WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Стандартизация фукуса пузырчатого (fucus) и настоек гомеопатических матричных, получаемых на его основе

На правах рукописи

саканян карен маисович

СТАНДАРТИЗАЦИЯ ФУКУСА ПУЗЫРЧАТОГО (FUCUS) И НАСТОЕК ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ, ПОЛУЧАЕМЫХ НА ЕГО ОСНОВЕ

15.00.02- фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва, 2008 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук профессор Сокольская Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук Лякина М. Н.

доктор фармацевтических наук Маркарян А. А.

Ведущая организация: Военно-медицинская Академия им. С. М. Кирова, Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится «___» ____________ 2008 г. в на заседании Диссертационного Совета Д 006.070.01 во Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений РАСХН по адресу: 117216, г Москва, ул. Грина,7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР по адресу:117216, г. Москва, ул. Грина, д.7

Автореферат разослан: «___»_________ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук Громакова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы в отечественном практическом здравоохранении наблюдается устойчивая тенденция применения наряду с аллопатическим гомеопатического метода лечения, что в свою очередь, сопровождается появлением на фармацевтическом рынке России отечественных гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС).

Однако, их ассортимент существенно уступает таковому зарубежных гомеопатических препаратов, что обусловлено рядом причин как объективного, так и субъективного характера. К их числу следует отнести отсутствие Российской Государственной Гомеопатической фармакопеи, нормирующей качество отечественных ГомЛС, ограниченный перечень отечественных гомеопатических субстанций различного происхождения, в том числе настоек гомеопатических матричных (НГМ), производство которых может быть организовано на базе отечественных предприятий.

В связи с этим достаточно актуальной задачей отечественной медицинской практики является увеличение ассортимента ГомЛС, назначаемых для профилактики и лечения наиболее выраженных патологий, к числу которых следует отнести нарушение обменных процессов, протекающих в человеческом организме.

Среди растительных объектов, используемых для этих целей в мировой гомеопатической практике, следует отметить различных представителей бурых водорослей. Наиболее часто используются представители рода ламинария - Laminariacae L., которые в настоящее время применяются в отечественной и зарубежной медицинской практике как лекарственные средства и биологически активные добавки (БАД) к пище. Однако не менее интересен с этой точки зрения другой представитель бурых водорослей – Phaeophyta, фукус пузырчатый – Fucus vesiculosus L.

Благодаря высокому содержанию йода, полисахаридов и других биологически активных веществ (БАВ) различные виды бурых водорослей применяются при заболеваниях щитовидной железы, воспалениях лимфатических желез, нарушение обменных процессов приводящих к ожирению.

НГМ Фукус включена в руководство В. Швабе, а также в различные отечественные и зарубежные гомеопатические рецептурные справочники и фармакопеи, в том числе Германии, Великобритании, Франции, Индии и др.

На российском фармацевтическом рынке представлены такие препараты Фукуса, как Fucus vesiculosus – Injeel (forte), Strumeel (forte), Thyreoidea compositum (Heel), капли ЭДАС-107, ЭДАС-907 (в их состав входит разведение Fucus C3).

Основное действие этих препаратов заключается в том, что влияют на нервную и эндокринную системы, на жировой и углеводный обмен и применяются при нарушениях обмена веществ, предрасположенности к избыточной массе тела, ожирении, заболеваниях щитовидной железы.

Химический состав слоевищ Фукуса как лекарственного растительного сырья изучен недостаточно, методики стандартизации отсутствуют. Поэтому, актуальным является комплексное фитохимическое изучение фукуса с использованием современных физико-химических методов, разработка методик стандартизации и их совершенствование, создание нормальной документации.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационного исследования является фармакогностическое изучение слоевищ Фукуса пузырчатого, получение и фитохимическое исследование настоек гомеопатических матричных Фукус, препаратов Фукуса и их стандартизация.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  1. Изучить фитохимический состав свежесобранного и высушенного сырья Фукуса пузырчатого и разработать методики качественного и количественного анализа основных груп БАВ.
  2. Предложить технологию получения и провести исследования химического состава НГМ из свежесобранного и высушенного сырья Фукуса. Разработать методики контроля качества НГМ.
  3. Разработать методики установления подлинности гомеопатических разведений Фукуса.
  4. Провести предварительную оценку фармакологической активности НГМ Фукус и ее разведений.
  5. Оформить проекты Фармакопейных статей на «Фукуса пузырчатого слоевища»; «Фукуса пузырчатого слоевища свежие»; «Fucus vesiculosus настойку гомеопатическую матричную» и «Fucus vesiculosus D1 настойку гомеопатическую матричную».

