Уровень молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти разных генотипов по локусам bola drb 3 и каппа-казеина

На правах рукописи

МАЧУЛЬСКАЯ ЕЛЕНА ВИТАЛЬЕВНА

УРОВЕНЬ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КОРОВ ГОЛШТИНСКОЙ ПОРОДЫ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ МАСТИ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ ПО ЛОКУСАМ BoLA DRB 3 И КАППА-КАЗЕИНА

06.02.01 – Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ставрополь – 2009 г.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии отдела разведения и генетики свиней ГНУ «Северо-Кавказский научно–исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук».

Научный руководитель: доктор биологических наук

Ковалюк Наталья Викторовна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных

наук, профессор

Яковенко Алексей Михайлович

кандидат биологических наук

Белов Денис Евгеньевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный университет».

Защита диссертации состоится 11 декабря 2009 г., в 1130 часов на заседании диссертационного совета Д.006.078.01 при Ставропольском научно-исследовательском институте животноводства и кормопроизводства по адресу: 355017, Ставропольский край, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 15, тел./факс (8652) 34-76-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского научно-исследовательского института животноводства и кормопроизводства.

Автореферат разослан « 10 » ноября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета М.И. Селионова

1. общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время в мире активно ведется поиск участков генома, имеющих наибольшее влияние на хозяйственно-полезные признаки и иммунитет животных.

Зарубежными исследователями был выявлен ген BoLA DRB 3 (Bovine Leukocyte Antigens), который является одним из ключевых генов, определяющих первичный иммунный ответ организма на вирусные и бактериальные инфекции. Так, например, разные аллели этого гена играют не одинаковую роль в формировании устойчивости крупного рогатого скота к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза (ВЛКРС)[Xu, Van Eijk, Park, 1993; Mirsky, Lewin, 1998; Mota et al., 2002; Nassiry, Shahroodi, Mosafer, 2005].

Показано, что животные, несущие аллели BoLA DRB 3*11, *23, *28 – У (устойчивые) не склонны к переходу лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза (в гематологическую стадию), а животные, несущие в своем генотипе аллели BoLA DRB 3*22, *24, *16, *8 Ч (чувствительные) – напротив, чаще других оказываются в выборке гематологических больных. Н (нейтральные) - аллели не ассоциируются ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу [Сулимова и др. 1995, 2000].

Изучается взаимосвязь тех или иных BoLA DRB 3 аллелей и молочной продуктивности животных. Так в работе Sharif,  Mallard,   Wilkie,  Sargeant,   Scott,   Dekkers,   Leslie [1999] на значительной выборке (n=835) показана достоверная взаимосвязь наличия в генотипе BoLA DRB 3*8 аллели и повышенного уровня молочной продуктивности.

Актуально проведение подобных исследований в условиях Краснодарского края, для определения насколько в этом регионе крупный рогатый скот генетически предрасположен к развитию лейкоза и как BoLA DRB 3 генотип влияет на молочную продуктивность.

Не менее интересные и значимые в хозяйственном отношении исследования проводились и в области изучения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина, его влияния на молочную продуктивность, качественные показатели моло­ка и сыропригодность.

В связи с изложенным выше актуально провести исследования по изучению аллельного полиморфизма гена каппа-казеина в условиях Краснодарского края на голштинской породе черно-пестрой масти.

Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы – изучить влияние генотипа по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина на хозяйственно ценные признаки крупного рогатого скота голштинской породы черно-пестрой масти.

В связи с этим были поставлены и решены следующие задачи:

1. Оптимизировать ПЦР/ПДРФ тестирование по локусу BoLA DRB 3, позволяющее с минимальными потерями реактивов и рабочего времени определять генотип;

2. Установить частоты встречаемости полиморфных вариантов генов BoLA DRB 3 и каппа-казеина у коров голштинской породы черно-пестрой масти;

3. Изучить влияние структуры генов BoLA DRB 3 и каппа-казеина на показатели молочной продуктивности и резистентности к инфекционным заболеваниям коров;

4. Оценить экономическую эффективность применения индивидуального подбора быков-производителей на основе использования маркера BoLA DRB3 в условиях промышленной технологии производства молока.

Научная новизна исследований. Оптимизирована методика эффективного выделения ДНК из спермы быков-производителей с применением реагентов-тиовосстановителей - 10 мМ дитиотрейтола (ДТТ) и 0,2% 2-меркалтоэтанола. Усовершенствован метод ПДРФ при определении ДНК-полиморфизма гена BoLA DRB 3, с использованием дополнительных рестриктаз Bst2UI и AspLEI. Установлена связь генотипа BoLA DRB 3 с показателями молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти I-II лактации.

