой коэффициент зависимости величины (I0/I – 1) от концентрации тушителя [Q]: I0/I – 1= Кq[Q]. Необходимость введения эффективной константы тушения связана с тем, что в микрогетерогенном растворе белка молекулы зонда и ионы тяжелых металлов не равномерно распределены по объему, а концентрированы в глобуле белка. Результаты приведены в табл. 1. По полученной зависимости относительной интенсивности флуоресценции пирена от концентрации нитрата таллия (рис. 4, зависимость 1) получены значения эффективных констант Штерна-Фольмера тушения флуоресценции молекул пирена, связанных с белками (табл. 2).
| Таблица 2. Значения эффективных констант Штерна-Фольмера тушения флуоресценции пирена и антрацена в буфере рН 7,4 САЧ |
В таблице 2 приведены также результаты тушения флуоресценции пирена и антрацена нитратом таллия и меди, йодидом цезия и натрия. Из табл. 2 следует, что константа тушения флуоресценции антрацена анионом I– гораздо меньше, чем катионом Tl+. Полученные данные свидетельствуют о том, что при рН 7,4 в отрицательно заряженных белках гидрофобные зонды, какими являются ПАУ, менее доступны для анионов йода, чем для положительно заряженных катионов таллия и цезия. Наибольшее тушение анионами I– наблюдалось у пирена, что подтверждает предположение о том, что пирен локализуется в поверхностном слое глобулы белка. Эта пограничная область более доступна для анионов йода, чем более глубинные области глобулы белка, где может быть локализован антрацен. Наибольшая константа тушения у дианиона меди. Это может быть обусловлено более эффективным воздействием иона меди на структуру белка, вследствие чего увеличивается вероятность встреч зонда с тушителем.
Полученные результаты по тушению флуоресценции и фосфоресценции полярного зонда эозина, а также флуоресценции неполярных зондов пирена и антрацена свидетельствуют об эффективном тушении тяжелыми металлами таллия, свинца, меди и цезия, а также тяжелым атомом йода синглетных и триплетных состояний зондов, связанных с белками. Процесс тушения может реализоваться как в поверхностном слое глобулы белка, так и в глубинных областях. По изменению индекса полярности пирена (рис. 4, зависимость 2) установлено, что соли тяжелых металлов вызывают структурную перестройку в белках.
 | |
| Рис. 4. Зависимость интенсивности флуоресценции (1) и индекса полярности (2) пирена от концентрации нитрата таллия в САЧ (С=1 мг/мл) в фосфатном буфере рН 7,4; на вставке – спектр флуоресценции пирена |
Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что разработан технологический способ создания люминесцентного сенсора на основе молекулы белка. Сенсор представляет собой надмолекулярный комплекс «белок-ТМ-эозин» и «белок-ТМ-пирен или антрацен». Сенсор позволяет осуществить контроль содержания тяжелых металлов в белках.
Исследование фотофизических параметров люминесцентных сенсоров по взаимодействию квантовых точек (ZnCdS) с белками.
Автором исследованы люминесцентные сенсоры на основе наномаркеров – квантовых точек (КТ), обладающих более значительным квантовым выходом люминесценции по сравнению с красителями эозином и пиреном. Значение квантового выхода КТ практически не изменяется в течение долгого времени эксплуатации биосенсора. В качестве такого наномаркера была выбрана квантовая точка на основе ZnCdS.
При исследовании взаимодействия квантовых точек ZnCdS с молекулами сывороточного альбумина человека (САЧ) была получена зависимость интенсивности люминесценции квантовых точек от концентрации САЧ, представленная на рис. 5. Аналогичная зависимость наблюдалась для БСА. Возрастание интенсивности флуоресценции КТ может быть обусловлено образованием комплексов квантовая точка – макромолекула белка. Белки, локализованные на поверхности КТ, препятствуют образованию агрегатов большего размера.
 |
| Рис. 5. Зависимость интенсивности флуоресценции КТ ZnCdS от концентрации САЧ в буфере рН 7,4 |
Кроме того, при связывании макромолекул белка с КТ возможны изменения фотофизических свойств поверхности КТ. Это может привести к снижению дефектов на поверхности КТ и увеличению квантового выхода фотолюминесценции. В результате интенсивность люминесценции квантовых точек на длине волны 655 нм увеличивается.