Научная новизна. Определены основные макро- и микродиагностические признаки сырья, его товароведческие показатели, установлены оптимальные сроки заготовки и условия сушки, для свежезаготовленного сырья – сроки использования и методы консервации.



С применением современных методов химического и физико-химического анализа установлен качественный и количественный состав БАВ свежих и высушенных слоевищ Фукуса пузырчатого. Определено, что в слоевищах Фукуса пузырчатого содержатся соединения йода и полисахариды. Так как полисахариды являются основной группой БАВ для этого растительного сырья, то с применением тонкослойной хроматографии (ТСХ), высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (13С) определен их компонентный состав. Показана необходимость стандартизации лекарственного растительного сырья Фукуса по содержанию в нем полисахаридов (гравиметрический метод), суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу (метод УФ-спектроскопии) и йода (титриметрический метод).

Предложена технология и разработаны показатели качества, а также методы их оценки для НГМ Фукус из свежего и высушенного ЛРС и лекарственных препаратов на их основе. Установлено, что для препаратов Фукуса также целесообразно использовать в качестве основных показателей качества содержание в них свободных сахаров, полисахаридов и йода.

Впервые проведено тестирование НГМ Фукус и их разведений, свободных и связанных моносахаридов с использованием биотест-систем в опытах in vitro, позволившая выявить выраженное антиоксидантное действие анализируемых объектов.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны проекты ФС:

  • «Фукуса пузырчатого слоевища свежие»;
  • «Фукуса пузырчатого слоевища»;
  • «Fucus vesiculosus (Fucus) настойка гомеопатическая матричная»;
  • «Fucus vesiculosus (Fucus) D1 настойка гомеопатическая матричная».

Связь задач исследования с проблемным планом развития фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГУ ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2001-2005 и 2006-2010 г.г».

Основные положения, выносимые на защиту:

  • Результаты исследований химического состава свежесобранного и высушенного сырья Фукуса и НГМ Фукус, приготовленных из него, в сравнительном аспекте;
  • Методики качественного и количественного анализа действующих веществ в ЛРС и НГМ Фукус, их разведениях;
  • Результаты оценки фармакологической активности НГМ Фукус, и их разведений, а также выделенных из них моно- и полисахаридных комплексов;
  • Проекты фармакопейных статей на ЛРС и НГМ Фукус.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Во в в е д е н и и раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы.

В п е р в о й г л а в е на основании литературных данных рассмотрены сведения о ботанико-морфологической характеристике Фукуса и близких ему видов водорослей; химическом составе, фармакологической активности и медицинском применении сырья и настоек гомеопатических матричных (НГМ) Фукуса пузырчатого; методах анализа основных действующих веществ и вопросах стандартизации сырья и НГМ Фукуса.

В разделе П о я с н е н и е к э к с п е р и м е н т у приводится характеристика объектов исследования – свежесобранного и высушенного ЛРС фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.),, заготовленного в 2002 – 2004 гг. в Чупинском заливе Белого моря (вблизи поселка Чупа, Архангельской области). а также НГМ, полученных из этого сырья. Описываются использованные в исследовании методы и приборы, хроматографические системы, сорбенты и реактивы.

В т о р а я г л а в а посвящена товароведческому анализу сырья Фукуса, установлению его морфолого-диагностических признаков и числовых показателей. Впервые подробно описаны внешний вид и диагностически значимые микроскопические признаки сырья Фукуса и его отличия от сырья ламинарии.

В т р е т ь е й г л а в е излагаются результаты фитохимического исследования сырья Фукуса, приводится разработка и обоснование методик качественного и количественного определения суммы полисахаридов, суммы связанных моносахаридов после гидролиза (в пересчете на глюкозу) и содержание йода в сырье Фукуса, а также динамика накопления полисахаридов и йода за один вегетационный период.

В ч е т в е р т о й г л а в е приводятся результаты фитохимического изучения НГМ Фукус, краткая технология их получения, разработка и обоснование методик качественного и количественного определения суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу, а также соединений йода в НГМ Фукус.

Г л а в а п я т ь содержит результаты предварительной оценки фармакологической активности НГМ Фукус, их разведений, а также выделенных из них моно- и полисахаридных фракций, выполненных методом биотестирования.