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Создана оптимальная схема генотипирования животных по локусу BoLA DRB 3, позволяющая с минимальными потерями реактивов и рабочего времени определять генотип. Использована схема индивидуального подбора быков-производителей с целью максимального повышения у потомства частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа Ч/У по локусу BoLA DRB 3, сочетающего в себе Ч – аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У – аллель – показатель высокого иммунитета. Результаты исследований использованы в работе племенного хозяйства ОАО «Агрообъединение «Кубань», Усть-Лабинского района Краснодарского края.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- Усовершенствованный метод ПДРФ, позволяющий точно идентифицировать аллели гена BoLA DRB 3 и пригодный для массового типирования животных.

- Взаимосвязь генотипов по локусам BoLA DRB 3 и каппа-казеина с количественными и качественными показателями молочной продуктивности коров голштинской породы черно-пестрой масти.

- Внедрение в практику селекционно-генетического способа, позволяющего повысить частоту встречаемости ценного в хозяйственном отношении генотипа по локусу BoLA DRB 3.

Апробация результатов исследований. Автором опубликовано 12 печатных работ, в том числе по теме диссертации - 7 работ. Публикация в издании, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ: Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. – 2007. - №8. - С. 2-4.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях:

- VIII региональная научно-практическая конференция молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». – Краснодар: КубГАУ, 2006.

- 6-я Международная научная конференция «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных».– Дубровицы: ВИЖ, 2006.

- Международная научно-практическая конференция «Современные достижения зоотехнической науки и практики – основа повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». – Краснодар, 2007.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, предложения производству, список литературы, включающий 144 работы, в том числе 61 зарубежных авторов. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 13 рисунков.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились на базе лаборатории биотехнологии Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства в период 2006-2009 гг. Объектом исследования были голштинские коровы черно-пестрой масти, быки и их потомство. Материалом для исследований служила кровь коров ОАО «Агрообъединение «Кубань», Усть-Лабинского р-она, n=834 и сперма быков-производителей ООО НПСХП «Астер», г.Краснодар, n=50. Исследования проводили по схеме:

Рисунок 1. Схема исследований.

Забор крови проводился с использованием одноразового инструмента; в качестве антикоагулянта использовался 1,5 М цитрат натрия или ЭДТА. Образцы спермы поступали на анализ в виде гранул, пайетт или на фильтровальной бумаге в высушенном виде.

Для выделения ДНК из крови и спермы, постановки ПЦР, ПДРФ-анализа, электрофореза использовали стандартные методики с собственными модификациями [Van Eijk, Stewart-Haynes, Levin,1992; Xu, М. Van Eijk., Park, 1993; Херрингтон и др., 1999].

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам [Лакин, 1980] с использованием программного обеспечения MS Excel.

Экономический эффект от создания модельной популяции с использованием генетических маркеров рассчитывали по формуле Р = (ОВ – ОЗ) / ОЗ * 100%, где Р – рентабельность, ОВ – общая выручка, ОЗ – общие затраты.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Отработка методических подходов к выделению ДНК из спермы быков-производителей.

Образцы спермы быков-производителей были представлены в трех формах хранения:

а) криоконсервированная сперма в гранулах объёмом 200 мкл (12 образцов);

б) криоконсервированная сперма в полипропиленовых соломинках (пайеттах) объёмом 200 мкл (12 образцов);

в) образцы спермы, нанесенные на разные типы фильтровальной бумаги (12 образцов).

Была поставлена задача – отработать оптимальный вариант выделения ДНК из каждой представленной формы хранения семени быков-производителей. Для выделения ДНК из образцов семени использовали:

- набор реагентов Diatom™ Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген»;

- 0,2 % 2-меркаптоэтанол;

- 10 мМ дитиотрейтол.

Результаты выделения ДНК определяли с помощью электрофореза в агарозном 2,5% геле, окрашенном бромистым этидием. О концентрации ДНК в растворе судили по интенсивности свечения образцов в ультрафиолетовом свете.

Установили, что выделение ДНК из семени быков без использования реагентов-тиовосстановителей (дитиотрейтола или 2-меркаптоэранола) является неэффективным. При этом принципиальной разницы в действии на процесс выделения между 2-меркаптоэтанолом и дитиотрейтолом не наблюдается. При выделении ДНК из семени быков хранящегося в сухом виде на фильтре выход спермальной ДНК оказывается прямо пропорциональным увеличению плотности фильтра.

3.2. Оптимизация подходов для проведения массового тестирования животных.

