Разработка биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола
На правах рукописи
МИШЕНИНА ИРИНА ИВАНОВНА
РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКОГО СПОСОБА УТИЛИЗАЦИИ НЕПРИГОДНЫХ К МЕДИЦИНСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛА
15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Пермь – 2008
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
| Научные руководители: | доктор фармацевтических наук, профессор Чекрышкина Людмила Александровна |
| доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН Ившина Ирина Борисовна | |
| Официальные оппоненты: | доктор фармацевтических наук, профессор Ярыгина Татьяна Ивановна |
| кандидат фармацевтических наук Захарова Людмила Андреевна | |
| Ведущая организация: | ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» |
Защита диссертационной работы состоится 22 апреля 2008 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» по адресу: 614990, ГСП-277, г. Пермь, ул. Ленина, 48. Тел.: (342) 212-90-06.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.
Автореферат разослан «20 » марта 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат фармацевтических наук, доцент Метелева Е.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время в Российской Федерации остро обозначилась проблема утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств – фальсифицированных, забракованных, с истекшим сроком годности или потерявших свои потребительские свойства по тем или иным причинам.
Все некачественные лекарства признаются фармацевтическими отходами и подлежат обязательному уничтожению. Анализ случаев уничтожения таких лекарственных средств на территории Российской Федерации в период с 1997 по 2005 показал отсутствие единой системы проведения этой процедуры и централизованных мест их хранения.
Научно обоснованные методики утилизации лекарственных средств, за исключением наркотических и психотропных, пока не разработаны. Используемыми на практике способами уничтожения являются слив в промышленную канализацию, сжигание на открытом воздухе или захоронение на свалках, при этом часто не учитываются физико-химические, токсические свойства лекарственных веществ и протекающие в процессе уничтожения химические процессы. Поэтому исследования по совершенствованию существующих и поиску новых путей утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств является актуальным.
Анализ исследований в области промышленной технологии показывает, что большое внимание, особенно за рубежом, уделяется биологическим методам, за которыми признается несомненный приоритет по показателям эффективности и безопасности. Природные микроорганизмы используют для обезвреживания химических отходов, в первую очередь, нефтепродуктов, тяжелых металлов, полихлорированных фенолов, фосфорорганических и других химических соединений. Ведутся активные поиски новых микроорганизмов, адаптированных к развитию в присутствии чужеродных веществ и вызывающих их биотрансформацию.
В качестве эффективных биодеструкторов ксенобиотиков могут быть использованы актинобактерии рода Rhodococcus, которые являются обычными компонентами техногенно-загрязненных сред обитания. Родококки способны усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические вещества, в том числе предельные и ароматические углеводороды, фенолы, гетероциклические соединения, что делает использование этой группы микроорганизмов перспективными при разработке биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств. Помимо поиска микроорганизмов-деструкторов токсических веществ, необходимо также изучение влияния на человека и окружающую среду промежуточных и конечных продуктов их трансформации.
Цель и задачи исследования. Оценка возможности использования актинобактерий для биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола.
Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:
- Провести скрининг активных штаммов актинобактерий рода Rhodococcus-биодеструкторов веществ, производных фенола, и выбрать среди исследуемых лекарственных средств модельное соединение.
- Разработать способы идентификации и количественного определения продуктов его биодеструкции.
- Установить оптимальные условия процесса биотрансформации.
- На примере модельного соединения изучить динамику процесса биодеструкции.
- Изучить свойства конечных продуктов биодеструкции (шлама).
- На основе полученных результатов разработать технологические схемы и лабораторный регламент процесса утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств.
Научная новизна. На примере парацетамола показана возможность биологического способа биодеструкции непригодных к медицинскому применению лекарственных веществ (ЛВ) и их препаратов.
Путем скрининга 82 бактериальных штаммов в качестве деструкторов выбраны 2 штамма актинобактерий рода Rhodococcus. Установлены оптимальные условия процесса: состав среды культивирования; влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток парацетамола, на скорость его деструкции; адаптация родококков к фенолу, что расширяет перспективу их использования для биодеструкции других ЛВ, производных фенола. Получены биокатализаторы на основе иммобилизованных в полимерном криогеле поливинилового спирта клеток микроорганизмов, с участием которых идет значительное ускорение процесса биотрансформации парацетамола.
