Исследования по стандартизации сырья и настоек гомеопатических матричных кактуса крупноцветкового ( cactus grandiflorus l.)
На правах рукописи
ГАККЕЛЬ ВАСИЛИЙ АНДРЕЕВИЧ
ИССЛЕДОВАНИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И НАСТОЕК ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ КАКТУСА КРУПНОЦВЕТКОВОГО (Cactus grandiflorus L.)
15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва – 2008 г
Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН
Научный руководитель:
Доктор фармацевтических наук,
профессор Сокольская Татьяна Александровна
Официальные оппоненты:
Доктор фармацевтических наук,
профессор Рабинович Александр Моисеевич
Кандидат фармацевтических наук Кашникова Марина Вадимовна
Ведущая организация: Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова (г.Санкт-Петербург)
Защита состоится «____ » _____________ 2008г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, Москва, ул. Грина, 7
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, Москва, ул. Грина, 7.
Автореферат разослан «__» ________________ 2008г.
Ученый секретарь диссертационного совета
Д 006.070.01
доктор фармацевтических наук А.И. Громакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
В связи с увеличением числа хронических заболеваний, нуждающихся в длительной терапии, в последнее десятилетие во всем мире наблюдается постоянный рост спроса населения на эффективные и безопасные лекарственные средства природного происхождения, в том числе гомеопатические.
Эти лекарственные средства обладают мягким, щадящим действием и минимальными токсико-аллергическими реакциями, что позволяет использовать их при длительном применении для лечения хронических заболеваний. Безопасность и эффективность указанных групп препаратов подтверждена многолетним использованием в зарубежной и отечественной медицинской практике. Однако ассортимент отечественных гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС) нуждается в существенном расширении.
Анализ номенклатуры ГомЛС, представленных на отечественном фармацевтическом рынке, показал, что в ней превалируют комплексные лекарственные средства, изготовленные с использованием настоек гомеопатических матричных (НГМ). К их числу следует отнести настойку гомеопатическую матричную Кактус, на которую в настоящее время отсутствует нормативная документация (НД), также как и на используемое для ее получения лекарственное растительное сырье (ЛРС).
В этой связи представляется актуальным проведение исследований по изучению лекарственного растительного сырья – побегов кактуса крупноцветкового Cactus grandiflorus L. (Britten et Rose), сем. Кактусовые Cactaceae L., и НГМ Кактус для создания соответствующей НД, необходимой для последующего внедрения этих объектов в практическую медицину.
В гомеопатической практике НГМ Кактус используется в виде различных разведений, а также входит в состав комплексных препаратов, назначаемых при слабости сердечной мышцы, неврозах сердца, стенокардии, нарушениях деятельности органов пищеварения, дыхательной и мочеполовой системы.
Химический состав кактуса крупноцветкового мало изучен и имеются лишь единичные сведения о наличии в нем биологически активных веществ (БАВ), в связи с этим, целесообразным является проведение детального изучения сырья этого растения.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является фармакогностическое изучение побегов кактуса крупноцветкового, получение и фитохимический анализ НГМ Кактус и их стандартизация.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи:
- Провести фармакогностическое исследование свежесобранных и высушенных побегов кактуса крупноцветкового и определить оптимальные сроки заготовки сырья.
- Исследовать химический состав свежесобранного и высушенного сырья с использованием физико-химических методов и разработать методики оценки его качества.
- Получить НГМ Кактус из свежесобранного и высушенного сырья, изучить их компонентный состав и разработать методы стандартизации.
- Провести предварительные фармакологические исследования НГМ Кактус.
- Разработать НД на сырье, НГМ Кактус и препараты на их основе.
Научная новизна
На основании макро- и микроскопического анализа побегов кактуса крупноцветкового установлены диагностически значимые признаки, характерные для этого вида сырья. Подобраны условия и изучен состав БАВ, содержащихся в сырье и НГМ кактус с помощью физико-химических методов. Разработаны методики качественного и количественного определения аминокислот и полисахаридов в ЛРС и НГМ Кактус.
С учетом современных требований к НГМ разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в исследуемых объектах. Определены основные виды фармакологической активности как НГМ Кактус, так и ее биологически активных комплексов (аминокислот и полисахаридов), а также разведений.
Практическая значимость работы
На основании проведенных исследований разработаны:
- Проект ФС на «Кактуса крупноцветкового побеги свежие»
- Проект ФС на «Кактуса крупноцветкового побеги»;
- Проект ФС на «Cactus grandiflorus (Cactus) D1 Настойку гомеопатическую матричную»;
- Проект ФС на «Cactus grandiflorus (Cactus) Настойку гомеопатическую матричную»
- Изменения и дополнения к ФСП на «Капли гомеопатические Cactus D3» и «Капли гомеопатические Кардисед-ГФ»ё.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты фармакогностического исследования свежесобранного и высушенного ЛРС кактуса крупноцветкового;
- Результаты разработки методик качественного и количественного анализа БАВ в ЛРС кактуса крупноцветкового;
- НГМ Кактус из свежесобранного и высушенного сырья и методы оценки их качества;
- Результаты предварительной оценки фармакологической активности НГМ Кактус, их разведений и биологически активных комплексов в опытах in vitro (методом биотестирования).
