Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья и матричных настоек барбариса обыкновенного
На правах рукописи
ИСАЕВА НАДЕЖДА ВАЛЕНТИНОВНА
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И МАТРИЧНЫХ НАСТОЕК БАРБАРИСА ОБЫКНОВЕННОГО
15.00.02-Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва - 2007
Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава
Научный руководитель: член-корр. РАМН,
доктор фармацевтических наук,
профессор Ирина Александровна Самылина
Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,
доктор фармацевтических наук,
профессор Дарья Алексеевна Муравьева;
доктор фармацевтических наук,
Ирина Анатольевна Баландина
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН
Защита состоится «__» _______2007г. в ___ часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова по адресу: 121998 Москва, Никитский бульвар, д.13.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА
им. И.М. Сеченова по адресу: 117418 Москва, Нахимовский пр-т, 49. Автореферат разослан «__» _____ 2007г.
Ученый секретарь
Диссертационного Совета
Д. 208.040.09
доктор фармацевтических наук,
профессор Наталья Петровна Садчикова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Гомеопатический метод лечения получил официальное разрешение на использование в Государственной системе здравоохранения на территории Российской Федерации сравнительно недавно. Издание Приказа МЗ РСФСР №115 от 01.07.91г. «О развитии гомеопатического метода лечения в медицинской практике и улучшении организации обеспечения населения гомеопатическими лекарственными средствами», а также Приказа Минзрвавмедпрома России №335 от 29.11.95г. «Об использовании метода гомеопатии в практическом здравоохранении» создало юридическую базу для существования и развития гомеопатии в нашей стране.
В гомеопатии для изготовления препаратов используются различные сырьевые источники свежие и высушенные лекарственные растения, животные и их органы, минералы, химические вещества, нозоды.
Более 70% гомеопатических средств получают из лекарственного растительного сырья. Учитывая важное значение лекарственных растений в изготовлении гомеопатических лекарственных средств, необходимо проводить исследования, направленные на изучение биологических особенностей растений и состава БАВ с целью стандартизации сырья. Стандартизация матричных настоек также необходима, поскольку от их качества зависит и качество последующих разведений. В «Программе развития гомеопатического метода лечения и гомеопатической фармации в России на 1998-2000год» и в « Отраслевой научно-исследовательской программе по традиционной медицине и гомеопатии на 2000-2005г.», утвержденных Минздравом, разработка и совершенствование методов оценки качества лекарственных средств, а также нормативной документации на препараты и на исходное сырье была названа в числе основных направлений научно-исследовательской деятельности.
Большинство видов сырья, используемых для получения гомеопатических матричных настоек, изучались недостаточно. Системный
4
подход к изучению сырья и матричных настоек и препаратов, был отражен в работах Яковлевой Е.В., Взоровой Л.Н., Селиванчиковой И.Б., Лякиной М.Н., Терешиной Н.С. и других.
В гомеопатии применяются препараты, в состав которых входят разведения настойки плодов барбариса. Они используются при заболеваниях печени и почек, в гинекологии. Особенно широко их применение для лечения и профилактики простудных заболеваний и их осложнений (гаймориты, синуситы, аденоиды и др.) и в педиатрической практике.
Имеются лишь отдельные публикации по стандартизации плодов барбариса, направленные на создание нормативных документов для пищевой промышленности. Решение вопросов стандартизации сырья и матричной настойки плодов барбариса обыкновенного, применяемых для получения гомеопатических лекарственных средств, не находит своего отражения в научной литературе.
Исходя из вышесказанного, разработка подходов к стандартизации сырья и матричных настоек плодов барбариса обыкновенного имеет важное значение для фармакогнозии.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было исследование по стандартизации плодов и матричных настоек барбариса обыкновенного на основе изучения состава биологически активных веществ и биологических особенностей сырья.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-провести анализ отечественной и зарубежной научной литературы и нормативной документации, регламентирущей качество гомеопатических лекарственных средств;
-изучить качественный и количественный состав БАВ плодов барбариса обыкновенного (органических кислот, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, окисляемых веществ, полисахаридов,алкалоидов);
5
-определить морфолого-анатомического строение плодов барбариса обыкновенного, выявить диагностические признаки для идентификации сырья;
-изучить содержание БАВ в плодах барбариса в процессе хранения;
-разработать показатели качества сырья, методики их определения и нормы;
-исследовать химический состав настойки гомеопатической матричной и содержания в ней органических кислот, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, окисляемых веществ, полисахаридов, аминокислот, алкалоидов;
-провести сравнительное изучение состава БАВ в настойках из свежего, замороженного и высушенного сырья;
-разработать показатели качества матричных настоек и их нормы;
-изучить стабильность настойки гомеопатической матричной при хранении;
-провести оценку биологической активности матричной настойки и ее разведений;
-изучить качественный и количественный состав водных извлечений плодов барбариса обыкновенного.
Научная новизна. На основании изучения химического состава и биологических свойств плодов барбариса обыкновенного проведены комплексные исследования по стандартизации плодов, матричных настоек и разведений барбариса обыкновенного; выявлены диагностические признаки сырья для идентификации; проведено определение содержания органических кислот, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, окисляемых веществ, полисахаридов в сырье. Предложены оптимальные методики определения содержания этих групп соединений в плодах барбариса обыкновенного.