Массовое тестирование материнского стада необходимо проводить быстро и точно. В этой связи исследования выполнялись в определённой последовательности, что позволило сократить время генотипирования и ряд операций. Применяли следующий алгоритм действий:

1. Анализ Rsa I -электрофореграмм рестрикции позволял генотипировать 10-20% животных.

2. При использовании параллельно двух рестриктаз – Rsa I и Hae III - удаётся генотипировать 60-70% животных.

Как правило, мы одновременно проводили рестрикцию эндонуклеазами Rsa I и Hae III, а полученные результаты заносили в таблицу следующего вида:

Таблица 1.- Форма для генотипирования животных по локусу BoLA DRB3

№ пробирки	№ животного	Rsa I	Hae III	Bst YI	Bst2UI	BoLA DRB3 генотип

3. Для некоторых животных требуется рестрикция ПЦР-продукта эндонуклеазами BstYI и/или Bst2UI для определения BoLA DRB 3 генотипа.

При генотипировании нескольких коров и быков возникала ситуация, когда генотип животного можно было определить как 8*28, если идентифицировать паттерны как: f/o, a/b, a/b, b/f; или 10*26, если идентифицировать паттерны как: f/o, a/b, b/a, f/b (табл. 2).

Таблица 2.- Сопоставление ДНК-паттернов генотипов 8*28 и 10*26 по локусу BoLA DRB 3

рестриктаза аллель BoLA DRB3	Rsa I	Hae III	Bst Y I	Bst 2UI	генотип BoLA DRB3
*8	f	a	a	b	8*28
*28	o	b	b	f
*10	f	a	b	f	10*26
*26	o	b	a	b

А так как генотипы 8*28 (Ч/У) и 10*26 (Н/Н) принципиально отличаются между собой по статусу отношения к лейкозу, и особенно это важно при генотипировании быков-производителей и при индивидуальном подборе их на коров материнского стада, то возникает необходимость использовать дополнительную рестриктазу, которая бы позволила различать между собой эти два генотипа.

Используя базу данных GenBank получили нуклеотидные последовательности второго экзона гена BoLA DRB 3 для аллелей *8, *28, *10, *26. В программе Primer Premier 5 построили для каждой из них рестрикционные карты и определили ДНК-паттерны, образующиеся при действии на ПЦР-продукт (284 пн) различными рестриктазами. Из множества имеющихся в базе данных программы Primer Premier эндонуклеаз рестрикции, отобрали те рестриктазы, которые позволяют дифференцировать генотипы 8*28 (Ч/У) и 10*26 (Н/Н). Рестриктазы-аналоги экзона 2 гена BoLA DRB3 объединили в группы и провели анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз каждой из групп.

Таблица 3.- Рестриктазы, позволяющие дифференцировать генотипы 8*28 (Ч/У) и 10*26 (Н/Н) по локусу BoLA DRB3

Эндонуклеаза рестрикции		BoLA DRB3*8, ДНК-паттерны	BoLA DRB3*28, ДНК-паттерны	BoLA DRB3*10, ДНК-паттерны	BoLA DRB3*26, ДНК-паттерны
группа	название
1	AccB7I AcpII Asp10HII Esp1396I PfIMI Van91I	а	а	b	а
2	AccII BepI Bpu95I Bsh1236I Bsp50I BstUI Bsu1532I CspKVI FauBII FnuDII MvnI ThaI	c	m	n	а
3	AspLEI CfoI FnuDIII HhaI	e	f	g	g
4	Hin6I HinP1I HspAI SciNI	i	j	h	h
5	SeII	d	k	l	а

Условно обозначенные ДНК – паттерны и соответствующие им фрагменты рестрикции:

a – 284; b – 181, 103; c – 215, 61, 8; d – 213, 63, 8; e – 118, 98, 68; f – 118, 114, 52; g – 166, 118; h – 168, 116; i – 116, 98, 70; j – 116, 116, 52; k – 167, 117; l – 220, 64; m – 169, 115; n – 222, 62 (в парах нуклеотидов – п.н.)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Рисунок 2. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле продуктов амплификации экзона 2 гена BoLA DRB 3 после рестрикции эндонуклеазами, представленными в табл. 3.

1,2- амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 1;

3,4- амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 2;

5. Маркер молекулярной массы (шаг маркера 50 пар нуклеотидов);

6,7 -амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 3;

8,9- амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 4;

10,11 -амплификат, рестрицированный эндонуклеазами группы 5;

1, 3, 6, 8, 10 – ДНК (амплификат) от животного

с генотипом BoLA DRB3 *8/ BoLA DRB3*28

2, 4, 7, 9, 11 - ДНК (амплификат) от животного

с генотипом BoLA DRB3 *10/ BoLA DRB3*26

Из указанных выше эндонуклеаз (табл. 3) нами была выбрана рестриктаза AspLEI. Таким образом, мы предлагаем проводить ПДРФ-анализ при типировании по по локусу BoLA DRB 3, используя эндонуклеазы рестрикции в следующей последовательности:

RsaI HaeIII Bst2XI Bst2UI AspLEI

3.3. Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA DRB 3 в исследуемом стаде.

