Разработка технологии ферментативных гидролизатов из пресноводного моллюска дрейссены ( dreissenum polymorpha pallas ) и зеленой мидии ( perna viridis )

На правах рукописи

НГУЕН ХАЙ ИЕН

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ ИЗ ПРЕСНОВОДНОГО МОЛЛЮСКА ДРЕЙССЕНЫ (DREISSENUM POLYMORPHA PALLAS) И ЗЕЛЕНОЙ МИДИИ (PERNA VIRIDIS)

Специальность 05.18.04 – технология мясных, молочных, рыбных продуктов

и холодильных производств

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва, 2009

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО»).

Научный руководитель: доктор технических наук,

Новикова Маргарита Владимировна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, доцент

Боева Нэля Петровна

кандидат технических наук,

Цибизова Мария Евгеньевна

Ведущая организация: ФГУП "Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича" (ФГУП «ПИНРО»).

Защита состоится: « 14 » октября 2009 г. в 13 часов 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 307.004.03 при ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО») по адресу: 107140, г. Москва, ул. Верхняя Красносельская, дом 17. Факс: (499) 264-91-87; е-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО»).

Автореферат разослан « 11 » сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук Татарников В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время жители большинства стран мира страдают от белковой и аминокислотной недостаточности, нехватка пищевого белка является острой социальной проблемой современного мира. Дефицит полноценного по аминокислотному составу белка в рационах питания сопровождается неспособностью соответствующих защитных систем организма адекватно отвечать на неблагоприятные воздействия окружающей среды, что резко повышает риск развития ряда заболеваний.

В связи с этим в мире активно разрабатывались и разрабатываются технологии промышленного производства пищевого белка и аминокислотных препаратов на основе сырья растительного и животного происхождения.

В рыбной промышленности основным сырьем для получения белковых и аминокислотных препаратов является рыба, по тем или иным причинам непригодная для традиционных способов переработки, беспозвоночные и отходы от разделки сырья.

Одним из направлений переработки сырья в легкодоступные для усвоения организмом человека белки и аминокислоты является его частичный или полный гидролиз любым из существующих способов – кислотным, щелочным, ферментативным или ферментативно-кислотным.

Из научных публикаций следует, что гидролиз, кислотный или ферментативный, применяется как один из способов получения биологически активных добавок (БАД), в основном из беспозвоночных и отходов их разделки (Рехина; Новикова; Давидович; Беседнова; Эпштейн).

Беспозвоночные как сырье для получения БАД представляют несомненный интерес благодаря уникальному химическому составу мягких тканей, содержащих полноценный по аминокислотному составу белок, макро- и микроэлементы, таурин, аминосахара, витамины, ПНЖК (Кизеветтер; Сафронова).

Последние годы характеризуются заметным истощением естественных биоресурсов водного происхождения, поэтому возникает проблема, связанная с освоением новых источников сырья для получения БАД, белковых и аминокислотных препаратов. Перспективным сырьем для этих целей может служить пресноводный моллюск дрейссена (Dreissenum рolуmorpha рallas), значительные запасы которой по экспертной оценке в Рыбинском водохранилище составляют 400-800 тыс. тонн, в Плещеевом озере - 15-20 тыс. тонн, а также зеленая мидия (Рerna viridis), обитающая в тихоокеанских прибрежных районах Вьетнама, промышленный вылов которых в настоящее время не освоен.

Исследованиями в области разработки технологии ферментативного гидролиза занимались такие ученые как Черногорцев, Кизеветтер, Ярочкин, Разумовская, Неклюдов, Мухин, Новиков, Круглик и ряд зарубежных ученых.

Принимая во внимание большие запасы дрейссены, а также возможность выращивания зеленой мидии в марикультуре, актуальной представляется разработка технологии рационального использования этих видов сырья для получения пищевой и кормовой продукции с применением ферментативного гидролиза.

Цели и задачи работы. Цель работы – разработка технологии ферментативных гидролизатов из новых видов сырья – дрейссены и зеленой мидии.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

- исследовать химический состав дрейссены и зеленой мидии;

- обосновать рациональные режимы ферментативного гидролиза и разработать технологическую схему получения гидролизатов из дрейссены и зеленой мидии;

- обосновать специфичность ферментов по отношению к определенному виду сырья;

- изготовить опытные партии гидролизатов из дрейссены и зеленой мидии, исследовать их пищевую, биологическую ценность и безопасность потребления гидролизатов;

- изучить биологическую активность гидролизатов;

- исследовать возможность применения гидролизатов в качестве добавки в

пищевые продукты и питательные среды для культивирования мицелия съедобных грибов;

- исследовать химический состав непрогидролированных осадков для

определения возможности их применения в качестве кормовых добавок;

- разработать проекты технической документации (ТУ и ТИ) на сырье и гидролизаты.

- рассчитать экономическую эффективность от внедрения разработанной технологии получения ферментативных гидролизатов из дрейссены и мяса зеленой мидии.

Научная новизна работы:

- Разработана ресурсосберегающая технология ферментативных гидролизатов из новых, потенциально промысловых видов сырья – дрейссены и зеленой мидии.

- Установлена зависимость степени гидролиза белков и эффективность использования сырья от вида ферментов (коллагеназа, папаин, флавоэнзим, Сorolаsе® L10 и Сorolаsе® L7089) и условий проведения процесса.

