Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы)
На правах рукописи
АГОЛЬЦОВ ВАЛЕРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
КАНДИДОЗ, АСПЕРГИЛЛЕЗ И МУКОРОЗ ЖИВОТНЫХ
(ДИАГНОСТИКА И МЕРЫ БОРЬБЫ)
16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора ветеринарных наук
Н. Новгород – 2006
Работа выполнена на кафедре патанатомии и патофизиологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», в лабораториях ГНУ «Саратовская НИВС», в Клинике гематологии и профпатологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГМУ» и в животноводческих хозяйствах Саратовской и Ульяновской областей.
Научный консультант- доктор ветеринарных наук, профессор
Ларионов Сергей Васильевич
Официальные оппоненты:
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор ветеринарных наук, профессор Даугалиева Эмма Хасановна
Доктор ветеринарных наук, профессор,
Член-корреспондент РАСХН Авилов Вячеслав Михайлович
Доктор ветеринарных наук, профессор Розовенко Михаил Васильевич
Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина (МГАВМиБ)
Защита состоится «1» марта 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 220.047.02 при ФГОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» (603107, Н. Новгород, пр. Гагарина, 97)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» (603107, Н. Новгород, пр. Гагарина, 97)
Автореферат разослан « » января 2006 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук, профессор Н. Г. Горчакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Состояние и эффективность современного животноводства определяются наряду с другими факторами и функционированием эволюционно сформировавшихся инфекционных и инвазионных паразитарных систем, соактантами которых являются их возбудители, а также домашние и дикие животные, а нередко и человек [Морозов В.Л., 1989; Маиэлян Э. С., 1999; Кузнецов А. Ф., 2001; Thenizol-Ferly M., 1996; Haase G., 1999].
Многие исследователи указывают, что главным этиологическим фактором ряда паразитозов являются микроскопические грибы, степень изученности которых до сих пор остается недостаточной [Офицеров В.И., 2003; Маянский А. Н., 2003; Barbosa O. et al., 2000].
Наиболее значимыми из этих болезней в современной медицине и ветеринарии являются кандидоз, аспергиллез и мукороз [Barboza O.A. et al., 2000; Офицеров В.И. с соавт., 2003; Маянский А.Н., Салина Е.В., Заславская Т.И., 2003], однако многие вопросы их этиопатогенеза, эпиозоотического проявления манифестации и диагностики, формирования специфического иммунитета, а также разработка эффективных методов их профилактики остаются недостаточно изученными [Аравийский Р.А., Антонов В.В., 1995; Деримсанова И. С., 2000; Будумян Т.М. с соавт., 2002].
Проблема микозов признана во всем мире. На 31 съезде микологов в Аяхси [1997] подчеркнуто, что: «…назрела необходимость в качественно новом подходе к диагностике, лечению и профилактике висцеральных микозов, а одним из переспективнейших направлений в современной медицине и ветеринарии является создание из микроскопических грибов препаратов обладающих иммуногенными и аллергенными свойствами» [Будумян Т. М. с соавт., 2000].
Несмотря на успехи, современной микологии, сведения об изменениях клеточно-гуморального иммунитета при висцеральных микозах обрывочные и неполные. Недостаточно изучены вопросы иммунологической оценки антигенов грибов [Выхрестенко Л.Р., 2001], конструирования и технологии производства вакцин против кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных [Петров Р.В., Хаитов Р.Т., 2003; Yerout D.R., 1988].
Недостаточность изученности формирования инфекционных паразитарных систем, вызываемых микроскопическими грибами, особенностей их эпизоотического проявления в популяциях животных и потребность совершенствования противомикозных мероприятий определили выбор темы и направления наших исследований.
Научно-исследовательская работа выполнялась по заданиям РАСХН: «Изучить молекулярно-генетические и клеточные механизмы создания экологически безопасных методов и средств профилактики и борьбы с болезнями животных, обеспечивающих устойчивое ветеринарное благополучие, высокое санитарное качество продуктов и сырья животного происхождения» (1991-1996гг). С 1996 по 2000г. (шифр госрегистрации 01.9.90 00 3164): «Разработать теоретические основы взаимоотношения макро- и микроорганизмов при висцеральных микозах сельскохозяйственных животных». В период с 2000 по 2005 гг. (шифр госрегистрации 01.200.1 20121): «Изучить основные закономерности защиты клеточных и тканевых систем организма животных от инфекционных болезней».
Цель работы. В сравнительном аспекте и в динамике изучены характер эпизоотического проявления кандидоза, аспергиллеза и мукороза домашних животных и на этой основе усовершенствовать систему противомикозных мероприятий в условиях современного животноводства.
Задачи исследований
- изучить этиологию и характер инфекционного и эпизоотического проявления кандидоза, аспергиллеза и мукороза сельскохозяйственных животных;
- изучить манифестацию спонтанного и экспериментального кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных;
- изучить методы прижизненной и посмертной диагностики основных висцеральных микозов сельскохозяйственных животных;
- усовершенствовать систему противомикозных мероприятий в современном животноводстве, в том числе и с применением специфических средств диагностики и профилактики.
Научная новизна
Впервые в условиях Среднего и Нижнего Поволжья изучены роль и место микозных болезней в формировании нозологического профиля заразной патологии сельскохозяйственных животных, характер и границы эпизоотического проявления висцеральных микозов, этиопатогенез и манифестацию кандидоза, аспергиллеза и мукороза, усовершенствована их дифференциальная диагностика. Разработана искусственная питательная среда для культивирования дрожжевидных и плесневых грибов, способ лабораторной оценки иммуногенности и аллергизирующих свойств антигенов микроскопических грибов. Выделены и депонированы в ВГНКИ штаммы грибов C. albicans, A. fumigatus и M. racemosus, для получения протективных антигенов и диагностикумов. На приоритетной основе разработаны способы конструирования и получения аллергенов и вакцин против кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных.
Практическая значимость
Доказано, что эпизоотический процесс при висцеральных микозах животных - процесс управляемый.
На основании проведенных исследований разработаны и предложены:
- Методические рекомендации по определению иммуногенности и конструированию вакцинных препаратов против микозов сельскохозяйственных животных. Утверждены РАСХН, Москва, 17.11.2000г.
2. Рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с висцеральными микозами и микотоксикозами сельскохозяйственных животных. Утверждены советом Ассоциации «Аграрное образование и наука», Саратов, 2002г.
3. Рекомендации по приготовлению вакцин и иммунопрофилактике кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных. Утв. РАСХН г. Москва 12. 10. 2005г.
4. Методические рекомендации по диагностике, предупреждению и ликвидации висцеральных микозов сельскохозяйственных животных. Утверждены РАСХН, Москва, 31. 05. 2004г.
5. Способ лечения аспергиллеза / Патент РФ № 2073512; опубл. 20. 02.1997г., в бюлл. № 5.
6. Питательная среда для культивирования плесневых грибов рода Aspergillus и Mucor / Патент РФ № 2093569; опубл. 20.10.1997г., в бюлл. № 29.
7. Питательная среда для культивирования дрожжевидных грибов рода Candida / Патент РФ № 2111245; опубл. 20. 05.1998г., в бюлл. №14.
8. Способ оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов / Патент РФ № 2176392; опубл. 27.11. 2001г., в бюлл. №33.
9. Штамм Aspergillus fumigatus №6, используемый для получения антигенов / Патент РФ № 2203940; опубл. 10. 05. 2003г., в бюлл. № 13.
10. Штамм Candida albicans №253, используемый для получения антигена / Патент РФ № 2209243; опубл. 27. 07. 2003г., в бюлл.№ 21.
11. Вакцина против кандидоза сельскохозяйственных животных / Патент РФ № 2217163; опубл. 27.11. 2003г., в бюлл. № 33.
12.Вакцина против аспергиллеза / Патент РФ № 2230567; опубл. 06. 06. 2004г., в бюлл. № 17.
13. Штамм Mucor racemosus №195, используемый при приготовлении иммуногенных препаратов против мукорозов сельскохозяйственных животных. /ПатентРФ № 2248392; опубл. 17. 02. 2005г., в бюлл. № 8.
14. Вакцина против висцеральных микозов сельскохозяйственных животных, вызываемых грибом рода Mucor racemosus. / Патент РФ № 2270694; опубл. 27. 02. 2006г., в бюлл. № 6.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
- Микозы сельскохозяйственных животных: кандидоз, аспергиллез и мукороз - важные компоненты нозологического профиля инфекционной патологии сельскохозяйственных животных в изучаемом регионе.
- Инфекционный процесс при спонтанных микозах характеризуется выраженной манифестацией и патоморфозом, а эпизоотическое их проявление - выраженными территориальными, временными и популяционными границами.
- Комплексная диагностика висцеральных микозов животных наиболее эффективна при использовании клинико-эпизоотологического, иммунологического, гематологического и биохимического методов исследований.
- Иммуногенные и аллергенные свойства антигенов микроскопических грибов - основа их отбора для изготовления специфических диагностикумов и профилактических препаратов.
- Усовершенствованная система противомикозных мероприятий научно обоснована и эффективна.
Пути реализации. Результаты исследований могут быть использованы при разработке научно обоснованных систем противоэпизоотических мероприятий при других инфекционных болезнях животных, а также в учебно- педагогическом процессе при подготовке специалистов ветеринарной профессии.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Методических комиссий и Ученых Советов Саратовской НИВС, Саратовского ГАУ, на международных, всероссийских и региональных научно-практических конференциях «Актуальные вопросы гастроэнтерологии» (Томск, 1993), «Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных» (Ставрополь, 1999), Института ветеринарной медицины и биотехнологии СГАУ им. Вавилова (Саратов, 2000- 2005), «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» (Покров, 2000), и «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001), «Госсанэпидслужбе России – 80 лет» (Саратов, 2002), «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2002), «Проблемы ветеринарной медицины в условиях реформирования сельскохозяйственного производства» (Махачкала, 2003), «Актуальные вопросы ветеринарной медицины и пути их решения» (Екатеринбург, Уральский НИВИ, 2005), «Актуальные проблемы экологии на современном этапе развития сельского хозяйства» (СГАУ им. Н. И. Вавилова, Саратов-Бонн,2005), «Межкафедральное заседание професс. - преп. состава фак-та вет. мед-ны СГАУ им. Н. И. Вавилова», (Саратов, 2006), «Экологические проблемы АПК», (Саратов-Ухань-Галвестон, 2006).
Публикации. Основные научные положения, выводы и разработки опубликованы в 49 печатных работах, в том числе в 6-ти центральных изданиях: «Вестник СГАУ», «Ветеринарная патология», «Доклады РАСХН», в сборниках материалов научно-практических Международных, Всероссийских и региональных конференций, а также в описаниях 10-ти изобретений Патентов РФ.
Внедрение результатов исследований. Результаты исследований под авторским надзором с положительным эффектом внедрены в ветлабораториях Ульяновской и Саратовской областей и в НИУ РАСХН. Разработанные методики и способы диагностики, а также способы оценки антигенов грибов и технологии изготовления вакцинных и аллергенных препаратов рекомендованы Бюро Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии для внедрения в научно-исследовательских ветеринарных учреждениях Республиканской, областных и районных лабораториях. Результаты исследований внедрены в микологических отделах и лабораториях НИУ подведомственных РАСХН, а также в Ульяновской областной и Краснокутской районной (Саратовской области) ветеринарных лабораториях.
Разработанные препараты и способы иммунопрофилактики используются в порядке широких производственных испытаний в животноводческих хозяйствах Саратовской области. Рекомендации по профилактике, диагностике, мерам борьбы с микозами и микотоксикозами сельскохозяйственных животных одобрены Управлением ветеринарии Правительства Саратовской области и включены в «Комплексную программу профилактики и борьбы с инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных». Результаты исследований используются в учебном процессе студентами факультета ветеринарной медицины СГАУ им. Н. И. Вавилова, а также слушателями Саратовского регионального Института повышения квалификации работников АПК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 380 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, иллюстрирована 49 таблицами и диаграммами и 60 макро- и микрофотографиями. Список литературы включает 626 источников, в том числе 266 зарубежных авторов.
Собственные исследования
Материалы, методы и объемы исследований
Работа выполнялась в 1991-2005 годах в лабораториях ГНУ «Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Россельхозакадемии» и на кафедре патологической анатомии и патологической физиологии ФГОУ ВПО СГАУ им. Н.И. Вавилова. Отдельные этапы исследований проводились в лабораториях ФГОУ ВПО «Саратовский НИИ биохимии и физиологии микроорганизмов», в Клинике гематологии и профпатологии ФГОУ ВПО СГМУ, а также в животноводческих хозяйствах Саратовской и Ульяновской областей.
Распространенность грибов возбудителей висцеральных микозов и их роль в патологии животных изучали исследованием проб кормов, подстилки и патологического материала от павших и вынуждено убитых телят, поросят и ягнят, а также молока от коров с клиническими признаками мастита.
Всего проведено 1.386 экспертиз с использованием микологических методов исследований (посевов и последующего микроскопирования).
Из патологического материала и кормов выделено 486 штаммов грибов A. fumigatus, C. albicans и M. racemosus.
В работе использовали депонированные в ВГНКИ штаммы грибов: C. albicans №253, A. fumigatus №6, M. racemosus №195 (апатогенные), C. albicans №70-74, A. fumigatus №21-91, M. racemosus №55-91 (патогенные),
Подвергнуто патологоанатомическому вскрытию и патоморфологическому исследованию 615 трупов животных различных видов и возрастов.
Для изучения макрокартины патологоанатомических изменений применялся метод полного вскрытия по Шору [Жаров А.В. и др., 1982]. При проведении гистологических исследований патматериала для выявления грибов рода Candida окраску срезов проводили по А.А. Боголепову и по В.В. Курасовой, рода Aspergillus гематоксилин-эозином и по В.В. Курасовой, рода Mucor – гематоксилин-эозином.
Культивирование грибов осуществляли на стандартизированных питательных средах (Сабуро, Чапека, Городковой, дрожжевой) и предложенных нами.
Концентрацию спор грибов определяли методом подсчета в камере Горяева, с использованием фазовоконтрастного устройства.
Жизнеспособность грибов изучали контрольными посевами последовательных десятикратных разведений (от 10-1 до 10-9).
В экспериментах использовано: 5.218 белых мышей, 917 морских свинок, 676 кроликов, 419 поросят, 396 телят и 196 коров.
Для получения АГ грибов с целью последующего конструирования иммуногенных и аллергенных препаратов использовали ультразвуковые дезинтеграторы: МЛ-1 (НПО «Биоприбор» АН СССР) и «Solana», ФРГ, с частотой волны 22кГц, мощностью 100Вт/см3 и экспозицией до 1 часа.
Фильтрацию грибковых дезинтеграторов осуществляли с использованием стационарных вакуум-аппаратов (Р-2-4Атм) и мембранных фильтров «Владипор МФА-ММ» №3.
Биохимический состав АГ грибов определяли на содержание белка, жиров и углеводов. Наличие белка устанавливали по методу Бредфорда [1983]. Белковый электрофорез проводили по методу Laemmli [1971].
Определение содержания азота и полипептидных фракций проводили согласно «Методических рекомендаций по физико-химическому и биологическому контролю белковых гидролизатов», [1983]. Содержание липидов и их составных кислот определяли согласно «Методов биохимического исследования растений», [1972].
Определение растворимых и легкогидролизуемых углеводов проводили согласно ГОСТ 26176-91 по методу Бертрана [1986].
В отдельных случаях (при изучении состава аллергенов) использовали «Методические указания ГИСК им. Л.А. Тарасевича [1988]».
Титр специфических АТ определяли с помощью иммуноферментных тест-систем (кандидозных, аспергиллезных) НПО «Аквапаст» г. С. Петербург Минздрава РФ, методом твердофазного «сэндвич»-варианта ИФА на фотометре АКИЦ-1.
Анализы гематологических, иммунологических и биохимических показателей проведены с использованием 786 проб крови животных.
Подсчет эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и выведение лейкоцитарной формулы проводили в автоматическом гематологическом анализаторе «DATACELL – 16 plus”, «HVCELL». Для исследования гуморального иммунитета по комплексам АГ-АТ (ЦИК) использовали 3,75% раствор полиэтиленгликоля – 6.000, с последующим определением плотности преципитата (у.е.). Определение Т-лимфоцитов (Е-РОК) проводили по спонтанному розеткообразованию [М. Jondal, 1976]; Т-хелперов и Т-супрессоров - по способности теофиллина изменять активность розеткообразования Т-лимфоцитами, а В-лимфоцитов - методом комплементарного розеткообразования (ЕАС-РОК) [N. Mendes, 1973].
