Разработка и стандартизация сердечно-сосудистого сбора
На правах рукописи
МАРЬИН АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
Разработка и стандартизация сердечно-сосудистого сбора
15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Томск – 2006
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук, профессор Калинкина Галина Ильинична
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Замощина Татьяна Алексеевна
кандидат фармацевтических наук, доцент Тихонова Людмила Александровна
Ведущая организация: ГОУ ВПО Иркутский государственный медицинский
университет Росздрава
Защита диссертации состоится «____» мая 2006 г
в «____» ч. на заседании диссертационного совета Д 208.096.04 при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по адресу: 634050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 107
Автореферат разослан «____» апреля 2006 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Е.В. Ермилова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Ухудшение экологической обстановки и разнообразные стрессовые факторы оказывают негативное влияние на состояние здоровья людей, являются причиной бурного роста так называемых «болезней цивилизации». Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), относятся к прогностически неблагоприятным и лидируют среди причин инвалидизации и внезапной смерти в России и ряде других стран. Здоровье этих групп населения в значительной мере зависит от достижений медицины и научных разработок, проводимых в области создания новых эффективных препаратов. Особенно интересны в этом отношении фитопрепараты, имеющие широкий спектр биологической активности, а именно седативные, ангиопротекторные, антигипертензивные, гипохолестеринемические, капилляроукрепляющие, гемореологические, коронарорасширяющие и другие свойства. Кроме того, растительные лекарственные средства, как правило, дают выраженный фармакологический эффект и более безопасны, чем синтетические препараты.
Несмотря на то, что каждое лекарственное растение обладает многосторонним действием, наиболее эффективным является их комбинированное применение. Это обусловлено тем, что в сборы входят растения с различными фармакологическими свойствами, благодаря чему достигается комплексное воздействие на различные звенья патогенеза заболевания.
Такие растения как боярышник кроваво-красный, рябина черноплодная, горец птичий, левзея сафлоровидная, шиповник, зизифора клиноподиевидная, валериана лекарственная, пустырник обыкновенный, мелисса лекарственная, душица обыкновенная, манжетка обыкновенная, являются наиболее известными растениями, которые целенаправленно оказывают влияние на сердечно-сосудистую систему. Кроме того, они обеспечивают дополнительные фармакологические эффекты (гипохолестеринемический, мочегонный, противовоспалительный, адаптогенный) в организме человека, тем самым усиливают основной конечный эффект. Однако среди официнальных растительных сборов, действующих на сердечно-сосудистую систему, нет таких, которые бы влияли на реологические свойства крови.
Цель диссертационной работы состоит в разработке научно-обоснованной прописи растительного сердечно-сосудистого сбора, обладающего комплексным действием.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- Дать краткую характеристику проблемы ССЗ и лекарственных растительных средств, используемых при данной патологии;
- Составить пропись и обосновать компонентный состав сердечно-сосудистого сбора на основе официнальных и перспективных для внедрения видов лекарственного растительного сырья;
- Разработать методики идентификации и стандартизации лекарственного растительного сбора;
- Получить рациональный экстракционный препарат из растительного сбора и провести его стандартизацию;
- Провести оценку фармакологических свойств и безвредности экстракционного препарата;
- Разработать проект фармакопейной статьи (ФС) на предлагаемый растительный сердечно-сосудистый сбор.
Научная новизна работы. На основании анализа банка данных литературы и собственных исследований разработана пропись лекарственного растительного сбора «Кардизид», обладающего комплексным действием на патогенез ССЗ.
Установлен качественный и количественный состав основных биологически активных веществ (БАВ) сбора (фенольные соединения, флавоноиды, экдистероиды, полисахариды, эфирное масло, аскорбиновая кислота, витамин К, каротиноиды) и полученного из него водно-спиртового экстракта.
Для идентификации сбора «Кардизид» предложены внешние и микроскопические диагностические признаки входящих в него ингредиентов.
Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения основных групп БАВ сбора «Кардизид»: флавоноидов и экдистероидов, обусловливающих основные фармакологические свойства сбора, в том числе гемореологическое действие.
Предложены товароведческие показатели определения доброкачественности сбора «Кардизид», включенные в проект ФС.
Обоснован рациональный метод получения экстракта из сбора «Кардизид» и проведена его стандартизация по технологическим показателям, содержанию флавоноидов и экдистероидов.
Экспериментальными исследованиями установлено гипотензивное и гемореологическое действие жидкого экстракта сбора «Кардизид», доказана его безвредность.
Практическая значимость работы. Теоретические и экспериментальные исследования показали целесообразность дальнейшего исследования предложенного сбора «Кардизид» и экстракционного препарата на его основе в качестве нового сердечно-сосудистого средства. Разработано учебное пособие «Фитопрепараты в профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний», которое используется в учебном процессе кафедры фармакогнозии Иркутского государственного медицинского университета, кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Алтайского государственного медицинского университета, кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета. Разработан проект ФС на растительный сердечно-сосудистый сбор.