Исследование тушения люминесценции сенсора на основе квантовых точек в воде нитратом меди Cu(NO3)2.
Автором исследованы процессы тушения люминесценции КТ ионами меди, которые образуются при растворении нитрата меди в водном растворе. По полученным результатам построена зависимость Штерна-Фольмера тушения флуоресценции КТ в водном растворе и САЧ. Результаты представлены на рис. 6. Для объяснения уменьшения интенсивности флуоресценции КТ при увеличении концентрации ионов меди было предположено, что тяжелые металлы образуют комплексы с КТ, в которых реализуется эффект тяжелого атома, приводящий к усилению спин-орбитальных взаимодействий в КТ. Данное явление может использоваться в электронике как метод управления спин-орбитальным взаимодействием в квантовых точках.
Возможно также изменение фотофизических свойств поверхности КТ при связывании ионов меди с поверхностью квантовой точки, что может также приводить к уменьшению интенсивности люминесценции поверхностных дефектов полупроводниковых наночастиц ZnCdS.
 |
| Рис. 6. Зависимости Штерна-Фольмера для тушения люминесценции КТ ионами меди: 1 – в САЧ; 2 – в воде |
По результатам, представленным на рис. 6, были определены значения констант тушения флуоресценции КТ в водном растворе К=0,04·104 М-1. При переходе к раствору САЧ константа тушения ионами меди флуоресценции КТ увеличилась до значения К=0,14·104 М-1. Следовательно, КТ могут использоваться при изготовлении активных элементов сенсоров на определение ТМ меди в белках плазмы крови.
Дальнейшее увеличение содержания ионов меди приводило к помутнению раствора, что, согласно существующим воззрениям, обусловлено образованием кластеров из глобул белка, в которых произошла нейтрализация зарядов при взаимодействии с ионами меди.
Автором исследованы свечения квантовых точек ZnCdS в органических пленках САЧ и бычьего сывороточного альбумина (БСА). Спектры флуоресценции КТ в пленке БСА представлены на рис. 7.
| Рис. 7. Спектр люминесценции квантовых точек ZnCdS в пленке БСА – 1; собственный спектр матрицы – 2; фоновый сигнал без образца – 3 |  |
Аналогичные результаты получены для пленки САЧ. Полученные результаты свидетельствуют об эффективном взаимодействии КТ ZnCdS с бычьим сывороточным альбумином и сывороточным альбумином человека.
Основные результаты и выводы
- Разработана технология создания люминесцентного сенсора на основе молекулы белка для микро- и наноэлектроники, позволяющая осуществлять контроль содержания тяжелых металлов в водных растворах, исследованы функциональные и эксплуатационные характеристики сенсора (Патент РФ № 24311132).
- С помощью модернизированной установки на базе спектрометра ДФС-24 изучены процессы тушения флуоресценции сенсоров ионами тяжелых металлов: таллия (Tl+), свинца (Pb2+), меди (Cu2+) и цезием (Cs+), а также ионами тяжелого атома йода (I-). Полученные результаты свидетельствуют об эффективном проникновении выбранных тяжелых металлов в полярные и неполярные микрообласти белка. Установлено, что процесс тушения люминесценции зондов может реализоваться как в поверхностном слое глобулы белка для эозина, так и в глубинных неполярных микрообластях для пирена и антрацена.
- На установке импульсного спектрофлуориметра получены результаты по тушению ионами таллия (Tl+), свинца (Pb2+), меди (Cu2+) и цезием (Cs+), а также тяжелого атома йода (I-) фосфоресценции полярного зонда эозина. Установлено, что константы тушения фосфоресценции эозина больше, чем тушения флуоресценции, что обусловлено значительно большим временем жизни триплетных состояний по сравнению с синглетными.