Разработаны характеристики подлинности и показатели качества плодов барбариса обыкновенного.
Проведено сравнительное изучение химического состава матричных настоек, полученных из свежих, замороженных, высушенных плодов и сока, а также водных извлечений. Показано, что наибольшее количество БАВ содержится в настойке из свежего сырья.
6
Разработаны показатели качества настоек, установлены их нормы.
На основании результатов исследований по изучению стабильности сырья и матричных настоек барбариса обыкновенного при хранении рекомендованы сроки их годности.
Выявлено иммуностимулирующее действие матричной настойки и D1 разведения в НАДФН-оксигеназном тесте на полиморфноядерных лейкоцитах человека.
Практическая значимость. Результаты научных исследований использованы при разработке проектов фармакопейных статей «Настойка гомеопатическая матричная плодов барбариса обыкновенного» и «Плоды барбариса обыкновенного свежие», которые переданы для утверждения в установленном порядке.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на научно-практической конференции «Актуальные проблемы гомеопатии» (Москва, 2005); на научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006).
Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармакогнозии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова по теме: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов» (код темы 0407093).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе журнальная статья.
На защиту выносятся:
-данные по качественному и количественному составу биологически активных веществ (органических кислот, фенолкарбоновых кислот,
7
флавоноидов, окисляемых веществ, полисахаридов, аминокислот) настоек из плодов барбариса;
-результаты сравнительного изучения состава БАВ в настойках из свежего, замороженного, высушенного сырья и сока;
-результаты морфолого-анатомического изучения плодов барбариса;
-результаты стандартизации плодов и матричных настоек барбариса обыкновенного;
-результаты по изучению стабильности сырья и матричных настоек барбариса обыкновенного;
-данные оценки биологической активности матричной настойки из свежего сырья
Объем и структура диссертации. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы ( 172 наименований, из них 52 на иностранных языках) и приложения.
Полученные результаты обработаны статистически, обобщены в таблицах, выражены в соответствующих формулах, которые приведены в работе.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе, на основании данных литературы, описана ботаническая характеристика барбариса обыкновенного, особенности его выращивания; обобщены данные по применению этого растения в аллопатии, гомеопатии и народной медицине; приведены сведения о химическом составе и фармакологическом действии плодов барбариса; рассмотрено влияние замораживания как перспективного метода консервации на химический состав растений, затронуты вопросы стандартизации сырья.
8
Во второй главе приведены объекты исследования и методы изучения.
Третья глава посвящена фармакогностическому изучению и стандартизации плодов барбариса обыкновенного. Отражены результаты морфолого-анатомического и товароведческого анализа. Приведены результаты определения содержания основных групп БАВ сырья (органических кислот, фенолкарбоновых кислот, окисляемых веществ, флавоноидов, полисахаридов,алкалоидов) и влияние методов консервации на эти показатели. Изложены данные по исследованию стабильности плодов при хранении.
Четвертая глава посвящена изучению настоек из плодов барбариса. Приведены результаты изучения компонентного состава основных групп БАВ настоек методами ТСХ и ВЭЖХ (органические кислоты, фенолкарбоновые кислоты, свободные и связанные аминокислоты, алкалоиды) и влияние способа изготовления на качественный состав. Отражены данные количественного определения органических кислот, фенолкарбоновых кислот, окисляемых веществ, флавоноидов, полисахаридов в настойках полученных из свежего, замороженного, высушенного сырья и сока. Приведены результаты изучения стабильности матричной настойки при хранении. Показана иммуностимулирующая способность матричной настойки и ее разведений.. Изложены данные по содержанию основных групп БАВ в водных и спиртовых извлечениях из высушенного сырья.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили:
- образцы свежесобранных и высушенных зрелых плодов барбариса обыкновенного урожая 2003-2005г., собранные в Пушкинском, Щелковском и Шатурском районе Московской области;
- образцы сырья, замороженные в морозильной камере при температуре –18-20°С;
- настойка гомеопатическая матричная, изготовленная из свежих плодов согласно инструкции 2а ОФС «Настойки гомеопатические матричные»;
9
-разведения D1,D2, D3, D4 настойки гомеопатической матричной;
-настойка из замороженных плодов, изготовленная по той же инструкции;
-настойка с использованием сока, изготовленная по инструкции 1 ОФС «Настойки гомеопатические матричные»;
-настойки из высушенных плодов, изготовленные методом 4 ОФС «Настойки гомеопатические матричные» и в соответствии с общей статьей ГФ ХI изд., вып.2 «Настойки»;
-настой и отвар плодов барбариса, изготовленные в соответствии с общей статьей ГФ ХI изд., вып.2 «Настои и отвары».
Морфолого-анатомическое изучение и определение товароведческих показателей проводили по методикам, изложенным в общих статьях ГФ ХI изд.
Применялся микроскоп МБИ-6 с пленочной фотонасадкой.