Общий белок сыворотки крови определяли биуретовой реакцией («Fluitest»), при длине волны 546 нм, на приборах: «Stat-Fax» и ФЭК.
Фракции белка определяли с помощью диагностического набора для электрофоретического разделения белков сыворотки крови на агарозе. Электрофоретическое разделение белков осуществляли при помощи Cormay gel protein 100 «DVSE- Sebia».
Полученные в процессе работы цифровые показатели анализировали биометрически с использованием критериев Стъюдента и константного метода, а также обрабатывали методами вариационной статистики по Е.К. Меркурьевой [1983] и на ЭВМ с использованием программы «Statgraphics Plus fon Wersion 2.1».
Результаты исследований
Причины возникновения кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных
Первоначальным этапом наших исследований было выяснение причин возникновения кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных.
Кандидоз в большинстве случаев возникает при бессистемном лечении животных антибиотиками, а также на фоне колибактериоза, сальмонеллеза, пастереллеза, диплококковой септицемии и др. инфекционных болезней, осложняя их течение. Нередко кандидозы возникают у истощенных животных, и имеющих признаки гиповитаминоза, в частности, витаминов А, В, С и D.
Кандидозы, в основном, возникают у животных не старше одного месяца, однако, на фоне других инфекций, не зависимо от возраста. Кроме того, в нашей практике был случай массовой вспышки кандидоза у телок старше одного года, при скармливании им свекольной барды, хранившейся около 10 месяцев, и контаминированной грибами этого рода. В данном конкретном случае кандидоз протекал в виде септического процесса с поражением печени и почек.
Причинами возникновения аспергиллезов и мукорозов, является использование подстилки, а нередко, и кормов, контаминированных спорами этих грибов, а также повышенная влажность (>90%) также способствует размножению грибов в животноводческих помещениях.
Травмирование слизистой оболочки сычуга остьями, в частности, ячменной соломы может стать фактором возникновения аспергиллеза и мукороза. Нередко мукороз развивается при ацидозе рубца.
Кандидоз животных
Прижизненная диагностика
Висцеральные кандидозы животных, протекающие с преимущественным поражением пищеварительного тракта, имеют много общего в клиническом проявлении болезни.
Первые признаки заболевания животных кандидозом проявляются уже на 3-10-е сутки после рождения. Для острого периода характерны диарея, угнетенное состояние, усиленная перистальтика кишечника, иногда болезненность при пальпации брюшной стенки и гиперемия слизистых оболочек ротовой полости. Испражнения водянистые, в отдельных случаях с примесью белых хлопьев, слизи и крови. Болезнь через 3-4 суток заканчивалась гибелью.
У телят 10– 20-ти дневного возраста температура тела находилась на низших границах нормы, фекалии приобретали кашицеобразную консистенцию серо-белого цвета с пузырьками газа. Больные телята плохо пили молоко, вид их был угнетенным, передвигались вяло без резких движений, свойственных молодняку этого возраста. А нередко и просто лежали и, как следствие этого, у некоторых отмечали даже мацерацию кожи на тазовых конечностях.
При возникновении кандидоза в более поздние сроки (на 20-60-й день жизни) течение заболевания в основном подострое или хроническое. В этом возрасте заболевание характеризуется атонией или гипотонией преджелудков, ослаблением перистальтики кишечника, периодически повторяюшимся вздутием рубца. Наряду с поражением внутренних органов желудочно-кишечного тракта, у части больных животных клинические признаки стоматита: незначительное слюнотечение, гиперемия слизистых оболочек ротовой полости, белый налет или пленки серого цвета на деснах и языке.
Бронхопневмонии кандидозной этиологии регистрировали в основном у телят в 2-3-х месячном возрасте. Для бронхопневмонии характерны кашель, влажные хрипы, усиленное бронхиальное дыхание и слизисто-гнойное носовое истечение. Заболевание заканчивается гибелью животных.
У поросят 3-7 дневного возраста кандидоз сопровождается диареей, усилением перистальтики кишечника и отсутствием гипертермии. Гибель, в большинстве случаев, наступала на 15-17-е сутки после рождения, а показатель смертности варьировал от 25 до40%.
В возрасте от двух недель до двух месяцев у поросят кандидоз протекает в основном с поражением респираторных органов с клиническими признаками пневмонии и воспалительными явлениями на слизистой оболочке ротовой полости с поражениями десен, губ и языка.
Взрослые животные (крупный рогатый скот и свиньи) по сравнению с молодняком более устойчивы к грибам рода Сandida, однако, коровы и свиноматки, являясь носителями этих грибов, выделяют их во внешнюю среду и становятся источником заражения молодняка. Наряду с носительством грибов рода Candida у коров и свиней обнаруживали маститы, эндометриты и вагиниты кандидозной этиологии; патогномоничным признаком абортов кандидозной этиологии является то, что они возникают в первой половине беременности.
Посмертная диагностика
Основные патологоанатомические изменения у телят обнаруживали в пищеварительном тракте, причем, наиболее часто в преджелудках и значительно реже – в сычуге (рис. 2.1).
У новорожденных телят на слизистой оболочке рубца отмечали рыхлые серовато-желтые пленчатые, легко снимающиеся наложения, под которыми обнаруживали гиперемированную слизистую оболочку. Сосочки слизистой оболочки нередко были диффузно покрасневшими.
На слизистой оболочке листочков книжки просматривались бугорковые, легко снимающиеся творожисто-подобные наложения, участками сливавшиеся между собой в сплошной рыхлый налет.
В сычуге обнаруживали густую тягучую грязно-серого цвета слизь с буроватым оттенком, множественные точечные и пятнистые кровоизлияния, напоминавшие дегтеобразные пятна. Стенка кишечника была утолщена за счет серозного пропитывания подслизистого слоя.
У телят старшего возраста на слизистой оболочке рубца и книжки обнаруживали массивные, слегка уплотненные творожисто-подобные наложения с желтоватым оттенком, покрывавшие всю поверхность слизистой, на которой отмечали множественные некрозы и изъязвления. Мезентериальные лимфатические узлы – в состоянии гиперплазии.
В сетке обнаруживали крошковатые творожистоподобные массы, Перегородки некоторых ячеек были частично некротизированы и выявлялись в виде буроватых очажков. В некоторых случаях обнаруживали обширные изъязвления слизистой. В центре изъязвлений ячейки слизистой полностью разрушались, превращаясь в рыхлую с буроватым оттенком однородную массу.
На слизистой оболочке листочков книжки обнаруживали массивные творожистоподобные наложения, а под ними изъязвления и некрозы.
Поражения пищевода, ротовой полости (язык, десны) - в виде рыхлого беловатого налета на их слизистой оболочке. В легких отмечали ателектатические участки грязно-красного цвета мясистой консистенции. На разрезе из бронхиол выделялась густая серо-желтого цвета слизь. Бронхи содержали слизисто-пенистую массу с хлопьями желтовато-серого цвета.
Установлено, что при кандидозе телят в основном поражаются преджелудки (рубец, сетка, книжка) и крайне редко другие отделы пищеварительного тракта.
Рис.2.1.Локализация патологий пищеварительного тракта телят
У поросят при кандидозе обнаруживали изменения на слизистой оболочке пилорической и реже фундальной части желудка в виде складчатости, отечности и гиперемии. Местами оболочка покрыта творожистыми наложениями или серо-белыми пленками. После их удаления обнаруживали точечные или пятнистые кровоизлияния, эрозии и язвы диаметром до 10-30 мм с неровными краями и темно-красным дном. Слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки и мезентериальные лимфоузлы набухшие и гиперемированные. В почечной лоханке - скопление серо-желтой слизистой массы и эритродиапедозные мелкие кровоизлияния.
Поражения слизистых оболочек ротовой полости (десен, губ, языка), миндалин и пищевода регистрировали у поросят в возрасте от двух недель и до трех месяцев в виде грязно-серых крошковидных наложений, под которыми выявляли эрозии и небольшие язвы. У овец обнаруживали очаги некроза в легких и миокарде.
Лабораторная диагностика
Для обнаружения грибов рода Candida проводили микроскопические и микологические исследования фрагментов пленок или творожистых наложений со слизистых оболочек, фекалий больных телят и поросят, молоко от коров с признаками мастита. При исследовании тканей рубца обращал на себя внимание тот факт, что в одних случаях в эпителии среди обилия нейтрофилов отчетливо различались псевдомицелий и бластоспоры гриба, в других – элементы гриба не просматривались, а большая часть лейкоцитов была разрушена. В подслизистом слое всегда обнаруживали обилие псевдомицелия, вросшего в эпителиальный покров сосочков слизистой. В отдельных участках ткани выявляли и бластоспоры гриба.
В участках с дистрофически измененным эпителием сетки выявляли тонкие скопления мицелия и бластоспор гриба. В творожисто-подобных массах и на поверхности эпителия в подслизистом слое сычуга обнаруживали псевдомицелий и отторгнутые дистрофически измененные клетки эпителия.
На плотных питательных средах грибы Candida росли в виде круглых, выпуклых, беловатых, гладких, сметанообразных или шероховатых, складчатых с желтоватым оттенком колоний, в зависимости от вида возбудителя болезни. В жидких средах образовывался рыхлый беловатый осадок без помутнения бульона.
Колонии гриба на плотных питательных средах состояли из почкующихся дрожжевидных клеток различной формы, а в бульонах - псевдомицелий.
От больных кандидозом телят и поросят выделяли C. albicans и C. tropicalis.
Следует отметить, что грибы из рода Candida выделяли из очагов поражений как монокультуры данного вида (C. albicans, C. tropicalis), так и в ассоциации с другими видами Candida (С. parakrusei, C. krusei), причем, нередко и с грибами из рода Aspergillus и Mucor.
Аспергиллезы животных
Прижизненная диагностика
Аспергиллезы регистрировали в двух формах: желудочно-кишечной и легочной. Гастроэнтерит у телят протекал остро и характеризовался частыми тенезмами и испражнениями, в фекалиях, как правило, - примесь крови в виде темно-красных сгустков.
Больные аспергиллезной пневмонией были малоподвижны, температура тела достигала 410С, кашель, дыхание брюшного типа, из носовых ходов слизистые выделения.
У поросят аспергиллез возникал с 30-ти дневного возраста, и характеризовался симптомами гастроэнтерита и бронхопневмонии одновременно.
У ягнят аспергиллез протекал с клиническими признаками двусторонней лобулярной пневмонии.
Посмертная диагностика
Аспергиллез у телят характеризовался язвенно-некротическими поражениями пищеварительного тракта, геморрагиями в паренхиматозных органах и наличием гранулем в легких. На слизистой оболочке рубца, сетки и книжки выявляли поверхностные или глубокие некрозы и язвы. Сычуг поражался особенно часто. Содержимое сычуга при наличии язв имело много слизи или желеобразной массы с буроватым оттенком. Дно язв было рыхлым темного цвета. Стенка сычуга на месте язв была утолщена, а со стороны серозной оболочки отмечались буроватые пятна, в кишечнике - геморрагическое воспаление.
В легких телят 10-ти дневного возраста, регистрировали гранулемы. В отдельных случаях кроме гранулем обнаруживали и обширные некрозы в ткани легкого вплоть до образования каверн. В этом случае отмечали фибринозно-экссудативные плевриты с наличием серо-зеленых пленок.
Поражения клапанного аппарата сердца были в виде гематом или пятнистых кровоизлияний. В печени - глубокие некрозы, а в селезенке - уплотнения и полосчатые кровоизлияния. В головном мозге сосуды инъецированы, твердая мозговая оболочка гиперемированная, в белом и сером веществе – кровоизлияния.
У свиней поражения желудка были аналогичны изменениям в сычуге телят.
У овец поражения отмечали только в респираторных органах и характеризовались они как гранулематозные и некротические изменения в легких, а также трахеобронхиты с грязно-зелеными наложениями на слизистой оболочке.
Лабораторная диагностика
При микроскопическом исследовании фекалий грибы рода Aspergillus выявляли в виде ветвящихся полупрозрачных нитей диаметром 3-5 мкм с небольшими вздутиями на концах.
В пораженных тканях грибы рода Aspergillus (в 90% A. fumigatus) выявлялись в виде множественных переплетающихся нитей с поперечными перегородками. В зеленоватых налетах со слизистой оболочки воздухоносных путей, с пульмональной плевры, а иногда и со слизистой оболочки преджелудков или сычуга обнаруживали и органы плодоношения гриба с типичными головками и конидиями.
Морфология аспергилл в тканях, окрашенных по методу В.В. Курасовой, была различной – от начала прорастания конидий и образования трубочек, до скопления активно размножавшегося мицелия, который нередко имел тенденцию к формированию друзоподобных образований. Было подмечено, что в подслизистом слое рубца или сычуга (желудка), куда гриб проникал, ветвления гиф почти не наблюдалось, там можно было видеть нити или фрагменты, окруженные фагоцитирующими клетками. Гриб нередко врастал одновременно в слизистый, подслизистый и мышечный слои. В пораженных участках макроскопически диагностировали микроабсцессы. В микроабсцессах морфология гриба претерпевала большие изменения. Гифы были уродливо ветвящимися, с вздутиями, от которых отходили гифальные отростки.
Мукорозы животных
Прижизненная диагностика
Мукорозы у телят регистрировали преимущественно до 3-х месячного возраста. Данный микоз диагностирован у коров, овец, поросят и кроликов. Хотя следует подчеркнуть, что мукорозы в «чистом виде», то есть, вызванные только грибом рода Mucor регистрировали редко.
Основным клиническим признаком мукороза у всех видов животных была диарея. В фекалиях - сгустки крови и фибрин. В нескольких случаях мукороз у телят до 2-х месячного возраста протекал с признаками бронхопневмонии. У животных отмечали сухой кашель, в легких жесткое везикулярное дыхание. Температура тела повышалась на 1,50С. Телята погибали на 6-е сутки. У коров отмечали атонию рубца.
У поросят месячного возраста мукороз сопровождался диареей, в фекалиях- примеси крови. Заболевание через 3-4 суток заканчивалось гибелью животных.
У ягнят симптомокомплекс - диарея. В водянистых фекалиях сгустки крови.
Посмертная диагностика
У телят 4-6-ти дневного возраста отмечали серозно-фибринозное воспаление слизистой оболочки рубца с наличием мелких очагов некрозов, пронизывавших всю толщу его стенки. Слизистая оболочка кишечника была геморрагически воспалена, брыжеечные лимфатические узлы находились в состоянии гиперплазии. Под перикардом и на эндокарде – точечные кровоизлияния.
У телят на слизистой оболочке сычуга (на месте его перехода в книжку) язвы полукруглой формы с ярко-красной зоной по периферии и почти черным центром. Содержимое сычуга темно-бурого цвета. Кишечник геморрагически воспален, как со стороны серозной, так и слизистой оболочки. Содержимое кишечника с буроватым оттенком.
У ягнят мукороз протекает с признаками диареи (в водянистых испражнениях - сгустки крови). Ягнята погибали на 5-8-й день с момента появления признаков заболевания. На секции отмечали катарально-геморрагическое воспаление, язвы слизистой оболочки сычуга и кишечника и поверхностные некрозы, в рубце и сетке выявляли резко отграниченные глубокие некрозы, вплоть до полного прободения стенки.
Мукорозы поросят месячного возраста на секции характеризовались язвами, геморрагическими инфарктами и глубокими некрозами стенки желудка. Инфаркты имели круглую форму, отчетливо различимые даже со стороны серозной оболочки желудка. Содержимое кишечника во всех случаях было кровянистым. Гистологически гриб выявлялся во всей толще стенки желудка и в кровеносных сосудах.
Язвенные поражения желудка, вызванные грибами этого рода, были зарегистрированы и у кроликов.
Лабораторная диагностика
Наибольшее скопление грибов отмечали на границе пораженной и здоровой ткани. Гифы гриба выявляли в тканях и кровеносных сосудах рубца. Обращала на себя внимание особенность морфологии гриба в тканях. В толще слизистой оболочки мукор сильно вегетировал, что указывало на его активное размножение, в мышечной оболочке и подслизистом слое – выявляли в виде обрывков нитей с вздутиями на концах гиф и по их длине.
Мицелий грибов рода Mucor в нативном материале - широкий (20 и более микрон), несептированный и ветвящийся.
Комплексные эпизоотологические и лабораторные исследования патологического материала позволили разработать методические подходы к постановке диагноза при кандидозе, аспергиллезе и мукорозе телят.
Для дифференциальной диагностики основных висцеральных микозов телят мы использовали ряд показателей, которые отражают основные отличительные признаки данных болезней:
Возраст заболевших телят:
кандидозы – до 1 месяца, реже старше;
аспергиллезы и мукорозы – все возрасты.
