Фармакотехнологические аспекты создания противовоспалительного средства на основе экстракта босвеллии
На правах рукописи
ИВАНОВА
СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА
ФАРМАКОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА БОСВЕЛЛИИ
15.00.01 – технология лекарств и организация фармацевтического дела
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
МОСКВА
2008
Диссертационная работа выполнена в Межрегиональном центре «Адаптоген»
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Макаров Валерий Геннадьевич
кандидат фармацевтических наук Пожарицкая Ольга Николаевна
Официальные оппоненты:
Доктор фармацевтических наук, профессор Сокольская Татьяна Александровна
Доктор фармацевтических наук, профессор Демина Наталья Борисовна
Ведущая организация:
Военно-Медицинская Академия имени С.М. Кирова
Защита состоится «____» _______________ 2008 г. в ______ часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО «Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Росздрава» (121998, Москва, Никитский бульвар, 13).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Росздрава» (117998, Москва, Нахимовский проспект, 49).
Автореферат разослан «___»_________2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Одним из основных направлений развития современной фармацевтической науки является расширение ассортимента и поиск эффективных лекарственных средств природного, в том числе растительного происхождения. Актуально при этом создание новых препаратов на основе известных лекарственных растений, действие и состав которых хорошо изучены.
Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) относятся к числу наиболее важных «симптоматических» лекарственных средств, особенно при лечении ревматических болезней (Насонов Е.Л., 2000, 2002б). Это определяется уникальным сочетанием противовоспалительных, анальгетических, жаропонижающих и антитромботических свойств. Многообразие лечебных свойств этой группы препаратов, а также большая распространенность клинических ситуаций, где они эффективны, вывели НПВП в разряд препаратов, наиболее часто назначаемых больным. Каждый третий житель планеты использует НПВП. Особенно возрастает потребность в НПВП у лиц пожилого возраста, то есть у контингента лиц, нередко имеющих сопутствующие заболевания и часто использующих медикаменты для их лечения (Насонов Е.Л., 2002а, 2002б). Несмотря на выраженную противовоспалительную активность при использовании синтетических НПВП возникает ряд осложнений, что создает серьезные проблемы для их рационального использования в реальной клинической практике (Машковский М.Д., 2000).
Множественность неблагоприятных реакций, свойственная современным противовоспалительным средствам, указывает на актуальность поиска новых малотоксичных препаратов. Более всего таким требованиям удовлетворяют препараты растительного происхождения. У ряда соединений растительного происхождения выявлены многочисленные виды биологической активности: противовоспалительная, антиоксидантная, мембраностабилизирующая, капилляроукрепляющая, иммунорегуляторная и ряд других. Выраженность названных эффектов биологически активных веществ отдельных растений, в большинстве своем, недостаточна и экспериментально мало обоснована. Очевидно, что активность фитопрепаратов может быть значительно усилена при рациональном, целенаправленном подборе биологически активных соединений ряда растений, что обеспечит патогенетически направленное действие.
Учитывая данные литературы о противовоспалительном действии босвеллиевых кислот (Ammon H.P.T., 2006), экстрактов куркумы (Araujo C.A.C., Leon L.L., 2001), сведения о благоприятных биологических эффектах препаратов из семян сосны кедровой сибирской (СКС) и имея в виду возможность потенцирования эффектов названных источников и ряд других положительных биологических сторон их действия, отсутствующих у официнальных противовоспалительных средств перспективным является разработка нового комплексного противовоспалительного средства растительного происхождения.
С целью повышения биодоступности актуальным является выбор оптимальной лекарственной формы для липофильных соединений с учетом физико-химических и технологических свойств и особенностей технологии в условиях современных фармацевтических производств.
В связи с вышеизложенным актуальной проблемой является создание новой лекарственной формы на основе сухого экстракта босвеллии и масляных экстрактов корневищ куркумы и семян СКС, обеспечивающих длительное поддержание и регулирование уровня терапевтических концентраций БАВ в крови, удобных в применении и стабильных при хранении.
Цель работы
Теоретическое и экспериментальное обоснование, разработка технологии и изучение биофармацевтических свойств препарата на основе экстракта босвеллии, корневищ куркумы и семян СКС.
Задачи исследования
- Исследование физико-химических свойств, противовоспалительной активности и биофармацевтических свойств экстракта босвеллии.
- Фракционирование экстракта босвеллии с целью поиска наиболее активных в отношении противовоспалительного действия компонентов.
- Разработка состава и технологии комплексного средства, содержащего БАВ экстракта босвеллии, корневищ куркумы и семян СКС.
- Исследование противовоспалительной и антирадикальной активности комплексного средства и его биофармацевтических свойств.
- Выбор параметров стандартизации и разработка нормативной документации на комплексное средство.