На защиту выносятся результаты теоретического и экспериментального обоснования состава лекарственного растительного сбора и экстракционного препарата на его основе, обладающего комплексным действием на основные звенья патогенеза ССЗ.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2004 г.); VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2005 г.); 59-ой региональной научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2004 г.); научной конференции «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (г. Барнаул, 2004 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005 г.); 63-ей международной студенческой научной конференции Н.И. Пирогова (г. Томск, 2004 г.), а также на заседаниях коллектива кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ (г. Томск, 2002 - 2004 гг.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета и комплексной целевой программой СО АМН Российской Федерации «Здоровье человека в Сибири» (№ Государственной регистрации 01.9.2002479).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 статей и тезисов докладов, 1 учебное пособие.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, в лаборатории кровообращения НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск), в Новосибирском институте органической химии СО РАН. Сотрудникам данных подразделений выражаем глубокую благодарность.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 142 источника литературы, из них 20 зарубежных.
Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулирована цель и задачи исследования, охарактеризованы научная новизна и практическая значимость работы.
В обзоре литературы (глава 1) приведен краткий анализ проблемы ССЗ, охарактеризованы сердечно-сосудистые средства растительного происхождения. Обозначена перспектива получения сердечно-сосудистых средств на основе лекарственного растительного сырья.
Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.
В третьей главе дается теоретическое обоснование компонентного состава сердечно-сосудистого сбора «Кардизид»; результаты исследования химического состава сбора.
В четвертой главе изложены результаты разработки методик определения подлинности и доброкачественности сбора «Кардизид».
Пятая глава посвящена разработке рациональной технологии получения жидкого экстракта сбора и методик его стандартизации. Приведены результаты исследования фармакологических свойств жидкого экстракта сбора «Кардизид».
В приложении представлен проект ФС «Сбор сердечно-сосудистый Кардизид».
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методики исследования
Подбор компонентов сбора «Кардизид» осуществляли, учитывая природу биологически активных веществ и поливалентный патогенез заболеваний сердечно-сосудистой системы. Основные компоненты предлагаемого сбора разрешены к применению в медицине, а трава зизифоры клиноподиевидной и манжетки обыкновенной используются для получения биологически активной добавки «Аргозид».
Для разработки сбора использовали лекарственное растительное сырье: трава манжетки обыкновенной, корневища с корнями левзеи сафлоровидной, плоды боярышника, плоды рябины черноплодной, трава зизифоры клиноподиевидной.
Качественный состав и количественное содержание БАВ, содержащихся в сборе, оценивали с использованием современных методов фитохимического анализа: химического, хроматографического, спектрофотометрического и др. Для идентификациикомпонентов в сборе использовали макро- и микроскопические методы анализа. При разработке экстракционной лекарственной формы использовали современные технологические методики.
Гипотензивное и гемореологические свойства сбора оценивали в лаборатории кровообращения НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск) под руководством доктора биологических наук, профессора Плотникова М.Б., за что выражаем ему искреннюю признательность и благодарность. Токсико-фармакологические исследования проводили с использованием принятых для этих целей методик и моделей.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятым методом с определением средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (м). Достоверность результатов оценивали параметрически по t-критерию Стьюдента. Кроме того, использовали пакет статистических программ «Statistica for Windows 7.0».
Разработка компонентного состава
сбора «Кардизид»
Учитывая требования, предъявляемые к фитосредствам, а также потребность в дешевых отечественных препаратах, обладающих комплексным действием на сердечно-сосудистую систему, нами на основании банка данных литературы, опыта использования лекарственных растений в клинической практике и последних исследований, проведенных в лаборатории кровообращения НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск), был предложен растительный сбор: трава манжетки обыкновенной, плоды боярышника, плоды рябины черноплодной, трава зизифоры клиноподиевидной и корневища с корнями левзеи сафлоровидной. При подборе компонентов учитывали способность БАВ растений влиять на основные звенья патогенеза ССЗ и сопряженные системы организма.
Отличительной особенностью предлагаемого сбора является способность улучшать реологические свойства крови. Синдром повышенной вязкости крови (СПВК) приводит к нарушению кровообращения, то есть является одним из звеньев патогенеза ССЗ. Растительных сборов с подобным действием среди официально зарегистрированных нет.
Так, трава манжетки обыкновенной выбрана нами из-за способности ее БАВ (прежде всего флавоноидов) ограничивать формирование синдрома ПВК, развивающегося при сердечно-сосудистых расстройствах различного генеза, за счет влияния как на клеточные, так и на плазменные факторы, определяющие вязкостные свойства крови. Флавоноидый комплекс и фитоэкдистероиды корневищ с корнями левзеи сафлоровидной также способны улучшать реологические свойства крови и, кроме того, при курсовом применении снижают повышенное артериальное давление и обладают гипокоагуляционной активностью, о чем свидетельствуют замедление фаз свертывания крови, увеличение протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. Все это благоприятно воздействует на течение заболеваний, связанных с острым и хроническим коронарогенным поражением миокарда. Таким образом, два компонента сбора оказывают положительный гемореологический эффект, снижают АД и влияют на систему гемостаза.