Клинические признаки:
кандидозы – диарея, фекалии с пузырьками газа, беловатые хлопья, аппетит нередко сохранен, температура тела нормальная, болезнь может протекать до 2-х недель, истощение, больные больше обычного лежат, облысение кожи задних конечностей.
аспергиллезы – диарея, фекалии со слизью, с примесью сгустков крови, частые тенезмы, может быть пневмония, температура тела повышена, кашель, больные больше обычного лежат, истощение, плохой аппетит.
мукорозы – изнурительная диарея, фекалии чаще водянистые, с примесью фибрина и крови, истощение.
Морфология грибов в фекалиях больных телят:
кандидозы – в виде почкующихся дрожжевидных клеток и псевдомицелия диаметром 2-4 мкм; нити гриба бывают длинными, по бокам удлиненные, клетки до 7-10 мкм; фрагментов гриба больше в беловатых хлопьях.
аспергиллезы – при наличии обширных поражений преджелудков гриб обнаруживается постоянно в виде уродливо ветвящихся нитей с поперечными перегородками, размером 3-5 мкм; можно одновременно видеть и органы плодоношения гриба; особенно много гиф гриба в некротических массах.
мукорозы – гифы гриба широкие (до 20 мкм), ветвистые, с зернистыми включениями, не имеют поперечных перегородок (несептированный мицелий).
Наиболее частая локализация поражений:
кандидозы – рубец, сетка, книжка, пищевод, ротовая полость.
аспергиллезы – рубец, книжка, сычуг, легкие.
мукорозы – рубец, книжка, сычуг.
Характер поражений:
кандидозы – творожистоподобные наложения и изъязвления слизистой оболочки переднего отдела пищеварительного тракта; стенка преджелудков утолщена, а со стороны серозной оболочки бугриста.
аспергиллезы – язвы в рубце и сычуге с валиковидными приподнятыми краями и розоватым ободком; отмечаются и некрозы; содержимое кишечника кровянистое; в легких – беловатые гранулемы размером до горошины и более, в бронхах – фибринозно-геморрагический экссудат; на серозных покровах сычуга кровоизлияния.
мукорозы – язвы в сычуге, геморрагические инфаркты в стенке преджелудков и сычуга, иногда фибринозно-геморрагические воспаления этих же органов; очаги инфарктов заметны и со стороны серозной оболочки преджелудков и сычуга кольцевидной формы.
Материал для микроскопических исследований:
кандидозы – творожистоподобные наложения со слизистой оболочки ротовой полости, пищевода, преджелудков.
аспергиллезы – соскоб из стенки или дна язв, из очагов некроза, гранулемы легких, слизь бронхов и бронхиол.
мукорозы – соскоб из стенки или дна язв, инфильтрат из толщи слизистой и из очагов инфарктов.
Характеристика колоний при высеве фекалий и пораженной ткани на агар:
кандидозы – круглые, белые, выпуклые, гладкие или складчатые, сметанообразные, иногда с дочерними микроколониями по периферии.
аспергиллезы – воздушный мицелий зеленовато-голубоватый с беловатой каймой по периферии, с возрастом колонии темнеют; органы плодоношения в виде пузыревидных утолщений с конидиями по периферии; рост строго на месте нанесения капель фекалий или кусочков ткани.
мукорозы – воздушный мощный мицелий, высокий, быстро растущий, беловатый, в последующем дымчатый; быстро закрывает всю поверхность агара; органы плодоношения круглые, крупные с конидиями внутри; рост на месте капель фекалий и на кусочках ткани.
Гистологические изменения:
кандидозы:
а) в преджелудках – лейкоцитарные инфильтраты, некроз и отторжение пластами плоского многослойного эпителия, единичные микроабсцессы (только в эпителии).
б) изменения в сычуге встречаются редко (в основном только при ассоциированных микозах).
аспергиллезы:
а) в преджелудках – множественные микроабсцессы и деструкция слизистой оболочки, некроз и отторжение сосочков.
б) в сычуге – на месте язв подслизистый слой резко увеличен, инфильтрирован лимфоидными клетками и эритроцитами.
мукорозы:
а) в преджелудках – обширные некрозы; воспалительная реакция слабо выражена; микроабсцессов не бывает.
б) в сычуге – слизистая оболочка некротизирована, в подслизистом слое на границе с мышечным слоем нередко мощная зона из скопления клеточных элементов.
Наиболее частая локализация грибов и особенности их морфологии в тканях:
кандидозы – обнаруживаются в плоском многослойном эпителии слизистой оболочки преджелудков, больше на верхушках и периферии сосочков, но иногда и в их основе в виде пучков псевдомицелия с отпочковывающимися круглыми или удлиненными клетками.
аспергиллезы – врастают в слизистую оболочку в различных направлениях; обнаруживаются во всех слоях стенки преджелудков, в кровеносных сосудах, в гранулемах легких; гриб ветвистый с вздутиями на концах и по ходу мицелия; в толще тканей гриб органы плодоношения не образует.
мукорозы – всегда обнаруживаются в кровеносных сосудах; в тканях нередко выявляются шаровидные образования с короткими гифами голубоватого цвета, напоминает полые трубки; органы плодоношения в тканях не образует.
Экспериментальные кандидозы, аспергиллезы и
мукорозы
Особенности течения микозов при различных путях заражения
Кандидозы.
Для воспроизведения кандидоза лабораторных животных заражали спорами трехсуточной агаровой культуры патогенного штамма C.albicans (№74-70) с концентрацией 3х109 спор/мл. Объем вводимой суспензии для морских свинок и кроликов 1см3. При пероральном способе заражения животным на слизистую ротовой полости предварительно апплицировали ампициллин из расчета 50000ЕД на 1кг живой массы один раз в день три дня подряд перед скармливанием культуры патогенного штамма C. albicans. Пероральное заражение только культурой заболевание вызывало крайне редко. Клинические признаки заболевания животных: отказ от корма, угнетение, взъерошенность шерстного покрова, отмечали после внутривенного (внутрисердечного) заражения на 2-3-е сутки, после перорального – на 5-е сутки. Гибель морских свинок после внутрисердечного заражения была на 5-6-е сутки, кроликов после внутривенного – на 6-9-е сутки. После перорального заражения в состоянии истощения морские свинки гибли на 9-10-е сутки, кролики – на 15-16-е сутки.
Аспергиллез.
При внутривенном заражении кроликов культурой штамма A. fumigatus №21-91 дозе 1х106 спор/мл и объеме 1см3 первые признаки заболевания аспергиллезом регистрировали на 3-4-е сутки, которые проявлялись снижением аппетита до полного его отсутствия, вялостью и тусклостью шерстного покрова. За 24-36 часов до гибели наблюдали парезы задних конечностей, смерть наступала через 3-7 суток после появления первых клинических признаков, и сопровождалась судорогами и параличами задних конечностей.
С целью усиления патогенного действия аспергилл подопытным кроликам также апплицировали ампициллин в тех же дозах и по той же схеме, что и при заражении грибами рода Candida. В результате было достигнуто течение заболевания, повторяющее основные характеристики естественного переболевания животных аспергиллезом.
После перорального заражения клинические признаки появлялись через одну-две недели после последнего заражения или за 7-10 дней до гибели. Падеж кроликов сопровождался признаками нарушения функций центральной нервной системы (судороги и параличи). Во всех случаях отмечали расстройство пищеварения, проявляющееся диареей. У некоторых выживших животных течение болезни принимало хроническую форму. При данной форме болезни наблюдали парезы задних конечностей, тонические и клонические судороги различных групп мышц. Выжившие кролики имели меньшую (на 30-40%) массу тела и сниженный аппетит.
Нами предложен интрагастральный способ заражения кроликов с помощью медицинского уретрального катетера. Использование катетера позволило доставлять культуру возбудителя аспергиллеза непосредственно в желудок, а также проводить дозирование заражающего материала. Для возникновения заболевания достаточно было трехкратного введения смывов культуры штамма (№21-91) A. fumigatus, перед кормлением, в объеме 10 см3 и содержанием спор 1х106клеток/мл. Интрагастральное заражение, как правило, характеризовалось расстройством пищеварения и теми же клиническими признаками, что и при пероральном инфицировании.
Признаками заболевания при аэрогенном заражения были: слизисто-гнойные истечения из носовых ходов, отставание в весе на 10-15% по сравнению с контролем.
Мукороз.
При внутривенном заражении кроликов в дозе 1х106спор/мл и объеме суспензии 1см3 первые признаки заболевания мукорозом проявлялись на 4-5-е сутки после введения культуры вирулентного штамма № 55-91 M. racemosus. Клинические симптомы были схожи с аспергиллезом и характеризовались сильным угнетением и нарушением координации движения. Животные погибали через 4-7 суток после появления первых признаков заболевания.
Алиментарное заражение с одновременной дачей антибиотика (ампициллина) вызывало диарею, угнетение, снижение аппетита и массы тела и гибель до 30% кроликов через 20-37 суток. Первые симптомы заболевания проявлялись через 7-10 дней после последнего (третьего) заражения. При интрагастральном заражении заболевание сопровождалось диареей и снижением массы кроликов на 20-30%.
Аэрогенное заражение вызывало хроническое течение.
Таким образом, клиническая картина висцеральных микозов, а также исход заболеваний зависят от способов и путей заражения.
Оценка гематологических, иммунологических и биохимических показателей в зависимости от способов заражения возбудителями висцеральных микозов
Кандидоз.
При внутривенном заражении исследования крови проводили на 4-5-е сутки после инфицирования. Было отмечено, что в этот период болезни содержание гемоглобина снижается со 132 до 111 г/л. Количество сегментоядерных лейкоцитов уменьшается с 34 до 14%. Отмечено и понижение уровня Т-общ. лимфоцитов с 56 до 48%; Т-с. лимфоцитов с 19до 4%; В-лимфоцитов с 10 до 6% и -глобулина с 20 до 15%. В то же время зарегистрировано повышенное количество лейкоцитов с 5,4 до 7,1х109/л. ; увеличение числа моноцитов с 4,1 до 12,3; лимфоцитов с 55,5 до 66,8%; Т-акт. лимфоцитов с 39,7 до 47,1%; Т-х. лимфоцитов с 37,1 до 42,7%, соотношения Тх/Тс с 2,1 до 9,3; ЦИКов с 2,1 до 5,9 у.е., -глобулинов с 6,4 до 7,1%.
При пероральном заражении и аппликации ампициллина анализ крови проводили на 10-12-е сутки после инфицирования. У кроликов в этот период было зарегистрировано снижение числа сегментоядерных лейкоцитов с 31,7 до 14,4%, а так же В-клеточных лимфоцитов с 11,4% до 6,1%; общего белка с 68,4 до 46,9%; глобулинов с 36,1 до 31,4% и его фракций. Отмечено и повышение: количества эритроцитов с 5,9 до 6,8х1012/л содержания гемоглобина со 128 до 140 г/л; количества лейкоцитов с 6,2 до 7,1х109/л; палочкоядерных лейкоцитов с 3,8 до 6,7%; моноцитов с 5,8 до 12,6%; лимфоцитов с 56,2 до 64,1%; Т-общ. с 52,7 до 64,1%; Т-акт. с 34,1 до 53,7%; Т-х. с 35,8 до 48,6%, соотношения Тх/Тс с 2,3 до 7,4% и ЦИКи с 1,3 до 4,8у.е.
Аспергиллез.
При внутривенном заражении аспергиллами исследования крови проводили на 5-6-е сутки после инфицирования. При этом было установлено, что количество эритроцитов не значительно увеличивается, оставаясь в границах физиологической нормы (с 5,1 до 6,3х1012/л), отмечен также и лейкоцитоз (с 6,7 до 9,0х109/л). В лейкоформуле – базофилия (с 0,2 до 2,3%), моноцитоз (с 4,3 до 18,2%) и нейтропения со сдвигом ядра влево.
Иммунологическими исследованиями установлено увеличение всех исследуемых популяций Т-лимфоцитов (кроме Т-с): Т-общ. с 35,1 до 60,7%; Т-акт. с 23,4 до 42,6%; Т-х с 23,4 до 57,6%; соотношение Тх/Тс с 2,3 до 13,6; уровень Т-с практически не изменялся. Прежние показатели были и при определении количества В-лимфоцитов. При исследовании белка установлено нарушение альбумино-глобулинового соотношения, причем увеличение глобулинов происходило за счет повышения и фракций и лишь незначительно -глобулинов. Отмечен повышенный уровень ЦИКов (с 1,2 до 14,6у.е.). Остальные показатели значимо не изменялись.
При аэрогенном заражении исследования крови проводили через 20-25 суток после завершения трехкратного аэрозольного инфицирования кроликов. Установлено, что к этому времени происходит снижение количества эритроцитов (с 5,5 до 4,6х1012/л); лейкоцитов – с 6,7 до 4,0х109/л; гемоглобина – с 147 до 116 г/л, достоверного снижения цветного показателя не отмечено. В лейкоформуле – моноцитоз (с 4,3 до 10,2%); лимфоцитоз (с 63,1 до 78,7%).
Исследования иммунологических показателей выявили увеличение Т-общ. лимфоцитов (с 48,5 до 71,8%); Т-акт. – с 36,7 до 53,9%; Т-х. – с 39,8 до 63,8% и ЦИКов – с 1,1 до 12,0 у.е. При исследовании белка установлено нарушение альбумино-глобулинового соотношения, причем увеличение глобулинов происходило за счет повышения и фракций и лишь незначительно -глобулинов. Остальные показатели (Т-с, В-л) практически не изменялись.
Течение заболевания и изменения ряда показателей крови кроликов при интрагастральном заражении аспергиллами имеет свои особенности. Количество эритроцитов наоборот увеличивалось (с 5,9 до 7,2х1012/л), то же самое происходило и с лейкоцитами (с 5,4 до 6,7х109/л) и с содержанием гемоглобина (с 124 до 142 г/л). В лейкоформуле – слабо выраженное увеличение палочкоядерных с одновременным снижением количества сегментоядерных нейтрофилов.
Выявлено увеличение Т-общ. лимфоцитов, Т-акт., Т-х. и ЦИКов. Содержание В-лимфоцитов не изменялось. Установлено снижение уровня общего белка крови за счет сокращения доли альбуминовой фракции. Количество глобулинов повышалось за счет увеличения всех фракций.
Мукороз.
При внутривенном заражении мукором анализ крови проводили на 5-6-е сутки после инфицирования. Исследования показали, что изменения гематологических показателей схожи с нарушениями в составе крови, отмеченные при аспергиллезе, вызванном интравенозным способом заражения, то есть также происходило увеличение количества эритроцитов (с 5,0 до 6,2х1012/л), лейкоцитов – с 6,4 до 8,9х109/л; незначительным снижением количества гемоглобина. В лейкоформуле отмечена нейтропения с возрастанием числа палочкоядерных лейкоцитов и моноцитоз (с 4,2 до 14,5%).
При оценке результатов исследований иммунологических и биохимических показателей установлено повышение уровня Т-общ. (с 37,5 до 60,2%); Т-акт. – с 24,0 до 53,0%; Т-х. с 25,5 до 67,8%; соотношения Т-х./Т-с. c 2,2 до 7,8 и В-лейкоцитов с 1,9 до 10,8%, а также возрастание ЦИКов с 0,9 до 13 у.е. Отмечено снижение содержание Т-с. лимфоцитов с 12 до 7,7%.
Изменения показателей крови кроликов, через 20-25-е сутки после аэрогенного заражения, характеризовались снижением количества эритроцитов с 5,1 до 4,0х1012/л; гемоглобина – с 139 до 109 г/л, лейкоцитов – с 6,0 до 4,0х109/л. В лейкоформуле – моноцитоз (с 2,3 до 9,7%) и нейтропения.
Увеличение Т-общ. составило с 50,4 до 73,5%; Т-акт. с 26,5 до 55,3%; Т-х. с 38,1 до 67,8%; ЦИКов с 1,1 до 12,0%. Субпопуляция Т-с. сокращалась в среднем в 2 раза. Повышение уровня глобулинов происходило за счет равномерного увеличения всех составляющих фракций.
Интрагастральное заражение вызывало ответную реакцию, схожую с аспергиллезом, однако, выражена она была несколько сильнее.
Таким образом, ответная реакция макроорганизма, проявляющаяся изменениями гематологических, иммунологических и биохимических показателей зависит от вида возбудителя микозов и от путей заражения.
Локализация поражений и тканевая реакция при экспериментальных кандидозах, аспергиллезах и мукорозах в зависимости от способов заражения
Кандидоз.