Научная новизна
Теоретически и экспериментально обосновано создание противовоспалительного средства в форме мягких желатиновых капсул, заполненных липидной матрицей, содержащей БАВ корневищ куркумы, семян СКС и экстракт босвеллии.
Для оценки фармакокинетики босвеллиевых кислот и куркуминоидов впервые применен метод тонкослойной хроматографии.
Впервые изучена и определена антирадикальная активность индивидуальных куркуминоидов в отношении радикала DPPH• методом ТСХ с применением постхроматографической дериватизации.
Практическая значимость
В результате проведенных исследований разработаны методы анализа и технология, составлена и утверждена нормативная документация на производство БАД Артро-Актив в мягких желатиновых капсулах, заполненных липидной матрицей, содержащей экстракт босвеллии и БАВ корневищ куркумы и семян СКС (ТУ 9197-020-17664661-2004; ТИ 020-17664661-2004). Разработан проект ФСП на сухой экстракт босвеллии.
Проведены доклинические испытания, подтвердившие противовоспалительную активность разработанного препарата.
Основные положения, выносимые на защиту
На защиту выносятся результаты исследования физико-химического состава экстракта босвеллии, и его биофармацевтических свойств; данные по изучению противовоспалительного действия экстракта босвеллии; состав и технология комплексного препарата; результаты фармакологических и фармакокинетических исследований разработанного препарата.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IX и X Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств природного происхождения, Санкт-Петербург, 2005 и 2006; 5 международном симпозиуме по хроматографии природных продуктов, Люблин, Польша, 2006; 3 Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии», Барнаул, 2007.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов исследования и методов анализа, трех глав, содержащих результаты экспериментальных исследований и их обсуждение, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 50 рисунков. Список литературы включает 192 источника литературы.
Приложение включает ФСП (проект) на сухой экстракт босвеллии, данные по изучению стабильности экстракта босвеллии, выдержки из ТУ на мягкие желатиновые капсулы Артро-Актив, данные по изучению стабильности Артро-Актива, акт о наработке желатиновых капсул, акт внедрения и санитарно-эпидемиологическое заключение на Артро-Актив.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объектами исследования служили экстракт босвеллии (Boswellia serrata Roxb, сем. Burseraceae) с содержанием суммы органических кислот в пересчете на -босвеллиевую кислоту не менее 85% (New Ambadi Estates Pvt., Ltd, Индия); измельченные корневища куркумы Curcuma longa L., сем. Zingiberaceae (CYCORIA, Польша) и семена сосны кедровой сибирской Pinus sibirica Du Tour, сем. Pinaceae (ООО Русский орех, Россия).
Исследования проводили с использованием различных физико-химических методов: гравиметрия, титриметрия, спектрофотометрия, а так же хроматографические методы, такие как хромато-масс-спектрометрия, ВЭЖХ, колоночная хроматография и планарная хроматография с использованием комплекта оборудования фирмы Camag (Швейцария), состоящего из полуавтоматического аппликатора (Linomat V), системы пошагового градиентного элюирования (AMD2) и сканирующего спектроденситометра (TLC Scanner 3).
Исследование антирадикальной активности (АРА) проводили методом ТСХ с использованием постхроматографической дериватизации раствором 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH). Для оценки АРА рассчитывали ID50 – количество компонента, обеспечивающие связывание половинного количества радикалов DPPH•.
Фармакологические исследования включали изучение фармакокинетики in vitro и in vivo и изучение фармакологических свойств.
Изучение фармакокинетики in vivo проводили на 40 беспородных белых крысах, массой 150-200 г. Препарат вводили голодавшим в течение 12 часов крысам однократно перорально (через зонд). Пробы отбирали через 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 36 ч. Определение содержания индивидуальных босвеллиевых кислот и куркумина в плазме проводили методом ТСХ.
Противовоспалительные свойства in vivo исследовали на моделях каррагенинового отека и формалинового артрита лапы крысы. В экспериментах использовали крыс-самцов массой 180-200 г. Показателями противовоспалительного эффекта служили антиэкссудативное, анальгезирующее и жаропонижающее действия. Для оценки эффективности действия изучаемых образцов рассчитывали терапевтические индексы (ТИ), которые определяли по отношению суммы степени улучшения показателя за все время проведения эксперимента (в процентах) по сравнению с контрольной группой животных к этому же показателю для группы животных, принимавших препарат сравнения (Александрова А.Е., 2004).
Для оценки противовоспалительной активности исследуемых образцов in vitro исследовали влияние их на синтез основных медиаторов воспаления: интерлейкин-1 бета (IL-1b); фактор некроза опухолей альфа (TNFa); простагландин Е2 (PGE2); лейкотриен В4 (LTB4), а так же интерлейкины 6 и 8 (IL-6, IL-8).
Изучение экстракта босвеллии
На первом этапе работы исследовали физико-химические, технологические и биофармацевтические свойства и провели первичную оценку противовоспалительной активности экстракта босвеллии.
