Разработка специализированного продукта с использованием антиоксидантов природного происхождения для питания спортсменов с пециальность

На правах рукописи

Манукьян Грант Гарикович

Разработка специализированного продукта

с использованием антиоксидантов природного происхождения для питания спортсменов

Специальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва 2009

Работа выполнена на кафедре «Технология продуктов детского, функционального и спортивного питания» ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Научный руководитель:

Лауреат Государственных премий СССР и РФ,

доктор технических наук, профессор Э.С. Токаев

Официальные оппоненты:

доктор технических наук Г.Н. Румянцева

кандидат медицинских наук В.Д. Городецкий

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный

университет пищевых производств»

Защита диссертации состоится «23» декабря 2009 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии (109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Автореферат разослан «18» ноября 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат технических наук, профессор А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Конкуренция в современном спорте вызывает постоянное увеличение объемов и интенсивности нагрузок спортсменов, зачастую находящихся в экстремальных условиях. Это обуславливает поиск новых путей комплексной поддержки организма спортсменов. Рациональное и планомерное применение средств восстановления как в течение годичного цикла, так и в отдельные периоды, во многом определяет эффективность всей системы их подготовки.

При повышенных физических нагрузках спортсменов защитные системы их организма не всегда могут адекватно отвечать на стресс, в результате резко повышается риск развития нарушений в работе систем и органов. Одними из главных средств восстановления спортсменов являются биологически активные добавки к пище и специализированные продукты, облегчающие переносимость и сокращающие отрицательные последствия физических и психоэмоциональных нагрузок. В связи с этим, актуальными становятся исследования новых биологически активных веществ, новых форм известных веществ и их источников.

На данный момент одним из эффективных средств восстановления организма после повышенных физических нагрузок являются биологически активные вещества, обладающие антиоксидантными свойствами. Среди не допинговых (разрешенных) антиоксидантных препаратов, которые могут быть рекомендованы при интенсивных физических нагрузках, следует выделить растительные экстракты, так называемые биофлавоноиды. Механизмы действия биофлавоноидов различны и в значительной степени не выяснены окончательно до сих пор. Биофлавоноиды значительно облегчают переносимость нагрузок, повышают выносливость и устойчивость к различным неблагоприятным факторам (жара, холод, жажда, голод, инфекция, психологические стрессы, физические нагрузки и т.п.).

В спортивном питании антиоксиданты (АО) применяются в системе подготовки для ускорения адаптации к повышенным нагрузкам и восстановления организма после них, когда существует реальная опасность перетренированности, ослабления иммунной системы и вследствие этого опасность развития различных заболеваний. Это связано как с ускорением обмена веществ, за счет интенсивной мышечной деятельности, так и с увеличением потребления кислорода.

Исследованию АО природного происхождения посвящено множество фундаментальных и прикладных работ в области биотехнологии и пищевой биотехнологии (В.А. Рогинский, Л.Г. Станкевич, И.И. Земцова, А.Б. Лисицын, Е.Б. Бурлакова, Н.А. Тюкавкина, Л.Ф. Митасева, П.С. Дегтярев, И.А. Рогов, Е.И. Титов, Н.И. Дунченко, А.А. Коренкова, Э.С. Токаев, Э.Г. Розанцев, В.А. Тутельян, L.J. Machlin, A. Bendich и др.).

Теоретической предпосылкой для использования продуктов этой категории в целях коррекции физической работоспособности спортсмена является способность АО препятствовать чрезмерной активации свободнорадикального окисления липидов клеточных и субклеточных мембран (перекисного окисления липидов).

Из литературных данных известно, что зачастую отдельный АО даже в больших количествах не так эффективен, как комплекс АО в определенных пропорциях. При этом наиболее выраженными свойствами могут обладать комплексы, разработанные с использованием АО нескольких механизмов действия.

Таким образом, изучение свойств АО и их синергизма для ингибирования свободнорадикального окисления липидов, при разработке специализированных продуктов для питания спортсменов, актуально и перспективно.

Цель работы. Целью диссертационной работы является создание специализированного продукта с использованием антиоксидантов природного происхождения для питания спортсменов, разработанного с учетом синергизма и механизмов действия антиоксидантов.

Основные задачи исследования.

1. Обосновать выбор компонентов с целью создания специализированного продукта для питания спортсменов.
2. Определить концентрации антиоксидантов в растительных экстрактах различного происхождения.
3. Изучить антиоксидантные свойства растительных экстрактов на модельной липидной системе для выявления наиболее активных ингибиторов процесса окисления.
4. Изучить синергизм антиоксидантов различных механизмов действия и химической природы, а также выявить наиболее эффективные соотношения антиоксидантов.
5. Разработать рецептуру антиоксидантного комплекса и сравнить его с другими продуктами.
6. Выработать опытную партию продукта и провести клинические испытания разработанного продукта в практике спортивной медицины.
7. Разработать техническую документацию на продукт и рекомендации по его применению.