Выбор плодов боярышника связан, главным образом, с присутствием комплекса БАВ, важнейшими из которых являются флавоноиды (кверцетин, гиперозид, витексин и др.) и тритерпеновые кислоты (олеаноловая, урсоловая и кратеговая). Данный комплекс БАВ способствует усилению сократительной функции миокарда, понижению его возбудимости, усилению кровообращения в венечных сосудах сердца и сосудах мозга. Плоды боярышника обладают антиаритмическим, гипохолестеринемическим, сосудорасширяющим действием, тем самым способствуют снижению кровяного давления. Высокое содержание в плодах боярышника микроэлементов, таких, как медь, цинк и марганец, обладающих положительным влиянием на сердечно-сосудистую систему, также стало основанием для введения их в состав сбора.
Плоды рябины черноплодной вносят капилляроукрепляющий компонент за счет содержания комплекса флавоноидов (рутин, геспередин, кверцетин), обладающих Р-витаминной активностью и высокого содержания аскорбиновой кислоты. Это играет важную роль в коррекции микроциркуляции головного мозга и внутренних органов при ССЗ. Кроме того, комплекс БАВ рябины черноплодной способен снижать уровень холестерина в крови и усиливать выведение с желчью предшественников его синтеза в печени, тем самым, оказывая антисклеротическое действие.
Лечебное действие травы зизифоры клиноподиевидной обусловлено, в первую очередь, наличием эфирного масла и комплекса фенольных соединений, обеспечивающих способность снимать спазм сосудов, уменьшать боли в сердце и, как следствие, снижать повышенное кровяное давление. Кроме того, растение способно накапливать ионы марганца и калия, влияющие на процессы кроветворения, тонус стенок сосудов и предупреждающие образование внутрисосудистых тромбов. Следует отметить слабое мочегонное действие травы зизифоры, что также способствует снижению повышенного кровяного давления. Также известно, что эфирные масла проявляют антиоксидантные свойства, снижая скорость активации перекисного окисления липидов в эритроцитах и повышая устойчивость мембран этих клеток, действуя профилактически на систему крови, предупреждая развитие серьезных нарушений в ее структуре и функции.
Таким образом, анализ данных литературы по химическому составу и фармакологическим свойствам выше перечисленных растений, позволил нам обосновать рациональность их использования в составе сердечно-сосудистого сбора «Кардизид».
Соотношение компонентов в сборе обусловлено их значимостью в формировании гемореологического эффекта данного лекарственного средства, поскольку действие сбора направлено на улучшение реологических свойств крови, которое в свою очередь снижает тяжесть течения основных ССЗ, а также оказывает профилактическое действие. Так, основными компонентами сбора стали трава манжетки обыкновенной и плоды боярышника, а другие составляющие введены нами с целью дополнительного влияния на различные звенья патогенеза ССЗ и формирования дополнительных фармакологических эффектов (гипохолестеринемический, противовоспалительный, капилляроукрепляющий, гипокоагуляционный, адаптогенный, мочегонный) в организме человека, усиливающих основной конечный эффект. Последующие фармакологические испытания подтвердили эффективность данной прописи сбора.
Химический состав компонентов сбора является достаточно изученным и позволяет обеспечить действительно комплексное действие на сердечно-сосудистую систему. Однако в задачи нашего исследования входит не только разработка состава сбора, но и методик его стандартизации. Для чего необходимо было провести качественный и количественный анализ основных групп БАВ сбора и выбрать главные действующие вещества, по которым будет проводиться его стандартизация.
Исследование химического состава сбора «Кардизид»
Для исследования химического состава сбора использовали общепринятые методы, а также методики качественного и количественного анализа БАВ по нормативным документам компонентов сбора.
Анализ показал, что основными действующими веществами сбора являются фенольные соединения, фитоэкдистероиды, полисахариды, витамины, эфирное масло, макро и микроэлементы. Среди фенольных соединений следует выделить флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, кумарины.
Качественно наличие флавоноидов и гидроксикоричных кислот было доказано спектрофотометрически, характерные для этих групп веществ пики в УФ области спектра наблюдались при длине волны 280, 290нм и 325нм, что свидетельствуют о содержании этих веществ. Также это подтверждалось методом бумажной хроматографии. С помощью, которой нами подтверждено наличие в сборе гликозидов, производных флавона, гидроксикоричных кислот и кумаринов. Для получения более объективных данных о присутствии и качественном составе данных БАВ нами было проведено разделение с помощью хроматографии на бумаге.
Присутствие остальных групп БАВ (полисахаридов, дубильных веществ, витаминов) было доказано с помощью общепринятых реакций.
Количественное определение БАВ показало (табл. 1), что сбор «Кардизид» содержит в наибольших количествах флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, полисахариды.
Таблица 1
Содержание основных групп БАВ в сборе (М±m, средние из 5 определений)
| Группа БАВ | Содержание, (%) |
| Фенольные соединения | 4,10±0,12 |
| Флавоноиды - в том числе антоцианы | 1,98±0.11 0,10±0.00 |
| Гидроксикоричные кислоты | 2,26±0,09 |
| Фитоэкдистероиды | 0,21±0,02 |
| Полисахариды | 18,42±0,42 |
| Эфирное масло | 0,10±0.00 |
| Аскорбиновая кислота | 74,00 мг% |
| Каротиноиды | 55,00 мг% |
Разделение фенольных соединений проводили по общепринятой схеме. Для этого использовали методы избирательной экстракции в сочетании с хроматографией на бумаге и в тонком слое сорбента. Для идентификации фенольных соединений использовали данные по хроматографическому поведению в сравнении с достоверными образцами флавоноидов и гидроксикоричных кислот. Хроматографические характеристики фенольных соединений сбора представлены в таблице 2.