Основными действующими веществами экстракта босвеллии, обеспечивающими противовоспалительный эффект экстракта традиционно считаются пентациклические триперпены – босвеллиевые кислоты. Для количественного определения четырех основных -босвеллиевых кислот (босвеллиевой кислоты (БК), ацетил босвеллиевой кислоты (АБК), кето-босвеллиевой кислоты (КБК) и ацетил кето-босвеллиевой кислоты (АКБК) разработали методику с использованием метода ТСХ в системе растворителей гексан/этилацетат/уксусная кислота (85/20/5); валидационные характеристики которой представлены в таблице 1. Для детектирования КБК и АКБК использовали денситометрию при 254 нм, для детектирования БК и АБК – постхроматографическую дериватизацию реагентом, содержащим анисовый альдегид, с последующей денситометрией при 560 нм.
Таблица 1
Валидационные характеристики методики определения индивидуальных кислот методом ТСХ
| Компонент | Rf | Уравнение регрессииа) | r | Пределы линейности, мкг | Предел обнаружения, мкг | sdv,% |
| КБК | 0,35±0,02 | y=631,287+4,467x | 0,9928 | 0,2-2,0 | 0,15 | 5,88 |
| АКБК | 0,46±0,02 | y=-88,329+4,581x | 0,9911 | 0,15 | 2,01 | |
| БК | 0,44±0,02 | y=4089,715+6,261x | 0,9964 | 0,10 | 1,92 | |
| АБК | 0,56±0,02 | y=2664,847+6,551x | 0,9901 | 0,10 | 0,72 |
а)х – количество аналита в нг; y – площадь пика в a.u.
Экстракт босвеллии представляет собой пушистый порошок желтовато-сероватого цвета с характерным бальзамическим запахом. Частицы экстракта неправильной формы (микроскопия). Экстракт легко растворим в органических растворителях: этиловом и метиловом спиртах, хлороформе; не растворим в воде (не смачивается данным растворителем). Содержание влаги в экстракте составляет 0,55±0,05%; содержание неорганических веществ растительного происхождения 1,00±0,02%; сумма органических кислот в пересчете на -босвеллиевую кислоту (титриметрия) 89,3±3,6 %; содержание 4 индивидуальных кислот (ТСХ) составляет: КБК 2,4±0,1%; АКБК 3,5±0,1%; БК 19,2±2,5% и АБК 12,1±2,0%.
Противовоспалительные свойства экстракта босвеллии в условиях in vivo исследовали на модели каррагенинового отека лапы крысы. На основании данных (Sterk V. et al., 2004) для увеличения биологической доступности исследуемых кислот, при изучении фармакокинетики экстракт босвеллии вводили в масляной основе. ТИ по сравнению с фенилбутазоном (56 мг/кг) приведены на рисунке 1.
Рис.1 Терапевтические индексы по некоторым показателям течения воспалительного процесса
На основании полученных данных установили, что экстракт босвеллии обладает выраженным противовоспалительным действием. Так, эффект экстракта босвеллии в дозе 25 мг/кг по большинству из исследованных показателей сравним с эффектом препарата сравнения (ТИ около 1), а эффект экстракта в дозе 75 мг/кг по большинству показателей превышает эффект препарата сравнения (ТИ >1). Так же отмечено выраженное анальгезирующее действие экстракта босвеллии (рис.1).
Фракционирование и оценка противовоспалительного действия фракций экстракта босвеллии
Исследуемый экстракт босвеллии является сложной смесью биологически активных, сопутствующих и балластных веществ. При создании лекарственного средства природного происхождения с известной направленностью действия, возникает интерес к концентрированию веществ, отвечающих за это действие. Известно, что различные кислоты обладают разной активностью в отношении ингибирования синтеза 5-ЛО. Поэтому следующий этап работы был посвящен разделению экстракта босвеллии методом колоночной хроматографии с выделением биологически активных фракций экстракта, обогащенных определенными компонентами. Для быстрого поиска активных фракций разработали и применили алгоритм по разделению многокомпонентных смесей (рис. 2).
Рис. 2 Алгоритм анализа и разделения многокомпонентных смесей
Наилучшие результаты разделения экстракта босвеллии методом пошагового градиентного элюирования получены при использовании на первой ступени элюирования системы растворителей гексан/этилацетат в соотношении 7:3 с последующим линейным уменьшением полярности системы до чистого гексана. Значения Rf босвеллиевых кислот в этих условиях составили: RfКБК=0,26±0,04; RfАКБК=0,47±0,05; RfБК=0,40±0,03; RfАБК=0,63±0,02.
Методом препаративной колоночной хроматографии получены 4 фракции, характеристика которых представлена в таблице 2.