По гену BoLA DRB 3 было генотипировано 834 коровы и 50 быков-производителей голштинской породы черно-пестрой масти (табл. 4).

Таблица 4.- Частота встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB 3

Генотип BoLA DRB 3	Коровы, (n=834)		Быки, (n=50)
	количество животных	количество животных, %	количество животных	количество животных, %
(Ч/Ч)	340	40,8	15	30,0
(Ч/У)	154	18,5	8	16,0
(Ч/Н)	222	26,6	15	30,0
(У/У)	14	1,7	2	4,0
(Н/Н)	46	5,5	5	10,0
(Н/У)	58	6,9	5	10,0

Наиболее многочисленными оказались группы животных, относящиеся к Ч/Ч, Ч/У и Ч/Н генотипам, т.е. генотипам, в состав которых входят чувствительные аллели. Эта тенденция характерна как для коров, так и чистопородных голштинских быков. Соответственно, в распределении аллелей гена BoLA DRB 3 наблюдается смещение в сторону чувствительных (Ч) аллелей – 63,3 % (табл. 5).

Таблица 5.- Частота встречаемости аллелей по локусу BoLA DRB 3

Частота встречаемости аллелей, N=834	процент данного типа аллеля в выборке	количество носителей данного аллеля	процент носителей данного типа аллеля в выборке
Н	22,3	326	39,1
Ч	63,3	716	85,8
У	14,4	226	27,1

Анализ распределения генотипов в группе выбракованных животных также показывает увеличение доли животных с генотипами Ч/Ч и Ч/Н. Это еще раз подтверждает тот факт, что животные, несущие в своем генотипе чувствительные аллели, чаще других попадают в группу больных и выбывают из стада, особенно по причине инфекционных заболеваний (табл. 6).

Таблица 6.- Распределение генотипов по локусу BoLA DRB 3 у выбракованных животных, ОАО «Агрообъединение «Кубань»

Распределение	Частота встречаемости генотипа BoLA DRB 3, %
	Ч/Ч	Ч/У	Ч/Н	У/У	Н/Н	Н/У
По стаду в целом, (N=834)	40,8	18,5	26,6	1,7	5,5	6,9
Все выбывшие, (N=186)	40,3	13,2	30,2	2,7	9,1	4,5
Выбывшие по причине инфекционных заболеваний, (N=157)	44,6	9,2	32,9	1,9	7,2	4,2

Но, тем не менее, в результате искусственного отбора, а точнее селекции на молочную продуктивность, эти генотипы не элиминируются, а, наоборот, продолжают накапливаться. Мы изучили качественные и количественные показатели молочной продуктивности исследуемых животных.

3.4. Качественные и количественные показатели молочной продуктивности голштинских коров черно-пестрой масти и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3.

Для удобства проведения расчетов и статистической обработки из общего стада (N=834) была сформирована выборка коров в размере N=115. В каждую из шести полученных групп (Ч/Ч, Ч/У, Ч/Н, Н/Н, У/Н и У/У) попали животные – полные аналоги по возрасту, дате первого отела, условиям кормления и содержания. Таким образом, было отобрано по 30 животных с генотипами Ч/Ч, Ч/У и Ч/Н, по 10 животных с генотипами Н/Н, У/Н и 5 животных с генотипом У/У.

Таблица 7.- Количественные показатели молочной продуктивности коров исследуемой выборки

I лактация
Генотип BoLA DRB 3	Количество измерений	Продуктивность, кг/сут., ±	Cs (%)	Продуктивность, (кг/305 дн. лактации)
(Ч/Ч), N=30	235	24,8** ± 0,32	1,3	7398±102
(Ч/У), N=30	225	26,0 ± 0,34	1,3	7685±107
(Ч/Н), N=30	222	23,9*** ± 0,50	2,1	7141±154
(У/У), N=5	30	25,5 ± 1,09	4,2	7604±328
(Н/Н), N=10	62	26,5 ± 0,79	2,3	7860±237
(Н/У), N=10	57	24,5* ± 0,54	2,2	7306±165
Итого,N=115	831	25,0±0,25	1,0	7447±89
II лактация
(Ч/Ч), N=26	239	24,1*** ± 0,51	2,1	7203±158
(Ч/У), N=28	268	26,2 ± 0,33	1,2	7831±101
(Ч/Н), N=23	211	23,9*** ± 0,62	2,6	7143±192
(У/У), N=5	42	25,2 ± 0,76	3,0	7532±231
(Н/Н), N=8	80	26,0 ± 0,68	2,6	7771±207
(Н/У), N=9	90	24,4** ± 0,47	1,9	7293±143
Итого, N=99	930	24,9 ± 0,30	1,2	7442±97

Примечание: здесь и далее: * - P<0.05; ** - P<0.01; ***- P<0.001. Достоверность различий определялась относительно группы Ч/У.