Ш е с т а я г л а в а посвящена разработке показателей качества и установлению сроков годности ЛРС и НГМ Fucus vesiculosus, методикам идентификации БАВ в гомеопатических разведениях изучаемых настоек.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит таблицы, рисунка и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, библиографии из 217 источников литературы, из которых 52 – на иностранных языках и приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Товароведческий анализ ЛРС Фукуса

Микроскопический анализ. Для микроскопического анализа готовили препараты с поверхности слоевищ Фукуса (ГФ XI изд., вып. 2 с. 277).

Поперечный срез таллома характеризуется наличием корового слоя, состоящего из клеток почти квадратной формы с утолщенными стенками. Далее следуют клетки – псевдоткани с многочисленными округлыми слизистыми вместилищами, а также полостями округлой формы, предназначенными для осуществления функции дыхания. Наличие этих отверстий фиксируется и на продольном срезе таллома.

При изучении анатомического строения органов размножения Фукуса – рецептакул установлено, что они имеют коровый слой по строению аналогичный таковому таллома. Анализ особенностей строения скафидий (концептакул) показал, что их внутренняя часть заполнена слизью, в которой хаотично распределены споры.

Таким образом, в качестве основных анатомо-диагностических признаков высушенного и свежего сырья Фукуса пузырчатого может быть использовано характерное строение клеток корового слоя и псевдоткани таллома, наличие дыхательных отверстий и слизистых вместилищ, а также особенности строения рецептакул и скафидий.

Все вышеописанные микроскопические признаки слоевищ Фукуса подтверждены фотографическими снимками и включены в разработанные фармакопейные статьи «Фукуса пузырчатого слоевища».

Проведено сравнительное изучение числовых показателей (влажность, зола, содержание допустимых примесей, микробиологическая чистота и радиационный контроль) для ЛРС Фукуса пузырчатого.

2. Фитохимическое изучение ЛРС Фукуса

Для ЛРС фукуса разработаны критерии подлинности, включающие качественные реакции на углеводы, соединения йода и тонкослойную хроматографию.

Для обнаружения свободных моносахаров применяли метод ТСХ. В качестве исследуемого раствора использовали свежевыжатый сок из свежих слоевищ (разведенный водой в соотношении 1:2) и спирто-водные извлечения из высушенных слоевищ Фукуса пузырчатого. В качестве свидетелей применяли 0,05 % спиртовые растворы аутентичных образцов моносахаров. Для разделения моносахаров использовали хроматографические пластинки Sorbfil «ПТСХ-П-А» размером 15х15 см. В качестве подвижной фазы применяли смесь растворителей вода-метанол-уксусная кислота ледяная-хлористый этилен в соотношении 10:15:25:50. Зоны адсорбции моносахаров обнаруживали опрыскиванием хроматограммы 0,5 % раствором тимола в 95 % этиловом спирте.

В табл. 1 представлены обобщенные данные по хромато-графическому анализу сырья фукуса на содержание моносахаров.

Таблица 1
Величины Rs зон адсорбции испытуемых растворов и растворов стандартных образцов (по фруктозе) на хроматограммах
Хроматограмма СО моносахаров Хроматограмма сока из свежих слоевищ Фукуса Хроматограмма спиртового извлечения из высушенных слоевищ Фукуса
глюкоза 0,80 0,78
рамноза 1,73 1,74
галактоза 0,75 0,76
арабиноза 1,82 1,84
фруктоза 1,0 1,0




Для уточнения результатов предварительного изучения состава моносахаров в сырье Фукуса с помощью тонкослойной хроматографии проводили их исследование на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "GILSON", ФРАНЦИЯ с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы "Мультихром для "Windows ".

Анализ осуществляли на металлической колонке размером 6,5x300 мм ALLTECHОА-1000 Organic Acids; подвижная фаза-0,005М раствор серной кислоты. Скорость подачи элюента – 0,4 мл/мин. Температура колонки 65°С. Продолжительность анализа 16 мин. Для детектирования моносахаридов применяли УФ-детектор при длине волны 190 нм. Исследование проводили в образцах сока из свежих слоевищ Фукуса пузырчатого и спирто-водного извлечения из сухих слоевищ (табл. 2).

Подготовка пробы: 1 мл сока из свежих слоевищ или спиртового извлечения из сухих слоевищ помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл 0,005М раствора серной кислоты, перемешивали и доводили объем раствора до метки 0,005М раствором серной кислоты, затем перемешивали и фильтровали (исследуемый раствор).