Таблица 2
Хроматографические характеристики фенольных соединений сбора «Кардизид»
| № пятна | Значение Rf | Окраска пятен | |||||
| БУВ (4:1:5) | 15% CН3СООН | 2% СН3СООН | Система Форесталя | УФ | УФ+ АlCl3 | Реактив Паули | |
| Апигенин | 0,87 | 0 | 0,04 | 0,83 | Темно-коричн. | Желтое | - |
| Лютеолин | 0,77 | 0 | 0 | 0,80 | Темно-коричн. | Желтое | - |
| Цинарозид | 0,44 | 0,15 | - | - | Коричневое | Желто-зеленое | - |
| Кемпферол | 0,79 | - | 0,80 | 0,55 | Желто-зеленое | Желтое | - |
| Кверцетин | 0,69 | 0 | 0 | 0,41 | Желто-зеленое | Лимонно-желтое | - |
| Изокверцетрин | 0,68 | 0,72 | - | - | Темно-коричн. | Лимонно-желтое | - |
| Гиперозид | - | 0,35 | - | - | Коричнево-бурое | Желто-зеленое | - |
| Витексин | 0,46 | 0,69 | - | 0,82 | Темно-желтое | - | - |
| Рутин | - | 0,51 | - | - | Коричневое | Лимонно-желтое | - |
| Синаповая кислота | 0,68 | 0,72 | 0,51 | - | Голубовато-зеленое | - | Голубовато-фиолетовое |
| Хлорогеновая кислота | 0,73 | 0,42 | 0,66 | - | Голубое | - | Желто-коричневое |
| Феруловая кислота | 0,83 | 0,52 | 0,31 | - | Синее | - | Фиолет. |
| Кофейная кислота | 0,85 | 0,47 | 0,22 | - | Светло-голубое | - | Коричневое |
На основании проведенных исследований установлено, что исследуемый сбор «Кардизид» содержит характерные для компонентов сбора флавоноиды и гидроксикоричные кислоты.
О наличии фитоэкдистероидов, содержащихся по данным литературы в корневищах с корнями левзеи сафлоровидной, свидетельствуют результаты тонкослойной хроматографии. Обнаружение фитоэкдистероидов проводили в системе растворителей хлороформ-метанол-ацетон (5:3:1) восходящим способом с достоверным образцом экдистерона. Хроматограмму проявляли 1%-ым раствором сернокислого ванилина и просматривали в УФ-свете. Отмечено несколько пятен голубого, желтого и зеленого цвета (рис. 1). Из них наибольшая интенсивность отмечена для голубого пятна с Rf = 0,36 на уровне пятна достоверного образца экдистерона.
Рисунок 1 – Хроматограмма фитоэкдистероидов сбора «Кардизид»
Определение химических элементов проводили нейтронно-активационным анализом. По результатам определения макро- и микроэлементов можно сказать, что минеральный состав сбора представлен не менее 30 химическими элементами, из которых наибольшую значимость для сердечно-сосудистого сбора имеют такие жизненно важные элементы, как цинк, железо, кальций, селен и др.
Обобщая результаты химического исследования сбора «Кардизид», следует отметить, что наибольшую значимость из его БАВ, с точки зрения количественного содержания в сырье, а также фармакологического влияния на сердечно-сосудистую систему, представляют флавоноиды и фитоэкдистероиды. Данные группы БАВ предложены нами для оценки качества сбора при его стандартизации.
Исследование химического состава эфирного масла
Эфирное масло сбора «Кардизид» представляет собой маслянистую жидкость темно-желтого цвета с характерным приятным запахом (выход эфирного масла из сбора – 0,08 – 0,12 % от массы воздушно-сухого сырья).
Компонентный состав эфирного масла исследован методом газожидкостой хроматографии (ГЖХ) (рис. 2).
Рисунок 2 – Хроматограмма эфирного масла сбора «Кардизид»
Рисунок 3 – Масс-спектр пика на хроматограмме
со временем удерживания 14,71 мин
Рисунок 4 – Масс-спектр пика на хроматограмме
со временем удерживания 17,77 мин
Рисунок 5 – Масс-спектр пика на хроматограмме
со временем удерживания 23,55 мин
Рисунок 6 – Масс-спектр пика на хроматограмме
со временем удерживания 25,53 мин
Всего в эфирном масле обнаружено 11 компонентов, которые идентифицированы по времени удерживания и методом хроматомасс-спектроскопии в сравнении с достоверными образцами. Преобладающими компонентами масла являются вещества пара-ментанового ряда: пулегон - 38,79 %, изоментон – 30,64 %, ментон – 12,82 %, ментол – 6,05 % (таблица 3). Полученные данные по химическому составу эфирного масла сбора соответствуют составу эфирного масла зизифоры клиноподиевидной.