Данные по I и II лактациям исследуемых животных показывают превосходство по количественным показателям молочной продуктивности в группах Ч/У, У/У и Н/Н, но так как две последние группы довольно малочисленны и, к тому же, имеют одни из самых высоких показателей репрезентативных ошибок (по I лактации: У/У – 1,09; Н/Н – 0,79; по II лактации: 0,76 и 0,68 соответственно), целесообразным будет определение достоверности различий выборочных средних, используя критерий Стьюдента, относительно группы Ч/У.

Группа Ч/У (26,0-26,2 кг/сут) превосходила по молочной продуктивности группы Ч/Ч (24,8-24,1 кг/сут), Ч/Н (23,9 кг/сут) и У/Н (24,5-24,4 кг/сут), достоверно от них отличаясь и имея при этом наименьшее значение ошибки репрезентативности (0,33-0,34). В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше по I лактации и на 628-688 кг больше по II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч. Во II лактации немного снижаются (24,8 24,1 кг/сут) показатели молочной продуктивности у животных с генотипом Ч/Ч, видимо, вследствие более частого поражения инфекционными заболеваниями. Наименьшая молочная продуктивность отмечена в группе животных с генотипом Ч/Н (23,9 кг/сут), причем эти животные изначально имеют низкий продуктивный потенциал и, к тому же, чаще остальных подвергаются выбраковке по причине инфекционных заболеваний.

Были изучены качественные показатели молочной продуктивности коров исследуемой выборки (жир, белок, лактоза, сухое вещество), но достоверных отличий между группами выявлено не было.

Также мы установили, что не отдельные аллели гена BoLA DRB 3, а их конкретные сочетания достоверно влияют на количественные показатели молочной продуктивности коров голштинской породы.

3.5. Взаимосвязь генотипа по локусу каппа – казеина с показателями молочной продуктивности у голштинских коров черно-пестрой масти.

Изучаемая выборка коров (N=115) была также генотипирована по локусу каппа-казеина. По итогам тестирования выделили три группы – АА, АВ и ВВ. Были определены частоты встречаемости каждого генотипа. В свою очередь, каждая из групп была разбита на подгруппы в зависимости от принадлежности к тому или иному генотипу по BoLA DRB 3, в каждой из которых были посчитаны среднесуточные показатели молочной продуктивности.

Наиболее встречаемыми являются генотипы группы АА (68,1%), менее встречаемыми – ВВ (1,7%), гетерозиготный генотип АВ по частоте встречаемости занимает среднее положение (30,2%). У быков частоты встречаемости генотипов по локусу каппа-казеина имеют схожие тенденции, что и у коров. Преобладает генотип АА (52%), не на много ему уступает по частоте встречаемости генотип АВ (42%) и самым редко встречаемым, как и в выборке коров, является генотип ВВ (6%).

Таблица 8.- Количественные показатели молочной продуктивности коров различных генотипов по генам BoLA DRB 3 и каппа – казеина

Генотип по локусу BoLA DRB 3	Генотип по локусу каппа-казеина
	АА, N=78			АВ, N=35			ВВ, N=2
	встречаемость, %	с/сут. удой, ±	Cs (%)	встречаемость, %	с/сут. удой, ±	Cs (%)	встречаемость, %	с/сут. удой, ±	Cs (%)
Ч/Ч N=30	20,2 N=23	25,2±0,89	3,5	4,3 N=5	22,6±1,71	7,5	1,7 N=2	25,9±2,63	10,1
Ч/У N=30	15,7 N=18	25,8±0,72	2,8	10,4 N=12	26,1±1,45	5,5	-	-	-
Ч/Н N=30	14,9 N=17	22,9**±0,70	3,0	11,2 N=13	25,0±1,03	4,1	-	-	-
У/У N=5	4,3 N=5	25,6±1,84	7,1	-	-	-	-	-	-
Н/Н N=10	8,7 N=10	26,4±0,46	1,7	-	-	-	-	-	-
У/Н N=10	4,3 N=5	25,3±0,92	3,6	4,3	23,0±0,12	0,5	-	-	-
выборка N=115	68,1	25,0±0,41	1,6	30,2	24,9±0,73	2,9	1,7	25,9±2,63	10,1

По количественным показателям молочной продуктивности, все генотипы (АА, АВ и ВВ) гена каппа-казеина равнозначны. А наилучшими качественными показателями молока обладают животные, имеющие генотип АВ по гену каппа-казеина.