Параллельно готовили серию 0,05 % растворов стандартных образцов в 95 % этиловом спирте. Оценка хроматограммы проводилась по временам удерживания и площади пика, в автоматическом режиме.

На основании данных ВЭЖХ установлено, что в сырье Фукуса пузырчатого идентифицированы свободные сахара – мальтоза, сахароза, лактоза, глюкоза, ксилоза, фруктоза, рамноза и арабиноза. Содержание фруктозы превалирует как в соке из свежих слоевищ (50,63 %), так и в спиртовом извлечении из сухих слоевищ Фукуса (42,18 %).

Таблица 2
Результаты исследования свободных сахаров в сырье Фукуса методом ВЭЖХ
Соединение Время удерживания, мин % содержание в пробе сока % содержание в пробе спиртового извлечения
мальтоза 1,12 6,27 4,14
сахароза 1,24 5,28 4,36
лактоза 11,50 7,94 4,85
глюкоза 13,45 5,21 4,49
ксилоза 14,30 9,84 7,17
фруктоза 14,95 50,63 42,18
рамноза 15,66 9,72 5,32
арабиноза 15,97 5,11 3,48

Для изучения мономерного состава полисахаридов Фукуса была выделена сумма полисахаридов из сырья и проведен ее гидролиз с использованием для этих целей методики, основанной на применении трифторуксусной кислоты (ТФУ).

Дальнейшее исследование качественного и количественного состава полисахаридного комплекса осуществляли методом денситометрии. Изучение качественного состава сахаров проводили с применением следующих систем элюентов: этилацетат-спирт изопропиловый- вода (5:3,2:1,6) и этилацетат-кислота муравьиная-вода (6:1,5:1,5).

Метод денситометрии был использован и для количественной оценки содержания сахаров. Результаты количественного определения приведены в табл. 3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что преобладающими соединениями в составе полисахаридного комплекса являются глюкуроновая кислота и глюкоза.

Таблица 3
Результаты количественного определения моносахаров и их производных в гидролизате полисахаридного комплекса Фукуса
Соединение Количество, в пере-счете на 100 мг гидролизата полисахаридов, полученного из сока Фукуса, мг Количество, в пересчете на 100 мг гидролизата полисахаридов, полученного из спиртового извлечения из Фукуса, мг
1. Кислота глюкуроновая 11,25 1,599
2. Ксилоза 1,32 0,145
3. Арабиноза 0,24 0,0387
4. Мальтоза 1,26 0,134
5. Рамноза 2,25 0,278
6. Глюкоза 9,687 0,845

Для подтверждения данных денситометрии было проведено спектроскопическое исследование суммы полисахаридов на ЯМР -спектрометре.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что полисахаридный комплекс слоевищ Фукуса пузырчатого содержит значительное количество уроновых кислот; они являются преобладающим компонентом. Кроме того, подтверждено наличие в составе полисахаридного комплекса глюкозы, ксилозы, рамнозы, арабинозы, мальтозы, что согласуется с данными денситометрического определения.

Для оценки содержания БАВ в ЛРС Фукуса разработаны методики их количественного определения. Сырье предложено характеризовать по содержанию суммы полисахаридов, суммы моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу, а также по содержанию йода.

Содержание суммы полисахаридов, определяемое методом гравиметрии в пересчете на абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах Фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.) составляет около 35,29 % (свежее сырье) и 27,60 % (высушенное сырье). Ошибка единичного определения c 95% вероятностью методики количественного определения суммы полисахаридов в ЛРС Фукуса не превышает 8,11% (табл.4).

Таблица 4
Метрологические характеристики методики количественного определения полисахаридов в сырье Фукуса пузырчатого
Xср f S2 S Sx Px t P,f) Xср. , %
ЛРС Фукуса пузырчатого (свежее сырье)
35,292 4 3,6407 1,9081 0,8533 0,95 2,78 2,3722 6,72
ЛРС Фукуса пузырчатого (высушенное сырье)
27,602 4 3,2442 1,8012 0,8055 0,95 2,78 2,239 8,11

Для определения содержания суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу и абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах Фукуса пузырчатого была разработана методика дифференциальной УФ-спектроскопии. На рис. 1 представлены спектры поглощения анализируемых компонентов моносахаров с пикриновой кислотой.