Разработаны методики анализа в культуральных средах: парацетамола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и его основного метаболита п-аминофенола спектрофотометрическим методом, позволяющие контролировать динамику процесса.
Предложена схема трансформации парацетамола в процессе биодеструкции. Методом тонкослойной хроматографии доказано наличие в культуральных средах п-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона и трех неидентифицированных веществ.
Изучены физико-химические свойства, токсичность и фитотоксичность конечных продуктов биодеструкции парацетамола (шлама).
Работа поддержана грантом РФФИ № 04-04-96057.
Практическая значимость. По результатам выполненных исследований разработан лабораторный регламент и представлены технологические схемы утилизации парацетамола. Процесс утилизации парацетамола с положительным результатом апробирован в ОАО «Пермфармация» с использованием ферментационной установки «Фермус – 3» с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении эксперимента (акт от 20.11.07 г.).
Результаты работы используются в учебном процессе Пермской государственной фармацевтической академии: в лекционном курсе и на лабораторных занятиях слушателей ФДПО, интернов и студентов на кафедрах фармацевтической технологии и фармацевтической химии ФДПО и ФЗО (акты от 05.04.05 г. и 01.11.07 г.), включены в лаборатор-ный практикум студентов очного отделения биологического факультета Пермского государственного университета (акт от 20.12.07 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Номер государственной регистрации 01.9.50 007417.
Апробация работы. Результаты и основные положения диссертационной работы доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; 69-й научно-практической конференции «Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья», Курск, 2004; V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2004; IX Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ», Новосибирск, 2004; XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2005; II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биопотенциал», Пермь-Казань, 2005; II Всероссийской научно-практической конференции «Техническая химия. Достижения и перспективы», Пермь, 2006; XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2006; XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007; Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2007.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 6 статей (3 – в изданиях, рекомендованных ВАК).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Обоснование условий биологического способа деструкции ЛВ, производных фенола, на примере парацетамола как модельного соединения.
2. Способы оптимизации процесса деструкции парацетамола.
3. Методики анализа парацетамола и продуктов его биодеструкции в культуральных средах.
4. Результаты изучения свойств конечных продуктов деструкции парацетамола.
5. Технологические схемы и лабораторный регламент процесса биодеструкции парацетамола.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 44 таблицы, 24 рисунка, 4 схемы, 4 фотографии, включает введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), список литературы, содержащий 181 библиографический источник, из которых 46 на иностранных языках, и Приложение.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, определены научная и практическая значимость работы.
В первой главе представлен обзор литературы, в котором рассмотрены способы утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств, перспективы использования для этой цели различных штаммов микроорганизмов, способы анализа парацетамола и п-аминофенола.
Во второй главе описаны объекты, материалы и методы исследования.
Третья глава посвящена разработке методик количественного определения парацетамола и п-аминофенола в культуральных средах; использованию метода ТСХ для исследования динамики процесса биодеструкции парацетамола.
В четвертой главе изложены исследования по оптимизации условий биодеструкции парацетамола, разработке технологической документации и её апробации.
Пятая глава посвящена изучению свойств шлама, образующегося в процессе биодеструкции парацетамола.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве модельных ЛВ использовали парацетамол (ацетаминофенол), ацетилсалициловую и салициловую кислоты как наиболее распространенные лекарственные средства, относящихся к производным фенола. В качестве биодеструкторов выбраны 82 штамма родококков, относящихся к 6 видам рода Rhodococcus: R. erythropolis (14 штаммов), R. fascians (14 штаммов), R.,,longus’’(14 штаммов), R. opacus (12 штаммов), R. rhodochrous (14 штаммов), R. ruber (14 штаммов), представленные Институтом экологии и генетики микроорганизмов (ИЭГМ) УрО РАН.
Условия биодеструкции. Для выбора объекта исследования и активного штамма актинобактерий использовали микролуночный метод. Культивирование клеток осуществляли в водной минеральной среде «К», в которую вносили исследуемые ЛВ в виде водных растворов. Биотрансформацию парацетамола изучали в условиях периодического перемешивания родококков в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на шейкере (160 об/мин) при 280С. В качестве посевного материала служила 48-часовая бактериальная культура родококков, предварительно выращенная на мясо-пептонном агаре, которую добавляли в концентрации 3,2 х 107клеток/мл.