Состав полученных фракций исследовали методом ТСХ. При детектировании пластин при 254 нм во фракции 2 обнаружено преимущественное содержание АКБК, во фракции 3 совместное присутствие АКБК и КБК с преобладанием второй и во фракции 4 преимущественное содержание КБК. После обработки пластины анисовым альдегидом наблюдали распределение веществ экстракта в различных фракциях, схематичное изображение которого представлено на рисунке 3.
Рис. 3. Схема распределения компонентов в экстракте и 4-х фракциях (на схеме представлены соединения, детектируемые и в УФ-свете, и после дериватизации пластины); гексан/этилацетат/уксусная кислота (85/20/5), расстояние элюирования 70мм (1 - экстракт; 2-5 - фракции 1-4, соответственно; 6 – БК; 7 – АБК; 8 – КБК; 9 – АКБК)
В зоне значений Rf соединений фракций 1 и 4 на треке экстракта босвеллии никакие компоненты не детектируются. По-видимому, компоненты, образующие фракции 1 и 4 находятся в экстракте в минорных, не значимых количествах (об этом же свидетельствуют и относительные количества этих фракций).
Для дальнейших исследований выбраны фракции 2 и 3 как превалирующие в количественном отношении. Количественная характеристика содержания босвеллиевых кислот (методом ТСХ) во фракциях экстракта представлена в таблице 2.
Таблица 2
Характеристика фракций экстракта босвеллии
| Образец | Элюент | Выход, % | Содержание босвеллиевых кислот, % | |||
| БК | АБК | КБК | АКБК | |||
| Фракция 1 | гексан/этилацетат 9/1 | 7-10 | не определяли | |||
| Фракция 2 | гексан/этилацетат 8/2 | 40-45 | 33,84 ±4,06 | 16,40 ±2,29 | не обнаружено | 5,76 ±0,14 |
| Фракция 3 | гексан/этилацетат 7/3 | 35-40 | 30,63 ±3,68 | не обнаружено | 13,05 ±0,16 | 5,20 ±0,13 |
| Фракция 4 | гексан/этилацетат 6/4 | 12-15 | не определяли | |||
Противовоспалительное действие фракций экстракта босвеллии в условиях in vivo исследовали на модели каррагенинового отека лапы крысы.
Установили, что по противовоспалительному действию препараты располагались следующим образом: фракция 2 (20 мг/кг)>экстракт босвеллии (20 мг/кг)>препарат сравнения>фракция 3 (20 мг/кг).
На основании данных о составе индивидуальных босвеллиевых кислот во фракциях и по результатам исследования противовоспалительной активности этих фракций сделали вывод, что основной вклад в противовоспалительную активность экстракта в выбранной модели вносят ацетил-производные босвеллиевых кислот и, преимущественно, АБК.
При исследовании противовоспалительного действия фракции 2 и суммарного экстракта босвеллии в условиях in vitro выявлено дозозависимое действие на IL-1b и TNFa. Причем, максимальная эффективность действия и экстракта, и фракции 2 проявлялась в минимальной исследуемой концентрации (1 мкг/мл).
Активность суммарного экстракта и фракции 2 в отношении LTB4 (метаболита арахидоновой кислоты, индуцируемого 5-ЛО) была практически одинакова. Таким образом, концентрирование компонентов суммарного экстракта босвеллии с целью выделения наиболее активных соединений, оказывающих противовоспалительное действие преимущественно за счет ингибирования 5-ЛО, не является эффективным путем повышения биологической активности экстракта
На основании литературных данных и данных предварительных экспериментов в качестве компонентов, дополняющих экстракт босвеллии для создания комбинированного средства, выбраны семена СКС и корневища куркумы длинной.
Разработка комплексного противовоспалительного средства, содержащего экстракт босвеллии, БАВ семян СКС и корневищ куркумы
Действующие компоненты разрабатываемого средства имеют ярко выраженный липофильный характер, что обуславливает предпочтительное применение липидной матрицы. В качестве лекарственной формы для создания перорального противовоспалительного средства выбраны мягкие желатиновые капсулы, содержащие экстракт босвеллии в масляном экстракте семян СКС и корневищ куркумы. В качестве экстракционного масла выбрано кукурузное масло.
На основании данных литературы, предварительных фармакологических и технологических экспериментов выбрана доза экстракта босвеллии в препарате, которую обеспечивает 10 % раствор экстракта босвеллии в масляном экстракте.
В качестве основы разрабатываемого средства использовали масляный экстракт СКС – Кедрол (ТУ 9369-001-23377026-2000), разработанный ранее на базе ЗАО МЦ «Адаптоген». Предварительно смоченные этиловым спиртом измельченные корневища куркумы экстрагировали Кедролом методом мацерации при нагревании (40 °С) и перемешивании (300 об/мин) в соотношении сырье:экстрагент 1:10. Известно, что при получении масляных экстрактов на выход липофильных веществ значимое влияние оказывает присутствие спирта в системе (Иванова С.А. и др., 2003а; Иванова С.А. и др., 2003б; Шиков А.Н., 2006).Установили, что для замачивания корневищ куркумы достаточно использовать спирт в соотношении 0,5 к массе загруженного сырья. Равновесие по сумме куркуминоидов в системе «твердое тело-жидкость» в этих условиях достигается через 1,5-2 часа (рис. 4а).