У животных, павших от перорального заражения возбудителем кандидоза и скармливания антибиотика ампициллина, изменения выявлены, в основном, в пищеварительном тракте в виде рыхлых наложений на его слизистой оболочке. При гистологическом исследовании слизистой оболочки ротовой полости обнаруживали дистрофически измененные эпителиальные клетки, пронизанные нитями псевдомицелия гриба Candida. На слизистой оболочке пищевода кроме псевдомицелия выявили почкующиеся клетки возбудителя, слущенный эпителий и лейкоциты. Гистологическая структура желудка от внедрения в нее гриба была резко нарушена. Морфологически гриб представлял собой ветвящийся мицелий с отпочковавшимися клетками. Отмечено врастание гриба в кровеносные сосуды желудка. В кишечнике выявлена десквамация эпителия, однако, элементов гриба не обнаружено. Во всех пораженных участках желудочно-кишечного тракта макроскопически выявляли инфильтраты, микроскопически представляющие собой скопление лимфоцитов, нейтрофилов и эозинофилов.
У животных, павших от внутрисердечного заражения, основные изменения обнаружены в респираторных органах, сердце, печени и почках. В стенках бронхов и легочных альвеолах выявлены десквамированные клетки эпителия, фрагменты псевдомицелия и макрофаги. В патологически измененных участках эндокарда и почек отмечали элементы гриба и клетки белой крови.
Аспергиллез.
После внутривенного заражения и гибели кроликов основные изменения обнаруживали в легочной ткани, бронхах и бронхиолах. В легких зарегистрирована абсцедирующая некротическая пневмония, в бронхах – катаральное воспаление. При микроскопических исследованиях пораженных участков тканей легких в клетках инфильтрата в большом количестве обнаруживали фрагменты мицелия грибов со скоплением лимфоцитов, макрофагов и гистиоцитарных клеток. Кроме легочной ткани в патологический процесс были вовлечены и паренхиматозные органы: печень, почки, селезенка. В них отмечена выраженная сосудистая реакция в виде геморрагий от токсического воздействия метаболитов гриба. На почках выявлены множественные гранулемы размером с просяное зерно. Микроскопическими исследованиями гранулем установлено, что состоят они из элементов гриба и лейкоцитов. У отдельных животных на сердце обнаружены инфильтраты, состоящие из лимфоидных клеток.
После перорального заражения мицелием и спорами гриба и дачи антибиотика ампициллина основные изменения обнаружены в желудке. На его слизистой оболочке отмечено ярко выраженное катарально-десквамативное воспаление. В пораженных участках желудка выявили фрагменты мицелия гриба Aspergillus и скопление лимфоидных клеток. Некоторые нити мицелия представляли собой лишь истонченные контуры из-за лизиса их фагоцитами.
Обнаружены, несмотря на пероральный способ заражения, изменения и в респираторных органах. Отмечена интерстициальная пневмония. Междольковые и межальвеолярные перегородки были расширены и инфильтрированы клеточными элементами, альвеолы заполнены фибринозно-геморрагическим экссудатом. На значительных участках ткани легкого выявляли гранулемы с некротическим распадом.
После аэрогенного заражения поражения локализовались в легочной ткани. Стенки бронхиол и кровеносных сосудов легких были проросшими мицелием гриба. Отмечали большое скопление мицелия под пульмональной плеврой. В воспалительном экссудате выявляли, в основном, гигантские клетки.
Мукороз.
После внутривенного заражения в легочной ткани, бронхиальных и средостенных лимфоузлах отмечены гранулематозные поражения. В тканях легких обнаружены макрофаги и нейтрофильные лейкоциты. Макроскопически во всех долях легких выявлены геморрагические инфаркты. В печени и на почках – опухолевидные уплотнения. В тканях почек обнаружено большое скопление лейкоцитов и элементов гриба Mucor.
Поражения после перорального заражения: слизистая оболочка желудка была набухшей и инфильтрированной серозным экссудатом. На отдельных участках выявлялись некрозы. В подслизистом слое вокруг кровеносных сосудов обнаружен мицелий. Некоторые сосуды были заполнены гифами гриба.
После аэрогенного заражения патоморфологические изменения обнаружены в легочной ткани, сердце и почках. Характер поражений был схожий с патогистологическими изменениями при внутривенном заражении, но были менее выражены. Клеточная реакция на внедрение гриба проявлялась появлением гигантских клеток, лимфоцитов и скоплением их в месте локализации возбудителя.
Таким образом, грибы в пораженных тканях органов обнаруживаются только в мицелиальной форме (без конидий). В слизистых оболочках грибные нити мицелия окружены макрофагами, нейтрофилами и лимфоидными клетками. Нити грибов в отдельных ее участках выявляются в виде контуров, что свидетельствует об их лизисе макрофагами.
Особенности фагоцитоза грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor in vitro et in vivo
Установлено, что общим для всех изучаемых грибов является активная роль нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов, которые фагоцитировали мелкие фрагменты грибов (конидии, бластоспоры). Гифы же грибов уничтожали гигантские клетки. Исследования иммуноклеточных реакций у телят при висцеральных микозах показали, что разрушение грибов, проникших в их организм, протекает с определенной закономерностью. Вначале грибные гифы облепляются тромбоцитами, функцию фагоцитов берут на себя нейтрофильные лейкоциты и макрофаги, затем в процесс фагоцитоза подключаются лимфоидные клетки, которые лизируют гифы грибов с помощью ферментов (протеолитических и др.). Гриб при этом разрушается на фрагменты, мелкие фагоцитируются нейтрофильными лейкоцитами и макрофагами, а крупные – гигантскими клетками.
Таким образом, фагоцитоз микроскопических грибов протекает несколько специфически. Аспергиллы, мукор и кандида из-за своих больших размеров разрушаются не только и не столько самими клетками-фагоцитами, а в основном лизируются за счет ферментов, секретируемых лимфоцитами.
Ассоциированное действие грибов и бактерий на организм животных
При выделении из патматериала авирулентной культуры C. albicans и слабовирулентного штамма E. coli, но продуцирующего термолабильный токсин и последующем ассоциированном заражении мышей в 80% случаев результат биопробы был положительный. Аналогичные результаты были получены при сочетанном заражении мышей авирулентными штаммами A. fumigatus, M. racemosus и слабовирулентными культурами эшерихий, стафилококков и стрептококков.
Усиление патогенного действия ассоциаций различных грибов, их токсинов, и кокковых бактерий на лабораторных животных установлено в экспериментах на белых мышах при внутрибрюшинной инокуляции им различных сочетаний микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.
При ассоциированном введении белым мышам токсинов плесневых грибов или эшерихий и апатогенных микроорганизмов (E. coli, A. fumigatus, M. racemosus) наступала их гибель. Наиболее выраженной вирулентностью обладала ассоциация: A. fumigatus и токсин E. coli.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при выделении из патологического материала апатогенных (слабопатогенных) штаммов грибов и бактерий необходимо учитывать возможное ассоциативное действие микроорганизмов и их токсинов на организм животных.
Культурально-морфологические и патогенные свойства штаммов грибов C. albicans, A. fumigatus и M. racemosus, выделенных из патологического материала и кормов.
Объектами выделения грибов были слизистые оболочки ротовой полости, языка, пищевода и преджелудков, а также из экссудата пораженных четвертей вымени, молока и фекалий больных телят. Выделено 126 штаммов гриба С. albicans.
В 1994 году получен штамм C. albicans, который был выделен от теленка 22-х дневного возраста и в последующем был использован при конструировании вакцинных препаратов.
По культурально-морфологическим свойствам штамм C. albicans № 253 был представлен овальными (2:1) клетками с хорошо заметными вакуолями и небольшими ядрами.
На агаре Сабуро через 48 часов культивирования при температуре 280С образовывались выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями. На 5-е сутки культивирования колонии - гладкие матовые, с кремовым оттенком, но со слегка волнистыми краями.
При культивировании на жидких питательных средах через 48 часов заметно помутнение бульона и образование компактного осадка.
Ферментативная активность штамма проявлялась на полужидкой среде Гисса с углеводами: с глюкозой и мальтозой – образованием кислоты и газа, сахарозой – только кислоты, а с лактозой активность не проявлялась.
При внутривенном и внутрибрюшинном введении белым мышам культуры штамма в дозе 1х109спор/см3 и объеме 0,5 мл, а морским свинкам внутрисердечно в дозе 3х109спор/см3 и объеме 2,0 мл гибели животных не вызывало. Внутримышечное введение кроликам в дозе 3х109спор/см3 и объеме 5,0 мл вызывало местную гиперемию с небольшим отеком прилежащих тканей, проходящую через 48-96 часов.
Штамм C. albicans №253 депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) г. Москва, как вакцинный.
Объектами выделения грибов A. fumigatus были язвенно-некротические поражения пищеварительного тракта, гранулемы легких, фекалии больных телят и поросят, а также грубые и концентрированные корма, контаминированные аспергиллами. Выделено 216 штаммов гриба.
В 1991 году получен штамм A. fumigatus, который был выделен из фекалий больного теленка 1,5 месячного возраста и в последующем был использован при конструировании вакцинных препаратов. По культурально-морфологическим свойствам данный штамм A. fumigatus №6 характеризуется следующими признаками:
Морфологически аспергиллы были представлены ветвящимися переплетающимися гифами 3-5 мкм ширины с поперечными перегородками. Органы плодоношения имеют фляжкообразные утолщения на концах гиф с цепочками спор по периферии. В окрашенных по Граму мазках аспергиллы представлены в виде грамположительных гиф и их фрагментов.
При культивировании штамма на агаре Сабуро через 24-48 часов роста при 370С образуется беловатый, пушистый налет. Через 72-96 часов вырастает массивная колония круглой формы с зеленовато-голубоватым оттенком в центре и беловатой каймой по периферии. В бульоне Сабуро на 3-и сутки культивирования отмечается поверхностный рост культуры бархатистого вида темно-зеленого цвета.
Вирулентные свойства штамма изучены методом заражения нелинейных белых мышей. Внутрибрюшинное введение культуры штамма в концентрации до 1х108спор/см3 и объеме 0,5 мл гибели мышей не вызывает. При внутривенном введении культуры в объеме 0,5 мл LD100 – 1х108спор/см3, LD50 – 1х107спор/см3, LD0 – 5х106спор/см3. Гибель при LD100 и LD50 на 2-5-е сутки.
В дальнейшем штамм A. fumigatus №6 исследован и депонирован в Центре эпизоотического бюро ВГНКИ и классифицирован как вакцинный.
При выделении из патологического материала и кормов культур M. racemosus и последующем инкубировании при 370С на питательных средах установлено, что большинство штаммов через 3-е суток на агаре Сабуро формируют объемные пушистые колонии с мощным, хорошо развитым воздушным мицелием сероватого цвета. В бульоне Сабуро к 3-м суткам отмечали поверхностный рост культуры в виде плотных дисков с менее развитым мицелием и образованием на дне пробирки ватоподобного осадка.
Объектами выделения грибов M. racemosus служили участки желудочно-кишечного тракта с язвенными поражениями, фекалии с примесью фибрина и крови, а также грубые и концентрированные корма с признаками поражения плесневыми грибами. Всего было выделено 295 штаммов гриба.
В 1991 году получен штамм M. racemosus, который был изолирован при высеве фекалий от теленка 15-ти дневного возраста с симптомами диареи. Данный штамм в дальнейшей работе использовался как продуцент антигенов, обладающих иммуногенными свойствами.
По морфологическим свойствам штамм, которому в центре эпизоотического бюро ВГНКИ г. Москва был присвоен порядковый номер 195, характеризовался хорошо развитым несептированным мицелием, имеющим ширину до 20 мкм на всем протяжении нитей. Кроме того, штамм отличался активно ветвящимся мицелием. Спорангиеносцы гриба прямолинейные, все спорангии шаровидные, без апофизы.
При культивировании штамма на агаре Сабуро при 370С рост гриба проявляется через 24 часа в виде беловатого, пушистого налета. Через 72 часа формируется объемная пушистая колония с мощным, хорошо развитым мицелием белого цвета с серо-черными вкраплениями. В бульоне Сабуро к 3-м суткам культивирования в пробирках отмечается поверхностный рост в виде плотных «войлочных» дисков с развитым мицелием и одновременным образованием ватоподобного осадка.
Вирулентные свойства штамма определены с использованием белых мышей и крыс. Установлено, что внутрибрюшинное введение 3-х суточной культуры в объеме 0,5 мл и концентрации спор 1х107 в см3 гибели белых мышей не вызывает, LD50 – 5х107спор/см3, LD100 – 1х108спор/см3 (гибель на 4-5сутки). Внутривенное заражение белых крыс в объеме 1,0 мл и концентрации спор от 1х106 до 1х107 в см3 вызывает гибель на 3-и сутки, а в дозе 7х107 в см3 – на 2-е сутки у 100% животных.
Штамм M. racemosus №195 депонирован после проведения комиссионных испытаний в ВГНКИ г. Москва и в дальнейшей работе использовался при конструировании вакцинных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных.
Научно обоснованная система противомикозных
мероприятий
Разработка средств специфической профилактики и прижизненной диагностики кандидоза, аспергиллеза и
мукороза
Сравнительная оценка культуральных свойств авирулентных штаммов грибов при выращивании их на различных питательных средах
Основной целью экспериментов являлась оценка питательных сред по скорости роста, получению высокого «урожая» мицелия, поддержания жизнеспособности и выживаемости, а также устойчивого уровня спорогенеза грибов и выяснение зависимости иммунобиологических свойств получаемых антигенов от сроков культивирования и фазы развития микромицетов, выращиваемых на различных по составу субстратах.
В течение 45-ти суточного культивирования отмечали динамику роста и развития грибов, как на жидких, так и на плотных питательных средах. В экспериментах испытывали жидкие и плотные среды Сабуро, Чапека, Городковой, дрожжевой и запаптентованные нами (с использованием солевого раствора Хенкса)
Так на бульоне Хенкса количество спор гриба уже к 3-м суткам культивирования, по сравнению с бульоном Сабуро, было в 1,5 раза больше. К 6 суткам это соотношение достигало уже двукратной разницы. Однако максимальное количество спор (на бульоне Сабуро – 3х107клеток/см3, а на бульоне Хенкса – 5х107клеток/см3) было выявлено к одному периоду времени инкубирования – 9 суткам. В последующем на всех средах отмечалась тенденция угасания спорогенеза. На бульоне Сабуро к 45-м суткам количество спор по сравнению с пиком спорообразования (9-15 сутки) было меньше в 4,8 раза, а на Хенкса - в 4,1 раза. Хотя и к этому времени количество спор на бульоне Хенкса оставалось в 2 раза больше, чем на среде Сабуро.
При анализе спорогенеза отмечаемого на агаризованных средах установлено, что к 3-м суткам на агаре Сабуро количество спор было выше, чем на субстрате Городковой (в 1,7 раза) и на Хенкса (в 1,2 раза). Однако на всех последующих этапах инкубирования наиболее интенсивное спорообразование шло на агаре, приготовленном с использованием солевого раствора Хенкса. Пик спорообразования на этой среде зафиксирован на 12-е сутки культивирования (1х108клеток/см3), тогда как к этому времени на агаре Сабуро количество спор было 7х107 в см3, а на субстрате Городковой - 5х107клеток/см3.
Жизнеспособность и выживаемость гриба C. albicans на разных питательных средах была различной. Наиболее эффективной признана среда с компонентами солевого раствора Хенкса (табл. 2.1).
Таблица 2.1.
Жизнеспособность и выживаемость C. albicans шт. №253
| Питательный агар | Разведение | |||||||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |||
Жизнеспособность | Выживаемость % | |||||||
| Городковой | + | + | + | + | + | + | 48,0 | |
| Сабуро | + | + | + | + | + | - | 12,7 | |
| Хенкса | + | + | + | + | + | + | 67,3 | |
На плотной питательной среде с использованием солевого раствора Хенкса максимальный пик спорообразования депонированного штамма гриба C. albicans №253 зафиксирован к 12-м суткам культивирования. К этому же времени колонии гриба, представляющие собой как споры, так и псевдомицелий, имели характерный вид и были представлены клетками, обладающими высокой жизнеспособностью и выживаемостью при последующих пересевах на свежие питательные среды.
При выращивании гриба A. fumigatus шт. №6 на плотных питательных средах первые признаки развития в виде мелких полупрозрачных образований отмечали через 6-8 часов на агаре Хенкса, через 8-10 часов на агаре Сабуро и Чапека и через 12-14 часов на дрожжевом агаре.
В бульонах первые признаки роста гриба отмечали при культивировании на питательном субстрате Сабуро через 14-18 часов, дрожжевом и Хенкса – через 18-22 часа, на Чапека – через 24-28 часов после посева.