Биодеструкцию парацетамола осуществляли в двух минеральных средах «Киевская» («К») и «RS», базовый состав которых включал следующие компоненты (г/л): KNO3 1.0, KH2PО4 1.0, K2HPО4 1.0, NaC1 1.0, MgSO4 . 7H2O 0.2, CaC12 . 6H2O 0.02, FeC13 . 6H2О 0.001; среда «RS» дополнительно содержала (NН4)2 SO4 2.0.
Парацетамол использовали в виде субстанции и лекарственной формы – таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола, которые вносили в водные минеральные среды.
Изучено влияние каждого из вспомогательных веществ таблеток на скорость, полноту биотрансформации, рост и жизнеспособность микроорганизмов.
Для активизации бактериальных оксигеназ и адаптации клеток штаммы родококков выращивали в жидкой минеральной среде «RS», содержащей 0,1% фенола и дрожжевой экстракт. Иммобилизацию осуществляли путем внесения бактериальной взвеси клеток родококков в раствор поливинилового спирта в соотношении 1:2. Условия утилизации парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus, установленные в ходе эксперимента, воспроизведены на укрупненной ферментационной установке «Фермус-3».
Исследование парацетамола и продуктов его биотрансформации. Результаты хроматографического исследования показали, что первый метаболит п-АФ появляется в течение первых суток эксперимента при использовании чистых и адаптированных клеток родококков, а в случае применения иммобилизованных клеток появление п-АФ наблюдается уже через 4-6 часов. На штаммах R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 в процессе биодеструкции парацетамола через 3-е суток эксперимента появляется пирокатехин, через 5 суток гидрохинон и через 7-8 суток обнаруживается бензохинон. На основе литературных и экспериментальных данных биодеструкцию парацетамола можно представить схемой, которая применима к аэробным микроорганизмам, какими являются актинобактерии рода Rhodococcus.
Предполагаемая схема биотрансформации парацетамола
Качественное определение продуктов биотрансформации парацетамола проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол и Сорбфил. Из десяти апробированных вариантов составов подвижных фаз эффективное разделение исследуемых веществ наблюдается в системах: спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80:4:16) и хлороформ–спирт этиловый 95% (8:2) на пластинках «Силуфол». Исследуемые вещества на хроматограмме обнаруживали путем облучения пластинок УФ-светом или обработкой цветореагентами: железа (III) хлорида 1% спиртовым раствором, п-диметиламинобензальдегида 5% спиртовым раствором, парами йода. На рис. 1 представлена хроматограмма, полученная при разделении модельной смеси продуктов биодеструкции парацетамола в системе: хлороформ–спирт этиловый 95% (8:2).
| 1 2 3 4 5 6 7 8 | |
| Рис. 1. Хроматограмма исследуемых веществ в системе хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2) на пластинках «Силуфол» | |
| 1– Парацетамол; 2– п-Аминофенол; 3 – Гидрохинон; 4 – Пирокатехин; 5– Бензохинон; 6– Фенол; 7– Муконовая кислота 8– Модельная смесь продуктов биодеструкции парацетамола | |
Свойства конечных продуктов биотрансформации парацетамола (шлама) оценивали по физико-химическим свойствам, токсичности и фитотоксичности.
Количественное содержание парацетамола в культуральных жидкостях определяли методом ВЭЖХ на базе лаборатории РИЦ «Фарматест» ПГФА на хроматографе модели HP-1090 (Hewlett Packard, США) и колонке ZORBAX SB- C18 (4,6 х 250 мм, 5 µм), заполненной октадецильной привитой фазой, на приборном комплексе «Милихром А-02» с УФ-детектором. Подвижная фаза - ацетонитрил:вода:натрия дигидрофосфат:натрия октилсульфонат (25 мл : 75 мл : 100 мг: 30 мг); постоянная времени детекции – 0,34 сек; скорость потока элюента – 100 мкл/мин; объем вводимой пробы 5 мкл; режим элюирования – изократический; температура колонки 35°С; длина волны =230 нм; время удерживания парацетамола около 3 мин ± 0,30 мин. Запись и обработку хроматограмм осуществляли с помощью программы «ChemStation». Хроматограммы 0,2% водного раствора парацетамола-стандарта и парацетамола, содержащегося в культуральной жидкости, полученные в этих условиях, идентичны (рис. 2 и 3).