- Результаты по разработке некоторых показателей качества монокомпонентного препарата Кактус D3 и комплексного препарата Кардисед-ГФ, содержащих НГМ Кактус;
Апробация работы
Материалы диссертационного исследования доложены на региональных, Всероссийских научно-практических конференциях: XVI Московской международной гомеопатической конференции (Москва, 2006), Региональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМА (Курск, 2006), Конгрессе, посвященному 30-летию со дня открытия ЦНИИР «Традиционная медицина 2007г.» (Москва, 2007), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики, лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (СПб, 2007), III Всероссийском гомеопатическом съезде (Москва, 2007).
Связь задач исследования с проблемным планом НИР
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2001-2005 и 2006-2010 г.г».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на _____ страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1) и 5 глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы, включающего 186 литературных источников, в том числе 57 на иностранных языках и приложений. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 20 рисунками.
В первой главе, на основании данных литературы, изложены общие сведения о растении, содержащихся в нем БАВ, фармакологической активности и медицинском применении НГМ Кактус, о требованиях зарубежных НД к качеству НГМ.
В разделе «Объекты и методы исследования» приводится характеристика объектов исследования – свежесобранных и высушенных побегов кактуса крупноцветкового, описываются использованные методы и методики, приборы, хроматографические системы, сорбенты и реактивы, стандартные образцы.
Вторая глава посвящена фармакогностическому исследованию сырья кактуса крупноцветкового: изучению внешних признаков и анатомического строения сырья свежих и высушенных побегов кактуса крупноцветкового; выявлению основных диагностических признаков изучаемого сырья; определению его числовых показателей.
В третьей главе приведены результаты фитохимического изучения побегов кактуса крупноцветкового с помощью методов химического и физико-химического анализа: ТСХ, ВЭЖХ, УФ и ЯМР-13С спектроскопии и разработке методик его качественного и количественного анализа. Определены оптимальные сроки заготовки и условия хранения ЛРС.
В четвертой главе описано получение НГМ из свежесобранного и высушенного сырья, изучение химического состава и исследования по разработке методик контроля их качества. Приведены результаты анализов полисахаридов и аминокислот в НГМ кактус при использовании методов ТСХ, ВЭЖХ, спектрофотометрии.
Пятая глава посвящена предварительной оценке фармакологической активности НГМ Кактус, их разведений и основных биологически активных комплексов (аминокислот и полисахаридов) с применением ферментных биотест-систем.
В шестой главе приводятся результаты исследований по разработке методов стандартизации гомеопатических препаратов на основе НГМ Кактус, а именно: Кардисед-ГФ и капель Кактус D3 по показателям «Подлинность» и «Количественное определение».
Основное содержание работы
1.Объекты и методы исследования
Объектами исследований служили образцы опытных партий свежесобранных и высушенных побегов кактуса крупноцветкового Cactus grandiflorus (Selenicereus grandiflorus) Brit. Et Rose сем. Кактусовые Cactaceae L., заготовлены в фазу цветения в теплице Ботанического сада им. В.Л. Комарова (Санкт-Петербург) в 2005-2007гг.
Отбор проб и анализ ЛРС проводили по методикам ГФ XI и разработанным нами методами качественного и количественного определения БАВ. В опытах использовали как свежесобранное, так и высушенное сырье. Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно статье «Техника микроскопического анализа» ГФ ХI изд., (вып.2., с. 277-285). Для исследования использовали микроскоп марки ZEISS и фотокамеру Nikon D-70.
Качественный анализ свободных и связанных моносахаров проводили методом ТСХ на пластинках «Sorbfil ПТСХ-П-А». Детектирование зон адсорбции осуществляли с помощью дифениламино-анилин-фосфорно-кислотного реактива. Подтверждение моносахаридного состава осуществляли методом ВЭЖХ приборе GILSON (Франция).
Исследование аминокислотного состава проводили методом ТСХ на пластинках «Sorbfil ПТСХ-П-А». Детектирование зон адсорбции проводили 0,2 % раствором нингидрина. ВЭЖХ анализ свободных аминокислот осуществляли на приборе GILSON (Франция).
УФ-спектры поглощения регистрировали на UV-VIS (Германия), Hitachi (Япония), СФ-2000 (Россия) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.
С13 -ЯМР – спектры получали с помощью спектрометра АС-200 «Bruker» (частота 200 МГц), используя в качестве растворителей диметилсульфоксид (ДМСО), D2О, NaOH в D2О.
Статистическую обработку результатов проводили согласно ГФ XI изд., (вып. 1, с. 199-207).
2. Фармакогностическое изучение побегов кактуса крупноцветкового
Исследование морфологических и микроскопических признаков сырья
На основании изучения морфологических характеристик опытных партий сырья было составлено описание внешних признаков свежесобранного и высушенного сырья кактуса крупноцветкового.
При изучении анатомического строения стебля кактуса крупноцветкового выявлены диагностические признаки как наличие на поперечном срезе механической ткани, около 3 мм толщиной, кольца проводящих пучков, губчатой паренхимы с крупными межклетниками и центральной паренхимой. Для клеток губчатой паренхимы характерно присутствие рафидов кальция оксалата. На поверхности стебля отмечено наличие ареол, имеющих также характерное строение. На продольном срезе лепестков прослеживается наличие проводящих пучков. Клетки эпидермиса чашелистиков характеризуются утолщенными стенками. На продольном срезе завязи цветка кактуса крупноцветкового также виден проводящий пучок и характерные крупные межклеточные пространства паренхимной ткани.
Определение числовых показателей сырья и установление их норм
В результате анализа 5 опытных партий свежесобранного и 5 партий высушенного сырья кактуса крупноцветкового установлены нормы его числовых показателей (табл.1).