Научная новизна. В результате исследований состава растительных экстрактов, определено суммарное количество антиоксидантов. Полученные данные позволили ранжировать исследованные экстракты. Установлено, что наибольшая концентрация антиоксидантов содержится в образце с содержанием дигидрокверцетина (ДГК) 92 %.

Изучены процессы ингибирования окисления липидов с помощью выбранных растительных экстрактов. Получены данные, отражающие динамику накопления продуктов окисления во времени, и определены рациональные концентрации выбранных экстрактов, составляющие: для дигидрокверцетина (92 %) – 0,05 %; для экстракта зеленого чая (95 % полифенолов) – 0,15 %; для экстракта зеленого чая (40 % EGCG) – 0,1 %; для экстракта виноградной косточки (30 % OPC) – 0,05 и 0,1 %; для экстракта виноградной косточки (95 % полифенолов) – 0,1 %; для VinOserae – 0,1 %; для VinOgrape – 0,1 %; для экстракта розмарина – 0,15 %.

Установлено, что из всех исследованных образцов растительных экстрактов, наиболее активно ингибирует процессы перекисного окисления липидов образец дигидрокверцетина (92 %) в концентрации 0,05 %.

Выявлен синергизм антиоксидантов различных механизмов действия и химической природы при ингибировании процесса окисления липидов и установлены рациональные соотношения ДГК с: витамином С – 1:0,8; витамином Е – 1:0,2; витамином А – 1:0,01; селеном - 1:0,0008; цинком – 1:0,3; L-карнозином – 1:6.

В результате клинических испытаний показано, что его курсовое применение вызывает тонизирующее, иммуномодулирующее и антиоксидантное действие на организм спортсменов: ускоряются процессы восстановления и адаптации к физическим нагрузкам, повышается иммунитет спортсменов после истощающих физических нагрузок.

Практическая значимость. На основании результатов исследований антиоксидантных свойств и синергизма выбранных компонентов, а также норм физиологических потребностей организма спортсменов, разработана рецептура антиоксидантного комплекса, содержащего: ДГК, L-карнозин, селенопиран, цитрат цинка и витамины А, С, Е. Экспериментально подтверждена его эффективность в сравнении с другими продуктами этой категории.

Разработаны техническая документация на «Антиоксидантный комплекс» ТУ 9197-010-29303017-09 и рекомендации по его применению, заключающиеся в необходимых дозировках и продолжительности курса приема продукта.

Клинические испытания продукта показали положительное влияние продукта, выраженное в повышении физической работоспособности и снижении негативных последствий интенсивных физических нагрузок.

Освоены и внедрены в учебный процесс, при проведении лабораторных работ, методика определения массовой доли антиоксидантов в экстрактах растений, биологически активных добавках, напитках и пищевых продуктах и методика определения концентрации малонового диальдегида.

Апробация работы. Основные положения работы и результаты исследований были представлены на: VI-VII Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007, 2008); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки с.-х. сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009).

Получен грант ассоциации «Университетский комплекс прикладной биотехнологии» за 2008 г.

Подана заявка на патент № 2009142020 «Антиоксидантный комплекс».

Публикации. По основным материалам исследований опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка использованной литературы, содержащего 136 источников информации, в том числе 52 зарубежных авторов. Основная часть работы изложена на 123 страницах, содержит 17 таблиц, 20 рисунков и приложения.

Содержание диссертационной работы

Введение. Обоснована актуальность темы, определены основные направления исследований, цель, задачи, научная новизна и практическая значимость диссертационной работы.

Глава 1. Обзор литературы. Обобщены литературные данные отечественных и зарубежных авторов, в которых отражены общие теоретические представления об окислении липидов, о влиянии свободных радикалов и продуктов окисления на здоровье человека. Обобщены сведения об антиоксидантах, их источниках, составе, свойствах, товарных формах.

Приведена классификация антиоксидантов. Описаны антиоксиданты, активно применяемые в спортивной практике. Проанализированы механизмы действия всех классов антиоксидантов. Показан характер проблем, связанных с недостатком антиоксидантов в пище.

Глава 2. Организация эксперимента, объекты и методы исследования.

Исследования проводились на кафедре «Технологии продуктов детского, функционального и спортивного питания» и в ПНИЛЭФМОПП Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Обоснованы и даны характеристики объектов исследований; обоснован комплекс исследуемых показателей антиоксидантной активности и изложены методики их определения; представлена схема эксперимента (рис. 1), а также поэтапно, в соответствии с главами диссертации, описана методология исследований.