3.6. Повышение частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа BoLA DRB 3.

Для того чтобы добиться повышения молочной продуктивности и повышения резистентности животных к инфекционным заболеваниям, необходимо увеличить частоту встречаемости генотипа Ч/У. Так как этот генотип является наиболее выгодным в хозяйственном отношении.

В ОАО «Агрообъединение «Кубань» было проведено индивидуальное закрепление быков-производителей на маточное поголовье следующим образом:

Ч/Ч У/У

Ч/Н Х У/У Баклан 6352 (11*23) У/Н Х Ч/Ч Кубок 1459 (8*24)

Н/Н Фокус 1133 (23*23) Ч/У Хит 7777 (16*24)

Таблица 9.- Наблюдаемые и расчетные частоты встречаемости у материнского поголовья и их дочерей в I поколении.

Частота встречаемости у материнского поголовья (общая по стаду, N=834)
аллелей, %			генотипов, %
Ч	У	Н	Ч/Ч	Ч/У	Ч/Н	У/У	Н/Н	У/Н
63,3	14,4	22,3	40,8	18,5	26,6	1,7	5,5	6,9
средняя продуктивность (305 дн. лакт.), кг (±)			7405±101
Расчетная частота встречаемости при индивидуальном закреплении быков, I поколение
аллелей, %			генотипов, %
Ч	У	Н	Ч/Ч	Ч/У	Ч/Н	У/У	Н/Н	У/Н
45,2	43,7	11,1	9,3	68,5	3,4	-	-	18,8
Частота встречаемости у дочерей (I поколение, N=56)
аллелей, %			генотипов, %
Ч	У	Н	Ч/Ч	Ч/У	Ч/Н	У/У	Н/Н	У/Н
44,5	44,5	11,0	10,9	67,3	-	-	-	21,8
Расчетная средняя продуктивность (305 дн. лакт.), кг			7571

От 115 коров исследуемой выборки было получено 94 теленка, из которых 56 были телочки. В раннем возрасте телочки были исследованы по локусу BoLA DRB 3 и установлены частоты встречаемости аллелей и генотипов этого гена.

В результате индивидуального подбора быков-производителей на маточное поголовье произошло повышение частоты встречаемости выгодного в хозяйственном отношении генотипа Ч/У с 18,5 % у материнского поголовья до 67,3 % у дочерей в I поколении.

Также нами составлен прогноз частоты встречаемости в следующих поколениях тех или иных генотипов по локусу BoLA DRB 3 и количественных показателей молочной продуктивности, с использованием уже имеющихся данных по продуктивности и предполагая, что индивидуальное закрепление быков-производителей на материнское поголовье будет проводиться по указанной выше схеме. Теоретические расчеты показывают, что молочная продуктивность в модельной популяции в последующих поколениях остается высокой (7531 и 7583 кг/305 дн. во II и III поколении, соответственно), а выгодный в хозяйственном отношении генотип BoLA DRB 3 (Ч/У) встречается с частотой 54,7% и 67,1 % во II и III поколении, соответственно. Если учесть, что поголовье станет более резистентным к инфекционным заболеваниям и, в связи с этим, меньше животных будет выбывать из стада, а молочная продуктивность от лактации к лактации будет повышаться, то экономически формирование такой популяции является выгодным.

3.7. Экономическое обоснование исследований

Экономический эффект дан в расчете на 100 голов:

1. Группа I (исходная группа) (n=100) представлена животными с генотипами по гену BoLA DRB 3 : Ч/Ч – 40,8 %, Ч/У – 18,5 %, Ч/Н – 26,6 %, У/У – 1,7 %, Н/Н – 5,5 %, Н/У – 6,9 %. Группа II (модельная группа, I-е поколение) (n=100) имеет следующую структуру по вышеуказанному гену: Ч/Ч – 9,3 %, Ч/У – 68,5 %, Ч/Н – 3,4 %, У/Н – 18,8 %.

2. В течение первых двух лактаций из группы I и II выбывает 22,0% и 17% коров, соответственно (т.е. по 11 голов из группы I и по 8 и 9 голов из группы II за I и II лактации).