| Рис. 2. Хроматограмма 0,2% водного раствора парацетамола-стандарта | |||
| Рис. 3. Хроматограмма культуральной жидкости, содержащей 0,2% парацетамола | |||
Содержание п-аминофенола определяли спектрофотометрическим методом на основе реакции конденсации его с п-диметиламино-бензальдегидом при =450 нм на приборе Lambda EZ201 корпорации «Perkin-Elmer». Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6,0 (StatSoft Inc., 2001).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Предварительными исследованиями установлено, что парацетамол, соли ацетилсалициловой и салициловой кислот не являются токсичными для родококков. R. ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767 сохраняют свою жизнеспособность в присутствии исследуемых ЛС в концентрациях от 0,75 до 500 мкг/мл. Другие штаммы по окончании эксперимента были нежизнеспособны или их минимальная подавляющая концентрация (МПК) составляла менее 100 мкг/мл. Из-за низкой растворимости в воде салициловой и ацетилсалициловой кислот необходимо введение в среду 5% водного раствора натрия гидрокарбоната для получения их водорастворимых солей, что требует дополнительной операции и может привести к изменению состава среды культивирования. В связи с этим, в дальнейших исследованиях в качестве модельного соединения для изучения процесса биодеструкции нами избран парацетамол, а в качестве микроорганизмов-деструкторов R. ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767.
Влияние условий культивирования на процесс трансформации парацетамола и активность родококков. Продолжительность эксперимента составляла до 25 суток. Установлено, что уменьшение содержания парацетамола в среде «RS» происходит значительно быстрее как в таблетках, так и в виде субстанции, что возможно, объясняется присутствием в ней аммония сульфата, который является легкоусвояемым для алканотрофных родококков и может служить дополнительным источником аммонийного азота. Скорость биотрансформации парацетамола зависит также от вводимой формы. В таблетированной форме биодеструкция парацетамола в обеих средах происходит значительно быстрее, чем в виде субстанции, вероятно, из-за наличия вспомогательных веществ, которые могли служить дополнительными источниками питания для актинобактерий. Остаточное содержание парацетамола в виде субстанции составляет 1,6% через 20 суток эксперимента в среде «RS» под влиянием R. erythropolis ИЭГМ 767. В то же время полная биодеструкция парацетамола в таблетируемой форме в этих же условиях наблюдается уже на 5-6 сутки (рис. 4). Скорость биодеструкции парацетамола при использовании R. ruber ИЭГМ 77 значительно ниже (рис. 5).
 | Рис. 4. Изменение содержания парацетамола, введенного в виде субстанции и таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола, R. erythropolis ИЭГМ 767 в среде «RS». |
 | Рис. 5. Изменение содержания парацетамола, введенного в виде субстанции и таблеток, содержащих 0,2 г парацетамола, R. ruber ИЭГМ 77 в среде «RS». |
Появление первого метаболита (п-АФ) обнаруживается на первые сутки эксперимента в обеих средах. Его количественное определение в культуральной жидкости в процессе эксперимента показало, что в первые 5 суток наблюдается увеличение его содержания. По окончании опыта через 25 суток остаточное содержание п-АФ составило около 2 % в среде «RS» и 8 % в среде «К», причем скорость его преобразования актинобактериями R. еrythropolis ИЭГМ 767 выше, чем при использовании штамма R. ruber ИЭГМ 77.
Для исследования влияния каждого из вспомогательных веществ таблеток (крахмала, талька, ПВП или стеариновой кислоты) на скорость и полноту биотрансформации парацетамола в культуральную среду вносили каждое из них в количестве 10% от содержания парацетамола в таблетке. Пробы для количественного определения парацетамола отбирали через 1, 3, 5, 10 и 15 суток.
Как следует из рис. 6 и 7, добавление кислоты стеариновой и ПВП увеличивает скорость биодеструкции парацетамола.