Таблица 3
Состав эфирного масла сбора «Кардизид»
| № пика | Время удерживания, мин. | Компоненты | Содержание компонента, % от массы цельного масла |
| 1 | 7,15 | -Пинен | 0,70 |
| 2 | 7,60 | Камфен | 0,40 |
| 3 | 8,50 | -Пинен | 0,89 |
| 4 | 10,30 | Лимонен | 6,73 |
| 5 | 14,71 | Ментон | 12,82 |
| 6 | 15,09 | Изоментон | 30,64 |
| 7 | 15,65 | Изопулегон | 0,58 |
| 8 | 15,98 | Ментол | 6,05 |
| 9 | 17,77 | Пулегон | 38,79 |
| 10 | 23,55 | Кариофиллен | 1,63 |
| 11 | 25,53 | Гермакрен D | 0,77 |
Разработка методик стандартизации сбора «Кардизид»
Для определения подлинности сбора использовали методики хроматографического обнаружения флавоноидов и фитоэкдистероидов.
Количественное содержание суммы флавоноидов в сборе определяли спектрофотометрическим методом с использованием ГСО рутина и комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом. При разработке методики анализа определялись влияние степени измельчения сырья, условий экстракции, природы и концентрации экстрагента на выход флавоноидов. Установлено, что максимальное количество флавоноидов извлекается из сырья, измельченного до 1 мм. Установлено, что экстрагирование флавоноидов целесообразнее проводить 40% этанолом при соотношении сырья и экстрагента 1:30 на кипящей водяной бане, так как дальнейшее увеличение соотношения сырье : экстрагент не приводит к повышению выхода флавоноидов.
По разработанной методике определяли содержание флавоноидов в образцах сбора, которое колебалось от 1,93% до 2,03%. Рекомендуем в проект ФС норму содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,5 %.
Результаты статистической обработки полученных данных показали, что относительная ошибка определения при доверительной вероятности 95% находится в пределах ± 0,31. Ошибка методики составляет 4,52%.
Содержание экдистероидов проводили хроматоспектрофотометрическим методом. Сущность метода заключается в выделении экдистерона из полученного экстракта и измерении оптической плотности элюата при длине волны 242 нм, соответствующей максимальному поглощению, стандартного образца экдистерона.
В результате определения предложенной методикой содержание экдистероидов в образцах сбора колебалось от 0,19% до 0,23%. Рекомендуем в проект ФС норму содержания экдистероидов в пересчете на экдистерон не менее 0,1%.
Результаты статистической обработки полученных данных показали, что относительная ошибка определения при доверительной вероятности 95% находится в пределах ± 0,01. Ошибка методики составляет 2,91%.
Изучение морфологических и микроскопических признаков сбора
Для диагностики и определения подлинности сбора определены морфологические и микроскопические признаки сбора, включенные в проект ФС.
Изучение внешних признаков сбора проводили в 2 этапа: в начале осматривали невооруженным глазом, отмечая общую структуру, цвет и запах растительной смеси; вкус водного извлечения. Затем сбор изучали под стереоскопическим микроскопом МБС-10 (увеличения 8х1; 8х2; 8х4), выделяя все составляющие каждого компонента и детально их характеризуя. При этом все компоненты сбора четко диагностируются по характерным видовым и групповым признакам.
Микроскопические признаки сбора «Кардизид» установлены на основании анатомического исследования его компонентов. Для микроскопического исследования использовали как общепринятые методики, так и разработанные нами приемы подготовки препаратов. Препараты изучали под микроскопом МИКМЕД – 1 (увеличения 7х1,5х8; 7х1,5х40), фотографировали цифровым фотоаппаратом «Olympus 4000 digital camera» с помощью фотонасадки МФН-3. Фотографии обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop 7.0».
В результате проведенного микроскопического и гистохимического исследования нами выявлен ряд признаков (структура эпидермиса, характерные волоски, эфирное масло и минеральные включения), которые наиболее достоверно определяют присутствие каждого компонента сбора (диагностически значимые признаки).
Получение жидкого экстракта сбора «Кардизид» и его стандартизация
Для выбора рационального метода получения экстракта из сбора «Кардизид» нами был проведен анализ влияния ряда факторов на выход биологически активных веществ с помощью общепринятых методик. При выборе экстрагента нами изучена динамика извлечения флавоноидов, экдистероидов и экстрактивных веществ из сбора водой, 40% и 70% этанолом. Определение суммы экстрактивных веществ проводили по методике Ю.Г. Пшукова. Экстрагирование проводили в течение 4-х часов со степенью измельчения сырья 0,25 мм. Результаты полученных исследований показали, что наиболее рациональным экстрагентом является 40%-й этанол.
При изучении влияния степени измельчения растительного сбора на выход флавоноидов, экдистероидов и ЭВ использовали сбор, измельченный до размеров частиц 2, 3 и 5 мм. В ходе исследований использовали ту же методику, что и при выборе оптимального экстрагента, с той лишь разницей, что в качестве экстрагента применяли 40% этанол, а степень измельчения сбора варьировала в указанных пределах. Результаты проведенных исследований показали, что при разработке технологии жидкого экстракта наиболее целесообразно использовать степень измельчения сбора 3 мм.