 – Спектры поглощения комплекса моносахаров с пикриновой кислотой: 1 –-0

Рис. 1. – Спектры поглощения комплекса моносахаров с пикриновой кислотой: 1 – испытуемый раствор (из высушенных слоевищ); 2 – испытуемый раствор (из свежих слоевищ); 3 – стандартный образец глюкозы.

Оно составляет около 31,84 % (для свежего сырья) и около 27,78 % (для высушенного сырья).

Ошибка единичного определения c 95 % вероятностью методики количественного определения суммы моносахаров в пересчете на глюкозу в ЛРС Фукуса не превышает 4,69 % (табл. 5).

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками глюкозы к сумме полисахаридов Фукуса пузырчатого (табл. 6).

Таблица 5
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу в сырье Фукуса
Xср f S2 S Sx Px t P,f) Xср. , %
ЛРС Фукуса пузырчатого (свежее сырье)
31,844 4 0,28838 0,53701 0,2402 0,95 2,78 0,6676 4,69
ЛРС Фукуса пузырчатого (высушенное сырье)
27,782 4 0,16142 0,40177 0,1797 0,95 2,78 0,4996 4,02
Таблица 6
Результаты опытов с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров в высушенном сырье Фукуса
Взято полисахаридов, г Добавле но глюкозы (г) Должно быть (г) Найде но (г) Ошибка
Абсолют ная (г) Относитель ная (%)
0,2812 0,0703 0,3515 0,3509 – 0,0006 ± 0,171
0,2812 0,1406 0,4218 0,4222 + 0,0004 ± 0,0947
0,2812 0,2109 0,4921 0,49017 – 0,00193 ± 0,394
0,2812 0,2812 0,5624 0,5628 + 0,0004 ± 0,0711

Опыты с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров показали, что относительная ошибка не превышает ошибки единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.

Содержание йода в пересчете на абсолютно сухое сырье, определяемого титриметрическим методом по ГОСТ 26185-84, составляет 0,886% (для свежего сырья) и около 0,780 % (для высушенного сырья).

Ошибка единичного определения c 95 % вероятностью методики количественного определения йода в ЛРС Фукуса не превышает 7,22 % (табл. 7).

Таблица 7
Метрологические характеристики метода количественного определения йода в сырье Фукуса
Xср f S2 S Sx Px t P,f) Xср. , %
ЛРС Фукуса пузырчатого (свежее сырье)
0,8864 4 0,000295 0,01717 0,007679 0,95 2,78 0,02135 5,38
ЛРС Фукуса пузырчатого (высушенное сырье)
0,7800 4 0,00041 0,02025 0,00906 0,95 2,78 0,02517 7,22

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками йода, относительная ошибка определения составила не более ± 0,175 %.

С помощью разработанных методик изучена динамика накопления полисахаридов и йода в ЛРС Фукуса. Полученные результаты свидетельствуют о том, что заготовку слоевищ Фукуса пузырчатого можно осуществлять в течение всего вегетационного периода, то есть с мая по сентябрь.

Результаты выполненных исследований по определению условий и сроков хранения ЛРС Фукуса позволяют сделать вывод о том, что высушенные слоевища Фукуса пузырчатого следует хранить не более 3 лет в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 15° С, а свежие слоевища Фукуса необходимо хранить не более 24 часов при температуре не выше 4° С в холодильной камере.

3. Фитохимическое исследование настоек гомеопатических матричных Fucus

Для получения НГМ Фукуса из свежего и высушенного ЛРС использовали методы 3 и 4а ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные», так как содержание сока в свежем и высушенном сырье составило менее 60 %, установлено наличие слизей. Изучение компонентного состава НГМ Фукус пузырчатого осуществляли с помощью методов ТСХ, ВЭЖХ, и дифференциальной спектроскопии в УФ-области спектра.

Анализ свободных моносахаров, содержащихся в НГМ Фукус, осуществляли методом ТСХ на пластинках Sorbfil «ПТСХ-П-А» размером 15х15 см. В качестве свидетелей применяли 0,05% спиртовые растворы аутентичных образцов моносахаров. Зоны адсорбции моносахаров обнаруживали опрыскиванием хроматограммы 0,5 % раствором тимола в 95 % этиловом спирте.

В табл. 8 представлены обобщенные данные по хроматографи-ческому анализу настоек гомеопатических матричных Фукус на содержание моносахаров.