- Научно обоснована субстратная специфичность ферментов Сorolаsе® L10 к белкам дрейссены и Сorolаsе® L7089 к белкам зеленой мидии.

- Изучена возможность применения гидролизатов в качестве белковой добавки в формованные фаршевые изделия и в качестве легкоусвояемых азотсодержащих веществ в питательные среды для культивирования мицелия съедобных грибов.

Практическая значимость работы. Разработана и апробирована в лабораторных условиях технология ферментативных гидролизатов из дрейссены и зеленой мидии. Разработаны проекты технической документации (ТУ и ТИ) на сырье и гидролизаты. Новизна разработанной технологии подтверждена положительными решениями о выдаче патентов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Рациональные технологические параметры процесса ферментативного гидролиза дрейссены и мяса зеленой мидии для получения пищевых и кормовых продуктов.

2. Обоснованная субстратная специфичность ферментов: Corolase® L10 для гидролиза дрейссены и Corolase® L 7089 для гидролиза мяса зеленой мидии.

3. Использование гидролизатов из дрейссены и мяса зеленой мидии в качестве

пищевых добавок и как компонентов питательных сред для культивирования мицелия съедобных грибов.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на IX Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва 2007; международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию Саратовского Госагроуниверситета «Вавиловские чтения – 2008»; международной научно-технической конференции «Наука и образование – 2009», Мурманск; Х международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань 2009; международной научно-практической конференции «Безопасность и качество товаров», Саратов 2009; II Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека», Кемерово 2009; доложены на заседании технической секции ученого совета ФГУП "ВНИРО".

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, оформлены 3 заявки на изобретения, на две из них получены положительные решения о выдаче патентов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 139 страницах, содержит 40 таблиц, 12 рисунков и 16 приложений. Список литературы включает 214 литературных источников, в том числе 53 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе «Обзор литературы» рассмотрены способы получения белковых гидролизатов, ферменты, применяемые для их получения, и характеристика механизма протеолиза. Приведены методы оценки степени гидролиза белка. Сформулированы цели и задачи проведения исследования.

Во второй главе «Экспериментальная часть» представлена программно-целевая модель выполнения работы (рис. 1), приведены объекты и методы

исследования, описана постановка опытов.

Рис. 1. Программно-целевая модель исследований

Содержание общего и небелкового азота определяли по Кьельдалю на автоанализаторе Kjeltecтм Foss - 2300 (Швеция), аминного азота по ГОСТ 7636, содержание жира - по методу Folch (1957) и на автоанализаторе "VELP" (Италия), жирнокислотный состав липидов - методом ГЖХ на приборе GC-17 фирмы «Shimadzu».

Степень гидролиза белка оценивали по процентному соотношению количества небелкового азота к общему и аминного к небелковому.

Определение аминокислотного состава сырья и гидролизатов проводили на анализаторе ААА-835 фирмы «Hitachi» с подготовкой образцов к анализу по методу Мура и Штейна (1954); содержание свободных аминокислот - по методу Jones (1955); триптофана по методу Фюрта (1955).

Эффективность режимов гидролиза оценивали по степени расщепления белков и выходу азотсодержащих веществ из сырья в гидролизат.

Молекулярно-массовое распределение азотсодержащих фракций в гидролизатах анализировали методом хроматографии на колонках Супероза-12 (Швеция), используя в качестве элюента 0,2М раствор NaCL+ азид натрия, с детектированием фракций при длине волны 280 нм на проточном УФ-детекторе UV-1. Хроматограммы интегрировали весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Для оценки биологической активности гидролизатов определяли их антирадикальные свойства по методу Glavind (1963), радиозащитную и гемостимулирующую в опытах на мышах-гибридах по утвержденным «Методическим рекомендациям по вопросам определения численности кроветворных колониеобразующих единиц (КОЭ) с помощью тестов экзогенных и эндогенных селезеночных колоний» (МРНЦ РАМН, г. Обнинск).

В соответствии с разработанными рациональными режимами в лабораторных условиях были изготовлены и подвергнуты сублимационной сушке на установке Consol-12 фирмы «Virtis» (США) гидролизаты из дрейссены и мяса зеленой мидии. Для установления возможности применения сухих гидролизатов в качестве пищевой добавки их вводили в количестве 1,5-3,0% для замены фарша в рецептурах формованных изделий. Органолептические показатели формованных фаршевых изделий оценивали по 9-ти балльной шкале (Сафронова, 1998).

Гидролизаты также использовали в качестве компонента питательных сред для культивирования мицелия съедобных грибов. Микологические исследования проводили в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА им. Тимирязева. Эксперименты ставили на трех видах грибов – масленок обыкновенный (Suillus luteus), опенок летний (Kuehneromyces mutabilis) и вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus). В качестве питательной среды использовали сусло-агар с добавлением cухих белковых гидролизатов в концентрациях 1, 5, 10,

20 г/л сусло-агара. После инкубации рост мицелия грибов оценивали визуально.

О безопасности потребления гидролизатов определяли по содержанию токсикантов и микробиологическим показателям, которые анализировали согласно существующим ГОСТам и методическим указаниям.