Таблица 1
Результаты исследования товароведческих показателей побегов кактуса крупноцветкового
| № п/п | Наименование показателя | Предложенная норма | |
| Свежее сырье | Высушенное сырье | ||
| 1 | Влажность | Не менее 57% | Не более 12% |
| 2 | Зола общая | Не более 20% | Не более 20% |
| 3 | Зола, нерастворимая в 10 % хлористоводородной кислоты | Не более 3% | Не более 3% |
| 4 | Органическая примесь | Не более 0,5% | Не более 0,5% |
| 5 | Минеральная примесь | Не более 0,5% | Не более 0,5% |
| 6 | Частиц, не проходящих сквозь отверстие с диаметром 7мм | - | Не более 3% |
| 7 | Частиц, проходящих сквозь отверстие с диаметром 0,5мм | - | Не более 3% |
| 8 | Микробиологическая чистота | Категория 4а | Категория 4а |
| 9 | Радиоактивная чистота | Соотв. требованиям ОФС 42-001-03 | Соотв. требованиям ОФС 42-001-03 |
Кроме того, определена микробиологическая и радиоактивная чистота анализируемого сырья.
Полученные показатели включены в проекты НД на «Кактуса крупноцветкового побеги свежие» и «Кактуса крупноцветкового побеги».
3. Фитохимическое изучение побегов кактуса крупноцветкового и разработка методов их стандартизации
Изучение качественного состава биологически активных веществ
На основании проведенных исследований с помощью качественных реакций в сырье кактуса обнаружены аминокислоты, полисахариды, фенолкарбоновые кислоты и флавоноиды. Последние группы БАВ представлены в следовых количествах.
Для изучения полисахаридов кактуса крупноцветкового применены методы ТСХ, ВЭЖХ и С13-ЯМР-спектроскопии.
Качественный состав свободных сахаров в свежесобранном и высушенном сырье определяли с помощью ВЭЖХ-анализа на колонке ALTECH OA-1000 Organic Acids размером 6.5х300 мм, используя в качестве подвижной фазы – 0,005 N раствор серной кислоты. В результате по временам удерживания идентифицированы такие сахара как мальтоза, лактоза, галактоза, глюкоза, ксилоза, рамноза, арабиноза (табл.2)
Таблица 2
Характеристика ВЭЖХ-хроматограммы свободных сахаров побегов кактуса крупноцветкового
| Название | Время удерживания, мин | Соотношение сахаров в пробе,% | |
| Свежее сырье | Высушенное сырье | ||
| мальтоза | 11,18 | 6,27 | 4,14 |
| лактоза | 11,48 | 7,94 | 7,85 |
| галактоза | 11,75 | 12,63 | 12,18 |
| глюкоза | 13,45 | 5,21 | 7,49 |
| ксилоза | 14,08 | 9,84 | 10,17 |
| рамноза | 15,61 | 9,72 | 5,32 |
| арабиноза | 15,97 | 52,11 | 43,7 |
Путем осаждения 96 % спиртом из предварительно очищенного от липофильных веществ водного извлечения из побегов кактуса крупноцветкового получена сумма полисахаридов. Для определения её мономерного состава проведен гидролиз с помощью трифторуксусной кислоты (ТФУ) в запаянных ампулах при температуре 100-105°С в сушильном шкафу в течение 2 ч.
В гидролизате полисахаридного комплекса методом ТСХ в системе растворителей – этилацетат:спирт изопропиловый:вода (5:3,2:1,6) установлено наличие глюкуроновой кислоте (Rf около 0,58); рамнозы (Rf около 0,73); мальтозы (Rf около 0,37); галактозы (Rf около 0,51); лактозы (Rf около 0,30); и глюкозы (Rf около 0,54).
С использованием метода денситометрии определено количественное содержание некоторых идентифицированных сахаров (табл.3).
Таблица 3
Результаты количественной оценки состава сахаров, обнаруженных в гидролизате полисахаридного комплекса побегов кактуса крупноцветкового
| № п/п | Наименование моносахарида | Количество мг в 100 мг полисахаридного комплекса |
| 1 | Глюкоза | 1,15 |
| 2 | Галактоза | 3,00 |
| 3 | Мальтоза | 0,37 |
| 4 | Рамноза | Следы |
| 5 | Лактоза | Следы |
| 6 | Кислота глюкуроновая | 0,21 |
Наряду с этим, полисахаридный комплекс кактуса крупноцветкового был охарактеризован с помощью метода С13ЯМР-спектроскопии. Спектры снимали в растворе диметилсульфоксида (ДМСО), D2О и смеси D2О и натрия гидроксида (табл.4).
Таблица 4
Химические сдвиги полисахаридных комплексов, выделенных из побегов кактуса крупноцветкового
| Анализируемый раствор полисахаридного комплекса | С1 | С2-С5 | С6 | Другие | |
| Полисахариды побегов кактуса крупноцветкового в ДМСО | 107,5 104,4 99,6 | 84,0 81,1 77,7 76,6 74,5 71,8 69,2 | 60,8 | 172,7 52,9 38,8 178,9 | |
| Полисахариды побегов кактуса крупноцветкового в D2О+NaOH | 107,5 104,4 99,6 | 84,0 81,1 77,7 76,6 74,5 71,8 69,2 | 60,8 | 172,7 52,9 38,8 178,9 | |
| Полисахариды побегов кактуса крупноцветкового в D2О | 107,5 104,4 99,6 | 84,0 81,1 77,7 76,6 74,5 71,8 69,2 | 60,8 | 172,7 52,9 38,8 178,9 | |
Полученные данные позволили в ряде случаев сделать заключение о характере связи между сахарами, а также о форме, в которой сахара входят в состав полисахарида. В частности, по ЯМР-спектру определены сигналы, характеризующие -D-связанные звенья глюкозы, галактозы и мальтозы, а также связанные межзвенной -связью 
-рамнозофуранозы и 
--D-галактопиранозы
При этом следует отметить схожесть составов полисахаридных комплексов, выделенных из свежего и высушенного сырья.