Таблица 8
Величины Rs зон адсорбции испытуемых растворов и растворов СО моносахаров (по фруктозе) на хроматограммах НГМ Fucus
Хроматограмма СО моносахаров Хроматограмма НГМ из свежего сырья Хроматограмма НГМ из высушенного сырья
Вода-метанол-уксусная кислота безв.-этиленхлорид (10:15:25:50)
глюкоза 0,82 0,80
рамноза 1,75 1,72
галактоза 0,76 0,72
арабиноза 1,84 1,80
фруктоза 1,0 1,0

Для уточнения результатов предварительного изучения состава свободных моносахаров в НГМ Фукус с помощью тонкослойной хроматографии проводили их исследование на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "GILSON", ФРАНЦИЯ с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы "Мультихром для "Windows".

Оценка хроматограммы проводилась, по временам удерживания и площади пика, в автоматическом режиме, в условиях, аналогичных условиям проведения эксперимента для сырья Фукуса.

Подтверждено наличие в составе свободных сахаров глюкозы, галактозы, ксилозы, рамнозы, арабинозы, мальтозы, сахарозы и фруктозы.

Содержание суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу определяемое методом дифференциальной спектрофотометрии составляет около 5,94 % (для НГМ из свежего сырья) и около 4,37 % (для НГМ из высушенного сырья). Ошибка единичного определения c 95 % вероятностью методики количественного определения суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу в НГМ Фукус не превышает 3,66 % (табл. 9).

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками глюкозы к НГМ из высушенного сырья Фукуса (табл. 10).

Таблица 9
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы связанных моносахаров в пересчете на глюкозу в НГМ Фукус
Xср f S2 S Sx Px t P,f) Xср. , %
НГМ Фукуса пузырчатого (из свежего сырья)
5,9388 4 0,003751 0,06125 0,027391 0,95 2,78 0,07615 2,87
НГМ Фукуса пузырчатого (из высушенного сырья)
4,3672 4 0,003313 0,05756 0,02574 0,95 2,78 0,07156 3,66
Таблица 10
Результаты опытов с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров в НГМ из высушенного сырья Фукус
Взято полисахаридов, г Добавле но глюкозы (г) Должно быть (г) Найде но (г) Ошибка
Абсолют ная (г) Относитель ная (%)
0,04455 0,01114 0,05569 0,05575 + 0,00006 ±0,108
0,04455 0,02228 0,06683 0,06678 – 0,00005 ±0,0748
0,04455 0,03342 0,07797 0,07802 + 0,00005 ±0,0641
0,04455 0,04455 0,08910 0,08901 – 0,00009 ±0,101

Опыты с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров показали, что относительная ошибка не превышает ошибки единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.

Содержание йода, определяемое титриметрическим методом, использованным для анализа ЛРС составляет около 0,184 % для НГМ из свежего сырья и около 0,149 % для НГМ из высушенного сырья. Ошибка единичного определения c 95% вероятностью методики количественного определения йода в НГМ Фукус не превышает соответственно 6,76 % (табл. 11).

Таблица 11
Метрологические характеристики методики количественного определения йода в НГМ Фукус
Xср f S2 S Sx Px t P,f) Xср. , %
НГМ Фукуса пузырчатого (из свежего сырья)
0,1844 4 0,000078 0,00883 0,00395 0,95 2,78 0,01098 5,95
НГМ Фукуса пузырчатого (из высушенного сырья)
0,1494 4 0,000066 0,00812 0,00363 0,95 2,78 0,0101 6,76

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки проведены опыты с добавками йода. Ошибка опытов с добавками не превышает ± 0,106 %.

4. Предварительная оценка фармакологической активности НГМ Fucus, их разведений а также моно- и полисахаридных комплексов.

Первичный скрининг по определению биологической активности ана­лизируемых объектов проводили с помощью запатентованных биотест-систем в опытах in vitro в НИЦ БМТ ВИЛАР.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об активации антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и глютатионпероксидазы (ГП) с помощью настоек Fucus, а также разведений НГМ и фракций поли- и моносахаров, содержащихся в НГМ. Почти для всех изученных гомеопатических образцов (исключение составляет влияние свободных моносахаров на скорость СОД – реакции) в активности ферментов имеется выраженный максимум, соответствующий оптимальной концентрации вещества, а увеличение или уменьшение концентрации приводит к снижению эффекта. Матричные настойки, изначально имеющие высокую концентрацию действующих веществ, как правило, ингибирует скорость реакций ферментов антиоксидантной защиты. Поэтому, тестирование только настоек может вызвать представление о направленности фармакологического действия гомеопатического препарата, который обычно применяется в виде потенцированных растворов.