Для статистической обработки экспериментальных данных и построения графических зависимостей использовали стандартные программы Windows ХР, Excel-2003.

В третьей главе «Обоснование режимов гидролиза дрейссены и мяса зеленой мидии» представлены результаты исследования химического состава мяса дрейссены и зеленой мидии, влияние различных режимов гидролиза на эффективность использования сырья и степень расщепления белков. Одним из технологических приемов в переработке двустворчатых моллюсков является предварительное бланширование сырья, позволяющее отделить мясо от створки. Выход бланшированного мяса дрейссены, отделенного от створки вручную в зависимости от сезона добычи составляет 14±0,20%, бланшированного мяса зеленой мидии – 22,5±0,15% от массы моллюска.

Химический состав бланшированного мяса дрейссены характеризуется более высоким содержанием углеводов и липидов, чем мясо зеленой мидии, но более низким содержанием белка (табл. 1).

Таблица 1

Химический состав сырья, %

Сырье	Сухие вещества	Сырой протеин, (N6,25)	Липиды	Минеральные вещества	Углево-ды
Дрейссена сырое мясо бланшированное мясо	20,34±1,04 20,53±1,11	14,83±0,24 14,65±0,18	2,09±0,07 2,06±0,06	1,55±0,01 1,51±0,01	1,87±0,73 2,31±0,89
Зеленая мидия бланшированное мясо	22,05±1,34	16,95±1,25	1,25±0,03	2,15±0,01	1,71±0,12

По содержанию сырого протеина бланшированное мясо дрейссены и зеленой мидии можно отнести к высокобелковому сырью – содержание белка в пересчете на сухое вещество составляет соответственно 71,6±4,55% и 76,8±1,00%.

Белки дрейссены и зеленой мидии полноценны по аминокислотному

составу, содержат все заменимые и незаменимые аминокислоты. Из незаменимых

аминокислот в мясе зеленой мидии больше, чем в белках дрейссены, изолейцина, метионина, цистина, тирозина, треонина, валина, лизина и триптофана. В отличие от мяса дрейссены в мясе зеленой мидии содержится биологически активное вещество – таурин (Ярцев и др., 1975), который, согласно литературным данным (Аюшин и др., 1997), является характерной особенностью тихоокеанских моллюсков и повышает их биологическую ценность (табл. 2).

Таблица 2

Аминокислотный состав бланшированного мяса дрейссены и зеленой мидий, г/100г белка

Аминокислоты	Мясо дрейссены	Мясо зеленой мидий
Изолейцин	5,77	6,18
Лейцин	4,67	4,49
Метионин	2,23	2,61
Цистин	0,64	0,77
Тирозин	2,49	3,23
Фенилаланин	3,14	2,86
Треонин	3,33	3,90
Валин	4,44	4,90
Лизин	5,88	6,71
Триптофан	1,51	1,70
Сумма незаменимых аминокислот	34,10	37,35
Аспарагиновая кислота	6,77	6,87
Серин	3,75	2,14
Глутаминовая кислота	8,21	12,50
Пролин	3,61	5,57
Глицин	4,78	5,99
Аланин	4,75	3,84
Гистидин	1,60	1,48
Аргинин	4,85	5,41
Таурин	не опр.	4,54
Сумма заменимых аминокислот	38,32	48,34
ИТОГО	72,42	85,69

Расчет аминокислотного скора показал, что по сравнению со шкалой ФАО/ВОЗ в белках дрейссены и зеленой мидии превалирующими аминокислотами являются изолейцин, лизин и триптофан, лимитирующей аминокислотой в обеих образцах является лейцин.

Содержание токсикантов в мясе дрейссены и зеленой мидии не превышает допустимых норм, регламентированных требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01.

Таким образом, высокое содержание белка и его аминокислотный состав свидетельствуют о перспективности использования мяса дрейссены и зеленой

мидии в качестве сырья для получения пищевых и кормовых продуктов.

Одним из способов переработки сырья, по тем или иным причинам непригодного для традиционных технологических подходов, является

ферментативный гидролиз.

Известно, что эффективность применения ферментативного способа переработки сырья зависит от вида фермента, фермент-субстратного соотношения, рН, температуры, продолжительности гидролиза, субстратной специфичности фермента. С целью установления наиболее рациональных режимов ферментолиза, об эффективности которых судили по степени гидролиза белка и выходу азотсодержащих компонентов из сырья в гидролизат, была проведена серия опытов на сыром и бланшированном мясе дрейссены, и бланшированном мясе зеленой мидии.

Результаты проведенных опытов показали, что степень гидролиза белков сырого мяса дрейссены в створке коллагеназой относительно низкая, выход азотистых веществ из сырья в гидролизат не превышает 14%. Поэтому были проведены опыты по гидролизу сырого мяса дрейссены в створке последовательно двумя различными ферментами с целью выяснению возможности увеличения степени расщепления белка и выхода азотсодержащих веществ из сырья в гидролизат по сравнению с использованием лишь одного фермента.

Последовательная обработка сырого мяса дрейссены в створке двумя ферментами (коллагеназа плюс папаин или флавоэнзим) не только повышает степень гидролиза белка до 98%, но и увеличивает выход азотсодержащих веществ из сырья в гидролизат до 35%. Однако, с экономической точки зрения, последовательное использование двух ферментов для гидролиза сырого мяса дрейссены невыгодно.