Уменьшение содержания парацетамола в присутствии ПВП происходит значительно быстрее, чем в присутствии стеариновой кислоты. Можно предположить, что ПВП является не только дополнительным источником питания для микроорганизмов, но и катализатором процесса биодеструкции парацетамола.
 | Рис. 6. Динамика изменения содержания парацетамола в присутствии 10 % количества вспомогательных веществ при использовании R. ruber ИЭГМ 77. 1 – крахмал; 2 – тальк; 3 – стеариновая кислота; 4 – ПВП |
 | Рис. 7. Динамика изменения содержания парацетамола в присутствии 10 % количества вспомогательных веществ при использовании R. erythropolis ИЭГМ 767. 1 – крахмал; 2 – тальк; 3 – стеариновая кислота; 4 – ПВП |
Влияние вспомогательных веществ таблеток изучено также на рост и жизнеспособность актинобактерий без введения парацетамола. Контроль увеличения биомассы родококков спектрофотометрическим методом (=600 нм) показал, что наиболее благоприятным для роста актинобактерий также являются стеариновая кислота и ПВП, что подтверждает результаты приведенного эксперимента.
Для активизации бактериальных оксигеназ изучен процесс адаптации родококков на феноле, поскольку парацетамол является производным фенола. Пробы отбирали ежедневно в течение 14 суток.
 | ||
| Рис. 8. Динамика роста R. erythropolis ИЭГМ 767 1 - контроль клетки, выращенные на плотной среде; 2 - клетки, адаптированные в парах фенола; 3 - клетки, адаптированные в среде с содержанием 0,1% фенола; 4 - контроль клетки, выращенные в жидкой среде | ||
Установлено, что увеличение биомассы клеток родококков и устойчивая адаптация клеток происходит в жидкой минеральной среде в присутствии 0,1% фенола, находящегося в растворенном виде. На рис. 8 приведена динамика роста биомассы на примере R. erythropolis ИЭГМ 767. Увеличение концентрации фенола более 0,1% замедляет рост биомассы клеток. Предварительная адаптация клеток родококков позволяет повысить устойчивость к окислительному стрессу в процессе биотрансформации парацетамола в сравнении со свободными культурами. Применение адаптированных клеток R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 сокращает время полной деструкции парацетамола в виде субстанции до 5 суток, а в таблетируемой форме до 3 суток, что оптимизирует процесс по временному параметру и позволяет проводить его без дополнительного внесения инокулята. При использовании R. ruber ИЭГМ 77 или смеси родококков процесс идет с меньшей скоростью (табл. 1 и 2).
Таблица 1.
Результаты количественного определения парацетамола (субстанция) при его биодеструкции адаптированными клетками
| Время инкубации, сутки | Содержание парацетамола, % | ||
| R. erythropolis ИЭГМ 767 | R. ruber ИЭГМ 77 | R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 | |
| 0 1 2 3 4 5 6 7 8 | 100,00* 67,89±3,39 35,41±4,06 5,63±2,09 1,82±0,011 0,00 0,00 0,00 0,00 | 100,00* 92,41±1,26 63,60±2,14 44,91±3,51 36,52±2,45 27,84±1,29 20,16±3,23 17,80±2,11 15,43±1,05 | 100,00* 77,32±4,23 43,87±2,51 19,40±2,49 9,34±1,08 6,53±0,67 4,03±0,99 0,90±0,007 0,00 |
Примечание. Каждый результат – среднее из 3-х значений
* За 100% принято введенное количество парацетамола – 0,2 г
Таблица 2.