Объектами исследований являлись образцы антиоксидантов, представляющих собой экстракты растений, готовые препараты биологически активных веществ и антиоксидантные комплексы отечественных и зарубежных производителей:

• антиоксиданты фирмы «Naturex», Франция:

• ЭВК – экстракт виноградной косточки (95 % полифенолов);
• ЭВК-30 – экстракт виноградной косточки (95 % полифенолов, 30 % OPC);
• ЭЗЧ – экстракт зеленого чая (95 % полифенолов);
• ЭЗЧ-40 – экстракт зеленого чая (95 % полифенолов, 40 % EGCG);
• ЭР – экстракт розмарина (22 % карнозиновой кислоты);
• ЭТ – экстракт токоферолов (28 % альфа-токоферола);

• ДГК – дигидрокверцетин, экстракт древесины сибирской лиственницы (85; 90; 92 и 94 % дигидрокверцетина, НПФ «Флавит», Россия);
• VinOserae – экстракт виноградной косточки (95 % полифенолов, «BiOserae», Франция);
• VinOgrape – экстракт виноградной косточки (95 % полифенолов, «BiOserae», Франция);

Рис. 1. Схема проведения исследований

1. определение массовой доли антиоксидантов в экстрактах растений;
2. определение перекисного числа;
3. определение концентрации малонового диальдегида

• ЭВК-40 – экстракт виноградной косточки (95 % полифенолов, 40 % ОРС, «La Gardonnengue S.C.A», Франция);
• ЭШ – экстракт шиповника («Frutarom», Швейцария);
• ЭА – экстракт ацеролы («Plantextract», Германия);
• L-карнозин (99 % карнозина, «WIRUD Co Limited», Китай);
• Селенопиран (24 % селена, «Биокор», Россия);
• Цинка цитрат дигидрат (32,1 % цинка, «Sigma-Aldrich», Германия);
• Витамин С – аскорбиновая кислота («DSM», Швейцария);
• Витамин А ацетат, сухой (0,15 г ретинола/г, «DSM», Швейцария);
• Витамин Е, сухой (50 % dl--токоферола ацетата, «DSM», Швейцария);
• «Vinitrox» – антиоксидантный комплекс, содержащий экстракты винограда и яблока («BiOserae», Франция);
• «Рефорс» – антиоксидантный комплекс из сухих экстрактов ягод черной смородины, черники и цельного зерна овса; дигидрокверцетина; креатина; витаминов А, В1, В2, В6, фолиевой кислоты, В12, Е; микро- и макроэлементов: кальция, калия, магния, железа, цинка, селена (НПФ «Флавит», Россия).

В качестве модельной липидной системы для исследования антиоксидантных свойств выбрано сливочное масло с массовой долей жира 82,5%. Этот выбор объясняется высоким содержанием жира в продукта и его относительной устойчивостью к нежелательному воздействию микроорганизмов, что позволяет наглядно показать процесс ингибирования окисления липидов с помощью антиоксидантов.

При изучении свойств объектов исследований использовали следующие методики: определение массовой доли антиоксидантов в экстрактах растений и биологически активных добавках (1) – амперометрическим методом измерения массовой доли антиоксидантов с помощью прибора «ЦветЯуза 01-АА», основанном на измерении силы электрического тока, возникающего при окислении молекул антиоксиданта на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале, и использовании градуировочного графика зависимости выходного сигнала от концентрации галловой кислоты; определение перекисного числа (2) – по методу, основанному на реакции продуктов окисления с йодистым калием в растворе уксусной кислоты и хлороформа с последующим количественным определением выделившегося йода раствором тиосульфата натрия; определение концентрации малонового диальдегида (3) – по методу, основанному на образовании окрашенных веществ в результате взаимодействия малонового диальдегида с 2-тиобарбитуровой кислотой и на измерении интенсивности развивающейся окраски на спектрофотометре.

Опыты были проведены в 3–5-кратной повторности. Эмпирические уравнения аппроксимации зависимостей накопления малонового диальдегида в модельных образцах с растительными экстрактами были получены с помощью программы MathCad v.14.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Изучение состава и свойств растительных экстрактов

3.1. Определение массовой доли антиоксидантов в растительных экстрактах

Химический состав растительных экстрактов зависит от вида растительного сырья, почвенно-климатических условий произрастания, воздействия факторов окружающей среды, технологии сбора, обработки, хранения и способа экстрагирования. Перечисленные факторы влияют на функциональные свойства экстрактивных антиоксидантных веществ.

Из всего многообразия представленных на рынке растительных экстрактов были выбраны образцы, имеющие высокое содержание активных веществ и отвечающие стандартам качества и безопасности. Также учитывалась возможность использования их при производстве питания для спортсменов.