Из научных публикаций следует, что наиболее доступными для

воздействия протеолитических ферментов являются денатурированные белки.

Известно также, что самым трудоемким процессом в переработке двустворчатых моллюсков, особенно таких мелких, как дрейссена является отделение мяса от створки. Поэтому в последующих опытах использовали бланшированное мясо дрейссены, отделенное от створки вручную и бланшированного моллюска, измельченного вместе со створкой.

Сопоставление результатов, полученных при гидролизе бланшированного мяса дрейссены папаином, флавоэнзимом и Corolase® L 10 показывает, что в случае применения Corolase® L 10 выход азотсодержащих веществ в гидролизат в 2,0-2,5 раза выше, чем при гидролизе папаином или флавоэнзимом. Эти данные могут служить основанием для предположения о разных механизмах каталитического процесса. В случае папаина и флавоэнзима ферментолиз идет практически до конечных продуктов гидролиза, о чем свидетельствует высокое содержание аминного азота по отношению к небелковому (табл. 3). В случае использования Corolase® L10, степень гидролиза белка ниже - количество аминного азота по отношению к небелковому азоту составляет около 52%, а количество небелкового азота к содержанию общего составляет 96%, что дает основание предположить, что в составе небелкового азота присутствуют более крупные азотсодержащие вещества - пептиды и др., не осаждаемые ТХУ.

Таблица 3

Рациональные режимы гидролиза белков дрейссены разными ферментами

№ опы-тов	Ферменты	рН	Темпе-ратура, oC	Концен-трация фермен-та,%	Продолжительность гидро-лиза,ч	Степень гидролиза белка				Выход Nобщ., %
						Nобщ. г/100г гидро-лизата	Nнеб.% к Nобщ.	Nам.
								% к Nобщ.	% к Nнеб
1	Коллагеназа	7,0	50±1оС	0,4	5	0,309	86,6	40,5	47,0	13,4
2	Коллагеназа + папаин	7,0	50±1оС	0,4 + 0,4	5	0,724	90,5	88,2	97,6	31,5
3	Коллагеназа + флавоэнзим	7,0	50±1оС	0,4 + 0,3	5	0,800	91,4	89,7	98,2	34,8
4	Папаин	7,0	50±1оС	0,4	5	0,708	94,6	80,7	85,3	30,8
5	Флавоэнзим	7,0	50±1оС	0,3	5	0,600	96,0	94,0	98,0	26,0
6	Corolase®L10	7,4	55±1оС	0,1	6	1,495	96,0	50,0	52,0	65,0
7	Corolase®L 7089	7,4	55±1оС	0,1	6	0,881	95,6	33,6	35,1	37,2

Примечание: № 1, 2, 3 – сырое мясо со створками; № 4, 5 - бланшированное мясо;

№ 6, 7 - бланшированное мясо со створками.

Полученные результаты позволяют предположить, что папаин и флавоэнзим обладают разной специфичностью по отношению к белкам мяса дрейссены, или к отдельным белковым фракциям в его составе.

Выход азотсодержащих веществ из сырья в гидролизат и степень расщепления белков дрейссены Corolase® L7089 значительно ниже, чем Corolase® L10, т.е. Corolase® L7089 не является специфичным ферментом по

отношению к белкам дрейссены.

Таким образом, можно заключить, что для получения гидролизата из дрейссены с высокой степенью расщепления белка (85-98%), но низким выходом растворимых азотистых веществ (26-30%) наиболее специфичными ферментами являются папаин и флавоэнзим, а для получения гидролизата со средней степенью гидролиза белка (52%) и высоким выходом азотсодержащих веществ в гидролизат (65%) наиболее специфичным является Corolase® L10 (рис. 2).

С учетом различий химического состава мяса дрейссены и зеленой мидии предположили, что ферменты, которые применяли для гидролиза белков дрейссены, в отношении мяса зеленой мидии могут повести себе по-другому.

Установили, что наиболее специфичным ферментом по отношению к белкам мяса зеленой мидии является Corolase® L7089: степень гидролиза белка (83,9%) и выход азотсодержащих веществ (53,9%) выше, чем при использовании других ферментов (табл. 4, рис. 3).

Субстратную специфичность ферментов подтверждают сравнительные данные по выходу и степени расщепления белков мяса дрейссены и зеленой

мидии Corolase® L10 и Corolase® L7089, представленные на рис. 4.

Таблица 4

Рациональные режимы гидролиза белков мяса зеленой мидии разными ферментами

Ферменты	рН	Темпе-ратура, oC	Концен-трация Фермен-та,%	Продол- житель-ность гидроли-за,ч	Степень гидролиза белка				Выход Nобщ., %
					Nобщ. г/100г гидро-лизата	Nнеб.% к Nобщ.	Nам.
							% к Nобщ.	% к Nнеб.
Коллагеназа	7,0	50±1оС	0,4	5	0,464	88,6	45,3	51,1	18,5
Папаин	7,0	50±1оС	0,4	5	0,851	84,0	46,8	55,7	33,9
Флавоэнзим	7,0	50±1оС	0,3	5	0,931	80,5	40,7	50,6	37,1
Corolase®L10	7,4	55±1оС	0,1	6	0,808	94,1	44,2	47,0	32,2
Corolase®L 7089	7,4	55±1оС	0,1	6	1,569	95,4	80,1	83,9	53,9

О субстратной специфичности ферментов свидетельствуют результаты определения в гидролизатах содержания свободных аминокислот: их количество

в гидролизате из дрейссены при использовании Corolase® L10 составляет

62,69% от общего содержания аминокислот, в гидролизате из мяса зеленой мидии – 54,87% (табл. 5). При гидролизе Corolase® L7089 количество свободных аминокислот в гидролизате из мяса зеленой мидии составляет 67,11% от общего содержания аминокислот, в гидролизате из дрейссены – 56,33%.