Изучение растворения сухого экстракта босвеллии в масляном экстракте семян СКС и корневищ куркумы проводили при различной температуре. Установили, что на процесс получения стабильной липидной основы, содержащей экстракт босвеллии, в значительной мере влияет время достижения равновесия в системе и в меньшей степени температура растворения (табл. 4).
Для обеспечения стабильности в состав препарата вводили различные антиоксиданты. Установили, что только совместное применение бутилгидрокситолуола (БГТ), лецитина, аскорбил пальмитата и -токоферол ацетата приводит к получению стабильной к перекисному окислению липидной основы препарата (рис. 4б).
Таблица 4
Высота смолистого слоя, см
| Т, °С, часы | 1 | 2 | 3 | 6 | 8 | 12 |
| 20 | 8,2±0,4 | 6,3±0,3 | 5,5±0,3 | 2,7±0,1 | 1,5±0,1 | 0,7±0,1 |
| 40 | 8,4±0,4 | 7,1±0,4 | 5,9±0,3 | 3,2±0,1 | 1,7±0,1 | 1,2±0,1 |
| 60 | 8,6±0,4 | 6,5±0,3 | 5,0±0,3 | 2,9±0,1 | 2,0±0,1 | 0,7±0,1 |
| 80 | 8,2±0,4 | 7,3±0,4 | 5,5±0,3 | 3,0±0,1 | 1,7±0,1 | 1,4±0,1 |
 |  |
| а) | б) |
Рис. 4 Кинетика экстрагирования корневищ куркумы Кедролом (а) и изменение перекисных чисел комплексного препарата в процессе ускоренного старения (б).
На основании экспериментальных данных разработан следующий состав противовоспалительного средства для перорального применения в мягких желатиновых капсулах:
Состав содержимого капсул (мг/капс.):
| Масляный экстракт семян СКС и корневищ куркумы | 268,665 |
| Сухой экстракт босвеллии | 30,000 |
| -токоферол ацетат | 0,320 |
| Аскорбил пальмитат | 0,800 |
| Лецитин очищенный | 0,200 |
| Бутилгидрокситолуол | 0,015 |
Разработанный препарат получил название Артро-Актив
Технология получения Артро-Актива включает следующие основные стадии:
- Экстракция цельных семян СКС кукурузным маслом с использованием роторно-пульсационной техники;
- Экстракция измельченных корневищ куркумы масляным экстрактом семян СКС;
- Внесение антиоксидантов;
- Растворение сухого экстракта босвеллии;
- Получение мягких желатиновых капсул экструзионным методом;
- Фасовка и упаковка готовой продукции.
Рис. 5 Технологическая схема производства Артро-Актива. Кх, Кт, Кмкб - контроль химический, технологический, микробиологический соответсвенно
Артро-Актив по составу представляет собой сложную многокомпонентную систему, по вязкости и консистенции отличающуюся от растительного масла. Поэтому предварительно в лабораторных условиях исследовали влияние вязкости желатиновой массы и толщины оболочки на качество получаемых капсул. Установили, что для получения капсул, удовлетвряющих требованиям ГФ XI (вып. 2, с. 143) необходимо использовать желатиновую массу с вязкостью 550-600 мм2/с; масса желатиновой оболочки должна составлять не менее 20-22 % от массы содержимого капсулы. Меньшая масса оболочки, а, значит, ее толщина, не обеспечивали удовлетворительной стабильности капсул, наблюдалось нарушение целостности оболочки, и, как следствие, большое количество «лопанцев».
На основании серии экспериментов в производственных условиях разработаны технологические режимы и апробирована в условиях предприятия ЗАО «Фармаген» технологическая схема производства Артро-Актива в мягких желатиновых капсулах (рис. 5).
Противовоспалительную активность Артро-Актива и масляного экстракта семян СКС и корневищ куркумы в условиях in vivo изучали на модели формалинового артрита. ТИ по сравнению с фенилбутазоном (56 мг/кг) по изученным показателям течения воспалительного процесса представлены на рис.6.
Для исследуемых образцов отмечено обезболивающее действие. Артро-Актив значимо эффективнее подавлял процесс воспаления по сравнению с масляным экстрактом СКС и корневищ куркумы.
Рис. 6 Терапевтические индексы по некоторым показателям течения воспалительного процесса
Антирадикальную активность (АРА) компонентов Артро-Актива исследовали в отношении радикала DPPH• методом ТСХ. Объединение хроматографического разделения и определения АРА позволяет оценить вклад каждого компонента в АРА суммарного экстракта.