После первых 3-6-ти суток культивирования наиболее интенсивный процесс спорообразования идет на среде Сабуро. Однако к 9-м суткам по формированию спор уже бульон Хенкса превосходит все остальные среды. В этот же период зафиксирован первый пик максимального спорогенеза на бульонах Сабуро и Хенкса. Второй пик спорообразования на этих же средах отмечается к 12-м суткам (увеличение количества спор в 2 и 2,5 раза соответственно). Во все последующие временные отрезки уровень спорогенеза и его стабильность наиболее высоки на бульоне Хенкса.
Исследования по динамике спорогенеза на плотных питательных средах показали, что культивирование аспергилл на агарах способствует большему «урожаю» спор, но меньшему выходу мицелиальной массы.
Максимальное количество спор образуется уже к шестым суткам культивирования на всех испытуемых средах, за исключением дрожжевого агара, где пик спорообразования отмечен на 18-е сутки. Фаза максимального спорогенеза на агаре Чапека продолжается 12 суток, на Сабуро и Хенкса – 9 дней, на Дрожжевой среде - трое суток. Пиковые значения формирования спор затем сменяются фазой угнетения спорогенеза и одновременным прекращением роста и развития мицелия, что в первую очередь связано с постепенным обеднением среды и накоплением продуктов метаболизма гриба. На некоторых средах (Сабуро, Хенкса) зафиксирована повторная «вспышка» спорообразования на 33-36-е сутки культивирования с последующим резким снижением количество спор и визуально заметной инволюцией мицелия, что связано с тотальным обеднением питательных свойств субстрата.
Таким образом, при сравнении характера роста по признакам спорогенеза и формированию мицелия на жидких и плотных питательных средах можно сделать вывод, что агаризованные среды способствуют как спорогенезу, так и накоплению грибницы. Однако, при культивировании аспергилл в бульонах процесс спорообразования идет более плавно, как при достижении пиковых значений (на Сабуро к 15-м суткам, на других средах к 21-му дню), так и при понижении уровня спорогенеза. Кроме того, продукты метаболизма и аутолизиса гриба, на плотных средах диффундируют в агар, тогда как в бульонах они всегда остаются в составе культуральной жидкости.
Анализ выживаемости и жизнеспособности спор A. fumigatus №6 на 30-е сутки в сравнении с пиковыми значениями спорогенеза дал следующие результаты.
На агаре Чапека живых спор было - 12%, на дрожжевом – 17%, Сабуро – 39%, Хенкса – 48%. Жизнеспособность спор в на свежей аналогичной среде отмечена во всех случаях до разведении 10-5 включительно.
На бульоне Чапека сохранность спор составила 15%, на дрожжевом – 23%, на Сабуро – 48%, на Хенкса – 56%. Жизнеспособность спор проявлялась до разведения 10-5 на всех испытуемых средах.
При культивировании гриба M. racemosus №195 на плотных питательных средах визуальное проявление начала формирования колоний происходило следующим образом: на дрожжевом агаре – через 8-10 часов после посева, на Сабуро и Хенкса – через 10-12 часов, на Чапека – через 16-18 часов. Скорость формирования грибницы проходила аналогичным образом. Сохранность спор гриба также зависела от питательного субстрата и составляла 13%; 45%; 51% и 46% на агаре Чапека, Сабуро, дрожжевом и Хенкса соответственно. Жизнеспособность спор была на уровне результатов, полученных в опытах по культивированию аспергилл.
Визуально начало развития гриба M. racemosus в бульонах характеризовалось помутнением среды и образованием культуральной пленки. На среде Чапека через 22-24 часа, Хенкса 16-20 часов, Сабуро – 12-14 часов, дрожжевой – 10-12 часов. Сохранность спор в бульонах составляла на среде Чапека – 14%, на Сабуро – 43%, на Дрожжевой и Хенкса – 50-51%. Показатель выживаемости имел значение – 10-5.
Полученные результаты наблюдений по другим культуральным свойствам грибов так же, прямо или косвенно, подтверждают оптимальность той или иной питательной среды. Однако, исходя из поставленной задачи – получение высокоактивных антигенов оптимальными питательными средами были признаны субстраты Сабуро и приготовленные на основе растворов Хенкса. Данные среды наиболее универсальны и позволяют в более короткие сроки и с большей долей постоянства получать клетки грибов (обильную мицелиальную массу с достаточно высоким выходом спор). Применение этих же сред для хранения штаммов грибов позволяет проводить пересевы не чаще одного раза в месяц с сохранением достаточной степени жизнеспособности и выживаемости клеток грибов.
При изучении влияния объемов питательных сред на рост и развитие грибов, что в пробирках уже через 20-24 часа происходит образование поверхностной культуральной пленки. Количество спор увеличивается постепенно. После 68-72 часов культивирования отмечается резкая скачкообразная вспышка спорогенеза с интенсивным развитием мицелия, особенно в 48-56 часовых культурах.
При культивирование грибов в бутылях отмечена задержка формирования культуральной пленки на 12-16 часов и интенсивный спорогенез (до 6-х суток у мукора и до 9-ти – у аспергилл), по сравнению с малыми (пробирочными) объемами.
Таким образом, существенное влияние на характер роста и направленность метаболизма оказывают не только состав и агрегативное состояние питательных сред, но и их объемы.
Получение антигенов из культур грибов: С. albicans, A. fumigatus и
M. racemosus
Установлено что самым эффективным и щадящим является способ разрушения клеток грибов ультразвуковой дезинтеграцией. Использование дезинтегратора с воздействием ультразвуковых волн в пределах 10-20 кГц, экспозиции 10-60 мин, в зависимости от объема культуральной жидкости, позволяло разрушать не менее 90% клеток грибов Candida и 50-60% - Aspergillus и Mucor. После разрушения мембран грибов для освобождения от поврежденных стенок и целых клеток использовали мембранные пластины типа «Владипор – МФА №3».
Разработка способа лабораторной оценки антигенов культур грибов
C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 реакцией специфической агломерации лейкоцитов
Способ оценки иммуногенности культур грибов и антигенов из них, с использованием реакции специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) основана на усилении склеивания (агломерирования) лейкоцитов крови донора при внесении антигена in vitro. Феномен агломерации, как и усиление амебовидной подвижности нейтрофилов, является первой фазой реакции клеток белой крови на антиген.
Методика постановки РСАЛ включает в себя несколько этапов. Вначале проводят подбор животных – доноров крови, с наименьшей естественной (физиологической) агломеративной способностью. Стабилизированную кровь разливают по 0,2 мл в пробирки Флоринского, добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки в рабочем разведении 1:20, встряхивают и инкубируют при 370С в течение 1 часа.
Кровь из пробирок наносят на предметные стекла и делают тонкие мазки, которые подсушивают при комнатной температуре и фиксируют в метиловом спирте не менее 3 минут. Зафиксированные мазки окрашивают 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут. Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении х450 в нескольких полях зрения и подсчитывают не менее 1000 лейкоцитов, учитывая при этом количество склеенных (агломерированных) клеток белой крови. Для каждого животного подсчитывают не менее 5 мазков.
Агломерированными считают те лейкоциты, которые склеиваются в количестве не менее трех. Кролик, кровь которого обладает наименьшей естественной агломерированной способностью, но не более 4%, используется в качестве донора. Кровь кролика-донора в последующем используют для иммунологической оценки культур грибов по индексу агломерации лейкоцитов.
Предварительно суспензии культур грибов разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего производят разрушение клеточной стенки спор и мицелия ультразвуком. Антигены в объеме 0,04 мл вносят в стабилизированную кровь и выполняют вышеописанные действия, с обязательной постановкой контролей. Контролями служат параллельная постановка реакций:
a) со стабилизированной кровью донора, антигеном, а вместо комплемента – физиологический раствор хлорида натрия.
б) стабилизированная кровь донора, комплемент, а вместо антигена – физиологический раствор хлорида натрия. При этом индекс в РСАЛ (А и Б) не должен превышать 4%.
Исследованиями антигенов культур грибов C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 установлено, что агломеративная способность лейкоцитов при постановке реакции подвержена колебаниям в зависимости от возраста культур и плотности используемых для их выращивания питательных сред (бульоны или агары). Так для получения антигенов из грибов Candida предпочтительней использовать агаризованную среду с компонентами солевого раствора Хенкса, а для продуцирования иммуноактивных АГ грибов Aspergillus и Mucor – бульоны Хенкса. Низкий уровень агломерации лейкоцитов отмечен в пробах культур C. albicans шт. №253 с АГ 5, 6, 9, 12 и 18-ти суточных агаровых культурах. Наиболее низкий индекс зафиксирован в РСАЛ с АГ 6-ти суточной культурой – 6,0%. Наименьший показатель в РСАЛ отмечен у АГ 5-9 суточных бульонных культур – 7-8%. При постановке реакции с АГ агаровых культур аспергилл и мукора индекс агломерации лейкоцитов находился в пределах 9-32%, что значительно выше, чем у грибов Candida. Однако, АГ аспергилл, извлеченные из 15-ти суточных бульонных культур имели показатели в РСАЛ – 7,9%, а АГ гриба Mucor в 12-ти суточных культурах всего 6,9%.
Конструирование иммуногенных и аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов: C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6),
M. racemosus (шт. №195)
Значительный разброс в показателях агломеративной способности грибов свидетельствовал об изменении антигенного состава кандиды, аспергилл и мукора в зависимости от возраста культур. Поэтому следующим этапом исследований было изучение иммуногенных и аллергогенных свойств АГ грибов с учетом значений индекса в РСАЛ.
С этой целью готовили препараты из АГ, давшие наименьшие и наибольшие показатели в РСАЛ. Для получения иммуногенных препаратов АГ подвергали воздействию формальдегида в 0,4% концентрации в течение 3-х недель. При изготовлении аллергенов АГ консервировали 0,25% раствором фенола.
Исследования препаратов кожно-аллергической пробой проводили на кроликах, зараженных теми или иным возбудителям висцеральных микозов. Аллергены вводили внутрикожно на 3-6 день после заражения. Учет реакции проводили через 24, 48 и 72 часа после введения аллергенов. АГ, имевшие в РСАЛ наиболее высокий индекс (свыше 20%), у больных аспергиллезом давали увеличение кожной складки 6-11 мм с ярко выраженной гиперемией, у больных мукорозом 5-9 мм, у зараженных возбудителем кандидоза – 3-4 мм. Использование в качестве аллергенов АГ с показателями в РСАЛ ниже 15% давало слабо выраженную реакцию, проходящую в течение 24 часов.
Внутримышечное введение препаратов, приготовленных по технологии вакцин из АГ, имевших различный индекс в РСАЛ, дало прямо противоположные результаты. АГ, имевшие показатели в РСАЛ от 6 до 16%, обладали наибольшей иммуногенной активностью, обеспечивая при этом высокий уровень защиты кроликов и морских свинок при их последующем контрольном заражении.
Следует подчеркнуть, что величина индекса в РСАЛ в 6-% получена при культивировании C. albicans шт. №253 на агаре Хенкса в течение 6-ти суток при t0 280C, а A. fumigatus шт. №6 и M. racemosus № 195 при выращивании их в бульоне Хенкса при t0C 370С в течение 15 и 12 суток соответственно (в матрасах и бутылях).
Таким образом, исходя из вышеизложенного, АГ грибов Candida (шт. №253) при величине индекса агломерации в РСАЛ (6-10%) проявляли иммуногенные свойства, АГ грибов Aspergillus (шт. №6) при 6-16%, АГ грибов Mucor (шт. №195) при показателях в 6-15%. При величине в РСАЛ свыше 16%, вакцинные свойства грибов снижались, а их аллергенная активность наоборот возрастала.
Технология получения иммуногенных препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и M. racemosus (шт. №195)
В результате проведенных исследований разработана унифицированная технология изготовления противомикозных вакцин.
Получение вакцины против кандидоза и оценка ее иммуногенности
- Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 280С в течение 3-х суток. Затем культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают на матрасы с питательным агаром, приготовленным с использованием солевого раствора Хенкса. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 280С в течение 6-ти суток. Полученную культуру смывают дистилированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор (обычно колеблется в пределах 8х108-1х109спор/см3). Концентрацию спор затем доводят до 4,5х108-5,5х108 м. т. в см3 дистиллированной водой.
- Выделяют АГ из клеточной стенки и цитоплазмы полученной суспензии гриба, используя метод разрушения микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора больших объемов – «Solana» (Erlan industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют при длине волны 10-20 кГц и экспозиции 60 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА-МА №3 при помощи вакуумнасоса. Полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белковополисахаридных антигенов.
- Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов.
Для этого фильтрат разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл антигенсодержащего материала и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 370С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем служат пробирки с антигеном, а вместо комплемента - тот же объем физиологического раствора и стабилизированную кровь кролика. Другим контролем служат пробирки со стабилизированной кровью кролика, комплемент морской свинки и изотонический раствор хлорида натрия, вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 370С в течение 45 минут.
Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают, а затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут.
Окрашенные мазки просматривают при увеличении микроскопа х450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных в конгломерат в количестве не менее 3). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 10% от общего числа подсчитанных 100, АГ считаются потенциально иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы по созданию вакцины.
- К АГ, имеющим индекс в РСАЛ 6-10%, добавляют формалин в конечном разведении смеси – 0,4%.
- В АГ – формалиновый комплекс вносят адъювант – 6% раствор гидроокиси алюминия в соотношении 10:1.
- Комплекс: АГ – формалин – адъювант помещают в термостат и инкубируют при температуре 370С в течение 21 суток.
- На конечном этапе проводят оценку иммуногенных свойств вакцины.
Для этого полученный препарат вводят в дозе: мышам и морским свинкам – по 0,5 мл и кроликам – 1,5 мл внутримышечно. Вакцину вводят двукратно с 7-10-ти дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации.
Оценку напряженности иммунитета проводят с использованием внутривенного заражения для кроликов и мышей и внутрисердечного для свинок. Для заражения используют бласто- и хламидоспоры трехсуточной вирулентной культуры C. albicans с концентрацией 3х109спор в 1см3 и объеме: мышам и морским свинкам – по 0,5 мл и кроликам – по 1 мл.
Для серологической оценки гуморального иммунитета используют реакцию преципитации (РП) и иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства НПО «Аквапласт» (г. Санкт-Петербург). Кровь для исследований берут от иммунированных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Титр специфических АТ в РП достигает значений 1:8-1:16, в ИФТС-1:3125.
Получение вакцины против аспергиллеза и оценка ее иммуногенности
Технология приготовления вакцины против аспергиллеза аналогична способу получения противокандидозного препарата, за исключением:
- Используется штамм гриба A. fumigatus №6, который вначале также засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 370С в течение 3-х суток. Количество засеваемых пробирок делается из расчета – 1 пробирка на 1 литр бульона, приготовленного на растворе Хенкса. Дальнейшее культивирование проводят в 10-ти литровых микробиологических бутылях при t0 370C в течение 15-ти суток. Определяют концентрацию спор. «Урожай» спор обычно достигает: 2,5-3,0х108 клеток на 1см3.
- Выделение АГ аналогично описанному в получении АГ из грибов Candida.
3. Ход проведения оценки полученных АГ идентичен описанному при анализе АГ грибов Candida. Однако АГ считаются иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы при индексе в РАЛ от 6 до 16%.
- К АГ, имеющим агрегативную способность 6-16%, добавляют формалин.
- Аналогично, как и при приготовлении вакцины против кандидоза.
- Аналогично, кандидозной вакцины.
- Оценка иммуногенных свойств вакцины. Вакцину вводят кроликам внутримышечно в дозе 2,5 мл двукратно с 8-10-ти дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации. Учитывая, что в естественных условиях возбудитель аспергиллеза проникает в организм алиментарным путем, поражая при этом органы пищеварительного тракта, оценку напряженности иммунитета проводят с использованием перорального заражения кроликов, вакцинированных по описанной выше схеме. С помощью интрагастрального зонда в желудок кроликов вводят культуру вирулентного штамма A. fumigatus с концентрацией возбудителя 1,0х106спор/см3 и в объеме вводимой суспензии клеток гриба – 10,0 мл.
У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, расстройство пищеварения, явления угнетения нервной системы) проявляются через 3-4 суток после заражения. Гибель интактных кроликов наступает через 3-6 суток после появления первых клинических признаков болезни. У вакцинированных животных клинические симптомы заболевания отсутствуют.
Серологическую оценку гуморального иммунитета проводят также с использованием РП и ИФТС. Кровь для исследований берут от иммунизированных и для контроля от интактных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Титр специфических АТ в РП достигает значений 1:8-1:16, в ИФТС - 1:3125.