Таблица 5

Содержание свободных аминокислот в гидролизатах, полученных с

применением ферментов Corolase® L10 и Corolase® L7089, г/100г белка

Аминокислоты	Corolase® L10		Corolase® L7089
	гидролизат из дрейссены	гидролизат из мяса зеленой мидии	гидролизат из дрейссены	гидролизат из мяса зеленой мидии
Таурин	-	2,00	-	3,00
Аспарагиновая кислота	4,12	3,04	2,72	5,11
Треонин	3,18	2,07	2,98	3,10
Серин	2,73	2,53	2,34	2,37
Глутаминовая кислота	4,00	4,00	4,07	6,09
Пролин	3,33	3,02	3,20	3,35
Глицин	2,01	2,05	2,00	4,05
Аланин	2,72	2,41	2,51	2,52
Цистин	0,31	0,49	0,22	0,37
Валин	4,04	3,15	3,15	3,23
Метионин	2,07	1,24	2,00	1,48
Лейцин	4,41	4,57	4,19	4,54
Изолейцин	3,15	3,02	2,72	3,93
Тирозин	2,09	2,61	1,98	3,00
Фенилаланин	2,32	2,65	2,03	2,05
Лизин	3,86	4,42	3,57	4,21
Гистидин	1,00	1,00	1,00	1,03
Аргинин	3,46	2,17	3,13	4,00
Сумма	48,80	46,44	43,81	57,43
Сумма свободных аминокислот, % от общего содержания аминокислот	62,69	54,87	56,33	67,11

Результаты сопоставления степени гидролиза белка по содержанию в конечном продукте низкомолекулярных азотсодержащих фракций в диапазоне молекулярных масс менее 1,7 кДа и 4,5-1,7 кДа, также подтверждают субстратную специфичность ферментов: в гидролизате из дрейссены, полученном при использовании Corolase® L10, сумма низкомолекулярных фракций составляет более 46,3%, при использовании Corolase® L 7089 – 30,0%, по сравнению с гидролизатом из мяса зеленой мидии, полученном с Corolase® L 10 – 35,0%, с Corolase® L 7089 – 36,4% от суммы фракций (табл. 6).

Таблица 6

Влияние Corolase® L 10 и Corolase® L7089 на молекулярно-массовое

распределение азотсодержащих фракций в гидролизатах, % от суммы

№ фракций	Диапазон молекулярных масс, кДа	Corolase® L 10		Corolase® L7089
		гидролизат из дрейссены	гидролизат из мяса зеленой мидий	гидролизат из дрейссены	гидролизат из мяса зеленой мидий
1	Более 275	15,3	9,9	4,9	11,1
2	275 – 72,4	2,2	8,2	8,7	4,0
3	72,4 – 22,4	4,3	12,6	19,1	9,4
4	22,4 – 10,2	10,3	14,9	15,0	11,1
5	10,2 – 4,5	21,6	19,5	22,3	28,0
6	4,5 – 1,7	22,1	30,4	19,8	21,0
7	Менее 1,7	24,2	4,5	10,2	15,4

В четвёртой главе «Пищевая и биологическая ценность гидролизатов из дрейссены и мяса зеленой мидии».

В лабораторных условиях с использованием субстратно-специфичных ферментов были изготовлены опытные партии гидролизатов - из дрейссены с Corolase® L 10, из мяса зеленой мидии – с Corolase® L 7089. Гидролизаты после сублимационной сушки представляют собой порошки светло-бежевого цвета со слабым запахом мяса дрейссены или зеленой мидии, которые полностью растворяются в воде. Выход сухих гидролизатов составляет из дрейссены в створке 2,5%, а из мяса зеленой мидии – 8,5% от массы сырья.

В сухих гидролизатах содержание сырого протеина составляет 73,8-79,4%, липидов 6,7-7,4% и углеводов 3,4-3,6%, что свидетельствует о высокой пищевой ценности. Кроме того, в гидролизатах, особенно в гидролизате из дрейссены, достаточно высокое содержание минеральных веществ 5,2-8,8% (табл. 7).

Таблица 7

Химический состав гидролизатов, %

Вид продукта	Сухие вещества	Общий азот	Сырой протеин (Nx6,25)	Липиды	Минеральные вещества	Углеводы
Гидролизат из дрейссены	93,6 ± 0,22	11,8 ± 0,10	73,8 ± 0,10	7,4 ± 0,03	8,8 ± 0,20	3,6 ± 0,02
Гидролизат из мяса зеленой мидии	94,7 ± 0,35	12,7 ± 0,13	79,4 ± 0,13	6,7 ± 0,06	5,2 ± 0,15	3,4 ± 0,04

В гидролизатах содержатся все заменимые и незаменимые аминокислоты. Сумма незаменимых аминокислот в гидролизате из дрейссены составляет –

36,47 г/100г белка, в гидролизате из мяса зеленой мидии – 42,15 г/100г белка (табл. 8).