Изучение качественного состава органических, фенолкарбоновых кислот, аминокислот, флавоноидов и алкалоидов настоек проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ).
Исследования по изучению качественного состава органических кислот, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот проводились на жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON» (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для «Windows». В качестве неподвижной фазы были использованы металлическая колонка размером 6,5Х300 мм ALTECH OA-1000 Organic Acids (для органических кислот) и металлическая колонка 4,6х250 мм PLATINUM C-18 100A (для фенолкарбоновых кислот и флавоноидов). В качестве подвижной фазы использовался 0,01н. раствор серной кислоты для органических кислот и система метанол-вода-фосфорная кислота (40:60:0,5) для фенолкарбоновых кислот и флавоноидов. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 190 нм и 220 нм соответственно.
10
Компонентный состав и содержание аминокислот устанавливали с помощью аминокислотного анализатора Biotronik LC-5001 (Германия), снабженном аналитической колонкой 400х32 мм, заполненной смолой Biotronik ВТС 2710 7-8 мкм. Разделение проводилось в пятибуферной системе натрий-цитратных буферов со скоростью потока 18,5мл/час. Нингидриновый реактив на метиловом эфире этиленгликоля подавался со скоростью 9,25 мл/час. Детектирование проводилось параллельно при длинах волн 440 нм и 570 нм.
Определение содержания органических кислот, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, окисляемых веществ, полисахаридов в сырье и настойках проводили по фармакопейным и общепринятым методикам.
При изучении биологической активности были использованы гомогенаты полиморфноядерных лейкоцитов человека, полученных из лейкоцитарной массы донорской крови. Роль субстрата играл НАДФН. В качестве препаратов сравнения применялись тактиферин и оксиметацил. Скорость НАДФН-оксигеназной реакции определяли спектрофотометрически на регистрирующем спектрофотометре фирмы «Шимадзу». Оптическую плотность измеряли при длине волны 340 нм.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятым методом с определением среднего арифметического и ошибки среднего. Достоверность результатов оценивали параметрически по t-критерию Стьюдента.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Как показал проведенный анализ научной литературы и нормативной документации, основные правила изготовления и нормы качества гомеопатических препаратов регламентируются в различных странах гомеопатическими фармакопеями. В Российской Федерации в ГФ XI издания отсутствуют какие-либо сведения по гомеопатическим лекарственным средствам. Правила построения и изложения стандартов качества гомеопатических препаратов в лекарственных формах представлены в XVI
11
разделе Отраслевого стандарта 91 500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения».
С 1995 года в России разрабатываются общие фармакопейные статьи на гомеопатические лекарственные формы, в том числе и на матричные настойки. В 2005году вышел «Сборник фармакопейных статей по гомеопатии», в который вошли 15 общих статей и 16 фармакопейных статей на настойки матричные растительного происхождения, используемые при производстве гомеопатических лекарственных препаратов. В общей статье «Настойки гомеопатические матричные» подробно описаны методы изготовления настоек из свежего, высушенного сырья и сока, а также их разведений. В разделе «Методы испытания» определены показатели качества настоек гомеопатических матричных описание, подлинность, плотность, сухой остаток, тяжелые металлы, микробиологическая чистота. Количественное определение действующих веществ, методы определения подлинности определяют в соответствии с частной нормативной документацией. Кроме того, для настоек из ядовитых и сильнодействующих растений предусматривается «испытание на четвертое десятичное разведение D4». В общей статье также указаны требования к упаковке, маркировке, хранению и сроку годности.
В «Руководстве по стандартизации лекарственных средств» (2006 год), изданном Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, описаны правила построения и изложения стандартов качества на настойки гомеопатические матричные растительного происхождения и требования к разработке документов на лекарственное растительное сырье различных морфологических групп, применяемых в аллопатии. В данных методических рекомендациях отсутствует раздел, регламентирующий разработку документации на свежее лекарственное растительное сырье, используемое для производства гомеопатических препаратов. Анализ научных публикаций показал, что таких работ проводится
12
очень мало (в литературе есть сведения по стандартизации арники, боярышника, калины и др.).
В связи с отсутствием современной отечественной нормативной документации для анализа сырья часто используют руководство В. Швабе под редакцией В.И. Рыбака, изданное в 1967 году. Однако в нем имеются далеко не все виды сырья, используемые для производства гомеопатических лекарственных средств в настоящее время, поэтому часто используются зарубежные гомеопатические фармакопеи.
Уровень требований к стандартизации сырья в них существенно ниже, чем принятый в РФ для сырья, используемого в аллопатии. Часто ограничиваются лишь очень кратким описанием внешних признаков. Раздел «Микроскопия» либо отсутствует, либо представляет собой словесное описание, которое не сопровождается фотографиями и иллюстрациями. Количественное определение биологически активных веществ проводится только в случае, если описываемое сырье ядовито.
Плоды барбариса в аллопатической медицине не используются. Документация, регламентирующая применение их в качестве лекарственного растительного сырья, отсутствует. Использование их в гомеопатии требует научного обоснования стандартизации сырья и матричных настоек на его основе с учетом требований, предъявляемых к стандартизации лекарственного растительного сырья и настоек гомеопатических матричных в Российской Федерации.