Поскольку в ходе предварительного фитохимического анализа побегов кактуса крупноцветкового обнаружены свободные аминокислоты, нами было проведено исследование их качественного состава. Изучение проводили на образцах, выделенных из свежих и высушенных побегов кактуса крупноцветкового методом ТСХ с использованием растворов стандартных образцов аминокислот.
Анализ осуществляли на пластинах «Sorbfil ПТСХ-П-А» в системе растворителей н-бутанол–ледяная уксусная кислота–вода в соотношении 80:20:20 с последующим детектированием зон адсорбции аминокислот 0,2% раствором нингидрина в ацетоне.
В результате в свежесобранном и высушенном сырье установлено наличие глицина (Rf около 0,18), кислоты глютаминовой (Rf около 0,32), метионина (Rf около 0,52) и триптофана (Rf около 0,54).
Для подтверждения и уточнения качественного состава аминокислот проведен ВЭЖХ-анализ на колонке Waters AccQ Taq размером 3,9х150 мм при использовании градиентного метода элюирования: элюент А: натрия ацетат- кислота фосфорная конц. – триэтиламин- вода – EDTA (19%:6-7%:1-2%:72-73%:0,1%); элюент В: ацетонитрил; Элюент С: вода.. (рисунок 3). Идентификацию аминокислот производили по времени удерживания в калибровочном стандарте (табл.5).
Таблица 5
Характеристика ВЭЖХ-хроматограммы свободных аминокислот в побегах кактуса крупноцветкового
| Название аминокислоты | Свежее сырье | Высушенное сырье | ||
| Время удерживания. мин | Соотношение в смеси, % | Время удерживания. мин | Соотношение в смеси, % | |
| Глицин | 18,71 | 1,24 | 18,73 | 2,32 |
| Гистидин | 19,92 | 6,02 | 19,91 | 5,98 |
| Аргинин | 20,65 | 9,87 | 20,63 | 8,47 |
| Тирозин | 21.44 | 5,67 | 21,44 | 6,03 |
| Аланин | 22,89 | 1,79 | 22,88 | 3,20 |
| Пролин | 23,47 | 4,81 | 23,48 | 4,74 |
| Лизин | 35,11 | 20,52 | 35,11 | 19,97 |
| Триптофан | 40,06 | 41,3 | 40,04 | 41,01 |
Согласно полученным данным в свежесобранных и высушенных побегах кактуса подтверждено наличие таких аминокислот как глицин, кислота глютаминовая, метионин и триптофан, а также обнаружены гистидин, аргинин, тирозин, аланин, пролин, лизин. Кроме того, установлено, что состав аминокислотный свежесобранного и высушенного сырья аналогичны.
Разработка методик количественного определения биологически активных веществ в сырье кактуса крупноцветкового
Согласно данным литературы и результатам проведенного фитохимического исследования сырья кактуса крупноцветкового установлено, что основными группами БАВ этого ЛРС являются полисахариды и аминокислоты, в связи с этим нами разработаны методики их количественной оценки.
Количественное определение суммы полисахаридов в побегах кактуса крупноцветкового
С учетом современных требований к анализу БАВ, для количественного определения полисахаридов в сырье кактуса нами предлагается спектрофотометрический метод, позволяющий оценивать содержание полисахаридов по количеству моносахаров (полученных после гидролиза полисахарида), образующих окрашенный комплекс с пикриновой кислотой в щелочной среде, который имеет поглощение в области 460 нм.
В ходе разработки методики были подобраны следующие параметры: измельченность высушенного сырья, время гидролиза полисахаридов, время образования окрашенного комплекса. В результате было установлено, что оптимальным является экстракция сырья водой в течение 1 ч при соотношении сырье:экстрагент 1:25. использование сырья, измельченного до размера частиц, проходящего сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм (для высушенного сырья), время гидролиза 2 часа и время реакции образования комплекса продуктов гидролиза полисахаридов с пикриновой кислотой - 30 мин.
Рис. 1. УФ-спектр поглощения комплекса гидролизата полисахаридов побегов кактуса крупноцветкового высушенных (1), свежих (2) с пикриновой кислотой и комплекса глюкозы с пикриновой кислотой (3)
Изучение спектра поглощения комплекса гидролизата полисахаридов кактуса крупноцветкового с пикриновой кислотой показало, что он имеет максимум поглощения при длине волны 460±2 нм, аналогичный максимум поглощения имеет комплекс глюкозы с пикриновой кислотой (рис.1). Таким образом, предложено использовать в качестве аналитической - длину волны 460 нм и проводить определение суммы моносахаров после гидролиза полисахаридов в пересчете на глюкозу.