Таблица 8

Аминокислотный состав гидролизатов, г/100г белка

Аминокислоты	Гидролизат из дрейссены	Гидролизат из мяса зеленой мидии
Изолейцин	3,88	6,12
Лейцин	6,41	7,33
Метионин	2,57	3,57
Цистин	0,83	0,79
Фенилаланин	3,70	2,94
Тирозин	2,56	3,15
Треонин	4,82	4,76
Валин	4,94	4,98
Лизин	5,83	7,01
Триптофан	0,93	1,50
Сумма незаменимых аминокислот	36,47	42,15
Таурин	-	4,21
Аспарагиновая кислота	7,40	6,82
Серин	5,56	3,11
Глутаминовая кислота	9,12	10,30
Пролин	4,82	4,46
Глицин	5,93	6,72
Аланин	5,84	4,97
Гистидин	1,40	1,37
Аргинин	5,25	5,47
Сумма заменимых аминокислот	45,32	47,43
Итого	81,79	89,58

Расчет аминокислотного скора показал, что в гидролизате из дрейссены превалирует содержание лизина, треонина и фенилаланина+тирозина. Лимитирующими аминокислотами являются лейцин и триптофан. В гидролизате из мяса зеленой мидии превалируют изолейцин, лейцин, метионин + цистин, фенилаланин + тирозин, треонин, лизин, триптофан. Кроме того, в гидролизате из

мяса зеленой мидии содержится таурин, что подчеркивает его высокую биологическую ценность.

О высокой биологической ценности гидролизатов, полученных из дрейссены и мяса зеленой мидии свидетельствует и анализ жирнокислотного состава липидов. Липиды характеризуются достаточно высоким содержанием ПНЖК – соответственно 11,67% и 23,61% от суммы. Количество незаменимых

жирных кислот в липидах гидролизата из зеленой мидии примерно в 2 раза выше - 13,79%, чем в липидах из дрейссены - 5,56% от суммы жирных кислот. Сумма эйкозапентаеновой и докозагексаеновой в липидах гидролизата из мяса зеленой мидии также значительно выше - 7,37%, чем в липидах гидролизата из дрейссены - 1,66% (табл. 9).

Таблица 9

Суммарный состав основных жирных кислот в гидролизатах, % от суммы

Жирные кислоты	Гидролизат из дрейссены	Гидролизат из мяса зеленой мидии
Насыщенные кислоты	56,20	46,00
Мононенасыщенные кислоты	32,13	30,39
Полиненасыщенные, в т. ч. эссенциальных кислот	11,67 5,56	23,61 13,79

В липидах гидролизатов из обоих видов сырья отмечено высокое содержание насыщенных жирных кислот – в липидах из дрейссены их 56,2%, в липидах из мяса зеленой мидии 46,0% от суммы. Можно предположить, что высокое содержание насыщенных жирных кислот является особенностью липидов сырья, использованного для получения гидролизов.

По содержанию токсикантов и микробиологическим показателям гидролизаты из дрейссены и мяса зеленой мидии соответствуют требованиям СанПиН 2.3.2. 1078-01 и безопасны для потребления.

Опытами по изучению биологической активности, проводившимися на животных сотрудниками МРНЦ РАМН (г. Обнинск), установлено, что гидролизаты из дрейссены и зеленой мидии обладают радиопротекторной и гемостимулирующей активностью, которая несколько ниже активности МИГИ-К ЛП®, получаемого из мяса мидий М. edulis солянокислым гидролизом и являющегося БАД (табл. 10).

Таблица 10

Биологическая активность гидролизатов

№	Образцы	Средняя масса селезенки (M±m), мг	Среднее количество эндоколоний (M±m)
1	Контроль, 6 Гр	36,2 ± 1,8	1,9 ± 0,3
2	МИГИ-К ЛП, изг. 15.09.08	45,7 ± 2,7	6,2 ± 0,3
3	МИГИ-К ЛП, изг 20.11.08	43,9 ± 2,1	5,7 ± 0,4
4	Гидролизат из дрейссены	43,2 ± 2,0	4,7 ± 0,4
5	Гидролизат из мяса зеленой мидии	43,0 ± 1,8	4,6 ± 0,2

На основании полученных данных учеными МРНЦ РАМН сделан вывод о возможности применения гидролизатов для повышения иммунитета, восстановления кроветворной системы больных после проведения курсов лучевой и химиотерапии, а также использования в качестве БАД населением в экологически неблагоприятных регионах.

В пятой главе «Применение гидролизатов из дрейссены и мяса зеленой мидии» представлены результаты опытов по изучению возможности использования белковых гидролизатов в качестве добавки в рыбные формованные изделия, микологические среды для выращивания мицелия съедобных грибов, а также приведен химический состав вторичного продукта гидролиза – плотного осадка.