Установили, что АРА в отношении радикала DPPH• обладают только БАВ корневищ куркумы. По совпадению значений Rf со стандартным образцом (являющимся смесью трех куркуминоидов) в составе комплексного средства идентифицированы куркумин, деметоксикуркумин и бисдеметоксикуркумин.
АРА суммы куркуминоидов и отдельных куркуминоидов изучали с использованием стандартного раствора куркумина. При детектировании пластины, обработанной раствором DPPH (Fluka, Германия; 0,2 мг/мл метанола) при 517 нм, гашение окраски фона пластины, свидетельствующее о наличии АРА компонента выглядит как «отрицательный пик» (рис. 7).
Наиболее активным в отношении радикала DPPH• является куркумин, наименее – бисдеметоксикуркумин (табл. 5).
Значения ID50 куркуминоидов различаются мало. Теоретически рассчитанное значение ID50 суммы куркуминоидов (с учетом массовой доли каждого компонента) должно было бы составлять 179 нг, однако ID 50 суммы куркуминоидов значительно (более чем в 1,5 раза) меньше, что дает основания предполагать о наличии эффекта синергизма АРА куркуминоидов в отношении радикала DPPH•.
Рис. 7 Денситограмма трека стандартного раствора куркумина до обработки раствором DPPH при детектировании при 425 нм (А) и после обработки раствором DPPH при детектировании при 517 нм (Б) (1 – куркумин; 2 – деметоксикуркумин; 3 - бисдеметоксикуркумин)
Таблица 5
Характеристика АРА куркуминоидов
| Объект | Система | Содержание, % | Rf | Уравнение регрессии а) | R2 | Пределы линейности, нг | ID50, нг  нмоль |
| Сумма куркуминоидов | гексан/этилацетат/уксусная кислота (80:25:5) | - | 0,17±0,02 | Y=0,3762x+1,693 | 0,9815 | 50-350 | 110,4 |
| Куркумин | толуол/уксусная кислота (4/1) | 68,0 | 0,55±0,04 | Y=0,4518x-5,209 | 0,9832 | 70-400 | 175,9 0,48 |
| Деметоксикуркумин | 25,5 | 0,41±0,03 | Y=0,1688+17,549 | 0,9911 | 50-550 | 180,9 0,55 | |
| Бис-деметоксикуркумин | 6,5 | 0,28±0,03 | Y=0,2115x+3,685 | 0,9886 | 60-250 | 198,8 0,66 |
а) х – количество куркуминоидов в нг; Y – высота «отрицательного пика» пика в a.u.
Исследование биофармацевтических свойств экстракта босвеллии и Артро-Актива. Основные босвеллиевые кислоты нерастворимы в воде и обладают выраженными гидрофобными свойствами (logPБК=9,38±0,39; logPАБК=10,27±0,40; logPКБК=7,10±0,39; logPАКБК=8,00±0,28), поэтому для изучения скорости их высвобождения невозможно применение традиционных сред растворения, таких как вода и буферные растворы, имитирующие условия желудочно-кишечного тракта. На основании данных предварительных экспериментов установили, что введение в состав среды растворения сурфактантов, фосфолипидов или компонентов желчи не приводило к увеличению степени растворения босвеллиевых кислот. Поэтому была использована двухфазная среда растворения, состоящая из фосфатного буфера (рН 6,8) и n-октанола в соотношении 3:1 (Pillay V., Fassihi R., 1999). Оценку скорости растворения босвеллиевых кислот проводили методом «лопастная мешалка» при температуре 37±1С и скорости вращения 100 об/мин. Эти же условия оказались оптимальными и для изучения биодоступности in vitro суммы куркуминоидов.
Содержание босвеллиевых кислот в пробах (из октанола) определяли методом обращено-фазовой ВЭЖХ (колонка Luna C18 4,6 150 мм (размер частиц сорбента 5 мкм); градиентное элюирование от 75 % ацетонитрила в 0,03% растворе трифторуксусной кислоты до 100% ацетонитрила за 20 минут; детектирование КБК и АКБК при 254, БК и АБК при 210 нм. Содержание суммы куркуминоидов оценивали спектрофотометрически при 432 нм.
Высвобождение суммы куркуминоидов из Артро-Актива носит линейный характер, основная часть растворяется за первые 45 мин и составляет около 90 %; константа скорости растворения 1,9144 мин-1. Высвобождение суммы куркуминоидов из субстанции куркумина (Fluka, Германия) протекает значительно медленнее - константа скорости растворения 0,1923 мин-1 - и к 5 часу эксперимента достигает 50 %.