Воспроизводимость методики количественного определения полисахаридов была установлена на примере одного образца сырья в 5 независимых повторностях. Метрологические характеристики методики определения содержания полисахаридов в пересчете на глюкозу приведены в таблице 6
Таблица 6
Метрологические характеристики методики количественного определения моносахаров в пересчете на глюкозу в побегах кактуса крупноцветкового,
| Сырье | f | X | S2 | S | P,% | t(P,f) | x |  ,% |
| Побеги свежесобранные | 4 | 22,671 | 1,597 | 1,263 | 95 | 2,78 | 1,57 | ±6,92 |
| Побеги высушенные | 4 | 21,623 | 1,362 | 1,167 | 95 | 2,78 | 1,45 | ±6,71 |
Относительная ошибка единичного определения не превышает ±6,92 для свежего сырья и ±6,71 % для высушенного, что свидетельствует об удовлетворительной воспроизводимости методики. Относительная ошибка проведенных опытов с добавками глюкозы находится в пределах случайной ошибки предложенной методики, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки (табл.7).
Таблица 7
Результаты опыта с добавками глюкозы к навеске полисахаридов свежесобранного сырья кактуса крупноцветкового
| Содержание полисахаридов в навеске, г | Добавлено глюкозы, г | Должно быть, г | Найдено полисахаридов, г | Ошибка | |
| Абс., % | Отн, % | ||||
| 0,2371 | 0,0611 | 0,2982 | 0,2826 | +0,0156 | +5,24 |
| 0,2410 | 0,1303 | 0,3713 | 0,3936 | -0,0223 | -6,02 |
| 0,2202 | 0,1821 | 0,4023 | 0,3822 | -0,0200 | -4,98 |
| 0,2334 | 0,2351 | 0,4685 | 0,4800 | +0,0115 | +2,45 |
С помощью разработанного метода проанализированы 5 серий свежесобранного и 5 серий высушенного сырья кактуса крупноцветкового, в результате проведенного эксперимента установлена норма содержания данной группы БАВ – не менее 20 %.
Количественное определение суммы аминокислот в побегах кактуса крупноцветкового
Для определения суммы аминокислот была использована методика, основанная на реакции их взаимодействия с раствором нингидрина и последующем измерении оптической плотности окрашенного комплекса. В ходе эксперимента нами установлены оптимальные условия экстракции аминокислот из побегов кактуса: измельченность высушенного сырья 1 мм, экстрагент – вода, соотношение сырье-экстрагент 1:50, время экстракции 45 мин. Для установления аналитической длины волны были изучены спектры поглощения окрашенного комплекса с нингидрином глютаминовой кислоты и окрашенных комплексов аминокислот кактуса крупноцветкового с нингидрином (рис.2).
В результате установлено, что при длине волны 566±2нм, наблюдается интенсивный максимум поглощения как исследуемых комплексов, так и комплекса глютаминовой кислоты с нингидрином. В связи с этим предложено использовать аналитическую длину волны 566 нм и проводить количественное определение суммы аминокислот в пересчете на кислоту глютаминовую.
Рис. 2. УФ-спектр поглощения комплекса глютаминовой кислоты с раствором нингидрина (1), водно-спиртового извлечения кактуса крупноцветкового побегов высушенных с раствором нингидрина (2) и кактуса крупноцветкового побегов свежих с раствором нингидрина (3)
Метрологические характеристики разработанной методики представлены в таблице 8. Относительная ошибка методики не превышает ±6,06 % для свежего сырья и ±5,96 % для высушенного
Таблица 8
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту в сырье кактуса
| Сырье | f | X | S2 | S | P,% | t(P,f) | x |  ,% |
| Побеги свежесобранные | 4 | 61,422 | 8,9327 | 2,99 | 95 | 2,78 | 3,72 | ±6,05 |
| Побеги высушенные | 4 | 60,923 | 8,527 | 2,92 | 95 | 2,78 | 3,63 | ±5,96 |
Отсутствие систематической ошибки подтверждено в опытах с добавками кислоты глютаминовой к навеске сырья перед экстракцией (табл. 9).
Таблица 9
Результаты опытов с добавками глютаминовой кислоты к навеске сырья кактуса крупноцветкового свежесобранных
| Содержание аминокислот в навеске мг | Добавлено глютаминовой кислоты, мг | Должно быть, мг | Найдено аминокислот, мг | Ошибка | |
| Абсолютная, мг | Относительная, % | ||||
| 0,6203 | 0,1553 | 0,7756 | 0,8132 | -0,0376 | -4,85 |
| 0,6169 | 0,3108 | 0,9277 | 0,9808 | -0,0531 | -5,72 |
| 0,6232 | 0,4723 | 1,0955 | 1,0417 | +0,0538 | +4,91 |
| 0,6280 | 0,6204 | 1,2484 | 1,2283 | +0,0201 | +1,61 |
Аналогичные результаты были получены в опытах с добавками глютаминовой кислоты к навеске высушенных побегов кактуса крупноцветкового.
На основании результатов анализа 5 серий свежесобранного и 5 серий высушенного сырья кактуса крупноцветкового, установлена норма содержания суммы аминокислот в пересчете на кислоту глютаминовую и абсолютно сухое сырье – не менее 58 мг%.
Изучение динамики накопления биологически активных веществ в зависимости от фазы вегетации растения
Поскольку накопление БАВ значительно варьирует в процессе онтогенеза растений, нами изучено содержание суммы связанных моносахаров и аминокислот в сырье в зависимости от фазы вегетации кактуса крупноцветкового (табл. 10).