Для изучения полноты и скорости экстрагирования, определения расходных норм сбора и экстрагента, а также для управления процессом экстрагирования были определены следующие технологические свойства сбора: содержание флавоноидов и экдистероидов, влажность сбора, содержание экстрактивных веществ, доброкачественность сырья, насыпная масса, коэффициенты наполнения сухого и набухшего сырья, коэффициент вытеснения, коэффициент образования внутреннего сока и коэффициент поглощения. С помощью полученных коэффициентов наполнения сухого и набухшего сырья осуществляли подбор рабочего объема диффузоров. Основываясь на данных литературы и используя коэффициенты вытеснения, образования внутреннего сока, поглощения сырья и насыпную массу, определяли количество экстрагента, необходимое для настаивания и перколяции.
Таблица 4
Сравнительная характеристика способов экстрагирования
| Показатель | Способы экстрагирования | ||
| Перколяция | Реперколяция | Ускоренная мацерация | |
| Выход суммы флавоноидов, % | 1,08 ± 0,05 | 1,59 ± 0,08 | 1,22 ± 0,06 |
| Выход суммы экдистероидов, % | 0,07 ± 0,00 | 0,14 ± 0,00 | 0,08 ± 0,00 |
| Выход экстрактивных веществ, % | 20,97 ± 1,05 | 26,92 ± 1,35 | 22,16 ± 0,11 |
| Истощение сырья по флавоноидам, % | 78,05 ± 3,90 | 83,68 ± 4,18 | 24,12 ± 1,20 |
| Истощение сырья по экдистероидам, % | 32,33 ± 1,62 | 66,62 ± 3,31 | 38,12 ± 1,91 |
| Истощение сырья по экстрактивным веществам, % | 81,36 ± 4,07 | 79,03 ± 3,95 | 42,08 ± 2,10 |
Кроме того, исследовали влияние способа экстрагирования на выход флавоноидов, экдистероидов и экстрактивных веществ, изучали возможность получения жидкого экстракта методами перколяции, реперколяции и мацерации с динамизацией процесса экстрагирования. Наибольший выход флавоноидов регистрируется в жидком экстракте, полученном реперколяцией, при этом по действующим веществам сырье истощается на 83,68% и только на 79,03% по экстрактивным веществам (табл. 4). В результате проведенных исследований нами была предложена технология получения жидкого экстракта методом реперколяции по Н.А. Чулкову.
Стандартизацию готового экстракта проводили по внешнему виду, содержанию этанола, сухому остатку и содержанию флавоноидов и экдистероидов (табл. 5). Для стандартизации экстракта по БАВ использовали принцип сквозной стандартизации: лекарственное сырье – субстанция – лекарственная форма.
Таблица 5
Параметры качества полиэкстракта
| № | Параметры качества | Значение параметра |
| 1 | Внешний вид | жидкость темно-бурого цвета, характерного запаха |
| 2 | Концентрация этанола, %v | 34,59±1,73 |
| 3 | Плотность, г/см3 | 0,9486 ± 0,03 |
| 4 | Флавоноиды, % | 1,58±0,05 |
| 5 | Экдистероиды, % | 0,16±0,00 |
| 6 | Сухой остаток, % | 25,12±1,26 |
| 7 | Тяжелые металлы | удовлетв. (по сырью) |
Оценка безвредности (острой токсичности) жидкого экстракта сбора «Кардизид»
При исследовании острой токсичности проводили эксперименты на 10 беспородных белых мышах-самцах средней массой 18-20 гр. Экстракт вводили однократно в желудок через зонд в виде водного раствора в дозах от 5000 до 10000 мг/кг. При наблюдении в течение 14 суток у животных не отмечали изменений поведенческих реакций, признаков диареи, каких-либо других токсических патофизиологических проявлений. Гибель животных не наступила. Следовательно, экстракт из сбора согласно ГОСТ 121007-76 (Государственный стандарт на вредные вещества) можно отнести к 4 классу: «вещества малоопасные».
Оценка гипотензивного и гемореологического действия экстракта сбора «Кардизид»
Гипотензивное действие сбора оценивали в лаборатории кровообращения НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск). Эксперименты проведены на 12 крысах самцах линии Вистар массой 170-200 г. Системное АД у крыс определяли прямым методом. В качестве наркоза использовали этаминал натрия в дозе 60 мг/кг внутрибрюшинно. Выделяли сонные артерии, в левую вводили катетер для измерения АД. По истечении 5-10 минут, до стабилизации системного АД и кровотока через сонную артерию, внутрибрюшинно вводили сухой 40% экстракт сбора «Кардизид» в дозе 50 мг/кг, растворенный в физиологическом растворе и подогретый до температуры тела крысы. В контрольном опыте вводили эквиобъемное количество физиологического раствора. В течение 40 минут регистрировали АД.
Таблица 6
Оценка гипотензивного действия экстракта сбора «Кардизид»
| Время, мин. | АД контроль, мм рт. ст. | АД опыт, мм рт. ст. |
| До введения | 117±6 | 116±4 |
| 5 | 114±1 | 109±3 |
| 10 | 117±2 | 109±2* |
| 15 | 116±2 | 105±1* |
| 20 | 117±2 | 107±2* |
| 25 | 116±2 | 105±1* |
| 30 | 116±3 | 109±2 |
| 35 | 113±4 | 109±1 |
| 40 | 115±3 | 109±1 |
*- Р < 0,05 по сравнению с контролем
Анализ данных эксперимента, представленный в таблице 6 показывает, что исходный уровень АД в контрольной группе достоверно не изменялся в течение эксперимента, в то время как в опытной группе наблюдалось статистически достоверное снижение АД с 10-ой по 25-ю минуту эксперимента. В последствии снижение АД не носило достоверного характера.