Изучение качественного и количественного состава БАВ плодов барбариса обыкновенного
В соответствии с поставленными задачами было проведено изучение качественного и количественного содержания БАВ (органических кислот, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, аминокислот) в плодах барбариса. Нами идентифицированы органические кислоты (лимонная, яблочная, винная, щавелевая), фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая, кофейная, галловая),
13
флавоноиды (апигенин, гиперозид, гесперидин, рутин и кверцетин), 19 аминокислот (доминирующие пролин и оксипролин), алкалоиды (берберин). Полученные данные в дальнейшем использованы нами при составлении хроматографических характеристик, необходимых для идентификации сырья.
Следующим этапом было сравнительное изучение количественного содержания основных групп БАВ в свежих, замороженных и высушенных плодах барбариса. Содержание органических кислот и окисляемых веществ определяли титриметрическим методом; для определения суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту и суммы флавоноидов в пересчете на рутин использовали спектрофотометрический метод; количество полисахаридов рассчитывали гравиметрически. Количествееное определение алкалоидов ввиду их незначительного содержания нами не проводилось. Результаты представлены в табл.1.
Таблица 1
Определение количественного содержания биологически активных веществ плодов барбариса обыкновенного
| Вид | Содержание,% | ||||
| сырья | Органические | Фенолкарбоновые | Окисляемые | Флавоноиды | Полисахариды |
| кислоты | кислоты | вещества | |||
| Свежее сырье | 24,00 ± 0,34 | 3,41± 0,10 | 5,26 ± 0,13 | 0,095± 0,01 | 2,99 ± 0,09 |
| Замороженное сырье | 21,03± 0,14 | 3,34 ± 0,11 | 4,61 ± 0,12 | 0,093 ± 0,04 | 3,03 ± 0,07 |
| Высушенное сырье | 16,09± 0,22 | 3,16 ± 0,10 | 2,79 ± 0,11 | 0,076 ± 0,03 | 4,03 ± 0,06 |
Полученные данные по содержанию БАВ в плодах барбариса говорят о том, что они являются богатым источником их получения, что свидетельствует о целесообразности их использования для получения лекарственных средств не только в гомеопатии, но и в аллопатии.
Доминирующей группой являются органические кислоты, их количество почти не изменяется при замораживании, а при высушивании сырья оно
14
заметно ниже. Высушивание и замораживание не влияет на содержание фенолкарбоновых кислот и полисахаридов. Количество окисляемых веществ сокращается наиболее существенно. Содержание флавоноидов заметно падает при высушивании.
Была изучена стабильность БАВ в высушенных и замороженных плодах барбариса при хранении. Результаты представлены в табл.2 и 3.
Таблица 2
Результаты анализа замороженных плодов барбариса в процессе хранения
| № | Длительность | Влажность | Суммы | Суммы | Суммы | Окисляемых | Полисаха- |
| образца | хранения | % | органич. | фенолкарбон. | флавоноидов, | веществ, % | ридов, % |
| кислот, % | кислот, % | % | |||||
| 1. | 0 мес. | 71,12 | 22,13 | 3,34 | 0,095 | 4,61 | 2,99 |
| 3 мес. | 70,08 | 21,08 | 3,28 | 0,095 | 4,27 | 2,89 | |
| 6 мес. | 68,11 | 22,54 | 2,82 | 0,092 | 4,03 | 3,27 | |
| 9 мес. | 68,01 | 22,28 | 2,84 | 0,090 | 4,08 | 3,31 | |
| 12 мес. | 64,25 | 22,34 | 2,67 | 0,090 | 3,63 | 3,24 | |
| 2. | 0 мес. | 72,54 | 20,08 | 3,42 | 0,093 | 5,29 | 3,16 |
| 3 мес. | 72,08 | 21,18 | 3,48 | 0,093 | 5,29 | 3,24 | |
| 6 мес. | 72,12 | 21,03 | 3,45 | 0,092 | 5,18 | 3,17 | |
| 9 мес. | 72,01 | 20,87 | 3,15 | 0,092 | 5,12 | 3,26 | |
| 12 мес. | 69,73 | 20,34 | 2,45 | 0,087 | 4,53 | 3,28 | |
| 3. | 0 мес. | 75,68 | 19,44 | 3,52 | 0,090 | 5,30 | 2,74 |
| 3 мес. | 74,95 | 19,59 | 3,48 | 0,091 | 5,26 | 2,77 | |
| 6 мес. | 73,15 | 19,57 | 3,42 | 0,088 | 4,89 | 2,84 | |
| 9 мес. | 72,78 | 19,84 | 3,45 | 0,088 | 4,17 | 2,80 | |
| 12 мес. | 69,77 | 19,92 | 3,16 | 0,083 | 3,93 | 2,86 |
В процессе хранения замороженных плодов значительно снижается содержание окисляемых веществ, количество органических кислот и флавоноидов практически не изменяется. При хранении высушенных плодов заметно снижается содержание органических кислот, фенолкарбоновых кислот, окисляемых веществ. На основании полученных данных рекомендованы сроки годности сырья 9 месяцев для замороженного и 18 месяцев для высушенных плодов барбариса.