Таблица 10
Результаты определения содержания аминокислот и моносахаров в побегах кактуса крупноцветкового в зависимости от фазы вегетации растения
| № п/п | Фаза вегетации | Содержание БАВ | |
| Аминокислоты, мг% | Связ.моносахара, % | ||
| 1 | Появление побега | 50,2 | 19,5 |
| 2 | Начало бутонизации | 54,5 | 21,8 |
| 3 | Цветение | 62,5 | 23,2 |
| 4 | Конец цветения | 58,6 | 22,1 |
| 5 | Плодоношение | 52,1 | 20,9 |
Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшее количество аминокислот и полисахаридов накапливается в фазу цветения, в связи с чем заготовку побегов кактуса целесообразно вести в конце июня – начале июля.
Установление сроков годности сырья
Для установления сроков годности сырья нами изучена стабильность при хранении побегов кактуса крупноцветкового в упаковке, предусмотренной проектом НД.
На основании полученных данных установлены срок и условия хранения для свежесобранного сырья – 24 часа при температуре не выше 40С в холодильной камере, высушенного – 3 года в защищенном от света месте при температуре не выше 150С.
Разработка нормативной документации на сырье
На основании проведенных исследований разработаны и оформлены проекты фармакопейных статей «Кактуса крупноцветкового побеги свежие» и «Кактуса крупноцветкового побеги». Согласно проекту ФС контроль качества ЛРС осуществляется по следующим показателям: внешние признаки, подлинность (микроскопия, качественные реакции), числовые показатели: содержание связанных моносахаров в пересчете на глюкозу, содержание аминокислот в пересчете на кислоту глютаминовую; потеря в массе при высушивании; зола общая; зола, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, органическая примесь, минеральная примесь; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм не более 0,5 % (только для высушенного сырья).
Проекты ФС находятся на рассмотрении в Институте стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ НЦСМП Росздравнадзора.
4. Получение настоек гомеопатических матричных Кактус и разработка методов их стандартизации
Получение НГМ Кактус проводили согласно методикам, изложенным в ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные» с учетом свойств исходного сырья. Поскольку влажность свежего лекарственного растительного сырья составляет не менее 60 %, и содержащиеся в сырье полисахариды представлены в основном слизями, то при изготовлении НГМ Кактус из свежего сырья применяли метод 3.
НГМ Кактус из высушенного сырья получали по методу 4а ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные».
Разработка методов оценки качества настойки гомеопатической матричной Кактус
В соответствии с требованиями, изложенными в ОФС «Настойки гомеопатические матричные» контроль качества НГМ осуществляли по показателям: описание, подлинность, сухой остаток, плотность, содержание спирта, тяжелые металлы, микробиологическая чистота.
Описание: НГМ из свежего сырья представляет собой прозрачную жидкость темно-коричневого цвета с зеленоватым оттенком со специфическим запахом. НГМ из высушенного сырья представляет собой прозрачную жидкость зеленого цвета со специфическим запахом.
Сухой остаток. Норму по этому показателю предложено установить не менее 0,3 % и не менее 0,25 % для НГМ из свежего и высушенного сырья соответственно.
Плотность. Величина плотности должна быть в интервале 0,886 – 0,897 для НГМ из свежего сырья и 0,752 – 0,761 для НГМ из высушенного сырья.
Содержание тяжелых металлов согласно ГФ XI, вып 1, С.24. должно быть не более 0,01%.
Микробиологическая чистота – должна соответствовать категории 3.2
Изучение химического состава БАВ и разработка методов стандартизации настойки гомеопатической матричной Кактус
В ходе фитохимического исследования настоек гомеопатический матричных с помощью качественных реакций, ТСХ и ВЭЖХ-хроматографии установлено, что качественный состав БАВ аналогичен исходному сырью.
Для характеристики подлинности в проект ФС на НГМ предложено включить качественную реакцию на свободные сахара и метод ТСХ на свободные аминокислоты
Количественное определение биологически активных веществ
Для количественной оценки БАВ в НГМ Кактус предлагается методика определения связанных моносахаров в пересчете на глюкозу и суммы аминокислот в пересчете на кислоту глютаминовую, проводимых методом УФ-спектроскопии. С этой целью использовали методики, разработанные для сырья и адаптированные к анализу НГМ.
Количественное определение суммы связанных моносахаров в НГМ Кактус
В ходе исследований подобраны условия и разработана методика количественного определения связанных моносахаров в пересчете на глюкозу методом спектрофотометрии.
Относительная ошибка методики составляет ±3,51 для НГМ из свежего сырья ±3,27 % для НГМ из высушенного сырья (табл. 11), что свидетельствует об удовлетворительной воспроизводимости.
Таблица 11
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы связанных моносахаров в пересчете на глюкозу в НГМ Кактус
| НГМ | f | X | S2 | S | P,% | t(P,f) | x |  ,% |
| Из свежее-собранного сырья | 4 | 0,171 | 0,000022 | 0,0047 | 95 | 2,78 | 0,0059 | ±3,51 |
| Из высушенного сырья | 4 | 0,123 | 0,000010 | 0,0032 | 95 | 2,78 | 0,0040 | ±3,27 |
Отсутствие систематической ошибки подтверждено в опытах с добавками, представленными в таблице 12.