Результаты количественного определения парацетамола (таблетки) при его биодеструкции адаптированными клетками
| Время инкубации, сутки | Содержание парацетамола, % | ||
| R. erythropolis ИЭГМ 767 | R. ruber ИЭГМ 77 | R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 | |
| 0 1 2 3 4 5 6 7 8 | 100,00* 8,97±1,43 1,82±1,09 0,07±0,005 0,03±0,001 0,00 0,00 0,00 0,00 | 100,00* 58,30±4,85 32,64±3,48 18,42±3,11 9,10±2,02 5,19±1,35 2,72±1,06 0,00 0,00 | 100,00* 33,01±3,23 15,47±1,05 8,05±1,73 2,12±0,17 0,00 0,00 0,00 0,00 |
Примечание. Каждый результат – среднее из 3-х значений
* За 100% принято введенное количество парацетамола – 0,2 г
Из литературных данных известно, что увеличение скорости процесса биодеструкции органических соединений возможно с помощью биокатализаторов на основе иммобилизованных живых клеток микроорганизмов в «мягких» условиях, при которых сохраняется жизнеспособность и функциональная способность клеток. Нами в качестве носителя использован криогель поливинилового спирта, что обеспечивает иммобилизацию бактериальных клеток при физиологических значениях рН, оптимальной температуре и без применения химических веществ. Каталитическую активность клеток родококков определяли в экспериментах по динамике биотрансформации парацетамола в субстанции и таблетках, отбирая пробы каждые 2 часа в течение эксперимента.
Использование клеток R. erythropolis ИЭГМ 767, предварительно выращенных на феноле и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта, позволяет значительно ускорить (до 12 часов) процесс биодеструкции парацетамола, внесенного в виде субстанции (рис. 9 и 10). В то же время, продолжительность процесса с участием иммобилизованных клеток R. ruber ИЭГМ 77, также адаптированных к фенолу, составляет более 24 ч. Изменение содержания парацетамола, внесенного в виде таблеток, с использованием адаптированных или чистых клеток R. erythropolis ИЭГМ 767 и R. ruber ИЭГМ 77 в этих же условиях значительно меньше. Возможно, влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток, ингибирует процесс биотрансформации парацетамола иммобилизованными клетками.
 |  | |
| 1 - субстанция, иммобилизованные адаптированные клетки; 2 - субстанция, иммобилизованные чистые клетки; 3 - таблетки, иммобилизованные адаптированные клетки; 4 - таблетки, иммобилизованные чистые клетки | ||
| Рис. 9. Изменение содержания парацетамола в культуральной среде при использовании иммобилизованных адаптированных и чистых клеток R. erythropolis ИЭГМ 767 | Рис. 10. Изменение содержания парацетамола в культуральной среде при использовании иммобилизованных адаптированных и чистых клеток R.ruber ИЭГМ 77 | |
Для реализации установленных в ходе эксперимента условий утилизации парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus в укрупненном масштабе разработана документация, регламентирующая процесс. Подготовлены технологические схемы процесса биодеструкции ЛС адаптированными иммобилизованными и адаптированными свободными клетками актинобактерий рода Rhodococcus и лабораторный регламент утилизации парацетамола применительно к ферментационной установке «Фермус – 3» с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении лабораторного эксперимента. На основе разработанной документации проведена утилизация субстанции парацетамола со сроком хранения более 5 лет и таблеток со сроком хранения более 3-х лет. Полученные результаты (табл. 3) свидетельствуют о возможности масштабирования объема ферментера и последующей промышленной реализации проекта.
Таблица 3.
Результаты количественного определения парацетамола (субстанция и таблетки) в культуральных средах в процессе биодеструкции на установке «Фермус – 3» при использовании адаптированных R. erythropolis ИЭГМ 767
| Время инкубации, сутки | Содержание парацетамола, % | |
| Таблетки | Субстанция | |
| 0 1 2 3 4 5 6 | 93,50 50,42±2,87 27,65±2,31 11,90±2,14 1,18±3,04 0,00 0,00 | 98,67 83,15±3,05 65,19±3,17 57,97±3,12 24,45±2,45 11,60±2,21 2,30±2,17 |
Примечание. Каждый результат – среднее из 3-х значений
Параллельно в культуральной среде проводили количественное определение п-АФ, остаточное содержание которого в субстанции составляет 3,15% на 15 сутки. Скорость образования и содержание метаболита в культуральной среде в процессе биодеструкции парацетамола в таблетках значительно выше и его содержание на 11 сутки составляет 1,03%.