15
Таблица 3
Результаты анализа высушенных плодов барбариса в процессе хранения
| № | Длительность | Влажность, | Суммы | Суммы | Суммы | Окисляемых | Полисахари- |
| образца | хранения | % | органич. | фенолкарбон. | флавоно- | веществ, % | дов, % |
| кислот, % | кислот, % | идов, % | |||||
| 1. | 0 мес. | 9,03 | 16,09 | 3,16 | 0,076 | 2,97 | 4,92 |
| 6 мес. | 13,04 | 16,67 | 3,16 | 0,076 | 2,92 | 4,35 | |
| 12 мес. | 12,37 | 15,42 | 3,03 | 0,073 | 2,64 | 5,15 | |
| 18 мес. | 12,89 | 15,12 | 2,98 | 0,072 | 2,52 | 5,87 | |
| 24 мес. | 11,14 | 13,54 | 2,83 | 0,072 | 2,29 | 5,77 | |
| 2. | 0 мес. | 10,22 | 13,18 | 2,92 | 0,084 | 2,71 | 3,99 |
| 6 мес. | 11,58 | 13,01 | 2,96 | 0,085 | 2,69 | 4,09 | |
| 12 мес. | 10,92 | 12,08 | 2,93 | 0,084 | 2,52 | 3,87 | |
| 18 мес. | 11,09 | 11,54 | 2,87 | 0,081 | 2,40 | 4,57 | |
| 24 мес. | 11,57 | 11,52 | 2,88 | 0,080 | 2,23 | 4,50 | |
| 3. | 0 мес. | 10,05 | 15,28 | 2,88 | 0,074 | 3,24 | 4,16 |
| 6 мес. | 12,45 | 15,33 | 2,79 | 0,074 | 3,33 | 4,02 | |
| 12 мес. | 12,53 | 14,95 | 2,71 | 0,070 | 3,18 | 4,19 | |
| 18 мес. | 12,89 | 14,59 | 2,71 | 0,070 | 3,09 | 4,28 | |
| 24 мес. | 12,07 | 12,08 | 2,65 | 0,069 | 2,53 | 4,98 |
Для стандартизации сырья нами были разработаны показатели качества и установлены и нормы: органических кислот в пересчете на яблочную кислоту не менее 18%; влажность не менее 70%; золы общей не более 3%; плодоножек, в том числе отделенных при анализе не более 1%; листьев барбариса не более 0,4%; плодов вялых и поврежденных вредителями не более 6%; органической примеси не более 0,5%; минеральной примеси не более 0,5%.
Для определения подлинности сырья с использованием биологических особенностей нами было проведено морфолого-анатомическое изучение плодов и выявлены наименее вариабельные признаки, которые использованы при составлении характеристик подлинности сырья на основе макро- и микроскопического метода исследования. В качестве диагностических признаков рекомендованы: клетки эпидермиса с четковидными утолщениями, группы устьиц аномоцитного типа и каменистые клетки у плодоножки плода, одноклеточные волоски булавовидной формы на границе с остатками рыльца,
16
друзы в клетках мякоти, сосуды лестничного и спирального типов, утолщенные и кутинизированные клетки эпидермиса семени, клетки эндосперма с каплями жирного масла и алейроновыми зернами.
Проведенное нами фармакогностическое изучение плодов барбариса позволило разработать характеристики подлинности (внешние признаки, микроскопию, хроматографические характеристики) и показатели качества, которые были использованы при составлении проекта фармакопейной статьи на плоды барбариса.
Изучение химического состава настоек из плодов барбариса обыкновенного
Основываясь на результатах изучения состава БАВ в сырье, для предварительной оценки компонентного состава органических кислот, содержащихся в изучаемых настойках, был использован метод ТСХ. Нами подобрана оптимальная система: спирт этиловый 96%-раствор аммиака (4:1). После обработки пластинки 0,4% спиртовым раствором бромкрезолового зеленого и нагревания в сушильном шкафу наблюдаются зоны белого цвета на ярко-голубом фоне. В настойках идентифицированы со стандартами лимонная кислота (Rf около 0,02), винная кислота (Rf около 0,11), яблочная кислота (Rf около 0,16). Выявлены отличия в количестве и интенсивности зон изучаемых настоек. Зона яблочной кислоты присутствует на всех хроматограммах и является самой интенсивной (табл.4).
Для подробного изучения отличий в составе органических кислот в настойках был использован метод ВЭЖХ. Установлено, что доминирующим компонентом во всех настойках является яблочная кислота. Ее содержание незначительно изменяется при изготовлении настойки из свежего, замороженного сырья и сока. Кроме того, методом ВЭЖХ идентифицированы винная и щавелевая кислота. Установлено, что их количество значительно снижается при получении настоек из замороженного сырья. Аскорбиновая, бензойная, салициловая кислоты обнаружены в незначительных количествах.