Таблица 12
Результаты опытов с добавками глюкозы к НГМ Кактус
| Содержание моносахаров в навеске НГМ, мг | Добавлено глюкозы, мг | Должно быть моносахаров, мг | Найдено моно-сахаридов, мг | Ошибка | |
| Абс., мг | Отн., % | ||||
| 1,723 | 0,4 | 2,123 | 2,188 | -0,064 | -3,05 |
| 1,698 | 0,8 | 2,498 | 2,426 | +0,072 | +2,89 |
| 1,730 | 1,2 | 2,93 | 3,0229 | -0,093 | -3,17 |
| 1,756 | 1,6 | 3,356 | 3,267 | +0,139 | +2,65 |
Относительная ошибка результатов опытов с добавками имеет отклонение в сторону отрицательных и положительных значений и не превышает ошибку единичного определения.
На основании анализа 5 опытных серий настойки установлена норма содержания полисахаридов в НГМ из свежего сырья не менее 0,17 %, а из высушенного сырья – не менее 0,12%. Данные показатели включены в проекты ФС.
Количественное определение суммы аминокислот в НГМ Кактус
Для количественного определения суммы аминокислот в пересчете на глюкозу также использован метод спектрофотометрии.
Метрологические характеристики разработанной методики, представленные в таблице 13, свидетельствуют об удовлетворительной ее воспроизводимости.
Таблица 13
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту в НГМ Кактус
| НГМ | f | X | S2 | S | P,% | t(P,f) | x |  ,% |
| Из свеже-собранного сырья | 4 | 5,643 | 0,0121 | 0,1100 | 95 | 2,78 | 0,1367 | ±4,02 |
| Из высушенного сырья | 4 | 5,62 | 0,0025 | 0,0495 | 95 | 2,78 | 0,0616 | ±3,85 |
Результаты опытов с добавками свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предложенной методики, поскольку относительная ошибка не превышает ошибку единичного определения и имеет отклонения как в сторону положительных, так и отрицательных значений (табл.14).
Таблица 14
Результаты опытов с добавками глютаминовой кислоты в НГМ Кактус из свежего сырья
| Содержание аминокислот в навеске НГМ, мг | Добавлено глютаминовой кислоты, мг | Должно быть аминокислот, мг | Найдено амино-кислот, мг | Ошибка | |
| Абс., мг | Отн., % | ||||
| 0,037 | 0,02 | 0,057 | 0,059 | -0,0021 | -3,68 |
| 0,039 | 0,03 | 0,069 | 0,067 | +0,0024 | +3,43 |
| 0,041 | 0,04 | 0,081 | 0,084 | -0,0031 | -3,81 |
| 0,038 | 0,04 | 0,078 | 0,075 | +0,0030 | +3,82 |
С помощью разработанной методики проанализированы по 5 опытных серий НГМ Кактус из свежего и высушенного сырья и установлено норма содержания суммы аминокислот не менее 5 мг% для НГМ из обоих видов сырья.
В ходе изучения стабильности при хранении НГМ Кактус установлен срок годности настоек – 2 года в защищенном от света месте при температуре не выше 25 С.
Разработка нормативной документации на настойки гомеопатические матричные Кактус
На основании проведенных исследований составлены проекты ФС на настойки гомеопатические матричные «Cactus grandiflorus (Cactus)» и «Cactus grandiflorus (Cactus) D1». Проекты ФС включают следующие показатели: описание, подлинность, сухой остаток, плотность, содержание спирта, тяжелые металлы микробиологическая чистота – категория 3.2., содержание полисахаридов в пересчете на глюкозу не менее 0,17 (0,12 % для НГМ из высушенного сырья), содержание аминокислот не менее 5 мг% (для обоих видов сырья), упаковка, маркировка, срок годности 2 года.
5.Предварительная фармакологическая оценка НГМ Кактус, их разведений и биологически активных комплексов (аминокислот и полисахаридов)
Использование ферментов антиоксидантной системы защиты для оценки биологической активности гомеопатических настоек из свежего и высушенного сырья кактуса крупноцветкового, а также выделенных из них аминокислот и полисахаридов показала, что полученные гомеопатические настойки, их разведения, а также фракция полисахаридов обладают ярко выраженными антиоксидантными свойствами. Причем, в наибольшей степени активируют ферменты супероксиддисмутазу, каталазу и глютатионпероксидазу НГМ из свежего сырья и полисахариды. Полученные результаты подтверждают целесообразность применения НГМ Кактус и препаратов на их основе в качестве кардиотропных средств.
6. Разработка методов стандартизации гомеопатических лекарственных средств, содержащих настойку гомеопатическую матричную Кактус
В настоящее время отечественный производитель гомеопатических препаратов «ООО Гомеопатическая фармация» (г.Санкт-Петербург) выпускает лекарственные препараты на основе НГМ Кактус. К числу однокомпонентных препаратов следует отнести выпускаемый в виде капель и гранул Кактус D3 (ФСП 42-01323258-02), среди комплексных препаратов представлен гомеопатический препарат Кардисед-ГФ (ФСП 42-01324508-03), выпускаемый в виде капель.
Оценку качества как моно-, так и комплексных гомеопатических препаратов, содержащих НГМ Кактус, осуществляют преимущественно по показателям подлинности, позволяющим идентифицировать вспомогательные вещества – наличию в составе капель спирта этилового (йодоформная проба), или в случае гранул - сахарной крупки (реакция с реактивом Фелинга).
В связи с этим нами разработаны методики определения подлинности и количественного содержания БАВ в монокомпонентном препарате Cactus D3 и многокомпонентном препарате Кардисед ГФ.
Для характеристики подлинности данных препаратов нами предлагается проведение ТСХ свободных сахаров и ТСХ свободных аминокислот.