Получение вакцины против мукороза и оценка ее иммуногенности
Технология приготовления вакцины против мукороза во многом аналогична способу получения противоаспергиллезного препарата. Однако имеются и различия:
1. Используется штамм гриба M. racemosus №195. После культивирования в бульоне Хенкса в течение 12-ти суток «урожай» спор обычно колеблется в пределах 0,5-0,6х106спор/см3.
2, 3, 4, 5 и 6 этапы выполняются аналогично описанным в способе приготовления вакцины против аспергиллеза.
7. Оценку иммуногенных свойств полученного препарата проводят на кроликах. Вакцину вводят внутримышечно двукратно в дозе 2,5 мл. Интервал между введениями 7-10 дней. Напряженный иммунитет наступает через 2 недели после реиммунизации. Контрольное заражение проводят перорально культурой вирулентного штамма M. racemosus c концентрацией спор возбудителя 1,0х106спор/см3 и в объеме вводимой суспензии клеток гриба – 10,0 мл.
У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, диарея, симптомы расстройства в центральной нервной системе и т.д.) проявляются на 5-7 сутки после заражения. Гибель животных на 10-20 сутки после появления признаков заболевания. У вакцинированных животных признаки болезни отсутствуют или проявляются снижением аппетита и быстропроходящей диареей).
Серологическую оценку гуморального иммунитета проводят постановкой только РП из-за отсутствия других методов. РП с сывороткой крови иммунизированных животных достигает значений 1:8 - 1:16, а интактных - не выше 1:4.
Антигены, использованные для конструирования кандидозной, аспергиллезной и мукорозной вакцин были подвергнуты биохимическим исследованиям. Результаты исследований представлены в таблицах 2.2-2.4.
Таблица 2.2.
Характеристика антигенов грибов по липидному составу
| № п.п. | Наименование и состав компонентов | Антигены | ||
| A. fumigatus №6 | M. racemosus №195 | C. albicans №253 | ||
| 1. | Общее содержание липидов, % | 2,24 | 2,05 | 0,22 |
| Содержание кислот в % к общим липидам | ||||
| 2. | Линолевая кислота | 1,50 | 11,5 | 2,05 |
| 3. | Линоленовая кислота | 5,31 | 3,77 | 5,22 |
| 4. | Олеиновая кислота | 76,8 | 66,5 | 76,2 |
| 5. | Насыщенные кислоты | 17,9 | 14,7 | 15,8 |
Таблица 2.3.
Характеристика антигенов грибов по составу углеводов
| № п.п. | Наименование углеводов | Антигены | ||
| количество углеводов, мг% | ||||
| A. fumigatus №6 | M. racemosus №195 | C. albicans №253 | ||
| 1. | Моносахариды | 0,24 | 49,1 | 49,5 |
| 2. | Дисахариды | 1395 | 1379 | 14,0 |
| 3. | Полисахариды | н/о | н/о | 76,0 |
Таблица 2.4.
Характеристика антигенов грибов по полипептидному составу
№ п.п. | Наименование компонентов | Антигены | ||
| A. fumigatus №6 | M. racemosus №195 | C. albicans №253 | ||
| Состав компонентов, мг % | ||||
| 1. | Общий азот | 31,2 | 28,8 | 3,7 |
| 2. | Полипептиды с М. м. > 10 кД | 134,2 | 12,4 | 86,4 |
| 3. | Полипептиды с М. м. 5,0 – 10 кД | 8,1 | 7,1 | 1,1 |
| 4. | Полипептиды с М. м. 1,5-5,0 кД | 20,0 | 21,4 | 2,5 |
| 5. | Полипептиды с М. м. < 1,5 кД | 142,8 | 128,5 | 17,1 |
Белки антигенов гриба A. fumigatus шт. №6 имели основные пептиды с М. м. 15,25,35,75 и 100 кД.
В антигенах грибов M. racemosus №195 превалировали белковые структуры с М.м. 75-50 кД., а также незначительное количество с М. м. 25 кД.
Белки грибов C. albicans шт. №253 были представлены в основном полипептидами с молекулярной массой 75 кД.
В исследованных образцах большее количество пептидов приходилось и на низкомолекулярные соединения (М.м.<1500Д и от 1500 до 5000Д).
Технология получения аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и
M. racemosus (шт. №195) и испытание их на лабораторных животных.
При проведении сравнительной оценки спорообразования было установлено, что максимальное количество спор при культивировании C. albicans (шт. №253) формировалось к 18-21-м суткам (2х109спор/см3), A. fumigatus (шт. №6) к 6-9-м суткам (3х108спор/см3) и M. racemosus (шт. №195) к 18-м суткам (8х107спор/см3). В указанные сроки коэффициент РСАЛ у всех изучаемых грибов достигал значений не менее 21-23%.
Получение кандидозного аллергена
- Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 280С в течение 3-х суток. Выросшую культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают в матрасы также с агаром Сабуро. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 280С в течение 18-21-х суток. Полученную культуру смывают дистиллированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор. Количество спор обычно колеблется в пределах 2 млрд 100 млн – 2 млрд 200 млн спор/см3.
- Выделяют АГ используя ультразвуковой дезинтегратор. Воздействие дезинтегратора осуществляют при длине волны 20 кГц и экспозиции 90 минут. Освобождение от разрушенных и неразрушенных вегетативных и споровых клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор МФА-МА №3» при помощи вакуум насоса. Отфильтрованный дезинтеграт содержит АГ гриба.
- Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов. При наличии агломерированных лейкоцитов не менее 20% и выше АГ считаются аллергенными.
- К АГ, имеющим коэффициент в РСАЛ 20% и выше, добавляют в качестве консерванта раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.
- На конечном этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на белых мышах.
Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом C. albicans в дозе 1х106спор/см3 и объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно с внутренней стороны бедра в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят через 24-48 и 76 часов. В качестве контроля используют интактных животных. У зараженных возбудителем кандидоза мышей через сутки отчетливо выражена гиперемия, повышенная температура кожи в месте введения аллергена и увеличение кожной складки на 1-3 мм, которая сохраняется не менее трех суток. У интактных мышей через 24 часа на месте введения аллергена реакция отсутствует.
Получение аспергиллезного аллергена
Технология приготовления аспергиллезного аллергена аналогична способу получения кандидозного препарата за исключением:
- Используется штамм гриба A. fumigatus № 6, который вначале также на 3-е суток засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют при 370С, а затем в матрасах в течение 6-9 суток и достижения «урожая» спор 300 млн клеток/см3.
2-3 п.п. Выделение АГ и их оценку проводят аналогично описанному выше при работе с грибом C. albicans.
- К АГ с коэффициентом в РСАЛ 20% и выше в качестве консерванта вносят раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.
- На последнем этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на лабораторных животных.
Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом A. fumigatus в дозе 1х106спор/см3 в объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично описанному при испытании кандидозного аллергена.
Получение мукорозного аллергена
- Используется штамм гриба M. racemosus №195. Полученный посевной материал после трехсуточного культивирования при 370С в пробирках засевают в матрасы и инкубируют еще 18 суток. Концентрация спор к этому времени достигает 80 млн клеток/см3.
2-4 п.п. Выполняются аналогично описанным при работе с грибами
C. albicans и A. fumigatus.
5. Оценку аллергенных свойств полученного препарата проводят также с использованием белых мышей. Для этого на 3 суток после внутрибрюшинного заражения вирулентным штаммом M. racemosus в дозе 1х106спор/см3 и объеме 0,5 мл аллерген белым мышам вводят в дозе 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично кандидозного аллергена. Биохимический состав аллергенов представлены в таблицах 2.5-2.6.
Таблица 2.5.
Характеристика антигенов (аллергенов) грибов по составу полипептидов
| № п.п. | Наименование компонентов | C. albicans, шт. №253 | A. fumigatus, шт. №6 | M. racemosus, шт. №195 |
| количество, мг% | ||||
| 1 | Общее содержание азота | 10,7 | 64,3 | 59,1 |
| 2 | Полипептиды с Мм > 250 кД | 51,4 | 156,3 | 149,1 |
| 3 | Полипептиды с Мм 150-250 кД | 31,6 | 53,1 | 49,4 |
| 4 | Полипептиды с Мм 50-150 кД | 2,6 | 4,3 | 4,1 |
| 5 | Полипептиды с Мм < 50 кД | 0,8 | 2,0 | 1,4 |
Таблица 2.6.
Состав и свойства аллергенов грибов
| Род, вид и штамм гриба | Общее содержание липидов, % | Соотношение белок/углеводы |
| C. albicans, шт. №253 | 0,29 | 1/4 |
| A. fumigatus, шт. №6 | 12,6 | 1/3 |
| M. racemosus, шт. №195 | 11,4 | 1/2 |
Антигены гриба C. albicans (шт. №253) отличаются от АГ плесневых грибов (M. racemosus шт. №195 и A. fumigatus шт. №6) по общему содержанию белкового азота. Соотношение же полипептидов с различной молекулярной массой (М.м.) примерно равное у АГ всех грибов. Основные пептиды аллергенов имеют М.м. > 250 кД.
В составе аллергенов как дрожжеподобных, так и плесневых грибов отмечено повышенное содержание липидных компонентов.
При отработке дозы внутрикожно вводимых аллергенов было установлено, что оптимальный объем - 0,2 мл. При этой дозе отчетливая кожно-аллергическая реакция проявляется в 100% случаев у зараженных возбудителем того или иного микоза. Постановка кожно-аллергических проб возможна уже на 2-3 сутки после заражения. Учет реакции можно проводить через 24 часа после инъецирования аллергенов. Оптимальный срок – 48-72 часа.
У больных аспергиллезом кроликов увеличение кожной складки варьирует от 6 до 11 мм с ярко выраженной гиперемией, у больных мукорозом от 5 до 9 мм, у зараженных возбудителем кандидоза от 3 до 6 мм. У ммунизированных мукорозной и аспергиллезной вакциной кожно-аллергическая проба (КАП) тоже дает положительную реакцию, проявляющуюся увеличением складки на 3-4 мм. У кроликов, иммунизированных противокандидозным препаратом, реакция на введение аллергена выражается покраснением, повышением местной температуры и незначительным увеличением кожной складки. Аллергическая реакция у вакцинированных тем или иным препаратом кроликов сохраняется не менее трех месяцев после иммунизации. Перекрестное введение аллергенов не давало ложноположительных результатов. У кроликов с хроническим течением микозов КАП проявлялся в течение двух месяцев болезни. У клинически здоровых животных испытуемые аллергены не давали положительных реакций.
Изучение аллергенных, пирогенных и реактогенных свойств противогрибковых вакцин
Для изучения пирогенных и реактогенных свойств вакцин, тест-дозу в объеме 1 см3 вводили внутривенно (Г.Ф. ХI, выпуск 2, с. 183).
Испытания проводили на 15 клинически здоровых кроликах. Вакцины вводили в краевую ушную вену. Разница в температурах до введения препаратов и после не превышала ±0,2оС на всем протяжении испытаний.
Реактогенность препаратов определяли методом клинических визуальных наблюдений и исследований. Отклонений от физиологических показателей отмечено не было.
Аналогичные исследования проводились на 20 клинически здоровых телятах и 60 поросятах. Возраст телят от 1 до 4-х месячного, поросят - 1-3 месяца.
Аллергенность препаратов изучали внутрикожным введением в дозах от 0,1 до 0,5 мл. Пирогенные и реактогенные свойства экспериментальных вакцин изучали внутривенным введением в дозе 1 см 3.
После внутривенного введения вакцин, каких-либо изменений в состоянии животных, а также в их поведении не отмечали. Динамика нарастания массы тела животных в опытных и контрольных группах не различались. Физиологические показатели животных (температура тела, пульс, частота дыхания, а также частота сокращения рубца у телят), опытных групп соответствовали контрольным. Гибели животных опытных групп не отмечали.
Однократное подкожное и внутримышечное введение телятам (возраст 3 мес.) кандидозной вакцины в дозе от 1 до 10 мл., и поросятам (возраст 4 мес.) в дозе от 1 до 5 мл., а также аспергиллезной и мукорозной вакцины в дозе от 1 до 5 мл., изменений в физиологических показателях и поведении не вызывало.
Установлено, что подкожное инъецирование в отдельных случаях вызывает припухлость в месте введения препаратов, которая исчезает в течение 6-12 часов при использовании объемов вакцин менее 5 мл. и в течение 18-24 часов при дозе от 5 до 10 мл.
Двух- и трехкратное инъецирование препаратов с интервалом между введениями в 5 - 10 дней телятам в дозе от 1 до 5 мл. в возрасте 1 – 4 мес. (ж.м. 30 - 60 кг.), а также поросятам в дозе от 1 до 3 мл. в возрасте 1 – 2 мес. (ж.м. от 6 до 30 кг), реактогенностью, пирогенностью и аллергенностью не обладало.
Гематологические, иммунологические и биохимические показатели у лабораторных и сельскохозяйственных животных, вакцинированных противокандидозными, противоаспергиллезными и противомукорозными препаратами.
Исследования крови кроликов проводили до вакцинации и через 14 дней после реиммунизации. Вакцины вводили внутримышечно в дозах – 1,5 мл. Интервал между вакцинациями – 7- 10 дней.
Установлено, что изменения после введения кандидозной вакцины характеризуются повышением количества: гемоглобина на 8 г/л, лейкоцитов на 0,8х109/л; увеличением относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов с 4,6 до 5,8%, моноцитов с 2,8 до 3,4%, при снижении количества эозинофилов с 2,2 до 1,6% и базофилов – до 0 (не определены).
Изменение тех же показателей крови кроликов после реиммунизации аспергиллезной вакциной имели аналогичный характер: увеличение содержания гемоглобина на 8 г/л, количества лейкоцитов – на 1,0х109/л, моноцитов с 4,8 до 6,0% и снижение эозинофилов с 2,2 до 1,8%.
После вакцинации кроликов мукорозной вакциной обнаружено достоверное увеличение содержания гемоглобина крови на 5 г/л, лейкоцитов на 0,7х109/л, моноцитов с 6,2 до 7,6% и снижение содержания эозинофилов с 2,2 до 1,8%.
Иммунологические и биохимические исследования крови кроликов после вакцинации противокандидозными препаратами характеризовались повышением общего количества Т-лимфоцитов – на 7,6%, Т-активных клеток – на 7,2%, Т-хелперов – на 9,6%, ЦИКов – на 4 у.е., снижением Т-супрессоров – на 2%. Отмечено падение уровня альбуминов – на 13%, при соответствующем возрастании глобулиновой фракции (13%), -глобулинов - на 3,6%, -глобулинов – на 7,8%. После двукратной иммунизации кроликов аспергиллезной вакциной изменения иммунологических и биохимических показателей были следующими: отмечено увеличение содержания Т-лимфоцитов – на 7,8%, Т-активных – на 7,8%, Т-хелперов – на 10,6%, соотношение Т-х/Т-с возрастало на 3,2%, ЦИКов – на 3,2% при снижении Т-супрессоров на 3,0%.
Изменение соотношения белковых фракций выражалось в снижении альбуминов – на 9,8%, с соответствующим увеличением глобулинов – 9,8%, -глобулинов - на 4,0%, -глобулинов – на 6,0%.
Биохимические показатели крови после иммунизации мукорозной вакциной были следующими: снизилось содержание альбумина на 14,2% и соответственно увеличилось относительное содержание глобулинов: -глобулинов - на 3,8%, -глобулинов – на 9,8%.
Иммунологические показатели в поствакцинальном периоде: общее содержание Т-лимфоцитов возросло на 5,8%, Т-активных – на 12,8%, Т-хелперов – на 11,8%, ЦИКов – на 4,0у.е.; снизилось содержание Т-супрессоров на 5,8%; соотношение Т-х/Т-с увеличилось на 5,0 единиц.
Иммунологические и биохимические показатели крови морских свинок, иммунизированных противокандидозными препаратами, выражались увеличением общего количества Т-лимфоцитов - на 8,8%, Т-активных – на 6,6%, В-лимфоцитов – на 4,4%. Биохимическими исследованиями зафиксировано снижение уровня альбуминов – на 6,6%, увеличением общего белка плазмы – на 5,6%, -глобулинов – на 6,6% и -глобулинов – на 6,0%.
После двукратной иммунизации морских свинок аспергиллезной вакциной отмечено нарастание общего количества Т-лимфоцитов – на 5,8%, Т-активных - на 7,2%. В биохимических показателях крови произошло снижение альбуминовой фракции на 10,4% при одновременном увеличении глобулинов (-глобулинов - на 2,4%, -глобулинов – на 4,8%.