Высвобождение босвеллиевых кислот и из экстракта и из Артро-Актива начинается с небольшой лаг-фазы, обусловленной растворением желатиновой оболочки. При растворении из экстракта босвеллии максимум концентрации КБК и АКБК достигается ко 2-му часу (около 65 % для обеих кислот); максимум концентрации БК и АБК достигается к 3-му часу и составляет около 30% для БК и около 80 % для АБК. Константы скорости растворения этих соединений составили 0,0593 мин-1 для БК; 0,2429 мин-1 для АБК; 0,6556 мин-1 для КБК и 0,5896 мин-1 для АКБК.
Основная часть босвеллиевых кислот из Артро-Актива переходит в n-октанол за первые 45 минут эксперимента (65-70% для БК, АБК, АКБК и 40% для КБК). Константы скорости растворения кислот из Артро-Актива составляют для БК – 1,3914 мин-1; для АБК – 1,634 мин-1; для КБК – 0,8599 мин-1; для АКБК – 1,4973 мин-1.
Увеличение скорости растворения босвеллиевых кислот и суммы куркуминоидов из Артро-Актива по сравнению с экстрактом, по-видимому, происходит за счет наличия липофильной матрицы препарата, обеспечивающей быстрое и достаточно полное высвобождение босвеллиевых кислот и куркуминоидов.
Фармакокинетика экстракта босвеллии и Артро-Актива in vivo. Предварительно была разработана методика пробоподготовки плазмы крови и ТСХ методика определения четырех индивидуальных босвеллиевых кислот и суммы куркуминоидов в плазме крови на модельных смесях. Валидационные параметры определения босвеллиевых кислот в плазме совпали с представленными в таблице 1. Параметры определения суммы куркуминоидов в плазме представлены в таблице 6.
Таблица 6
Валидационные параметры определения суммы куркуминоидов в плазме крови
| Система растворителей/условия детектирования | Rf | Уравнение регрессии | r | Пределы линей- ности, нг | Предел обнаружения, нг | sdv,% |
| Гексан/этилацетат/уксусная кислота (85/20/5 по объему) / 425 нм | 0,17±0,02 | Y=39,14x+1237,12 х – количество аналита; Y – площадь пика | 0,9990 | 50-100 | 10 | 2,3 |
Как при введении экстракта босвеллии, так и при введении Артро-Актива в плазме крови крыс в неизменном виде были обнаружены только КБК и АКБК. Куркуминоиды в неизменном виде в плазме крови при применении Артро-Актива обнаружены не были, но были обнаружены метаболиты курукмина.
Кинетика обнаружения АКБК, КБК и наиболее часто встречающегося метаболита куркумина (метаболит 1) в крови носит характерную для перорально применяемых средств форму (рис. 8). Сравнивая параметры фармакокинетики босвеллиевых кислот из Артро-Актива и экстракта установили, что компоненты Артро-Актива обеспечивают пролонгированное поступление АКБК в системный кровоток и увеличивают биологическую доступность КБК (табл. 7).
Для определения корреляции между результатами, полученными для КБК и АКБК в условиях in vitro и in vivo, рассчитывали процент их абсорбции в желудочно-кишечном тракте по методу Wagner-Nelson (Emami J., 2006). Коэффициенты корреляции составили 0,8377 и 0,8461 для АКБК и КБК, соответственно. Исследование биодоступности показало, что существует сильная корреляционная связь уровня А между результатами in vivo и скоростью растворения босвеллиевых кислот в двухфазную среду растворения.
 |  |  |
| а) | б) | в) |
Рис. 8. Кривые «концентрация-время» для АКБК (а) и КБК (б) при пероральном введении экстракта босвеллии и для метаболита куркумина (в) при пероральном введении Артро-Актива
Таблица 7
Показатели фармакокинетики АКБК и КБК при однократном пероральном введении Артро-Актива / экстракта босвеллии
| Тmax, ч | Сmax, мкг/мл | AUC, чмкг/мл | MRT, ч | Cl, мл/ч/кг | Vss, мл/кг | Т1/2, ч |
| 4/2 | 2,220/2,010 | 33,544/34,131 | 9,070/17,944 | 209,280/228,53 | 1898,211/4100,74 | 6,286/12,4 |
| 1/2 | 2,843/1,250 | 96,377/4,725 | 25,819/2,866 | 70,971/1608,46 | 1832,404/4609,85 | 17,893/2,98 |
В качестве параметров стандартизации Артро-Актива выбраны внешний вид капсул, органолептические свойства содержимого капсул, средняя масса содержимого капсул, перекисное и кислотное числа, подлинность по наличию босвеллиевых кислот, куркумина и пиностробина, количественное содержание суммы босвеллиевых кислот в пересчете на -босвеллиевую кислоту и содержание суммы куркуминоидов в пересчете на куркумин.
При изучении стабильности препарата в условиях естественного хранения показана его стабильность по приведенным параметрам стандартизации в течение не менее 2,5 лет.