Замена части рыбного фарша в рецептурной композиции гидролизатами составила 1,5 или 3,0%. Анализ химического состава формованных изделий показал, что замена фарша в рецептуре позволяет повысить содержание белка в продукте на 1,0-1,2%, обогатить их незаменимыми аминокислотами, и не

Рис. 5: Комплексная органолепти-

ческая оценка готовых продуктов

Результаты опытов по использованию в качестве источников легкодоступных азотсодержащих веществ гидролизатов в составе питательных сред для выращивания съедобных всех грибов показали, что рост мицелия всех грибов наблюдается на средах при концентрации белковых гидролизатов от 1 до 20г/1л питательной среды. При введении в среду гидролизатов из дрейссены или зеленой мидии наиболее интенсивный рост мицелия наблюдается у масленка

обыкновенного: максимум роста отмечен при концентрации гидролизатов 5г/л

сусло-агара (рис. 6,7).

На среде с добавкой гидролизата из дрейссены в концентрации 1 и 5г/л хорошо растет мицелий опенка летнего и вешенки, причем мицелий опенка удовлетворительно растет и при более высокой концентрации 10, 20г/л гидролизата из дрейссены, а мицелий вешенки обыкновенной при этих концентрациях развивается слабо (рис. 6).

Масленок обыкновенный Опенок летний Вешенка обыкновенная

Рис 6. Рост мицелия съедобных грибов на сусло-агаре с добавкой гидролизата из дрейссены

Масленок обыкновенный Опенок летний Вешенка обыкновенная

Рис 7. Рост мицелия съедобных грибов на сусло-агаре с добавкой гидролизата из мяса зеленой

мидии

1- контроль; 2- концентрация гидролизата 1г/л сусло-агара; 3- концентрация гидролизата 5г/л сусло-агара; 4- концентрация гидролизата 10г/л сусло-агара; 5- концентрация гидролизата 20 г/л сусло-агара.

На средах с введением гидролизата из зеленой мидии рост мицелия опенка летнего и вешенки обыкновенной аналогичен их росту на средах с введением гидролизата из дрейссены (рис. 7).

При гидролизе белоксодержащего сырья, помимо основного продукта – собственно гидролизата, образуется плотная фракция – непрогидролизованный остаток. В зависимости от степени отделения жидкой фракции осадок при гидролизе дрейссены вместе со створкой может составлять примерно 50%, а при гидролизе мяса зеленой мидии – 20% от массы сырья.

Результаты анализа химического состава осадков показали, что в зависимости от вида исходного сырья и степени отделения гидролизата в осадках содержится около 31-41% сухих, примерно 2% азотистых веществ (или 11-12% сырого протеина), 10-13% липидов и около 6-20% минеральных веществ (табл. 11).

Таблица 11

Химический состав осадков, образующихся при гидролизе дрейссены и мяса зеленой мидии, %

Вторичный продукт	Сухие вещества	Общий азот	Сырой протеин (N6,25)	Липиды	Минеральные вещества
Осадок, образующийся при гидролизе дрейссены	41,1± 0,25	1,8 ± 0,17	11,3 ± 0,17	12,3± 0,31	19,5 ± 0,22
Осадок, образующийся при гидролизе мяса зеленой мидии	30,6 ± 0,30	1,9 ± 0,20	11,9 ± 0,20	10,8± 0,36	6,2 ± 0,19

Высокое содержание сухих и минеральных веществ в осадке, полученном при гидролизе дрейссены, обусловлено наличием створки.

Различия в химическом составе осадков предполагают и их возможное направление для применения в качестве кормовых добавок – осадок, получаемый при гидролизе мяса зеленой мидии, может быть использован в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных, например, в свиноводстве, а осадок, образующийся при гидролизе дрейссены из-за высокого, более 19% содержания минеральных веществ и наличия створки, пригоден только для применения в птицеводстве.

Таким образом, новые потенциально промысловые виды моллюсков – дрейссена и зеленая мидия можно рекомендовать в качестве источников пищевой и кормовой продукции, а также БАД с применением ферментативного гидролиза как безотходного способа переработки сырья.

В шестой главе «Технологический процесс получения ферментативных гидролизатов из дрейссены и мяса зеленой мидии» представлена схема и описание технологического процесса (рис. 8), а также расчет экономической эффективности внедрения технологии в промышленность.

Рис 8. Технологическая схема получения ферментативных гидролизатов из дрейссены и мяса зеленой мидии

При расчете эффективности производства гидролизатов исходили их выхода сухого продукта и условной производительности цеха по объему перерабатываемого сырья. Расчет экономической эффективности показал, что прибыль от внедрения разработанной технологии ферментативных гидролизатов может составлять из дрейссены более 547 тыс.руб/год, из мяса зеленой мидии – 505 тыс.руб/год, при окупаемости 1,3 и 1,4 года, рентабельности выпуска продукции – 29% и 25% - соответственно.

Выводы

1. Разработана технология ферментативных гидролизатов из новых, потенциально промысловых видов сырья – пресноводного моллюска дрейссены (Dreissenum polymorpha pallas) и зеленой мидии (Perna viridis), в мясе которых содержится до 14% белка, полноценного по аминокислотному составу.