3. Средняя продуктивность в группе I составляет в среднем за 305 дней лактации 7405 кг, в группе II – 7571 кг.

4. Молоко реализовывалось по цене 8,0 руб. за 1 кг.

5. Затраты на выращивание телок до первой лактации в обеих группах таковы: 70% корма, 30% - прочие расходы, возраст начала 1 лактации – 2,5 года (при расходе 8 кормовых ед./день себестоимость кормов составляет для одного животного – 18250 руб., а себестоимость выращивания 1 животного –26071 руб.).

6. Затраты на производство 1 кг молока в обеих группах одинаковы: 70% корма, 30% - прочие расходы, на производство 1 кг молока затрачивается 1,1 кормовая единица, стоимость 1 кормовой единицы – 2,5 руб.; тогда себестоимость кормов составляет 2,75 руб., а себестоимость производства 1 кг молока – 3,95 руб.

7. Выручка от реализации молока за 2 лактации в группе I составила 9,893 млн. руб. (89 гол. (100 гол.-11гол.) х 7405 кг х 1 лактацию х 8 руб.+78 гол. (89 гол.-11гол.) х 7405 кг х 1 лактацию х 8 руб.=9,893 млн. руб.). Выручка от реализации молока за 2 лактации в группе II составит 10,599 млн. руб. (92 гол. (100 гол.-8 гол.) х 7571 кг х 1 лактацию х 8 руб.+83 гол. (92 гол.-9 гол.) х 7571 кг х 1 лактацию х 8 руб.= 10,599 млн. руб.)

8. Выход телят в группах составляет 82%, стоимость одного теленка приравнивается к стоимости 100 кг молока. Таким образом, от группы I за 2 лактации можно получить 155 телят (82 гол. (100 гол. х 82 %)+73 гол. (89 гол. х 82 %)), что соответствует 15500 кг молока, или 124000 руб. От группы II за 2 лактации можно получить 157 телят (82 гол. (100 гол. х 82 %)+75 гол. (92 гол. х 82 %)), что соответствует 15700 кг молока, или 125600 руб.

9. Следовательно, общая выручка от реализации молока и телят в группе I равна 10,017080 руб., а в группе II - 10725000 руб.

10. Общие затраты, включая затраты на ДНК-анализы (генотипирование по локусу BoLA DRB3), в группе I составляют 7491808 руб., а в группе II – 7860553 руб. Отсюда прибыль в группе I составляет 2525272 руб., а группе II – 2864447 руб.

Таблица 10.- Экономический эффект от создания модельной популяции с использованием генетических маркеров

Показатели	Группа I (исходная популяция)	Группа II (модельная популяция)
Общая выручка от реализации молока и телят, руб.	10017080	10725000
Общие затраты, руб.	7491808	7840553
Затраты на ДНК анализы, руб.	-	20000
Прибыль, руб.	2525272	2864447
Рентабельность, %	33,7	36,4

При расчете экономического эффекта не были учтены затраты на приобретение импортного скота и строительство корпусов для содержания скота, оборудованных по современным технологиям.

ВЫВОДЫ

1.Усовершенствован метод ПДРФ, применяемый для массового типирования животных по гену BoLA DRB 3. Использованы дополнительные эндонуклеазы рестрикции - Bst2UI (обеспечивает высокую точность при дифференцировке аллелей BoLA-DRB3.2 *7 *8 *9) и AspLEI (дифференцировка генотипов BoLA DRB3*8/ BoLA DRB3*28 (Ч/У) и BoLA DRB3*10/ BoLA DRB3*26 (Н/Н)).

2.Установлено, что для эффективного выделения ДНК из семени быков необходимо применять реагенты-тиовосстановители - 0,2 % 2-меркалтоэтанол и 10 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

3.По гену BoLA DRB 3 в ОАО «Агрообъединение «Кубань» было прогенотипировано 834 коровы и 50 быков-производителей голштинской породы (ООО НПСХП «Астер»). Определено, что генетическое равновесие смещено в сторону аллелей, имеющих статус чувствительных по отношению к персистентному лимфоцитозу (Ч – аллелей – 63,3 %, Н – 22,3 %, У – 14,4 %).

4.Наиболее ценным в хозяйственном отношении генотипом является Ч/У, сочетающий в себе Ч – аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У – аллель – показатель высокого иммунитета. В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше в I лактации и на 628-688 кг больше во II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч.

5.Также определено, что не отдельные аллели, а именно их конкретные сочетания влияют на показатели молочной продуктивности коров.

6.Внедрен селекционно-генетический метод, в основе которого лежит схема индивидуального подбора быков-производителей на маточное поголовье с целью повышения частоты встречаемости выгодного генотипа Ч/У в следующих поколениях.