Оценку количественного содержания БАВ в каплях гомеопатических Кардисед-ГФ и каплях гомеопатических Кактус D3 предложено проводить по сумме моносахаров в пересчете на глюкозу методом спектрофотометрии согласно методике, разработанной для НГМ Кактус и адаптированной к условиям анализа данных гомеопатических препаратов
Таблица 15
Метрологические характеристики методики количественного определения моносахаров в пересчете на глюкозу в препаратах, содержащих НГМ Кактус
| Препарат | f | X | S2 | S | P,% | t(P,f) | x |  ,% |
| Кардисед-ГФ | 4 | 0,145 | 0, 000022 | 0,0046 | 95 | 2,78 | 0,0047 | ±3,2 |
| Капли Кактус D3 | 4 | 0,033 | 0,01 | 0,001 | 95 | 2,78 | 0,001 | ±3,06 |
Согласно данным, полученным при анализе 5 серий препаратов содержание моносахаров в пересчете на глюкозу составило не менее 0,14% в препарате Кардисед-ГФ и не менее 0,03 % в каплях гомеопатических Cactus D3, что совпадает с расчетными данными.
Методики определения подлинности и количественного определения полисахаридов оформлены в виде «Изменений и дополнений» к ФСП 42-01323258-02 и ФСП 42-01324508-03 на капли гомеопатические Кардисед-ГФ и Cactus D3 соответственно.
Общие выводы
- Впервые проведено макроскопическое и микроскопическое исследование побегов кактуса крупноцветкового. Установлены диагностически значимые признаки сырья. Определены числовые показатели свежесобранного и высушенного сырья кактуса крупноцветкового.
- Изучен химический состава побегов кактуса крупноцветкового (свежих и высушенных) и установлено наличие в них таких групп БАВ, как свободные сахара, аминокислоты, полисахариды, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты. Выделен очищенный полисахаридный комплекс, который охарактеризован методами денситометрии и С13-ЯМР-спектроскопии. Определен качественный состав свободных сахаров и свободных аминокислот методом ТСХ, результаты анализа подтверждены и дополнены методом ВЭЖХ.
- Разработаны методики определения подлинности и количественной оценки по сумме связанных моносахаров в пересчете на глюкозу. (относительная ошибка методики ±6,92 % для высушенного и ±6,71 % для свежего сырья) и методика определения суммы аминокислот в пересчете на кислоту глютаминовую (относительная ошибка методики ±6,05 % для свежего и ±5,96 % для высушенного сырья).
- Получены НГМ Кактус из свежего и высушенного сырья, с использованием методов физико-химического анализа исследован компонентный состав БАВ в изучаемых настойках. Разработаны критерии подлинности и установлены нормы содержания БАВ в НГМ Кактус.
- С применением ферментных тест-систем в опытах in vitro проведено определение антиоксидантной активности НГМ Кактус из свежего и высушенного сырья, их разведений и биологически активных комплексов. Наибольший антиоксидантный эффект оказывают НГМ из свежего сырья и фракция полисахаридов.
- Предложены методики определения подлинности гомеопатических препаратов, содержащих НГМ Кактус и разработаны методики оценки количественного содержания БАВ в препаратах Кардисед-ГФ и Кактус D3.
- По результатам исследования подготовлены проекты фармакопейных статей на «Кактуса крупноцветкового побеги свежие», «Кактуса крупноцветкового побеги»; «Cactus grandiflorus (Cactus) D1 Настойку гомеопатическую матричную»; «Cactus grandiflorus (Cactus) Настойку гомеопатическую матричную» и «Изменения и дополнения к ФСП 42-01324508-03 Кардисед-ГФ и ФСП 42-01323258-02 капли Кактус D3.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Сокольская Т.А., Гаккель В.А. К разработке состава, технологии и методов оценки качества гомеопатических лекарственных средств на основе Кактуса крупноцветкового – Selenecereus grandiflorus L. Bretteu et Rose. / Тезисы докладов XVI Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (27-29 января 2006 г). – М.: 2006. – С. 117.
- Гаккель В.А., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д., Настойка матричная гомеопатическая Кактус и основные показатели ее качества. / Материалы региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной 40 –летию фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики» (15 декабря 2006 г). – Курск. – 2006. – С. 270-272.
- Гаккель В.А., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. «Царица ночи», как лекарственное средство в гомеопатической практике. / Сборник научных трудов конгресса «Традиционная медицина – 2007» (1-3 марта 2007 г). - М.: 2007. – С. 183-188.
- Гаккель В.А., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. Определение основных макро- и микродиагностических признаков Селенецереуса крупноцветкового – Selenecereus grandiflorus L. Bretteu et Rose стеблей и цветков. / Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». – Пятигорск 2007. – С. 31-34.
- Гаккель В.А., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. Применение и методы оценки качества настойки матричной гомеопатической Кактус. / Вестник Бурятского Государственного университета (серия медицина физкультура и спорт). – Улан-Удэ: изд. Бурят. Гос. Ун-та, 2007. – вып. 8. – С. 29-32.
- Саканян К. М., Еникеева Р. А., Гаккель В. А., Сокольская Т. А. Некоторые гомеопатические препараты в отечественной медицинской практике / Вестник Российской Военно-медицинской академии (приложение части I). – С-Пб.: 2007, №1 (17) С. 480-481.
- Гаккель В.А. Современные подходы к оценке качества настойки матричной гомеопатической Кактус и препаратов на ее основе. Сборник трудов III Российского гомеопатического съезда. – М.: 2007. - С. 168-169.