Тестирование с помощью биотест-систем в опытах in vitro показало, что матричные настойки и их разведения, полученные из высушенных слоевищ Фукуса, оказывают более выраженный эффект на ферменты антиоксидантной защиты. При этом, препараты из высушенных слоевищ значительно сильнее по сравнению с контролем увеличивают скорости СОД-, КАТ- и ГП-реакций, чем препараты из свежих слоевищ.

Поли- и моносахариды, содержащиеся в ЛРС и НГМ, в большей степени активируют ферменты СОД, ГП и КАТ, чем настойки гомеопатические матричные и их разведения. При этом они, в отличие от настоек, приготовленных из высушенных и свежих слоевищ, практически не оказывают влияния на скорость ГР-реакции.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии у анализируемых объектов выраженной антиоксидантной активности и способности оказывать влияние на липидный обмен.

5. Разработка показателей качества и установление срока годности ЛРС, НГМ Fucus vesiculosus. Анализ гомеопатических разведений.

Для контроля качества ЛРС Фукуса пузырчатого предложены следующие показатели: описание ЛРС, диагностически значимые признаки, качественные реакции, числовые показатели, количественное определение БАВ – суммы полисахаридов, суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу и содержание йода.

Предложены следующие нормативы: влажность для свежего сырья – не менее 50 %, для высушенного сырья – не более 12 %; содержание золы общей не более 14 %; золы, не растворимой в 10 % хлористоводородной кислоте - не более 4 %; содержание минераль-ной и органической примеси не более 1,5 %; содержание суммы полисахаридов – не менее 28 %; содержание суммы моносахаридов после гидролиза (в пересчете на глюкозу) – не менее 27 %; содержание йода – не менее 0,50 %.

Предлагается установить срок годности высушенного ЛРС 3 года, срок использования свежего ЛРС – 24 часа.

Контроль качества НГМ Фукус регламентируется по следующим показателям: состав настойки; описание; критерии подлинности; сухой остаток, содержание спирта; плотность; тяжелые металлы; микробиологическая чистота; количественное определение суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу; содержание йода; срок годности.

Разработка показателей качества настойки проводилась на пяти сериях препарата. Критерии подлинности настоек включают реакции на углеводы с реактивом Фелинга (выпадение красно-оранжевого осадка, указывающее на наличие восстанавливающих сахаров); с дифениламином в кислой среде (на кетогруппу в углеводном остатке), а также с помощью метода ТСХ.

Хроматография в тонком слое сорбента проводится на пластинках Sorbfil «ПТСХ-П-А» размером 15х15 см. В качестве свидетелей применяли 0,05% спиртовые растворы аутентичных образцов моносахаров. Зоны адсорбции моносахаров обнаруживали опрыскиванием хроматограммы 0,5 % раствором тимола в 95 % этиловом спирте.

Содержание сухого остатка должно быть не менее 0,4 %, плотность – в пределах от 0,8325 до 0,8350. Содержание тяжелых металлов составляет не более 0,001%.

Количественное определение суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу было проведено по разработанной нами методике; в НГМ Фукус пузырчатого содержание должно быть не менее 4 %.

В настойках проведено испытания на микробиологическую чистоту. Результаты испытаний показали, что в 1 мл препаратов содержание сапрофитных форм бактерий не превышает 10. Бактерии сем. Enterobaceriaceae, St. aureus, Ps. aeruginosa не обнаружены. Настойки соответствуют требованиям, предъявляемым к данной лекарственной форме.

Нами проведено изучение состояния НГМ Фукус пузырчатого в процессе естественного хранения по всем показателям качества, регламентируемым проектом ФС. Срок годности НГМ Фукус установлен 2 года. Наблюдение за настойками в процессе хранения продолжаются.

Для оценки подлинности гомеопатических разведений Fucus, которые применяется в гомеопатической практике в качестве монопрепаратов, и для изготовления комплексных лекарственных средств, использованы качественные реакции и испытание методом ТСХ, при этом важным является установление наличия веществ, обуславливающих терапевтический эффект, в том числе моносахаров. Разведения настоек Fucus готовили по правилам гомеопатической технологии (ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные»).

Первое десятичное (1D) разведение Fucus представляет собой прозрачную жидкость красно-коричневого цвета, со своеобразным запахом. Второе десятичное разведение (2D) - прозрачная жидкость светло-коричневого цвета практически без запаха; третье десятичное разведение (3D) - жидкость бледно-желтого цвета, спиртового запаха и четвертое десятичное разведение (4D) - бесцветная жидкость спиртового запаха.