Гемореологические исследования проведены на 40 крысах-самцах линии Вистар массой 200-250 г. Оценку абсолютных значений вязкости цельной крови (в сантипуазах) проводили с помощью ротационного гемовискозиметра АКР-2 в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 300 с-1.
Спонтанную агрегацию эритроцитов исследовали методом силлектометрии. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полупериод агрегации (Т1/2 – время, за которое величина фотометрического сигнала снижается в 2 раза).
Деформируемость эритроцитов изучали методом лазерной дифрактометрии, или эктацитометрии. Для исследований применялся диапазон скоростей сдвига от 90 до 890 с-1. Способность эритроцитов к деформируемости выражали в виде индекса (ИДЭ), определяемого как отношение разности диаметров эллипса к их сумме.
Для воспроизведения модели СПВК in vitro кровь забирали из общей сонной артерии у крыс под эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта использовали натрия цитрат (3,8%) в соотношении с кровью 1:9. После измерения исходных значений вязкости крови, обратимой агрегации и деформируемости эритроцитов пробы в объеме 0,5 мл помещали в термостат и инкубировали в течение часа при температуре 42,5 °С. Это приводило к выраженному увеличению вязкости цельной крови, уменьшению полупериода агрегации эритроцитов и снижению индекса деформируемости эритроцитов. Исследуемый 40% экстракт сбора «Кардизид» или растворитель (изотонический раствор натрия хлорида) вносили в пробы крови за 15 минут до термостатирования в объеме 10 мкл в конечной концентрации 110-5 г/мл.
Таблица 7
Влияние 40% экстракта сбора «Кардизид» на агрегацию эритроцитов и деформируемость эритроцитов в условиях 60-минутной инкубации образцов крови при 42,5 °С
| Т1/2, с | ИДЭ | ||||
| 90 с-1 | 180 с-1 | 350 с-1 | 890 с-1 | ||
| Исходные значения | 9,6±0,4 | 0,094±0,008 | 0,195±0,012 | 0,343±0,016 | 0,517±0,021 |
| Контроль | 6,1±0,2* | 0,074±0,007* | 0,151±0,009* | 0,277±0,012* | 0,404±0,019* |
| Экстракт сбора | 9,7±0,2+ | 0,098±0,006+ | 0,192±0,008+ | 0,329±0,008+ | 0,489±0,019+ |
Примечание: *- Р< 0,05 по сравнению с исходными значениями
+ - Р< 0,05 по сравнению с контролем
На модели СПВК in vitro, развивающегося при тепловом воздействии на кровь, экстракт сбора «Кардизид» вызывал выраженное улучшение функциональных свойств эритроцитов. Так, полупериод агрегации эритроцитов составил 9,7±0,2 с, что в 1,6 раза выше, чем в группе контроля и статистически значимо не отличалось от значения показателя у интактных крыс и указывает на способность экстракта сбора «Кардизид» устранять патологическую гиперагрегацию эритроцитов. Вместе с ослаблением эритроцитарной агрегации под действием экстракта улучшалась деформируемость эритроцитов. ИДЭ во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига у животных опытной группы не только превосходил контрольные значения, но и статистически значимо не различался на скоростях сдвига 90 с-1, 180 с-1, 360 с-1 с интактной группой (табл. 7).
Таблица 8
Влияние 40% экстракта сбора «Кардизид» на вязкость крови в условиях
60-минутной инкубации образцов крови при 42,5 °С
| Вязкость крови, абс. ед. | |||||||
| 3 с-1 | 5 с-1 | 7 с-1 | 10 с-1 | 50 с-1 | 100 с-1 | 300 с-1 | |
| Исходные значения | 10,5±0,51 | 8,9±0,45 | 7,8±0,39 | 7,1±0,36 | 4,6±0,23 | 4,3±0,22 | 4,1±0,20 |
| Контроль | 18,2±1,8 | 14,7±2,7 | 11,3±0,7 | 10,3±0,6 | 7,7±0,6 | 6,3±0,3 | 5,8±0,2 |
| Экстракт сбора | 14,2±1,5* | 12,8±1,2* | 10,7±1,1* | 9,9±0,9* | 7,1±0,7* | 6,1±0,6* | 5,3±0,5* |
Примечание: *- Р< 0,05 по сравнению с контролем
Положительная динамика основных гемореологических параметров при применении экстракта сбора «Кардизид» сопровождалась достоверным снижением, по сравнению с контролем, вязкости крови при скоростях сдвига от 3 с-1 до 300 с-1 (табл. 8). Анализ гемореологического механизма действия экстракта сбора «Кардизид» показывает, что в первую очередь, снижение вязкости крови происходит за счет влияния на эритроциты. Полностью устраняется гиперагрегация эритроцитов, а также нормализуется деформируемость эритроцитов, что является одним из важнейших факторов для поддержания кровотока на уровне микроциркуляторного русла, когда диаметр сосудов сопоставим или меньше размера эритроцитов.