7.Определены частоты встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB 3 у дочерей, полученных от индивидуального подбора и установлено, что частота генотипа Ч/У увеличилась с 18,5 % до 67,3 %.

8.Определены генотипы по локусу каппа-казеина у коров (N=115) и быков-производителей (N=50) и установлено, что генетическое равновесие смещено в сторону гомозиготного АА генотипа (АА-68,1% и 52,0%, АВ-30,2% и 42,0%, ВВ-1,7% и 6,0% у коров и быков, соответственно).

9.Достоверных отличий по количественным показателям молочной продуктивности между животными различных генотипов (АА, АВ и ВВ) по гену каппа-казеина выявлено не было.

10.По качественным показателям молока гетерозиготный генотип АВ достоверно превосходит гомозиготные генотипы АА и ВВ. Группа ВВ-Ч/Ч по содержанию жира в молоке достоверно (Р<0,05) уступает группе АВ-Ч/Ч. Группа АА-Ч/У по этому же показателю достоверно (Р<0,05) уступает группе АВ-Ч/У. По содержанию белка в молоке группы АА-Ч/Ч и ВВ-Ч/Ч достоверно (Р<0,01) уступают группе АВ-Ч/Ч. По содержанию сухого вещества группа АВ-Ч/Ч достоверно (Р<0,05) превосходит группу ВВ-Ч/Ч, а группа АВ-Ч/У – группу АА-Ч/У (Р<0,05).

11.Экономические расчеты показали, что при сложившихся в настоящее время низких закупочных ценах на молоко экономический эффект от создания высокопродуктивного стада селекционно-генетическим способом увеличит рентабельность производства на 2,7 %.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Сельхозпредприятиям по разведению молочного крупного рогатого скота рекомендуется:

Для повышения уровня молочной продуктивности и резистентности голштинских коров к персистентному лимфоцитозу использовать схему индивидуального подбора быков-производителей с целью достижения у потомства максимальной частоты встречаемости ценного в хозяйственном отношении генотипа Ч/У по локусу BoLA DRB 3, сочетающего в себе Ч – аллель как маркер повышенной молочной продуктивности и У – аллель – показатель высокого иммунитета.

2. Исследовательским и диагностическим лабораториям рекомендуется:

- При выделении ДНК из спермы крупного рогатого скота использовать реагенты-тиовосстановители - 0,2 % 2-меркалтоэтанол или 10 мМ дитиотрейтол (ДТТ).

- При анализе ПДРФ использовать дополнительные эндонуклеазы рестрикции Bst2U I (при дифференциации аллелей BoLA DRB3 *7 *8 *9) и AspLEI (при дифференциации генотипов BoLA DRB3 8*28 и 10*26).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Публикация в издании, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. – 2007. - №8. - С. 2-4.

Публикации в других изданиях:

2. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В., Фоменко Д.В. Использование ДНК-технологий в молочном животноводстве // Материалы IV Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», посвященной 100-летию со дня рождения академика Николая Александровича Шманенкова.- Боровск. – 2006.- С. 244-246.

3. Ковалюк Н.В., Мачульская Е.В., Фоменко Д.В. Взаимосвязь генетической структуры популяций с устойчивостью к инфекционным заболеваниям и продуктивностью // Сборник тезисов конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «Юг России «Вклад фундаментальных исследований в развитие экономики Краснодарского края».- Краснодар. - 2006. – С. 141-142.

4. Мачульская Е.В., Ковалюк Н.В. Способ создания группы крупного рогатого скота с заданными свойствами с использованием отбора по генетическим маркерам // Материалы VIII региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». – Краснодар: КубГАУ, 2006. – С. 269-271.

5. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивных групп крупного рогатого скота // Материалы 6 Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных».– Дубровицы: ВИЖ, 2006. – С. 82-85.

6. Мачульская Е.В., Ковалюк Н.В. Взаимосвязь генетической структуры популяций по локусу каппа-казеина с молочной продуктивностью крупного рогатого скота // Сборник научных трудов международной научно-практической конференции «Современные достижения зоотехнической науки и практики – основа повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». – Краснодар, 2007. – С.174-176.

7. Мачульская Е.В., Ковалюк Н.В., Кононенко С.И., Сацук В.Ф. Изучение частот встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB3 у быков голштинской и айрширской пород // Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». - Санкт-Петербург, 2007.- С. 252-254.

Подписано в печать 2.11.2009

Формат 60х84 1/16.Бумага офсетная. Печать офсетная.

Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ № 138.

Типография «Биотех-Юг» ООО,350000, г. Краснодар, ул. Рашпилевская 22