Свойства продуктов трансформации парацетамола. В течение эксперимента появляется, накапливается и укрупняется черный с серо-фиолетовым оттенком аморфный осадок. Температура плавления полученного осадка (шлама) находится в интервале 150-2050С (с разложением). Он практически нерастворим в воде, эфире и хлороформе, мало растворим в гексане и ацетонитриле, хорошо растворим в этилацетате, ацетоне, метиловом и этиловом спиртах, легко растворим в растворе аммиака и очень легко - в диметилсульфоксиде и 1 М растворе натрия гидроксида. Растворы полученного осадка в спиртах окрашены в красно-коричневый цвет, в ацетоне, эфире и этилацетате имеют желто-оранжевую окраску, а в растворе аммиака - сине-фиолетовую.
Конечный продукт трансформации парацетамола представлен сложной смесью веществ, ряд компонентов которых на данном этапе исследования не представляется возможным идентифицировать. Их значения Rf не совпадают со значениями Rf веществ, полученных при исследовании биотрансформации парацетамола в этих системах.
Установлено, что осадок (шлам) не является токсичным для окружающей среды. Значение LD50 составляет 3.000 (2.400 – 3.800) мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам. Для сравнения LD50 парацетамола в этих же условиях составляет 2.728 мг/кг. При пероральном введении значение LD50 более 4.000 мг/кг.
Исследование на фитотоксичность при использовании в качестве тест-объектов семян и проростков травяных культур в результате обработки почвы осадком (шламом) показало, что биомасса исследуемых фитокультур и растений, выращенных на чистой сельскохозяйственной почве, значительно различается (табл. 4 и 5).
Таблица 4.
Влияние конечных продуктов биодеструкции парацетамола на вегетативное развитие овса
| Показатель фитотоксичности | Контроль | Содержание конечных продуктов в почве* | |
| 0,25 г | 0,5 г | ||
| Длина стебля, мм Длина корня, мм Биомасса сухая, г | 64,1±1,58 49,4±1,44 0,6838±0,27 | 116,7±5,45 62,4±4,74 0,6883±0,32 | 125,4±8,13 58,1±6,23 0,7205±0,38 |
Примечание. Каждое значение – среднее определение при трехкратном повторении
* Содержание исследуемых продуктов в 100 г почвы
Таблица 5.
Влияние конечных продуктов биодеструкции парацетамола на вегетативное развитие гороха
| Показатель фитотоксичности | Контроль | Содержание конечных продуктов в почве* | |
| 0,25 г | 0,5 г | ||
| Длина стебля,мм Длина корня, мм Биомасса сухая,г | 77,3±3,11 52,4±2,48 0,4865±0,26 | 95, 5±4,23 67,2±3,96 0,7759±0,15 | 110,9±5,73 76,4±4,15 0,9112±0,21 |
Примечание. Каждое значение – среднее определение при трехкратном повторении
* Содержание исследуемых продуктов в 100 г почвы
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что полученный после окончания процесса биодеструкции парацетамола шлам нетоксичен для животных и оказывает благоприятное воздействие на растения. Возможно, что исследуемый продукт является дополнительным источником азота и углерода и может использоваться в качестве биодобавок к почве.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что в качестве модельного соединения для изучения биодеструции ЛС, производных фенола, может служить парацетамол, а актинобактериями деструкторами - штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767, которые его эффективно метаболизируют.
2. Установлено, что деструкция парацетамола протекает более эффективно при использовании адаптированных к фенолу и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков.
3. Изучена динамика процесса биодеструкции парацетамола с использованием актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и R. erythropolis ИЭГМ 767. Установлено, что штамм Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767 обладает более высокой биотрансформирующей активностью в отношении парацетамола. При использовании свободных клеток родококков R. erythropolis ИЭГМ 767 процесс деструкции парацетамола заканчивается через 10 суток, на адаптированных свободных клетках – через 5 суток, а при использовании иммобилизованных адаптированных клеток в течение 14 часов эксперимента. В тех же условиях скорость трансформация парацетамола клетками R. ruber ИЭГМ 77 значительно ниже.
4. Найдены оптимальные условия разделения парацетамола и возможных продуктов его деструкции методом ТСХ на пластинках Силуфол с использованием систем растворителей: хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2) и спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80:4:16) при детектировании УФ-светом и в парах йода.
5. Разработаны методики количественного определения парацетамола и п-аминофенола в культуральных средах, позволяющие контролировать процесс биотрансформации: для п-аминофенола – это спектрофотометрическое определение на основе реакции с п-ДМАБА (относительная ошибка не превышает ± 2,09%); для парацетамола – методика с использованием ВЭЖХ (относительная ошибка не превышает ± 4,15%).