17
Таблица 4
Результаты сравнительного изучения органических кислот настоек методом ТСХ
| Rf | Цвет зоны | Настойка | Настойка | Настойка | Настойка | Стандарты |
| из свежих | из замороженных | из сока | из высушенных | |||
| плодов | плодов | плодов | ||||
| 0,02 | Белая | Слабо- | Слабо- | Отсутствует | Отсутствует | Лимонная |
| выраженная | выраженная | кислота | ||||
| 0,11 | Белая | Интенсивная | Слабо- | Интенсивная | Отсутствует | Винная |
| выраженная | кислота | |||||
| 0,16 | Белая | Очень | Очень | Очень | Интенсивная | Яблочная |
| интенсивная | интенсивная | интенсивная | кислота | |||
| 0,36 | Белая | Слабо- | Слабо- | Слабо- | Отсутствует | Отсутствует |
| выраженная | выраженная | выраженная | ||||
| 0,53 | Белая | Интенсивная | Интенсивная | Слабо- | Отсутствует | Отсутствует |
| выраженная |
Для изучения компонентного состава фенолкарбоновых кислот был использован метод ТСХ (табл. 5).
Таблица 5
Результаты сравнительного изучения фенолкарбоновых кислот настоек методом ТСХ
| Rf | Цвет зоны | Настойка | Настойка | Настойка | Настойка | Стандарты |
| из свежих | из замороженных | из сока | из высушенных | |||
| плодов | плодов | плодов | ||||
| 0,06 | Темно- | Интенсивная | Интенсивная | Интенсивная | Интенсивная | Хлорогеновая |
| зеленая | кислота | |||||
| 0,09 | Сине- | Интенсивная | Интенсивная | Интенсивная | Интенсивная | Отсутствует |
| зеленая | ||||||
| 0,23 | Серо- | Интенсивная | Интенсивная | Интенсивная | Интенсивная | Отсутствует |
| зеленая | ||||||
| 0,28 | Серо- | Слабо- | Слабо- | Слабо- | Отсутствует | Отсутствует |
| зеленая | выраженная | выраженная | выраженная | |||
| 0,41 | Серо- | Слабо- | Слабо- | Отсутствует | Слабо- | Галловая |
| зеленая | выраженная | выраженная | выраженная | кислота | ||
| 0,49 | Серо- | Слабо- | Слабо- | Отсутствует | Слабо- | Отсутствует |
| зеленая | выраженная | выраженная | выраженная | |||
| 0,54 | Серо- | Интенсивная | Интенсивная | Интенсивная | Очень | Кофейная |
| зеленая | интенсивная | кислота |
18
Наилучшее разделение наблюдалось в системе этилацетат-хлороформ-муравьиная кислота (5:5:1). После обработки раствором фосфорномолибденовой кислоты и нагревания обнаруживались зоны сине-зеленого, темно-зеленого и серо-зеленого цвета. В настойках идентифицированы хлорогеновая (Rf около 0,06), галловая (Rf около 0,41) и кофейная (Rf около 0,54) кислоты.
Методом ВЭЖХ была проанализирована настойка гомеопатическая матричная (НГМ) из свежих плодов, определено наличие галловой, хлорогеновой и кофейной кислот, а также идентифицированы флавоноиды: апигенин, гиперозид, гесперидин, рутин и кверцетин.
Для изучения алкалоидов настойки применялся метод ТСХ. Хроматографировали в системе этилацетат-спирт этиловый 96%-раствор аммиака (40:10:5). После обработки реактивом Драгендорфа обнаруживались зоны оранжевого цвета. Показано наличие не менее 6 соединений алкалоидной природы, идентифицирован со стандартом берберин.
Для изучения аминокислотного состава НГМ из свежих плодов проводилась хроматография в системе бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1). После обработки раствором нингидрина обнаруживались 10 зон различной окраски. Идентифицированы валин, треонин, лейцин, серин, аспарагиновая кислота. Для более точного установления компонентного состава аминокислот в настойке был использован метод ВЭЖХ. Результаты представлены в табл.6 и 7.
Исследование аминокислотного состава гомеопатической матричной настойки показало присутствие в свободном виде 17 аминокислот. Суммарное содержание свободных аминокислот составило 52,1мг в 100 мл настойки. Более 80% приходится на пролин (49,81%) и оксипролин (32,28%). На долю остальных аминокислот приходится всего 17,91%. Среди них преобладает аспарагиновая кислота (5,93%).