ВЫВОДЫ:
- На основании анализа банка данных литературы и собственных исследований предложена пропись нового лекарственного растительного сбора «Кардизид», обладающего комплексным действием на сердечно-сосудистую систему.
- В составе сбора «Кардизид» установлено содержание: фенольных соединений – 4,10%, из них флавоноидов – 1,98% (апигенин, лютеолин, цинарозид, кемпферол, кверцетин, изокверцетрин, гиперозид, витексин, рутин), в том числе антоцианы – 0,10%, гидроксикоричных кислот – 2,26% (синаповая, хлорогеновая, феруловая, кофейная кислоты); экдистероидов – 0,21%, полисахаридов: водорастворимых полисахаридов – 9,46%, пектиновых веществ – 3,16%, гемицеллюлозы А – 2,53%, гемицеллюлозы В – 3,27%; эфирного масла – 0,10%; аскорбиновой кислоты – 74,00 мг %; каротиноидов 55,00 мг %.
- Элементный состав сбора «Кардизид» представлен 30 макро- и микроэлементами, из которых в наибольших количествах содержатся такие жизненно важные и необходимые для нормального функционирования ССС элементы, как кальций (7,110-2 %), железо (5,210-2 %), цинк (1210-4 %), кобальт (1.210-4 %), и селен (2,510-6 %).
- Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения основных групп БАВ в сборе «Кардизид»: флавоноиды – спектрофотометрическим методом; экдистероиды – хроматоспектрофотометрическим методом.
- Разработаны показатели определения доброкачественности сбора «Кардизид», включенные в проект ФС: содержание флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,5%; экдистероидов не менее 0,1%; показатели влажности, зольности и примесей.
- Для идентификации сбора «Кардизид» предложены внешние и микроскопические диагностические признаки, входящих в него ингредиентов (структура эпидермальной ткани, волосков, наличие эфирного масла и минеральных включений).
- Разработан рациональный способ получения жидкого экстракта из сбора «Кардизид» и проведена его стандартизация по технологическим показателям, по содержанию флавоноидов и экдистероидов.
- Установлены гипотензивное действие жидкого экстракта сбора «Кардизид» и его способность улучшать реологические свойства крови.
- На основании выполненных исследований разработан проект фармакопейной статьи «Сбор сердечно-сосудистый Кардизид».
Основные результаты материалов исследования отражены в опубликованных работах:
- Возможности создания новых фитосредств для терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Сб. трудов по материалам 59-ой научной конференции по фармакологии и фармации «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». – Пятигорск, 2004. – С. 293 (Соавт. Г.И. Калинкина, М.Б. Плотников, О.И. Алиев, А.С. Васильев).
- Проблема сердечно-сосудистых заболеваний и возможности их профилактики и лечения фитопрепаратами // Сб. статей по мат. пятого конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – Томск, 2004. – С. 19 (Соавт. Г.И. Калинкина, М.Б. Плотников, А.И. Алиев).
- Оценка гипотензивного действия сбора «Кардизид» // Лекарственные растения в фармакологии и фармации: тезисы докладов научной конференции посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета. – Барнаул, 2004. – С. 159 - 160 (Соавт. Г.И. Калинкина, А.И. Алиев, А.С. Васильев).
- Разработка сбора «Кардизид» и методик его стандартизации // Сборник статей по результатам Всероссийской 63-й итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова. – Томск, 2004. – С. 275 (Соавт. А.Н. Чурюмов).
- Разработка показателей качества сбора «Кардизид» // Сб. статей по результатам Международной 63-ой итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова. – Томск, 2004. – С. 273 - 274 (Соавт. А.Н. Чурюмов, В.Ю. Андреева, Н.Э. Коломиец).
- Разработка методик стандартизации сердечно-сосудистого сбора «Кардизид» // Химия растительного сырья. – 2005. - № 1. – С. 37 – 40 (Соавт. Г.И. Калинкина).
- Исследование элементного состава сбора «Кардизид» // Сб. статей по результатам всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации». - Новосибирск, 2005. - С. 436 (Соавт. Г.И. Калинкина).
- Фитохимическое исследование сердечно-сосудистого сбора «Кардизид» // Сб. статей по мат. шестого конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – Томск, 2005. – С. 95.
- Проблема рационального использования экологически чистого ЛРС // Труды постоянно действующей научно-технической школы-семинара студентов, аспирантов и молодых ученых «Информационные системы мониторинга окружающей среды». - Томск, 2004. - Выпуск 3. - С. 51-53 (Соавт. Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец, И.А. Туева, А.С. Ангаскиева, Е.А. Лукша, Л.П. Охрименко, Е.Н. Сальникова, И.М. Смолякова).
- Фитопрепараты в профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний // Учебное пособие. – Томск, 2005. – 40 с. (Соавт. И.М. Смолякова, А.С. Ангаскиева).
Список сокращений:
ССС – сердечно-сосудистая система;
ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания;
БАВ – биологически активные вещества;
ФС – фармакопейная статья;
СПВК – синдром повышенной вязкости крови;
АД – артериальное давление;
ГЖХ – газожидкостная хроматография;
ГСО – государственный стандартный образец;
ИДЭ – индекс деформируемости эритроцитов