Целью данного этапа исследования являлось определение содержания антиоксидантов в растительных экстрактах, отвечающих за их активность. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1

Опытный образец		Массовая доля антиоксидантов, мг/г
1. ЭВК (экстракт виноградной косточки)		277,3±1,3
2. ЭВК-30 (экстракт виноградной косточки)		282,6±1,8
3. ЭЗЧ (экстракт зеленого чая)		436,5±2,0
4. ЭЗЧ-40 (экстракт зеленого чая)		386,5±1,3
5. ЭР (экстракт розмарина)		214,2±1,5
6. ЭТ (экстракт токоферолов)		101,5±2,4
7. ДГК (85% дигидрокверцетина)		474,9±1,1
8. ДГК (90% дигидрокверцетина)		467,2±1,6
9. ДГК (92% дигидрокверцетина)		498,0±1,8
10. ДГК (94% дигидрокверцетина)		479,8±2,2
	11. VinOserae (экстракт виноградной косточки)	235,8±1,9
	12. VinOgrape (экстракт виноградной косточки)	221,4±1,6
	13. ЭВК-40 (экстракт виноградной косточки)	155,3±1,2
	14. ЭА (экстракт ацеролы)	83,2±2,3
	15. ЭШ (экстракт шиповника)	46,7±1,1

Из числа изученных растительных экстрактов лучшими оказались образцы дигидрокверцетина во всех четырех концентрациях, однако для дальнейшего изучения был выбран только образец с содержанием дигидрокверцетина – 92 %, где были получены наибольшие значения по содержанию антиоксидантов.

Помимо этого, из числа всех исследованных экстрактов для дальнейшего изучения антиоксидантной активности на модельной липидной системе были выбраны также образцы других экстрактов, имевших концентрацию антиоксидантов выше 200 мг/г.

3.2. Исследование антиоксидантной активности растительных экстрактов на модельной липидной системе.

Антиоксидантную активность (АОА) определяли путем изучения влияния экстрактов на скорость окисления липидов. Определяли показатели перекисного числа (ПЧ), характеризующего накопление первичных продуктов распада липидов, и по изменению показателей концентрации малонового диальдегида (МДА), характеризующего накопление вторичных продуктов распада липидов.

Показатель количества продуктов окисления обратно пропорционален показателю активности антиоксиданта. Таким образом, большое количество продуктов свидетельствует о слабом действии антиоксиданта и, наоборот, высокой активности антиоксиданта соответствует низкий уровень продуктов окисления.

Максимальную активность антиокислитель проявляет в определенной концентрации. Поэтому одной из задач данного исследования являлось определение рациональной концентрации образца, при которой наблюдается наибольший антиоксидантный эффект.

Каждый образец антиоксиданта вносили в концентрациях 0,05; 0,1 и 0,15 % на 100 г модельной системы (в пересчете на массовую долю жира) и помещали в термостат при температуре 37 °С, а также готовили контрольные пробы без добавления антиоксиданта, которые хранили вместе с остальными образцами при тех же условиях. Выбор диапазона концентраций основан на данных научной литературы и рекомендаций к антиоксидантам.

Каждую неделю в течение месяца проводили измерения по указанным выше методикам. На основании статистически обработанных данных, полученных в ходе исследования, выполнены графические зависимости. На рис. 2 и 3 представлена динамика накопления первичных (ПЧ) и вторичных (МДА) продуктов окисления в модельных липидных системах, содержащих исследуемые растительные экстракты.

Установлено, что характер зависимости накопления продуктов окисления во времени для каждого вида антиоксидантов индивидуален. Для каждого вида антиоксиданта установлена рациональная концентрация, при которой проявляется максимальная АОА. Установлено, что динамика накопления первичных продуктов окисления (ПЧ) и проявление растительными экстрактами антиоксидантных свойств сходны с динамикой накопления вторичных продуктов окисления (МДА).

В результате исследования получены данные, отражающие динамику накопления продуктов окисления во времени для каждого образца растительного экстракта. Определены рациональные концентрации выбранных экстрактов, составляющие: ДГК (92 %) – 0,05 %; ЭЗЧ – 0,15 %; ЭЗЧ-40 – 0,1 %; ЭВК-30 – 0,05 и 0,1 %; ЭВК – 0,1 %; VinOserae – 0,1 %; VinOgrape – 0,1 %; ЭР – 0,15 %.

Сравнительный анализ результатов значений ПЧ и МДА опытных образцов относительно контрольных (без внесения антиоксидантов) (рис. 2, 3), показал, что лучше всего себя проявили образцы ДГК, ЭЗЧ-40, ЭВК, VinOserae,

Рис. 2. Динамика накопления первичных продуктов окисления (ПЧ) в модельных липидных системах, содержащих растительные экстракты

Рис. 3. Динамика накопления вторичных продуктов окисления (МДА) в модельных липидных системах, содержащих растительные экстракты

ранжированные по антиокислительной способности в следующей последовательности:

1. ДГК в концентрациях: 0,05 % (на 28-е сутки хранения ПЧ образца ДГК 0,05 % было меньше ПЧ контроля в 2,53 раза, а МДА в 1,94 раз); 0,1 % (ПЧ в 2,28 раза, МДА в 1,84 раз) и 0,15 % (ПЧ в 2,18 раза, МДА в 1,79 раз).
2. ЭЗЧ-40 в концентрации 0,1 % (на 28-е сутки хранения ПЧ образца ЭЗЧ-40 было меньше ПЧ контроля в 1,71 раз, а МДА в 1,7 раз).
3. ЭВК в концентрации 0,1 % (на 28-е сутки хранения ПЧ образца ЭВК было меньше ПЧ контроля в 2 раза, а МДА в 1,57 раз).
4. VinOserae в концентрации 0,1 % (на 28-е сутки хранения ПЧ образца VinOserae было меньше ПЧ контроля в 1,92 раза, а МДА в 1,57 раз)

Известно, что антиоксиданты природного происхождения, как правило, оказывают положительный эффект в больших дозах. С другой стороны, большинство соединений данной группы характеризуется двухфазным действием, т.е. антиоксидантный эффект при превышении некоторой пороговой величины сменяется прооксидантным.

В случае с образцом ДГК, помимо наибольшей АОА, отмечены еще и незначительная разница значений между концентрациями и высокий показатель активности при малой концентрации (0,05 %). Из этого можно сделать вывод, что образец ДГК действует в достаточно широком диапазоне концентраций, что очень удобно при разработке и производстве продуктов.

В результате данного этапа исследования был выбран образец дигидрокверцетина с концентрацией 0,05 %, как наиболее яркий представитель класса биофлавоноидов. Дальнейшие опыты были направлены на изучение синергизма компонентов предполагаемого антиоксидантного комплекса с использованием образца дигидрокверцетина и антиоксидантов других механизмов действия и химической природы.

Глава 4. Исследование синергизма антиоксидантов различного

механизма действия и химической природы

В качестве рабочей гипотезы использованы данные о различии механизмов действия АО. Все АО по механизму действия разделены на АО прямого и косвенного действия. Антиоксиданты прямого действия можно классифицировать по пяти основным классам:

1. Доноры протона – вещества с легкоподвижным атомом водорода, которые связывают свободные радикалы в менее активные соединения. В качестве представителей этого класса были выбраны: дигидрокверцетин, витамины С, Е.
2. Полиены – это вещества с несколькими ненасыщенными связями, которые способны взаимодействовать с различными свободными радикалами, ковалентно присоединяя их по двойной связи. Обладают невысокой антиоксидантной активностью, но сочетание с антиоксидантами – донорами протона приводит к синергичному усилению антиоксидантного эффекта смеси. Представитель: витамин А.
3. Катализаторы – эффективны в низких концентрациях, могут использоваться в небольших дозах, их эффект в организме сохраняется дольше, а вероятность проявления побочного действия у них низкая. Представители: селен (селенопиран) и цинк (цитрат цинка).
4. Ловушки радикалов – антиоксиданты, которые имеют сродство к какому-то определенному свободнорадикальному продукту (ловушки синглетного кислорода, гидроксил-радикала и др.). Представители: дигидрокверцетин, L-карнозин, селен, витамины А, С, Е.
5. Комплексообразователи (хелаторы) – ингибируют металлозависимые реакции свободнорадикального окисления за счет связывания катионов металлов переходной валентности, катализирующих реакции образования активных форм кислорода. Представитель: L-карнозин.

Таким образом, смеси АО разных механизмов действия могут оказаться существенно более эффективными, чем отдельно взятые антиоксиданты. Роль этого эффекта имеет большое значение при разработке антиоксидантного комплекса. Главной задачей данного этапа являлось определение рациональных соотношений антиоксидантов, при которых наблюдается наилучший антиоксидантный эффект.

4.1. Исследование синергизма дигидрокверцетина и витаминов А, С, Е

Несмотря на широкую известность и популярность этих витаминов-антиоксидантов и доказанную эффективность, в рамках данного исследования было необходимо изучить влияние витаминов на АОА дигидрокверцетина.

Для проведения эксперимента образцы ДГК (50 мг), витамина С (40; 50; 60 мг), витамина Е (10; 15; 20 мг) и витамина А (0,3; 0,4; 0,5 мг) были внесены в модельную жировую систему (100 г) и помещены в термостат при температуре 37 °С. Критерием выбора необходимого для исследований диапазона количества веществ служили: данные научной литературы и нормы физиологических потребностей спортсменов в исследуемых веществах. Контролем служил образец без введения антиоксиданта.

Для проведения эксперимента использовали методики определения количества продуктов окисления липидов, фиксировали изменения показателей ПЧ и концентрации МДА. Результаты измерений представлены на рис. 4, 5.