2. Обоснованы рациональные режимы (рН, температура, концентрация фермента, продолжительность процесса) при использовании для гидролиза дрейссены и мяса зеленой мидии различных ферментов. Установлено, что наиболее высокая степень расщепления белков дрейссены и зеленой мидии наблюдается при использовании папаина в концентрации 0,4% и флавоэнзима в концентрации 0,3%, при выходе общего азота из сырья в гидролизат, не превышающим 37%.

3. На основании анализа распределения азотсодержащих фракций в гидролизатах и выхода азота как основного показателя эффективности использования сырья обоснована субстратная специфичность ферментов: Сorolаsе® L10 по отношению к белкам дрейссены, Corolase® L 7089 - к белкам мяса зеленой мидии. При рациональных режимах гидролиза выход азотистых веществ составляет из дрейссены 65,0%, из мяса зеленой мидии -53,9%.

4. Разработана и апробирована в лабораторных условиях технологическая схема получения сухих гидролизатов из дрейссены в створке и мяса зеленой мидии, выход которых составляет соответственно 2,5% и 8,5% к массе сырья.

5. Установлено, что сухие гидролизаты из дрейссены и мяса зеленой мидии характеризуются высокой пищевой и биологической ценностью. В них содержится соответственно 73,8% и 79,4% белка, полноценного по аминокислотному составу, 7,4% и 6,7% липидов, 8,8% и 5,2% минеральных веществ. Количество ПНЖК в липидах гидролизата из дрейссены составляет 11,67%, в т.ч. эссенциальных 5,56%, в липидах гидролизата из мяса зеленой мидии – соответственно 23,61% и 13,79% от суммы жирных кислот. По содержанию токсикантов и микробиологическим показателям сухие гидролизаты

соответствуют требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01.

6. Определены основные направления применения сухих ферментативных

гидролизатов из дрейссены и мяса зеленой мидии. Установлено, что замена части рыбного фарша в рецептурах формованных изделий за счет введения гидролизатов в количестве до 3% позволяет обогатить продукт белком и незаменимыми аминокислотами. Впервые показана возможность использования ферментативных гидролизатов как источников легкоусвояемых азотистых веществ в питательных средах для культивирования мицелия съедобных грибов – масленка обыкновенного, опенка летнего и вешенки.

7. Установлено, что ферментативные гидролизаты обладают антирадикальной, радиопротекторной и гемостимулирующей активностью, что позволяет рекомендовать новые, потенциально промысловые виды сырья – пресноводного моллюска дрейссену и зеленую мидию для получения БАД.

8. Изучен химический состав побочных продуктов гидролиза – непроферментированных плотных остатков. В них содержится 11,3-11,9% белка и 6,2-19,5% минеральных веществ, что позволяет рекомендовать их в качестве кормовых добавок в животноводстве и птицеводстве.

9. На сырье и готовую продукцию разработаны проекты ТД: на дрейссену мороженую для промышленной переработки – ТИ к ТУ 9265-071-00472124-09, мясо зеленой мидии варено-мороженое – ТИ к ТУ 9265-072-00472124-09, на сухой белковый гидролизат из дрейссены – ТИ к ТУ 9283-076-00472124-09 и на сухой белковый гидролизат из мяса зеленой мидии ТИ к ТУ 9283-077-00472124-09.

10. Расчет экономической эффективности показал, что прибыль от внедрения разработанной технологии ферментативных гидролизатов из дрейссены (в створке) может составить более 547 тыс.руб./год, из мяса зеленой мидии - 505 тыс.руб./год при объемах производства сухих гидролизатов – 800 кг/год. и 900 кг/год. Окупаемость 1,3 и 1,4 года, рентабельность выпуска продукции – 29% и 25% - соответственно.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Нгуен Хай Иен, Новикова М.В., Хамзина А.К. / Получение гидролизата из пресноводного моллюска дрейссены // РыбПром, 2007, № 4, С. 14-15.
2. Нгуен Хай Иен, Новикова М.В. / Corolase® L 10 в технологии белковых гидролизатов // РыбПром, 2008, № 2, С. 25-26.
3. Зорин С.Н., Матяш А.И., Мазо В.К., Нгуен Хай Иен, Новикова М.В. / Одностадийный ферментативный гидролиз мяса мидий // Вопросы детской диетологии, 2008, Т.6, № 3, С. 36-38.
4. Нгуен Хай Иен, Новикова М.В., Зорин С.Н. / Молекулярно-массовое распределение фракций ферментативных гидролизатов из дрейссены и мидий // РыбПром, 2009, № 1, С. 43-45.
5. Новикова М.В, Нгуен Хай Иен / Сравнительная характеристика белковых гидролизатов из дрейссены и зеленой мидии // РыбПром, 2009, № 2, С.33-35.
6. Заявка на изобретение № 2008128643/13(035352). Новикова М.В., Нгуен Хай Иен «Способ получения белкового гидролизата из дрейссены». Положительное решение о выдаче патента от 05.05.2009.
7. Заявка на изобретение № 2008128646/13(035355). Новикова М.В., Нгуен Хай Иен «Способ получения белкового гидролизата из зеленой мидии». Положительное решение о выдаче патента от 05.05.2009.
8. Заявка на изобретение № 2009122672 (031325). Новикова М.В., Нгуен Хай Иен «Питательная среда для культивирования высших базидиомицетов». Приоритет от 16.06.2009.