Анализ полученных данных свидетельствует об активизации иммунокомпетентных клеток после введения как кандидозной, так и аспергиллезной и мукорозной вакцины. Повышение уровня -глобулиновой фракции подтверждает наличие иммуногенных свойств препаратов. Низкий уровень эозинофилов свидетельствует об отсутствии аллергенности препаратов.
Влияние двукратного внутримышечного, с интервалом между инъекциями в 7 дней в дозах 3-5,0 мл. противомикозных вакцинных препаратов на гематологические ииммунологические показатели клинически здоровых телят представлены в табл. 2.7.
Приведенные данные свидетельствуют, что препараты, приготовленные из грибов Candida, Aspergillus и Mucor стимулируют иммунную систему клинически здоровых телят.
Таблица 2.7.
Результаты гематологических и иммунологических исследований
Группы телят | Показатели | |||||
| эритроциты 1012/л | лейкоциты 109/л | гемоглобин, г/л | общ. лимфоциты, 109/л | Т-лимфоциты, % | В-лимфоциты, % | |
| До введения препаратов | 5,85+ 0,28 | 6,5+ 0,52 | 113,4+ 4,6 | 4,22+ 0,41 | 11,2+ 0,85 | 2,22+ 0,16 |
| После введения кандидозного препарата | 6,87+ 0,25 | 7,9+ 0,43 | 113,8+ 0,42 | 5,6+ 0,47 | 13,9+ 0,92 | 3,34+ 0,18 |
| После введения аспергиллезного препарата | 7,1+ 0,33 | 8,3+ 0,55 | 113,4+ 4,2 | 5,8+ 0,46 | 14,6+ 1,22 | 3,51+ 0,23 |
| После введения мукорозного препарата | 7,05+ 0,28 | 8,25+ 0,53 | 113,6+ 4,9 | 5,62+ 0,54 | 14,43+ 1,24 | 3,46+ 0,27 |
Отмечается как абсолютное увеличение лимфоцитов (от 32,7 до 37%), так и Т-лимфоцитов (от 24 до 30%) и В-лимфоцитов (от 50,4 до 58%). Количественное увеличение лейкоцитов (от 21,5 до 27%) также свидетельствует о повышении резистентности животных. Отмечается и незначительное увеличение количества эритроцитов (от 17,4 до 20,5%), однако, содержание гемоглобина крови при этом не меняется.
Испытание экспериментальных вакцин и аллергенов, полученных из грибов в условиях хозяйств, неблагополучных по кандидозу, аспергиллезу и мукорозу сельскохозяйственнных животных.
Испытания экспериментальных вакцин проводились в хозяйствах, где ранее на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и микологических исследований патматериала и кормов был поставлен диагноз – висцеральный микоз той или иной этиологии.
Аналогично экспериментам, поставленным на морских свинках и кроликах, препараты против кандидоза, аспергиллеза и мукороза испытывались на сельскохозяйственных животных с использованием различных доз, путей введения (подкожный и внутримышечный), и кратности (одно, двухкратно), с интервалом между инъекциями в 7 – 10 дней. Экспериментальные вакцины испытывались на клинически здоровых, больных и подозрительных в заболевании телятах и поросятах 1 – 5 месячного возраста (табл. 2.8-2.10).
Таблица 2.8.
Оценка способов и кратности иммунизации сельхозживотных противокандидозной вакциной
Вид и возраст животных | Доза, мл | Способ введения | Титры АТ в ИФТС: | ||
до иммунизации (контроль) | после 1-й иммунизации | после 2-й иммунизации | |||
Телята (1-2 мес.) | 1,0 – 3,0 | п/к | 1:400 | 1:800 | 1:1600 |
| в /м | 1:800 | 1:1600 | |||
| Телята (2-3 мес.) | 2,0 – 4,0 | п/к | 1:400 | 1:800 | 1:1600 |
| в/м | 1:1600 | 1:1600 | |||
Телята (3-5 мес.) | 5,0 – 10,0 | п/к | 1:400 | 1:800 | 1:1600 |
| в/м | 1:1600 | 1:3200 | |||
Поросята (1-2 мес.) | 1,0 – 2,0 | п/к | 1:400 | 1:800 | 1:1600 |
| в/м | 1:1600 | 1:3200 | |||
Таблица 2.9.
Оценка способов и кратности иммунизации сельхозживотных противоаспергиллезной вакциной
Вид и возраст животных | Доза, мл | Способ введения | Титр АТ в ИФТС: | ||
| до имм-ции (контроль) | после 1-й имм-ции (опыт) | после 2-й имм-ции (опыт) | |||
Телята (1-2 мес.) | 1,0 – 2,0 | п/к | 1:400 | 1:800 | 1:1600 |
| в/м | 1:800 | 1:1600 | |||
Телята (2-3 мес.) | 2,0 – 3,0 | п/к | 1:400 | 1:800 | 1:1600 |
| в/м | 1:1600 | 1:3200 | |||
Телята (3-5 мес.) | 3,0 – 5,0 | п/к | 1:400 | 1:1600 | 1:3200 |
| в/м | 1:1600 | 1:3200 | |||
Поросята (1-2мес.) | 1,0 – 2,0 | п/к | 1:400 | 1:800 | 1:1600 |
| в/м | 1:800 | 1:1600 | |||
Поросята (2-4 мес.) | 2,0 – 3,0 | п/к | 1:400 | 1:1600 | 1:3200 |
| в/м | 1:1600 | 1:3200 | |||
Таблица 2.10.
Оценка способов и кратности иммунизации сельхозживотных противомукорозной вакциной
Вид и возраст животных | Доза, мл | Способ введения | Титр АТ в РП: | ||
| до иммунизации (контроль) | после 1-й иммунизации (опыт) | после 2-й иммунизации (опыт) | |||
Телята (1-2 мес.) | 1,0 – 2,0 | п/к | 1:2 | 1:4 | 1:8 |
| в/м | 1:4 | 1:8 | |||
Телята (2-3 мес.) | 2,0 – 3,0 | п/к | 1:2 | 1:4 | 1:8 |
| в/м | 1:8 | 1:16 | |||
Телята (3-5 мес.) | 3,0 – 5,0 | п/к | 1:2 – 1:4 | 1:8 | 1:16 |
| в/м | 1:8 | 1:16 | |||
Поросята (1-2 мес.) | 1,0 – 2,0 | п/к | 1:2 | 1:4 | 1:8 |
| в/м | 1:4 | 1:8 | |||
Поросята (2-4 мес.) | 2,0 – 3,0 | п/к, в/м | 1:2 – 1:4 | 1:8 | 1:16 |
Примечание: п/к – подкожно; в/м – внутримышечно
Результаты испытаний противомикозных вакцин показали, что однократная иммунизация повышает уровень специфических АТ в 2 раза. Ревакцинация с интервалом между введениями в 7 – 10 дней повышает титр АТ до значений 1:1600 – 1:3200 при иммунизации кандидозной и аспергиллезной вакцинами (в контроле 1:400), а также мукорозной до разведений 1:8 – 1:16 (контроль 1:2 – 1:4). Наиболее предпочтительный способ введения внутримышечный, так как максимальные титры специфических АТ 1:3200 в ИФТС и 1:16 в РП на 14 день после ревакцинации были получены при данном способе иммунизации. Титры специфических АТ сохранялись на указанном выше уровне не менее 3-х месяцев (срок наблюдения).
В результате приведенных исследований установлено, что в зависимости от возраста и вида животных оптимальными дозами являются: противокандидозная вакцина телятам в возрасте: 1–2 месяца – 1–2,0 мл; 3-5 месяцев – 5,0 мл; поросятам в возрасте: 1-2 месяца – 1-2,0 мл; 2-4 месяца – 3,0 мл; противоаспергиллезная и противомукорозная вакцины телятам в возрасте: 1-2 месяца – 1-2,0 мл; 3-5 месяцев – 3,0 мл; поросятам в возрасте: 1-2 месяца – 1-2,0 мл; 2-4 месяца – 2,0 мл.
После проведения массовой иммунизации молодняка случаи возникновения заболеваний прекращались на период до 6 месяцев (срок наблюдений).
Испытания экспериментальных аллергенов проводились на клинически здоровых, спонтанно заболевших кандидозом, аспергиллезом и мукорозом телятах и поросятах, а также животных с клиническими признакими расстройства пищеварения невыясненной этиологии. Результаты испытаний аспергиллезного аллергена представлены в табл. 2.11.
Таблица 2.11.
Реакция на введение аспергиллезного аллергена
Группы животных | Вид животных | |||||
телята | поросята | |||||
увеличение кожной складки, мм (М±m) | ||||||
| через: | через: | |||||
| 24 ч | 48 ч | 72 ч | 24 ч | 48 ч | 72 ч | |
| Клинически здоровые | 1,0±0,1 | 1,0±0,1 | 0±0,0 | 1,3±0,1 | 1,2±0,1 | 1,0±0,1 |
| Больные аспергиллезом | 4,5±0,5 | 5,5±0,5 | 8,5±0,5 | 4,0±0,2 | 4,2±0,2 | 5,3±0,3 |
| Больные кандидозом | 1,0±0,2 | 1,0±0,2 | 0±0,0 | 1,3±0,1 | 1,2±0,1 | 1,1±0,1 |
| Больные мукорозом | 1,5±0,2 | 1,3±0,1 | 1,0±0,1 | 1,6±0,2 | 1,5±0,2 | 1,3±0,1 |
| Больные невыясненной этиологии | 1,0±0,1 | 1,0±0,1 | 0,5±0,1 | 1,0±0,1 | 1,0±0,1 | 0,5±0,1 |
Разработка способов лечения при аспергиллезе.
С целью поиска средств защиты животных от аспергиллеза было испытано влияние антигельминтиков на грибы рода Aspergillus. Было установлено, что вермокс, мебенвет и медамин из-за наличия в их составе активного компонента мебендазола не только задерживают рост грибов, но и обладают фунгицидными свойствами. При подтитровке наибольшую зону задержки роста аспергилл 30 мм обеспечивал медамин. Установлено, что для лечения животных больных аспергиллезом оптимальной ежедневной дозой является пероральная дача медамина из расчета 50 мг на 1 кг ж. м. При лечении телят и поросят 2- 4 месячного возраста в течение 7 дней выздоровление наступало у 100 % животных.
ВЫВОДЫ
1. В патологии сельскохозяйственных животных особое место занимают сапронозы, вызываемые микроскопическими грибами из рода Candida, Aspergillus и Mucor, протекающие в форме моно- и микстинфекций с поражением пищеварительной и дыхательной систем.
1.1. Источником возбудителя кандидоза, аспергиллеза и мукороза являются зараженные животные и контаминированные ими объекты окружающей среды (грубые, концентрированные и сочные корма, подстилочный материал, предметы ухода, оборудование). Передача возбудителей висцеральных микозов обусловлена естественными традиционными путями (алиментарным и респираторным).
2. Эпизоотическому проявлению спонтанных микозов сельскохозяйственных животных способствуют повышенная влажность в животноводческих помещениях, необоснованное и широкое применение противобактериальных антибиотиков.
3. Эпизоотический процесс при висцеральных микозах сельскохозяйственных животных отличается выраженным тропизмом, манифестацией и субпопуляционными границами.
3.1. Кандидоз наиболее часто поражает молодняк в раннем постнатальном периоде (до 2-х месячного возраста) с пораженим тех отделов пищеварительного тракта, слизистая оболочка которых выстлана плоским многослойным эпителием (ротовая полость, пищевод, рубец, сетка, книжка) и характеризуются творожистоподобными или пленчатыми наложениями.
3.2. Аспергиллез поражает животных всех возрастов с выраженными язвенно-некротическими поражениями пищеварительного тракта и гранулемами в легких, сопровождается абортами и отклонениями в мочеполовой системе.
3.3. Мукороз поражает животных всех возрастов с выраженными гранулематозными изменениями лимфатических узлов, изъязвлениями, инфарктами и инфильтратами слизистой оболочки пищеварительного тракта.
4. Манифестация экспериментальных висцеральных микозов животных характерна выраженными изменениями гомеостаза:
4.1. При кандидозе развивается лейкоцитоз (увеличивается количество лейкоцитов на 14,5 - 31 %, в том числе моноцитов в 2,17 - 3 раза, палочкоядерных - в 1,76 раза, лимфоцитов – в 1,14 – 1,2 раза, в том числе Т-акт. – в 1,18 - 1,57 раза, Т-хелперов – 1,15 – 1,35 раза); ЦИКов – в 2,8 – 3,7 раза, а также понижением количества сегментоядерных лимфоцитов в 2,2 – 2,4 раза, В-лимфоцитов в 1,6 – 1,87 раза и - глобулинов в 1,15 – 1,3 раза;
4.2. При аспергиллезе и мукорозе - лейкоцитоз, за счет увеличения всех субпопуляций Т-лимфоцитов в 1,47 – 1,6 раза и моноцитов в 2,3 раза.
5. Разработанная впервые технологическая схема получения биологически активных препаратов из микроскопических грибов, включающая отбор штаммов грибов с потенциальной способностью проявлять иммуногенные или аллергенные свойства на определенных стадиях их роста, с соблюдением параметров среды с потребностью грибов и параметров их культивирования, щадящую (ультразвуковую) технологию получения антигенов и их оценку на иммуногенность и аллергенность в РСАЛ (реакция специфической агломерации лейкоцитов), является эффективной и приоритетной.
5.1. Антигены полученные из биомассы грибов с превалированием спор и имеющие высокие (более 16%) коэффициенты в РСАЛ и обладающие наивысшей аллергогенностью, пригодны для изготовления специфических диагностикумов. Они, как правило, имеют высокую молекулярную массу (150-250 кД) и отличаются повышенным содержанием белкового азота липидов и полипептидов.
5.2. Антигены, полученные из биомассы грибов с превалированием вегетирующего мицелия, имеющие более низкий коэффициент в РСАЛ (менее 16%) и обладающие наибольшей иммуногенностью, пригодны для изготовления специфических вакцинных препаратов. Как, правило, они представлены белковыми полипептидами с М.м. от 10 до 100 кД, а также ди- и полисахаридами.
6. Двукратное введение животным противомикозных (противокандидозной, противоаспергиллезной и противомукорозной) вакцин активизирует их иммунную систему, способствует нарасстанию титра специфических антител в их крови, выявляемых в РП до 1:16, а в ИФА (ИФТС) до - 1:3125.
6.1. Иммунизация животных противокандидозной вакциной обеспечивает напряженный иммунитет как при внутривенном (внутрисердечном), так и при пероральном их заражении.
6.2. Иммунизация животных противоаспергиллезной и противомукорозной вакцинами обеспечивают 100% специфический иммунитет при пероральном и 40-50%- при внутривенном заражении.
7. У иммунизированных противомикозными вакцинами животных повышается уровень гемоглобина в крови на 5 – 8 г/л., лейкоцитов – на 0,7 – 1,09/л., в том числе палочкоядерных нейтрофилов в 1,2 – 1,26 раза и моноцитов в 1,2 раза; популяций Т-лимфоцитов - на – 5,8 – 7,8%, в том числе субпопуляций Т-акт. на – 7,2 – 12,8%, Т-х. на – 9,6 – 11,8%; глобулинов на – 3,8 – 13,0%, в том числе - глобулинов – на 6,0 – 9,8%; ЦИКов – на – 3,2 – 4,0 у.е.; снижается уровень эозинофилов и базофилов в 1,2 – 1,37 раза, а также Т-супрессоров - на – 2 – 5,8% и альбуминов – на 13 – 14,2%.
8. Препараты группы мебендазола обладают выраженным фунгистатическим и фунгицидным действием при аспергиллезе животных.
9. Внедрение в базовых хозяйствах Саратовской и Ульяновской областях научно обоснованной системы противомикозных мероприятий, основанных на лечении больных животных препаратами мебендазола, 2-х кратной иммунизации животных противомикозными вакцинами, обеззараживании природной среды, упорядочении применения противобактериальных антибиотиков подтвердило ее востребованность и эффективность.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ
- Лабораторная оценка антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor, на иммуногенность и аллергогенность с использованием реакции специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ), (Патент РФ №2176392г; Приор. 10.11.99г; опубл. 27.11.01г, Бюл. № 33).
- Методические рекомендации по определению иммуногенности и конструированию вакцинных препаратов против микозов сельскохозяйственных животных (Утв. РАСХН, г. Москва, 17.11.2000г).
3. Рекомендации по культивированию дрожжевидных и плесневых грибов с использованием питательных сред на основе раствора Хенкса, повышаюших выход спор и мицелия, а также способствующих повышению выживаемости и жизнеспособности микромицетов (Патент РФ №2111245; приор. 10.07.96г; опубл. 20.10.97г, Бюл. № 14 и Патент РФ №2093569; приор. 14.06.95г, опубл. 20.10.97г, Бюл. № 14).