Сравнительный анализ результатов значений ПЧ и МДА опытных образцов с образцом, содержащим только ДГК, показал (см. рис. 4, 5), что наибольший синергетический эффект образцы витаминов проявляют в соотношениях:

• ДГК (50 мг) + Витамин С (40 мг) или 1:0,8 – на 28-е сутки хранения ПЧ образца ЭВК было меньше ПЧ контроля в 2,39 раза, а МДА в 2,4 раза;
• ДГК (50 мг) + Витамин Е (10 мг) или 1:0,2 – на 28-е сутки хранения ПЧ образца ЭВК было меньше ПЧ контроля в 2,5 раза, а МДА в 2,2 раза;
• ДГК (50 мг) + Витамин А (0,5 мг) или 1:0,01 – на 28-е сутки хранения ПЧ образца ЭВК было меньше ПЧ контроля в 2,5 раза, а МДА в 2,2 раза.

Рис. 4. Динамика накопления первичных продуктов окисления (ПЧ) в модельных системах, содержащих смеси ДГК и витаминов С, Е, А

Рис. 5. Динамика накопления вторичных продуктов окисления (МДА) в модельных системах, содержащих смеси ДГК и витаминов С, Е, А

2. Исследование влияния селенопирана и цитрата цинка на активность дигидрокверцетина

В данной работе изучен органический источник селена – селенопиран. Селенопиран выгодно отличается от используемых сегодня препаратов селена, т.к. не является аллергеном и не обладает канцерогенной активностью, напротив, отмечены его антиканцерогенное действие и гепатопротекторный эффект.

Источником цинка выбран цитрат цинка, т.к. цитраты являются наиболее удобной для усвоения организмом формой микроэлементов. Цитраты хорошо усваиваются даже при пониженной кислотности желудочного сока.

Для сравнительной оценки антиоксидантной активности образцы дигидрокверцетина (50 мг), селена (20; 40; 60 мкг) и цинка (10; 15; 20 мг) вносили в модельную жировую систему (100 г) в различных соотношениях, затем с помощью аналитических методов выполняли измерения показателей ПЧ и концентрации МДА. Результаты измерений представлены на рис. 6, 7.

Рис. 6. Динамика накопления первичных продуктов окисления (ПЧ) в модельных системах, содержащих смеси ДГК, селенопирана и цитрата цинка

Рис. 7. Динамика накопления вторичных продуктов окисления (МДА) в модельных системах, содержащих смеси ДГК, селенопирана и цитрата цинка

В результате определения показателей порчи липидов установлено, что количество продуктов окисления в опытных образцах меньше, чем в контроле в среднем в 2 раза. Это свидетельствует об эффективности использования исследуемых образцов.

Самые низкие показатели окислительной порчи по окончании опыта были в образцах смесей:

• ДГК (50 мг) + Селен (40 мкг) – 0,021 ммоль (1/2 О)/кг (ПЧ)

или 1:0,0008 – 9,07 нмоль/мл (МДА);

• ДГК (50 мг) и Цинка (15 мг) – 0,027 ммоль (1/2 О)/кг (ПЧ)

или 1:0,3 – 9,59 нмоль/мл (МДА).

4.3. Исследование синергизма дигидрокверцетина и L-карнозина

Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина связаны с наличием в его структуре слабых фенольных гидроксильных групп, которые легко отдают свой атом водорода при взаимодействии со свободными радикалами. В этом случае дигидрокверцетин выступает в роли «ловушек» свободных радикалов, превращая их в малоактивные феноксильные радикалы.

В основе АОА L-карнозина, лежит его способность подавлять свободнорадикальные реакции путем взаимодействия с активными формами кислорода за счет его дипептидной структуры. L-карнозин может служить «ловушкой» пероксильных и гидроксильных радикалов, синглетного и супероксид–аниона кислорода, а также может нейтрализовать гипохлорит–анион, образуя с ним стабильные хлораминовые комплексы [Болдырев А.А., 1998].

Для проведения эксперимента использовали те же методики определения количества продуктов окисления липидов. Образцы дигидрокверцетина (50 мг) и L-карнозина (200; 300; 400 мг) вносили в модельную жировую систему (100 г) и помещали в термостат при температуре 37 °С. Контролем служил образец без введения антиоксиданта. Полученные результаты представлены в виде графических зависимостей на рис. 8, 9.

Рис. 8. Динамика накопления первичных продуктов окисления (ПЧ) в модельных липидных системах, содержащих смесь ДГК и L-карнозина

Рис. 9. Динамика накопления вторичных продуктов окисления (МДА) в модельных липидных системах, содержащих смесь ДГК и L-карнозина

В результате определения количества продуктов окисления липидов установлено, что наибольшее их количество было в контрольном образце, а в опытных образцах содержание последних уменьшалось в среднем в 2,5 раза, что свидетельствует об эффективности использования исследуемых образцов.

Анализ результатов показал, что L-карнозин может быть использован в качестве синергиста образцу дигидрокверцетина во всех исследуемых соотношениях. Экспериментально доказано, что наибольший синергетический эффект наблюдается у антиоксидантной пары с содержанием дигидрокверцетина 50 мг и L-карнозина 300 мг, в соотношении 1:6.