19
Таблица 6
Результаты количественного определения свободных аминокислот настойки гомеопатической матричной плодов барбариса
| Соединение | Содержание, | % от суммы |
| мг на 100 мл | ||
| Аспарагиновая кислота | 3,09 | 5,93 |
| Оксипролин | 16,82 | 32,28 |
| Треонин, аспарагин | 1,62 | 3,11 |
| Серин, глютамин | 0,48 | 0,92 |
| Глутаминовая кислота | 0,85 | 1,63 |
| Пролин | 25,95 | 49,81 |
| Глицин | 0,28 | 0,54 |
| Аланин | 0,21 | 0,40 |
| Валин | 0,25 | 0,49 |
| Изолейцин | следы | 0 |
| Лейцин | 0,11 | 0,20 |
| Тирозин | 0,28 | 0,54 |
| Гистидин | 1,33 | 2,56 |
| Лизин | 0,11 | 0,20 |
| Аргинин | 0,72 | 1,38 |
| Суммарное содержание | 52,10 | 100 |
Таблица 7
Содержание аминокислот в настойке матричной из свежих плодов барбариса после гидролиза
| Соединение | Содержание | % от суммы |
| мг на 100 мл | ||
| Аспарагиновая кислота | 12,33 | 9,16 |
| Оксипролин | 46,12 | 34,25 |
| Треонин | 1,87 | 1,39 |
| Серин | 2,59 | 1,92 |
| Глутаминовая кислота | 11,18 | 8,30 |
| Пролин | 37,48 | 27,85 |
| Глицин | 2,78 | 2,06 |
| Аланин | 2,67 | 1,98 |
| Валин | 1,87 | 1,39 |
| Изолейцин | 1,45 | 1,08 |
| Лейцин | 2,40 | 1,78 |
| Тирозин | 1,37 | 1,02 |
| Фенилаланин | 1,18 | 0,88 |
| Гистидин | 2,09 | 1,55 |
| Лизин | 1,98 | 1,47 |
| Аргинин | 5,28 | 3,92 |
| Суммарное содержание | 134,64 | 100 |
20
После проведения кислотного гидролиза было идентифицировано 19 аминокислот. Общее содержание аминокислот в настойке составило 134,64 мг в 100 мл. Доминирующими аминокислотами были оксипролин (34,25%) и пролин (27,84%).
Следующим этапом были исследования по сравнительному количественному определению основных групп БАВ в настойках, полученных из свежего, замороженного, высушенного сырья и сока. Результаты представлены в табл.8.
Выявлено, что доминирующей группой БАВ в настойках, так же как и в сырье, являются органические кислоты. Их содержание незначительно изменяется при изготовлении настоек из свежего, замороженного сырья и сока. При изготовлении настойки из высушенного сырья оно ниже в два раза. Применение замороженного сырья и сока не влияет на содержание полисахаридов, но существенно снижает количество фенолкарбоновых кислот и флавоноидов, а также окисляемых веществ.
Таблица 8
Содержание основных групп БАВ в настойках плодов барбариса
| Содержание,% | |||||
| Исследуемая | Органические | Фенолкарбоновые | Окисляемые | Флавоноиды | Полисахариды |
| настойка | кислоты | кислоты | вещества | ||
| Матричная | |||||
| из свежего | 3,23±0,12 | 0,81± 0,03 | 0,81± 0,04 | 0,0080± 0,0001 | 0,37± 0,02 |
| сырья | |||||
| Из заморо- | |||||
| женного сырья | 3,53 ±0,08 | 0,72 ±0,02 | 0,76 ±0,02 | 0,0077 ±0,0002 | 0,37 ±0,01 |
| С использова- | |||||
| нием сока | 3,16 ±0,11 | 0,64 ±0,02 | 0,43± 0,01 | 0,0058 ±0,0002 | 0,35± 0,02 |
| Из высушен- | |||||
| ного сырья | 1,54±0,07 | 0,33±0,02 | 0,27± 0,02 | 0,0032±0,0001 | 0,12 ±0,01 |
Нами было проведено изучение стабильности настойки гомеопатической матричной плодов барбариса обыкновенного в процессе естественного хранения. Из полученных результатов следует, что наиболее значительно
21
снижается содержание фенолкарбоновых кислот (на 11-17%) и окисляемых веществ (на 7-15%). На основании полученных данных рекомендован срок хранения 2 года.
Изучение биологической активности настойки гомеопатической матричной
Для изучения иммуностимулирующей способности матричной настойки и ее разведений был проведен НАДФН-оксигеназный тест in vitro, позволяющий выявить возможность изучаемого образца активировать НАДФ-оксигеназу гомогенатов полиморфноядерных лейкоцитов при непосредственном контакте.
Изучалась настойка гомеопатическая матричная из свежих плодов барбариса обыкновенного и ее разведения D1, D2 и D3.О результатах судили по скорости НАДФН-оксигеназной реакции, измеряемой спектрофотометрически. Полученные данные представлены в таблице 9.
Таблица 9
Результаты измерения скорости НАДФН-оксигеназной реакции
| Исследуемый | Скорость реакции, рмоль/тыс. клеток | ||||
| образец | 0 мкл | 1 мкл | 5 мкл | 10 мкл | 50 мл |
| Berberis fructus | 0 | 64,0 0,6 | 190,0 7,6 | 78,0 0,7 | 9,0 0,1 |
| Berberis fructus D1 | 0 | 30,0 02 | 45,0 0,4 | 20,0 0,2 | 5,0 0,1 |
| Berberis fructus D2 | 0 | 2,0 | 8,0 0,1 | 2,0 | 1,0 |
| Berberis fructus D3 | 0 | 1,0 | 1,0 | 2,0 | 1,0 |
| Спирт этиловый | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
В результате эксперимента установлено, что гомеопатическая матричная настойка и ее разведение D1 проявляют активизирующие свойства по отношению к НАДФН-оксигеназе.