6. Изучены физико-химические свойства конечных продуктов процесса биодеструкции парацетамола (шлама): растворимость, температура плавления, значение рН среды. Исследование токсичности и фитотоксичности, показало, что эти продукты нетоксичны для животных и оказывают благоприятное воздействие на растения, что может быть использовано в сельском хозяйстве.
7.На основе проведенных биологических, химических и физико-химических исследований процесса биодеструкции парацетамола предложены технологические схемы утилизации его адаптированными и иммобилизованными клетками родококков и лабораторный регламент, которые реализованы при проведении процесса на ферментационной установке «Фермус – 3».
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Изучение возможности окислительной биодеструкции лекарственных средств, не пригодных к медицинскому использованию (на примере парацетамола) / Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья: Матер. 69-ой конф. - Курск. - 2004. - С. 292-293.
2. Биодеструкция парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / Е.В. Вихарева, И.Б. Ившина, И.И. Мишенина, Л.А. Чекрышкина [и др.] // Человек и лекарство: Тез. докл. XI Рос. нац. конгресса. - Москва. - 2004. - С. 16-17.
3. Использование родококков для биодеструкции лекарственных средств / Е.В. Вихарева, И.И. Мишенина, Л.А. Чекрышкина [и др.] // Матер. IX Международ. экологической студенческой конф.: Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ. - Новосибирск. - 2004. - С. 204.
4. Биоконверсия парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / И.Б. Ившина, Е.В. Вихарева, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Матер. V Международ. науч.-практич. конф.: Здоровье и образование в XXI веке. - Москва. Росс. ун-т дружбы народов. - 2004. - С.148.
5. Изучение биодеструкции парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus / Е.В. Вихарева, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Фармация. - 2004. - № 5. - С. 12-13.
6 Биодеструкция непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств актинобактериями рода Rhodococcus sensu stricto / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, И.И. Мишенина [и др.] // Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности: Тез докл. II конф. - Новосибирск, 2004.- С.119-122.
7. Изучение динамики и скорости бактериальной деструкции парацетамола / Е.В. Вихарева, И.И. Мишенина, Ю.В. Данилов [и др.] // Матер. XII Росс. нац. конгресса: Человек и лекарство. – Москва. - 2005. - С. 743.
8. Кинетические параметры процесса биодеструкции парацетамола, непригодного к медицинскому использованию / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, И.И. Мишенина [и др.] // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биопотенциал: Тез. докл. II Международ. конф. - Пермь-Казань - 2005. -С. 86-87.
9. Деградация парацетамола с истекшим сроком годности свободными клетками актинобактерий / И.Б. Ившина, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Катализ в промышленности. - 2006. - № 2. - С. 44-49.
10. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств / И.Б. Ившина, И.И. Мишенина, М.И. Рычкова [и др.] // Журнал прикладной микробиологии и биохимии. - 2006. - Т. 42. - № 4. - С 392-395.
11. Интенсификация процесса биодеструкции непригодного к медицинскому использованию парацетамола / И.Б. Ившина, Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина [и др.] // Техническая химия. Достижения и перспективы // Докл. II Всероссийс. конф. – Пермь. - 2006. - С.54 -56.
12. Кинетические параметры процесса биотрансформации парацетамола / Е.В. Вихарева, И.И. Мишенина, Ю.В. Данилов [и др.] // Мат-лы XIII Росс. нац. конгресса: Человек и лекарство. - Москва. - 2006. - С. 10.
13. Оптимизация процесса биодеструкции парацетамола свободными клетками актинобактерий / Е.В. Вихарева, И.И. Мишенина, Л.А. Чекрышкина [и др.] // Сб. материалов XIV Рос. нац. Конгресса «Человек и лекарство» - Москва. - 2007. - С. 10-11.
14. Оптимизация процесса биодеструкции парацетамола актинобактериями рода Rhodococcus / И.И. Мишенина, Л.А. Чекрышкина, Ю.Н. Карпенко [и др.] // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2007. - № 2. – С. 168-171.