Глава 5. Обоснование рецептуры антиоксидантного комплекса и

сравнение с другими продуктами

На основании результатов проведенных исследований по изучению функциональных свойств и синергизма компонентов продукта, а также литературных данных о механизмах действия антиоксидантов и норм физиологических потребностей спортсменов, была разработана рецептура антиоксидантного комплекса (АОК), приведенная в табл. 2.

Таблица 2

Название компонента	Рецептура продукта, мг	Содержание компонентов, %	Суточная норма потребления веществ, мг	Верхний допустимый уровень потребления, мг
Дигидрокверцетин	50	11,66	25	100
L-карнозин	300	64,4	200	2000
Селен (селенопиран)	0,04	0,04	0,07	0,3
Цинк (цинка цитрат)	15	10,3	12	25
Витамин А	0,5	0,7	0,9	3
Витамин Е	10	4,3	15	300
Витамин С	40	8,6	40	2000

Антиоксидантная активность природного биофлавоноида дигидрокверцетина, умноженная на синергетический эффект взаимного усиления активности каждого из компонентов продукта, позволят обеспечить надежную защиту от многих последствий окисления и воздействия свободных радикалов. Максимально эффективная дозировка активных компонентов и абсолютно точно подобранное соотношение антиоксидантов в составе разработанного комплекса позволят обеспечить многократное усиление защитной активности и добиться значительного каскадного антиоксидантного действия.

Для подтверждения антиоксидантных свойств разработанного АОК проводили исследования, направленные на сравнение комплекса с другими продуктами, на основе антиоксидантов. Сравнивали с продуктами: «Vinitrox» (антиоксидантный комплекс, содержащий экстракты винограда и яблока, «BiOserae», Франция); «Рефорс» (антиоксидантный комплекс на основе дигидрокверцетина, НПФ «Флавит», Россия).

Образцы вносили в модельную жировую систему в одинаковых количествах и регистрировали показатели окисления липидов. Результаты представлены в виде графических зависимостей на рис. 10, 11.

Рис. 10. Динамика накопления первичных продуктов окисления (ПЧ) в модельных системах с АОК, Vinitrox и Рефорс

Рис. 11. Динамика накопления вторичных продуктов окисления (МДА) в модельных системах с АОК, Vinitrox и Рефорс

Результаты проведенного эксперимента показали, что наилучшей антиоксидантной способностью обладает разработанный антиоксидантный комплекс. Перекисное число образца АОК на 28-е сутки хранения меньше ПЧ контрольного образца в 2,5 раза, а показатель МДА в 2,2 раза. В сравнении с образцом «Рефорс» значение ПЧ было меньше в 1,66 раза, а значение МДА в 1,76 раза. В сравнении с образцом «Vinitrox» значение ПЧ было меньше в 1,33 раза, а значение МДА в 1,32 раза.

Показатель количества продуктов окисления обратно пропорционален показателю активности антиоксиданта. Таким образом, большое количество продуктов окисления в образцах с продуктами «Vinitrox» и «Рефорс», свидетельствует об их слабом действии, в сравнении с образцом, обогащенным разработанным антиоксидантным комплексом.

Глава 6. Результаты клинических испытаний разработанного продукта.

Испытания разработанного АОК проводились в ООО «СПОРТМЕД» (лицензия №77-01-000803 от 8 сентября 2005г.). В результате исследования планировалось получить данные о влиянии на показатели специальной работоспособности высококвалифицированных спортсменов, испытывающих повышенные физические нагрузки.

Эксперимент проводили в течение 25 дней. Тестирование работоспособности осуществляли в исходном состоянии на 10-й и 20-й день тренировок и через 5 дней после прекращения приема препаратов. Для оценки действия продукта на организм человека проводили  биохимический  и  гормональный  контроль, цитохимический анализ, морфологические и другие исследования. Особое внимание уделялось определению процессов перекисного окисления липидов ненасыщенных жирных кислот в организме.

Выявлено, что курсовое применение продукта вызывает тонизирующее, иммуномодулирующее и антиоксидантное действие на организм спортсменов: ускоряются процессы восстановления и адаптации к физическим нагрузкам, повышается иммунитет спортсменов после истощающих физических нагрузок. Отмечено, что продукт хорошо переносится спортсменами, противопоказаний к применению препарата выявлено не было.

В результате исследования было установлено, что антиоксидантный комплекс, содержащий: дигидрокверцетин, L-карнозин, селенопиран, цитрат цинка и витамины А, С, Е, оказывает общее благотворное действие на показатели специальной работоспособности высококвалифицированных спортсменов, испытывающих повышенные физические нагрузки.