- Проведены исследования взаимодействия полупроводниковых квантовых точек (КТ) ZnCdS с белками и тяжелыми металлами. Обнаружено тушение люминесценции КТ ионами меди в САЧ. Определенное значение константы скорости тушения ионами меди (Cu2+) люминесценции КТ в САЧ составило 0,14·104 М-1. Предположено, что тушение люминесценции КТ ионами меди обусловлено усилением спин-орбитальных взаимодействий в квантовых точках под действием ионов тяжелых металлов. Не исключено изменение фотофизических свойств поверхности КТ при связывании ионов меди с поверхностью квантовой точки, что приводит к уменьшению интенсивности люминесценции поверхностных дефектов полупроводниковых наночастиц ZnCdS. Таким образом, показана возможность использования комплекса КТ/молекула белка в качестве люминесцентного сенсора определения ионов тяжелых металлов в водных растворах.
- Обнаружено изменение колебательной структуры спектра флуоресценции пирена в САЧ при добавлении соли ТМ нитрата таллия. Установлено, что соли тяжелых металлов вызывают структурную перестройку в белках, это может быть использовано в сенсорах для физико-химической медицины при определении структурных изменений в белках под действием тяжелых металлов.
- Разработан портативный импульсный фосфориметр на основе люминесцентного сенсора. Подобраны параметры электрической схемы таким образом, чтобы минимизировать влияние переходных процессов в схеме для регистрации полезного сигнала. Проведены тестовые измерения кинетики и определено время жизни фосфоресценции люминесцентного сенсора: эозин-САЧ-ТМ.
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
Публикации в центральных изданиях, включенных в перечень
периодических изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России
- Наумова, Е. В. Люминесцентный сенсор для определения экотоксикантов в биологических средах / Е. В. Наумова, Г. В. Мельников// Вестник Саратовского государственного технического университета. – 2013. – № 1. – С. 155–160.
- Наумова, Е. В. Тушение фосфоресценции зондов в белках ионами тяжелых металлов / Е. В. Наумова, А. Г. Мельников, Г. В. Мельников // Журнал прикладной спектроскопии. – 2013. – Т. 80. – № 2. – С. 165–170.
- Наумова, Е. В. Определение ионов тяжелых металлов в сывороточном альбумине человека методом импульсной фосфориметрии / Е. В. Наумова, А. Г. Мельников, А. А. Поляков // Вестник Саратовского государственного технического университета. – 2010. – № 4. – С. 35–38.
Патенты
- Пат. 24311132 Российская Федерация, МПК7 G 01 N 21/64. Люминесцентно-кинетический способ определения наличия ионов тяжелых металлов в водных растворах и устройство для его реализации / Е. В. Наумова [и др.] ; заявитель и патентообладатель СГТУ – № 2010119360/28 ; заявл. 17.05.2010 ; опубл. 10.10.2011, Бюл. № 28. – 8 с. : ил.
- Пат. 118755 Российская Федерация МПК7 G 01 N 21/64. Устройство для регистрации фосфоресценции люминесцентных зондов в биологических образцах / Е. В. Наумова [и др.] ; заявитель и патентообладатель СГТУ имени Гагарина Ю. А. – № 2012118417/28; заявл. 03.05.2012 ; опубл. 27.07.2012, Бюл. № 21. – 5 с. : ил.
Программы для ЭВМ
- Программа моделирования процессов тушения люминесценции биосенсоров / Е. В. Наумова [и др.] ; Свидетельство Роспатента о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2013615068 (зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 27.05. 2013).
Публикации в других изданиях
- Наумова, Е. В. Тушение тяжелыми атомами триплетных состояний люминесцентных зондов в исследовании структурных преобразований в белках / А. Г. Мельников, Е. В. Наумова // Ломоносов : XIV Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых : материалы докл. XIV Междунар. конф. / МГУ. – М., 2007. – 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).
- Наумова, Е. В. Эффекты тяжелого атома в изучении структурных изменений в белках люминесцентными методами / Е. В. Наумова (Лось), А. Г. Мельников // Симпозиум «Нанофотоника» : сб. тез. докл. / ИПХФ РАН. – Черноголовка, 2007. – С. 113.
- Naumova, E.V. Probe phosphorescence and triplet-triplet energy transfer in the study of conformation changes in the proteins / E. V. Naumova [et al.] // Book of abstract International conference «Organic nanophotonics» (ICON – RUSSIA 2009) / St. Petersburg, 2009. – Р. 143.