С учетом всех проведенных исследований по качественному и количественному содержанию БАВ разработаны методики определения подлинности и показатели качества настойки матричной из свежих плодов барбариса обыкновенного, которые включены в проект фармакопейной статьи.
22
Выводы
1. На основании изучения качественного состава БАВ плодов и настоек барбариса обыкновенного с использованием современных физико-химических методов и стандартных образцов идентифицированы органические кислоты (лимонная, яблочная, винная, щавелевая), фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая, кофейная, галловая), флавоноиды (апигенин, гиперозид, гесперидин, рутин и кверцетин), 19 аминокислот (доминирующие пролин и оксипролин), алкалоиды (берберин).
2. Оптимизированы методики определения содержания органических кислот, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, окисляемых веществ, полисахаридов для использования их при стандартизации свежих, замороженных и высушенных плодов и различных настоек барбариса обыкновенного.
3. С использованием разработанных методик проведено определение содержания изучаемых групп БАВ в свежих плодах и настойках соответственно: (органических кислот 24,00±0,34% и 3,23±0,12%; фенолкарбоновых кислот 3,41±0,13% и 3,23±0,12%; флавоноидов 0,0952±0,0014% и 0,0080±0,0001%; окисляемых веществ 5,26±0,15% и 0,81±0,04%; полисахаридов 2,99±0,09% и 0,37±0,02%).
4. На основании сравнительного изучения установлено, что при замораживании количество органических кислот, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, полисахаридов изменяется незначительно, а содержание окисляемых веществ снижается. При высушивании снижается количество органических кислот, флавоноидов; содержание окисляемых веществ падает почти в два раза, тогда как количество фенолкарбоновых кислот и полисахаридов практически не изменяется.
5.При сравнительном изучении компонентного состава и содержания БАВ матричных настоек, приготовленных из свежего, замороженного, высушенного сырья и сока показана возможность получения НГМ из свежих и
23
замороженных плодов. При использовании сока и высушенного сырья для изготовления настоек изменяется как качественный, так и количественный состав БАВ.
6.На основании изучения содержания БАВ в процессе хранения плодов и настоек рекомендованы сроки годности для свежего сырья 72 часа; замороженного 9 месяцев; высушенного 1,5 года. Для матричной настойки 2года.
7. С использованием микроскопического метода для идентификации сырья выявлены диагностические признаки: клетки эпидермиса с четковидными утолщениями, аномоцитный тип устьичного комплекса, каменистые клетки, одноклеточные волоски булавовидной формы, друзы в клетках мякоти, сосуды лестничного типа, утолщенные и кутинизированные клетки эпидермиса семени, клетки эндосперма с каплями жирного масла и алейроновыми зернами.
8.Разработаны показатели качества свежего сырья, методики их определения и нормы.
9.В НАДФН-оксигеназном тесте in vitro на полиморфноядерных лейкоцитах человека показана иммуностимулирующая активность матричной настойки плодов барбариса и D1 разведения.
11.Показана возможность использования высушенного сырья для приготовления отваров, настоек и экстрактов и использования их в аллопатии.
Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях.
1. Исаева Н.В. Разработка показателей качества настойки плодов барбариса обыкновенного гомеопатической матричной// Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. Москва, 19-23 апреля 2004 г.-С.873.
2.Исаева Н.В., Самылина И.А. Исследование химического состава настойки плодов барбариса обыкновенного гомеопатической матричной//«Развитие
24
Московской международной гомеопатической конференции. Москва, 23-25 января 2004 г.-С.81-82.
3. Исаева Н.В., Самылина И.А., Копытько Я.Ф. Стандартизация настойки плодов барбариса обыкновенного гомеопатической матричной//Материалы научно-практической конференции: «Актуальные вопросы гомеопатии: место и возможности гомеопатического метода в практическом здравоохранении». Санкт-Петербург, 18-19 июня 2004 г.-С.43-44.
4. Лекарственное растительное сырье и настойки матричные в гомеопатии./ Копытько Я.Ф., Сокольская Т.А., Давгаева Т.Д., Копнин А.А., Исаева Н.В.// Сборник научных трудов «генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений». Материалы международной научной конференции, посвященной памяти А.И. Шретера. Москва, 12-14 июля 2004 г.-С.277-278.
5. Исаева Н.В., Самылина И.А. Изучение возможности использования замороженных плодов барбариса обыкновенного для изготовления настойки гомеопатической матричной // «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». Тезисы докладов Московской международной гомеопатической конференции. Москва, 28-30 января 2005г.-С.92-93.
6. Исаева Н.В., Самылина И.А. Изучение органических кислот в сырье и настойке гомеопатической матричной плодов барбариса обыкновенного// «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». Тезисы докладов Московской международной гомеопатической конференции. Москва, 28-30 января 2005г.-С.93-94.
7. Исаева Н.В. Изучение фенолкарбоновых кислот гомеопатических матричных настоек плодов барбариса обыкновенного // Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. Москва, 18-22 апреля 2005 г.-С.758.
8. Исаева Н.В., Самылина И. А. Биологически активные вещества плодов и настойки барбариса.//Фармация.-2006.-№1.-С.22-23.