4. Рекомендации по изготовлению противомикозных вакцин и аллергенов на основе использования штаммов: A. fumigatus №6, C. albicans №253 и M. racemosus №195, обладающих набором необходимых антигенов (Депонированы в ВГНКИ, г. Москва: 12.10.2001г.; 12.10.2001г. и 13.08.2002г. соответственно. Приоритет защищен (Патентами РФ: №2203940; опубл. 10.05.2003, Бюл. №13; №2209243; опубл. 27.07.2003г, Бюл. №21; №2248392; опубл. 20.03.2005г, Бюл. № 8).
5. Универсальная технология конструирования вакцин против кандидоза, аспергиллеза и мукороза сельскохозяйственных животных (Патент РФ №2217163; Приор. 19.02.2002г, опубл. 27.11.03г, Бюл. №33; Патент РФ №2230567; Приор. 06.06.2002г, опубл. 20.06.2004г, Бюл. №17; Патент РФ № 2270694; Приор. 24.08.2004г, опубл. 27.02.2006г.
6. Для лечения сельскохозяйственных животных, больных аспергиллезом рекомендуется использовать препараты, имеющие в своем составе мебендазол. (Патент РФ №2073512; приор. 21.03.95г; опубл. 20.02.97г, Бюл.№5;
7. Рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с висцеральными микозами и микотоксикозами сельскохозяйственных животных. Утв. Советом Ассоциации «Аграрное образование и наука МСХиП», Саратов, 2002г).
8. Методические рекомендации по диагностике, предупреждению и ликвидации висцеральных микозов сельскохозяйственных животных». Утв. РАСХН, г. Москва, 31.05. 2004г).
9. Рекомендации по приготовлению вакцин и проведению иммунопрофилактики кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных (Утв. РАСХН, г. Москва 12. 10. 2005г.).
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:
- Агольцов, В.А. Фунгицидное действие антигельминтиков на грибы рода Aspergillus/В. А. Агольцов, И. П. Ноздрачев // Мат-лы 1-ой науч.-практич. Конф.: Актуальные вопросы гастроэнтерологии.-Томск, 1993.-С.5-6.
- Пат. 2073512 Российская Федерация, А 61 К 31 /415 Способ лечения аспергиллеза /Агольцов В.А. [и др.]; заявитель и патентообладатель Саратов. Науч. - исслед. вет. станция.-№95103993/15; заявл. 21. 03. 95; опубл. 20. 10. 97; Бюл.№14.-4 табл.
- Пат. 2093569 Российская Федерация, 6 С12 №1/17 // (12 №1 /14, С 12 R 1: 645) Питательная среда для культивирования плесневых грибов рода Aspergillus и Mucor / Агольцов В.А. [и др.]; заявитель и патентообладатель Саратов. Науч. - исслед. вет. станция.-№ 95109797/13; заявл. 14. 06. 95; опубл. 20. 10.97; Бюл. №29.- 3 табл.
- Пат. 2111245 Российская Федерация С 12 № 1/14 // (С 12 № 1/14С 12 R 1/725 Питательная среда для культивирования дрожжевидных грибов рода Candida / Агольцов В.А.; заявитель и патентообладатель Саратов. Науч. - исслед. вет. станция.-№ 96113999 /13; заявл.10. 07. 96;опубл.20.05.98; Бюл.№14.-4 табл.
- Агольцов, В.А. Оценка выживаемости и жизнеспособности культур C. аlbicans / В.А.Агольцов // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.:Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных.- Ставрополь, 1999.- С.25-26.
- Агольцов, В.А. Роль грибов рода Candida при бактериальных инфекциях /В. А. Агольцов // Материалы междунар. науч.-практич. конф.: Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных.- Ставрополь, 1999.- С.26-27.
- Агольцов, В.А. Сравнительная оценка спорообразования культур грибов родов Candida, Aspergillus и Mucor на разных питательных средах / В. А. Агольцов, А. А. Парфенов, И. А. Полников // Мат-лы междунар. науч.-практич. Конф.: Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных.- Ставрополь, 1999.- С.27-28.
- Агольцов, В.А. Искусственное воспроизведение мукороза и аспергиллеза на кроликах/ В. А.Агольцов, И. А. Полников, А. А. Парфенов // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.:Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных.- Ставрополь, 1999.- С.28-30.
- Агольцов, В.А. Изучение иммуногенности кандидозной вакцины с использованием иммуноферментного анализа /В. А. Агольцов, Е. Ф. Федотова // Материалы междунар. науч.-практич. конф.: Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных.- Ставрополь, 1999.- С.30-31.
- Агольцов, В.А. Влияние бактерий и грибов на организм животных /В. А. Агольцов, Р. И. Кудинов // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.: Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропозоонозными болезнями животных.- Покров, 2000.- С.257-258.
- Агольцов, В.А. Дифференциальная диагностика висцеральных микозов /В. А. Агольцов, В. А. Баринов, И. Н. Полников // Мат-лы науч.-практич. конф. ин.-та вет. медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова. – Саратов, 2000. – Вып.1.- С.17-19.
- Агольцов, В.А. Изготовление и изучение аллергенных препаратов для диагностики микозов /В. А. Агольцов, Е. Ф. Федотова, А. А. Парфенов/ / Материалы науч.-практич. конф. ин.-та вет. медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова. – Саратов, 2000.-Вып.1. С.19-20.
- Агольцов, В.А. Разработка специфической профилактики кандидоза животных/В. А. Агольцов // Мат-лы науч.-практич. конф. ин.-та вет. медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова. – Саратов, 2000.-Вып.1- С.20-22.
- Агольцов, В.А. Роль грибов Candida в этиологии маститов и диарей новорожденных телят / В. А. Агольцов, А.Н.Чичкин, Е. В. Федотова // Материалы науч.-практич. конф. ин.-та вет. медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова. – Саратов, 2000.-Вып.1.- С.22-23.
- Ласкавый, В.Н. Оценка иммуногенности культур грибов Mucor и Aspergillus / В. Н. Ласкавый, В. А. Агольцов: Мат-лы науч.-практич. конф. ин.-та вет. медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова.- Саратов, 2000.-Вып. 1.- С.41-43.
- Пат. 2176392 Российская Федерация 7 G 01 №33/53, 33/569 Способ оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов / Агольцов В. А.[и др.]; заявитель и патентообладатель Саратов. Научн. исслед. вет. станция. - № 99123796/13; заявл. 10.11.1999; опубл. 27.11.01.Бюл. №33.
- Агольцов, В.А. Ассоциированное действие на организм животных аспергилл, мукора и эшерихий / В. А. Агольцов, Р. И. Кудинов // Мат-лы науч.-практич. конф. ин.-та.вет.мед.и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова. – Саратов, 2001.-Вып.2.- С.26-27.
- Агольцов. В.А. Локализация поражений и тканевая реакция при экспериментальных микозах /В. А. Агольцов, Г. П. Демкин, И. А. Полников // Мат-лы науч.-практич. конф. ин.-та вет. мед. и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова. – Саратов, 2001.-Вып.2.- С.27-30.
- Агольцов, В.А. Использование естественных путей заражения при экспериментальных микозах /В. А. Агольцов, И. А. Полников // Мат-лы док. Всероссийской науч.-практич. конф.: Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. – М.:ВГНКИ, 2001. – С.153-155.
- Полников, И.А. Оценка спорообразования и сохранности культур аскомицетов и фикомицетов /И. А. Полников, В. А. Агольцов // Мат-лы докл. Всероссийской науч.-практич. конф.: Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. – М.:ВГНКИ, 2001. – С.155-156.
- Полников, И.А. Фунгистатическая активность тиомерсала /И. А. Полников, В. А. Агольцов// Мат-лы науч.-практич. конференции: Госсанэпидслужбе России – 80 лет.- Саратов, 2002.- С.184-185.
- Агольцов, В.А.Рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с висцеральными микозами и микотоксикозами сельскохозяйственных животных /В. А. Агольцов, И. А. Полников – Саратов: Аквариус, 2002.- 40с.
- Агольцов, В.А. Анализ гематологических, биохимических и иммунологических показателей при системных микозах /В. А. Агольцов // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.: Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. – Воронеж: ВНИВИПФиТ, 2002-. С.56-58.
- Агольцов, В.А. Явление фагоцитоза in vitro грибов: Aspergillus, Mucor, Candida /В. А. Агольцов // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.: актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях.– Воронеж: ВНИВИПФиТ, 2002.- С.58-61.
- Пат. 2203940 Российская Федерация 7 С 12№ 1/14, А 61 К 39/00, С 12 Р 1/06 //( С 12 №1/14, С 12 R 1:68) Штамм Aspergillus fumigatus № 6, используемый для получения антигена / Агольцов В.А.; заявитель и патентообладатель Саратов. Науч. - исслед. вет. станция.-№201129311/13; заявл.31. 10.2001; опубл. 10.05.03; Бюл.№13.-3 табл.
- Агольцов, В.А. Кандидоз и его иммунопрофилактика /В. А. Агольцов // Мат-лы науч.-практич. конф.:Проблемы ветеринарной медицины в условиях реформирования сельскохозяйственного производства.-Махачкала. :ПЗНИВИ, 2003.- С.33-34.
- Пат. 2209243 Российская Федерация 7 С 12 № 1/02, А 61 К 39/00 Штамм Candida albicans № 253, используемый для получения антигена / Агольцов В. А.[и др.]; заявитель и патентообладатель Саратов. Научн. исслед. вет. станция. - № 200129312/13; заявл. 31. 10. 2001; опубл. 27.11.03. Бюл. №33.
- Ласкавый, В.Н. Фагоцитоз грибов при висцеральных микозах/В. Н. Ласкавый, В.Н. Баринов, В. А. Агольцов//Доклады РАСХН.-2003.-№4-С.39-40.
- Пат. 2217163 Российская Федерация А 61 К 39/00, С12 №1/14 Вакцина против кандидоза сельскохозяйственных животных/ Агольцов В. А.; заявитель и патентообладатель Саратов. научн. исслед. вет. станция. - № 2002104050/13; заявл. 19.02.2002; опубл. 27.11.2003; Бюл. №33 (п. ч.). – 12 с.: табл.
- Агольцов, В.А. Дифференциальная диагностика основных висцеральных микозов телят/В.А. Агольцов // Ветеринарный врач.- 2004.- № 18. -С.39-41.
- Агольцов, В.А. Применения анатоксинов из грибов при маститах / В. А. Агольцов // Ветеринарный врач. – 2004.- № 18.- С.41-43.
- Пат. 2230567 Российская Федерация 7 А 61 К 39/00 Вакцина против аспергиллеза/ Агольцов В. А.; заявитель и патентообладатель Саратов. научн. исслед. вет. станция. - № 2002115193/13; заявл.06.06.2002; опубл.20.06.2004. Бюл. №17 (п. ч.). – 12 с.: табл.
- Агольцов, В.А. Диагностика, предупреждение и ликвидация висцеральных микозов сельскохозяйственных животных: Методические рекомендации /В. А. Агольцов, В. Н. Ласкавый – М.: РАСХН, 2004.- 16 с.
- Ласкавый, В.Н. Рекомендации по приготовлению вакцин и иммунопрафилактике кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных: Методические рекомендации /В. Н. Ласкавый, В. А. Агольцов, В. Н. Баринов. – Саратов: Ассоциация АОН, 2005. – 16 с.
- Агольцов, В.А. Аспергиллез и его иммунопрофилактика /В. А. Агольцов // Профилактика и меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Российской Федерации: Мат-лы междунар. науч.- практич. конф., Уральский НИВИ.- Екатеринбург, 2005.-.С. 136-137.
- Агольцов, В.А. Изменение показателей крови кроликов иммунизированных экспериментальными противогрибковыми вакцинами /В. А. Агольцов // Актуальные проблемы экологии на современном этапе развития сельского хозяйства: Материалы междунар. науч.-практич. конференции СГАУ им. Н.И. Вавилова.- Саратов-Бонн, 2005.-С. 138-140.
- Агольцов, В.А. Получение противокандидозной вакцины и изучение ее иммуногенных и биохимических свойств / В. А. Агольцов// Вестник СГАУ им. Н.И. Вавилова. - 2005.- № 1.- С.3-5.
- Пат. 2248392 Российская Федерация МПК С 12 №/14, А 61 К 39/00 35/70 Штамм Mucor racemosus №195, используемый при приготовлении иммуногенных препаратов против мукорозов сельскохозяйственных животных / Агольцов В. А.[и др.] ; заявитель и патентообладатель Саратов. научн. исслед. вет. станция. - № 20033104731/13; заявл. 17. 02. 2003; опубл. 17.12.05. Бюл.№8.
- Агольцов, В.А. Получение противоаспергиллезной вакцины и изучение ее иммуногенных и биохимических свойств /В. А. Агольцов // Вестник СГАУ им. Н.И. Вавилова. - 2005.- № 3.- С.3-5.
- Агольцов, В.А. Особенности экспериментального висцерального аспергиллеза при различных путях заражения /В. А. Агольцов // Вестник СГАУ им. Н.И. Вавилова. - 2005.- № 3.- С.12-13.
- Агольцов, А. В.. Рекомендации по диагностике, мерам борьбы и профилактике маститов коров: Методические рекомендации /А. В. Агольцов, А. М. Чичкин, И. Идельбаев – Саратов: Ассоциация «АОН».- 2005.-28с.
- Ласкавый, В.Н. Рекомендации по приготовлению вакцин и иммунопрафилактике кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных: Методические рекомендации; Утв. Отд. вет. мед. РАСХН 24.11. 2005 /В. Н. Ласкавый, В. А. Агольцов, В. Н. Баринов. – Саратов, 2005.-16 с.
- Пат. 2270694 Российская Федерация А 61 К 39/00 С 12 № 1/4 А 61Р 31/10 С 12 R 1/645 Вакцина против висцеральных микозов сельскохозяйственных животных, вызываемых грибом рода Mucor racemosus/ Агольцов В. А.; заявитель и патентообладатель Саратов. научн. исслед. вет. станция. - № 2004125814/13; заявл.24.08.2004; опубл.27.02.2006. Бюл. №6 (п. ч.). – 6 с.: табл.
- Агольцов, В.А. Иммунопрофилактика мукороза животных /В. А. Агольцов, В. Г. Идельбаев // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.: Экологические проблемы в АПК.-Саратов-Ухань-Галвестон: СГАУ им. Н. И. Вавилова, 2006.- С.162-163.
- Агольцов, В.А. Этиология мастита коров в хозяйствах Саратовской области /В. А. Агольцов, В. Г. Идельбаев // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.: Экологические проблемы в АПК.-Саратов-Ухань-Галвестон: СГАУ им. Н. И. Вавилова, 2006.- С.163-167.
- Агольцов, В.А. Эпизоотологическое и эпидемиологическое значение мастита коров /В. А. Агольцов, В. Г. Идельбаев // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.: Экологические проблемы в АПК.-Саратов-Ухань-Галвестон: СГАУ им. Н. И. Вавилова, 2006.- С.167-169.
- Агольцов, В.А. Культурально- морфологические и патогенные свойства штаммов грибов Candida, Aspergillus и Mucor, выделенных из патологического материала и кормов /В. А. Агольцов // Мат-лы междунар. науч.-практич. конф.: Экологические проблемы в АПК.-Саратов-Ухань-Галвестон: СГАУ им. Н. И. Вавилова, 2006.- С.169-172.
- Агольцов, В.А. Экспериментальное воспроизведение кандидоза, аспергиллеза и мукороза животных и анализ морфологических, иммунологических и биохимических исследований крови/В. А. Агольцов// Ветеринарная патология.- 2006.- № 4.- С. 160-167.
- Агольцов, В.А. Показатели крови животных, вакцинированных экспериментальными противокандидозными, противоаспергиллезными и противомукорозными препаратами/В. А. Агольцов// Ветеринарная патология.- 2006.- № 4.- С. 167-172.
АГОЛЬЦОВ ВАЛЕРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
КАНДИДОЗ, АСПЕРГИЛЛЕЗ И МУКОРОЗ ЖИВОТНЫХ
(ДИАГНОСТИКА И МЕРЫ БОРЬБЫ)
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук
Компьютерный набор и верстка Шакерова Э.Н.
Корректор О.Ф. Костина
Лицензия ЛР № 040284 от 6.05.98г.
Подписано в печать 3.09.2006 г.
Формат 60/84 1/16. Печать офсетная. Бумага офсетная.
Усл. печ.л. – 2,0 Тираж 100 экз. Заказ № 03/1105
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия
603107, г. Н. Новгород, пр. Гагарина, 97
Типография НГСХА