ВЫВОДЫ
- Исследован компонентный состав терпеноидов экстракта босвеллии; на модели каррагенинового отека лапы крысы установлена выраженная противовоспалительная активность экстракта в дозе 75 мг/кг сравнимая с эффектом фенилбутазона. Изучены фармакокинетические параметры КБК и АКБК. Установлено существование сильной корреляционной связи уровня А между результатами in vivo и скоростью растворения КБК и АКБК in vitro. Показано, что БК и АБК в неизменном виде в плазме не обнаружены.
- С использованием разработанного алгоритма поиска активных компонентов получены 4 фракции экстракта босвеллии. Установлено преимущественное влияние АБК на противовоспалительную активность экстракта босвеллии.
- Разработан состав и технология комплексного препарата Артро-Актив в форме мягких желатиновых капсул, содержащих экстракт босвеллии в липидной матрице, содержащей БАВ корневищ куркумы и семян сосны кедровой сибирской. Выбран оптимальный режим экстрагирования куркуминоидов, подобран эффективный комплекс антиоксидантов (-токоферол ацетат, аскорбил пальмитат, лецитин и бутилгидрокситолуол), обеспечивающий стабильность препарата к перекисному окислению в течение срока годности.
- Методом ТСХ с постхроматографической оценкой антирадикальной активности куркуминоидов по dpph радикалу впервые установлен синергизм их действия. Изучена фармакокинетика босвеллиевых кислот и куркуминоидов при однократном пероральном применении Артро-Актива. Установлено, что введение экстракта босвеллии в состав липидной матрицы приводит к повышению биодоступности босвеллиевых кислот.
- Разработаны методы качественного и количественного анализа Артро-Актива. Разработан и зарегестрирован проект ТУ на БАД Артро-Актив. В условиях ЗАО «Фармаген» проведена апробация технологии капсул Артро-Актива. Разработан проект ФСП на сухой экстракт босвеллии.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Иванова С.А., Вайнштейн В.А., Каухова И.Е. Особенности массопереноса липофильных БАВ при экстрагировании сырья двухфазной системой экстрагентов // Хим.-фармац. журн. - 2003. -№ 8. -С. 30-34.
- Иванова С.А., Скочипец С.Е., Скочипец М.Е, Вайнштейн В.А., Каухова И.Е., Демченко Ю.Т. Изучение экстракции плодов рябины и шиповника двухфазной системой экстрагентов // Фармация. - 2003.-№6.-С. 23-25.
- Иванова С.А., Шиков А.Н., Пожарицкая О.Н., Макаров В.Г. Исследование состава экстракта босвеллии (Boswellia serrata Roxb.) c применением методов планарной и колоночной хроматографии // Материалы IX Международного съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств природного происхождения" Фитофарм 2005, Санкт-Петербург. - 2005.- С. 537-541.
- Pozharitskaya ON., Ivanova SA., Shikov AN., Makarov VG. Separation and quantification of terpenoids of Boswelia serrata Roxb. extract by planar chromatography techniques (TLC and AMD) // J. Sep. Sci. - 2006.- 29(14).-P. 2245-2250.
- Pozharitskaya O., Karlina M., Ivanova S., Shikov A., Makarov V., Tikhonov V. Plasma analysis of boswellic acids by HPTLC: a useful technique for pharmacokinetic studies // 5 International Symposium on Chromatography of natural Products, Lublin - 2006.-P.183.
- Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Оценка противовоспалительного действия комбинированного природного препарата артрофлекс на модели каррагенинового отека у крыс линии вистар // Вестн. СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2006.- №3(7).- С. 138-142.
- Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Тесакова С.В., Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Противовоспалительная активность и механизм действия препарата «Артро-Актив» // Фармация. - 2007. - №1.- С. 38-41.
- Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Шиков А.Н., Макаров В.Г. Постхроматографическая оценка антиоксидантной активности семян сосны кедровой сибирской Pinus sibirica по dpph радикалу методом тсх // Материалы 3 Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии», Барнаул. - 2007.-С. 216-221.
- Pozharitskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG. Separation and evaluation of free radical-scavenging activity of phenol components of Emblica officinalis extract by using HPTLC-DPPH• method // J. Sep.Sci. - 2007. - 30(9). – P. 1250-1254.
- Pozharitskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG, Galambosi B. Separation and evaluation of free radical-scavenging activity of phenol components of green, brown, and black leaves of Bergenia crassifolia by using HPTLC-DPPH method // J. Sep.Sci. – 2007. – 30 (15). – P. 2447-2451.
- Pozharitskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG. Separation and free radical-scavenging activity of major curcuminoids of Curcuma longa using HPTLC-DPPH method // Phytochem. Anal. – 2007. – DOI: 10.1002 / pca.1035.
- Карлина М.В., Пожарицкая О.Н., Косман В.М., Иванова С.А. Изучение биологической доступности босвеллиевых кислот: in vitro/in vivo корреляция // Хим.-фармац. журн. – 2007. – 41 (11). – С. 38-41.