С учетом рецептуры и физиологических потребностей спортсменов в компонентах продукта, были разработаны рекомендации по его применению. Продукт обладает значительным антиоксидантным эффектом и может использоваться, прежде всего, при занятиях циклическими видами спорта, такими как троеборье, плавание, бег на длинные дистанции и лыжный спорт. Дозировка продукта варьируется от 1-й до 2-х капсул в сутки, в зависимости от степени нагрузки. В результате проведенной работы составлена техническая документация на «Антиоксидантный комплекс»

выводы

1. В результате исследований состава растительных экстрактов определено суммарное количество антиоксидантов, обуславливающих их антиоксидантную активность. Полученные данные позволили ранжировать исследованные экстракты в следующей последовательности: ДГК (92 %) > ДГК (94 %) > ДГК (85 %) > ДГК (90 %) > ЭЗЧ > ЭЗЧ-40 > ЭВК-30 > ЭВК > VinOserae > VinOgrape > ЭР > ЭВК-40 > ЭТ > ЭА > ЭШ. Установлено, что наибольшая концентрация антиоксидантов содержится в образце с содержанием дигидрокверцетина (ДГК) 92 %.
2. Изучены антиоксидантные свойства растительных экстрактов и определены рациональные концентрации: для дигидрокверцетина – 0,05 %; для экстракта зеленого чая (95 % полифенолов) – 0,15 %; для экстракта зеленого чая (40 % EGCG) – 0,1 %; для экстракта виноградной косточки (30 % OPC) – 0,05 и 0,1 %; для экстракта виноградной косточки (95 % полифенолов) – 0,1 %; для VinOserae – 0,1 %; для VinOgrape – 0,1 %; для экстракта розмарина – 0,15 %.
3. Установлено, что из всех исследованных образцов растительных экстрактов, наиболее эффективно ингибирует процессы перекисного окисления липидов образец дигидрокверцетина (92 %) в концентрации 0,05 %.
4. Выявлен синергизм антиоксидантов различных механизмов действия и химической природы при ингибировании процесса окисления липидов и установлены рациональные соотношения ДГК с: витамином С – 1:0,8; витамином Е – 1:0,2; витамином А – 1:0,01; селеном - 1:0,0008; цинком – 1:0,3; L-карнозином – 1:6.
5. Разработана рецептура антиоксидантного комплекса, содержащая: 50 мг – дигидрокверцетина; 300 мг – L-карнозина; 40 мкг – селена; 15 мг – цинка; 40 мг – витамина С; 10 мг – витамина Е и 0,5 мг витамина А. По результатам сравнительного эксперимента установлено, что разработанный продукт превосходит по эффективности другие продукты этой категории.
6. В результате проведенных клинических исследований доказано положительное влияние продукта на организм спортсмена, выраженное в повышении физической работоспособности и снижении негативных последствий интенсивных физических нагрузок.
7. Разработаны техническая документация на «Антиоксидантный комплекс» ТУ 9197-010-29303017-09 и рекомендации по его применению, заключающиеся в необходимых дозировках и продолжительности курса приема продукта.

Публикации по теме диссертационной работы:

1. Манукьян Г.Г. Роль антиоксидантов в спортивном питании // «Живые системы и биологическая безопасность населения»: материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых. – М., 2007. – С.110-112.
2. Токаев Э.С. Разработка продукта для спортсменов на основе антиоксидантов природного происхождения / Э.С. Токаев, Г.Г. Манукьян // «Биотехнология. Вода и пищевые продукты»: материалы международной научно-практической конференции. – М., 2008. – С.188.
3. Манукьян Г.Г. Разработка антиоксидантного комплекса для спортсменов // «Живые системы и биологическая безопасность населения»: материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых. – М., 2008. – С.59-60.
4. Токаев Э.С. Сравнительная характеристика антиоксидантной активности растительных экстрактов / Э.С. Токаев, Г.Г. Манукьян // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2009. – №9. – С.36-38.
5. Токаев Э.С. Антиоксидантный комплекс для питания спортсменов на основе натуральных экстрактов / Э.С. Токаев, Г.Г. Манукьян // «Биотехнология: Состояние и перспективы развития»: материалы V московского международного конгресса. – М., 2009. – С.107-108.
6. Манукьян Г.Г. Разработка специализированного продукта для спортсменов на основе антиоксидантов природного происхождения // «Молодежная наука – пищевой промышленности России»: материалы I Всероссийской студенческой научной конференции. – Ставрополь, 2009. – С.87-88.
7. Токаев Э.С. Разработка антиоксидантного комплекса для питания спортсменов / Э.С. Токаев, Г.Г. Манукьян, М.Е. Титова // «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности»: материалы III Международной научно-технической конференции. – Воронеж, 2009. – С.538-540.
8. Манукьян Г.Г. Специализированный продукт для питания спортсменов на основе антиоксидантов природного происхождения // «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки с.-х. сырья и производства продуктов питания»: материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых. – М., 2009. – С.94.