Подлинность первого, второго, третьего, четвертого и последующих десятичных разведений (1D, 2D, 3D, 4D и т.д.) фукуса пузырчатого предлагается устанавливать спектрофотометрическим методом.

Проведенные нами исследования позволили установить, что разведения до D7 имеют характерный УФ-спектр поглощения, который в дальнейшем может быть использован для оценки подлинности препаратов (рис. 2). Кроме того, могут быть использо-ваны реакции подлинности на присутствие моносахаров с последующим снятием спектра в УФ-свете (рис. 3). Для оценки количественного содержания свободного и связанного йода, а также полисахаридов могут быть использованы методики, предложенные для анализа НГМ Фукус.

 – УФ-спектр D7 разведений НГМ Фукус – УФ-спектр фракции-1

Рис. 2. – УФ-спектр D7 разведений НГМ Фукус

 – УФ-спектр фракции моносахаров ОБЩИЕ ВЫВОДЫ Проведен-2

Рис. 3. – УФ-спектр фракции моносахаров

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

  1. Проведен товароведческий анализ ЛРС Фукуса, установлены диагностически значимые микроскопические признаки сырья «Фукуса пузырчатого слоевища», определены числовые показатели для ЛРС Фукуса.
  2. С помощью методов физико-химического анализа (ТСХ, ВЖХ, ЯМР С13-спектроскопии и др.) изучен в сравнительном аспекте углеводный состав ЛРС Фукуса, как свежего, так и высушенного, и НГМ, изготовленных из него.
  3. Разработаны методики количественного определения суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу в слоевищах Фукуса пузырчатого свежих и высушенных и НГМ Фукус с помощью метода дифференциальной УФ-спектрофотометрии, а также содержания йода с помощью титриметрического метода.
  4. По результатам предварительной оценки фармакологической активности НГМ Fucus определено, что настойки гомеопатические матричные слоевищ Фукуса пузырчатого, их разведения, а также моно- и полисахаридные фракции, выделенные из них, обладают выраженной антиоксидантной активностью.
  5. Установлен срок годности высушенного ЛРС Фукуса – 3 года, срок использования свежего сырья Фукуса – 24 часа, НГМ – 2 года.
  6. По результатам исследований разработаны проекты ФС на ЛРС Фукуса: «Фукуса пузырчатого слоевища свежие» и «Фукуса пузырчатого слоевища»; а также на НГМ Фукуса: «Fucus vesiculosus настойка гомеопатическая матричная» и «Fucus vesiculosus D1 настойка гомеопатическая матричная» предназначенных для включения в Государственную гомеопатическую фармакопею РФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Сокольская Т.А., Саканян К.М., Фукус пузырчатый (Fucus vesiculosus L.) в отечественной гомеопатической практике и методы оценки качества в гомеопатической практике //Тезисы докладов XVI Московской международной гомеопатической конференции, Москва, 27–29 января 2007 г., С. 119-120.
  2. Саканян К.М., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Определение показателей качества настойки матричной гомеопатической Фукус //Сборник материалов региональной научно-практичес-кой конференции с международным участием, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ, Курск, 15 декабря 2007 г., С. 312-314.
  3. Саканян К.М., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. Fucus vesiculosus L. и его применение в традиционной, народной и официнальной медицине //Сборник научных трудов конгресса «Традиционная медицина», Москва, 1–3 марта 2007 г., С. 82-85.
  4. Саканян К.М., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. Изучение анатомо-диагностических признаков лекарственного раститель-ного сырья – Фукуса пузырчатого слоевищ (Fucus vesiculosus L.) //Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Пятигорск, 2007 г., С. 106-108.
  5. Саканян К.М., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Анализ и стандартизация настойки матричной гомеопатической Фукус //Вестник Бурятского Государственного университета, Улан-Удэ, 2007 г., вып. 8, С. 25-29.
  6. Саканян К.М., Еникеева Р.А., Гаккель В.А., Сокольская Т.А. Некоторые гомеопатические препараты в отечественной медицинской практике //Вестник Российской Военно-медицинской академии, С-Пб., 2007 г., №1 (17), С. 480-481.
  7. Саканян К.М. Настойка Фукус и методы ее стандартизации //Сборник научных трудов «Российский гомеопатический съезд», Москва, 19–21 октября 2007 г., С.216-217.


 





<


 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.