- Наумова, Е. В. Математическая модель импульсного фосфориметра для экологического мониторинга / Е. В. Наумова [и др.] // Проблемы управления, передачи и обработки информации (АТМ-ТКИ-50) : сб. тр. Междунар. науч. конф. / СГТУ. – Саратов, 2009. – С. 175–176.
- Наумова, Е. В. Обменно-резонансный перенос энергии электронного возбуждения в белках / А. В. Купцова, А. Г. Мельников, Е. В. Наумова // Инновации и актуальные проблемы техники и технологий : материалы Всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых : в 2 т. / СГТУ. – Саратов, 2009. – Т. 1. – С. 255–257.
- Наумова, Е. В. Импульсный фосфориметр в изучении структурных изменений в биополимерах методом переноса энергии / О. А. Дячук, А. Г. Мельников, Е. В. Наумова // Наноинженерия-2009 : сб. тр. II Всерос. школы-семинара аспирантов и молодых ученых / МГТУ. – М., 2009. – С. 315.
- Наумова, Е. В. Сенсор для определения внутримолекулярных структурных изменений в белках / А. Г. Мельников, Е. В. Наумова // Второй Междунар. форум по нанотехнологиям : сб. тез. докл. / ОАО «Роснано». – М., 2009. – С. 560–561.
- Наумова, Е. В. Импульсный фосфориметр как средство экологического контроля наличия тяжелых металлов в водных растворах / Е. В. Наумова, А.Г. Мельников // Инновации и актуальные проблемы техники и технологий : материалы Всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых : в 2 т. / СГТУ. – Саратов, 2010. – Т. 2. – С. 63–65.
- Наумова, Е. В. Определение тяжелых металлов в белках с помощью люминесцентного наносенсора / А. Г. Мельников, Е. В. Наумова, Г. В. Мельников // Биосовместимые материалы и покрытия : материалы Всерос. конкурса научных работ бакалавров и магистрантов / СГТУ. – Саратов, 2010. – С. 130.
- Наумова, Е. В. Люминесцентные методы определения экотоксикантов в биологических средах / Е.В. Наумова [и др.] // Экологические проблемы промышленных городов : сб. науч. тр. Всерос. науч.-практ. конф. : в 2 ч. / СГТУ. – Саратов, 2011. – Ч.1. – С. 85-87.
- Наумова, Е. В. Тушение фосфоресценции наномаркеров ионами тяжелых металлов и акцепторами энергии в определении структурных перестроек в белках / Е. В. Наумова [и др.] // Фотоника органических и гибридных наноструктур : сб. тез. докл. Всерос. конф. / ИПХП РАН. – Черноголовка, 2011. – С. 107.
- Наумова, Е. В. О разработке импульсного фосфориметра на основе люминесцентного сенсора для контроля тяжелых металлов в биологических образцах/ Е.В. Наумова // Экономика природопользования и природоохраны : сб. статей XV Междунар. науч.-практ. конф. / АННОО «Приволжский Дом знаний». – Пенза, 2012. – С. 67–69.
- Наумова, Е. В. Особенности процессов тушения тяжелыми металлами фосфоресценции люминесцентных зондов, связанных с белками / Е. В. Наумова [и др.] // IV Съезд биофизиков России : материалы докл. / НГУ им. Н.И. Лобачевского. – Н. Новгород, 2012. – С. 168.
- Наумова, Е. В. Биосенсор на основе квантовых точек в определении солей тяжелых металлов / Е. В. Наумова [и др.] // II Междунар. заоч. науч. конф. для молодых ученых, студентов и школьников «Наноматериалы и нанотехнологии: проблемы и перспективы» : электронное науч. издание / ФГУП НТЦ «Информрегистр», Депозитарий электронных изданий, 2013. – С. 404–409.
Подписано в печать 30.08.2013 Формат 6084 1/16
Бум. офсет. Усл. печ. л. 1,0 Уч.-изд. л. 1,0
Тираж 100 экз. Заказ 21
ООО «Издательский Дом «Райт-Экспо»
410031, Саратов, Волжская ул., 28
Отпечатано в ООО «ИД «Райт-Экспо»
410031, Саратов, Волжская ул., 28, тел. (8452) 90-24-90
