WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Разработка технологии дрожжевых обогатителей пищи на базе молочной сыворотки и растительного сырья

На правах рукописи

ЛЫСКО КСЕНИЯ АНДРЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ДРОЖЖЕВЫХ ОБОГАТИТЕЛЕЙ ПИЩИ НА БАЗЕ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ И РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Специальность: 05.18.10 – Технология чая, табака и биологически активных веществ и субтропических культур

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Борисенко Евгений Георгиевич
Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Винаров Александр Юрьевич кандидат технических наук, доцент Тихомирова Ольга Ильинична

Ведущая организация: ОАО «Очаковский молочный завод»

Защита состоится: «_29__» ____мая_______2007 г. в ________час. в ауд. _____ на заседании диссертационного совета Д 212.148.04 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.148.04.

Автореферат разослан «_____» _____________2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.т.н., проф. Крюкова Е. В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. На сегодняшний день в России достаточно остро стоит проблема нарушения структуры питания населения. Нехватка в рационе полноценных белков, витаминов, пищевых волокон, макро- и микронутриентов вызывает рост социально опасных заболеваний, в том числе желудочно-кишечных. Часто причиной этих заболеваний является нарушение микробиоценозов желудочно-кишечного тракта.

Ассортимент ферментированных продуктов, употребляемых в пищу населением России, относительно неширок и, в основном, ограничен кисломолочными продуктами, тогда как спектр ферментируемого сырья и микроорганизмов, осуществляющих его ферментацию, может быть значительно расширен, как это делается в странах Юго-Восточной Азии и Океании, где широко используется биотрансформация растительных субстратов композициями на основе мицелиальных грибов, дрожжей и бактерий.

В связи с увеличением объемов и ассортимента производства молока и молочных продуктов в России и за рубежом весьма актуальна проблема утилизации молочной сыворотки, которая ввиду своего состава, пищевой и биологической ценности является ценнейшим сырьем, однако нередко сбрасывается в канализацию, что негативно сказывается на работе очистных сооружений. Одним из способов ее утилизации, не требующим предварительной обработки и значительных материальных затрат, является выращивание на ней специальных штаммов дрожжей. Дрожжи – весьма технологичные микроорганизмы: они обладают высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре и богатым химическим составом.

В условиях дефицита кормового и пищевого белка дрожжевая биомасса является весьма перспективным источником не только белка и незаменимых аминокислот, но и минеральных веществ (в частности металлопротеинов), витаминов и других БАВ ([1] ). Поэтому в последнее время все больше внимания уделяется дрожжам как основе БАД к пище, да и самих пищевых продуктов.

Имеется достаточно фактических данных о положительном влиянии дрожжей на нормофлору кишечника. Клеточные стенки дрожжей активно сорбируют токсины и токсичные метаболиты, обладают выраженным лакто- и бифидогенным эффектом, т.е. дрожжевые препараты могут играть роль не только нутрицевтиков, но и парафармацевтиков. Поэтому производство дрожжевых обогатителей пищи и продуктов на их основе представляется весьма актуальным.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в разработке технологии дрожжевых обогатителей (ДО) пищи на базе растительного сырья и молочной сыворотки и теоретическом и экспериментальном обосновании целесообразности использования полученных обогатителей пищи в хлебопекарной промышленности.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

  • выделение из молочнокислых и ферментированных продуктов высокопродуктивных штаммов дрожжей, способных расти на молочной сыворотке и на негидролизованных растительных субстратах;
  • испытание различных растительных субстратов в качестве компонента питательных сред для ГФ и ТФФ дрожжей и выбор наиболее перспективных из них;
  • подбор оптимального состава питательных сред для максимального накопления биомассы и белка отселекционированными дрожжами;
  • подбор оптимальных режимов культивирования в условиях ферментера;
  • разработка технологии ДО для различных условий культивирования и комплекта документов для производства дрожжевых обогатителей;
  • оценка биологической ценности и безопасности полученных ДО;
  • исследование возможности применения ДО в хлебопечении.

Научная новизна работы. Впервые осуществлен скрининг дрожжей из молочнокислых и других ферментированных продуктов, активно растущих на молочной сыворотке с растительным компонентом; проведена идентификация до рода дрожжевых культур, наиболее продуктивных в отношении накопления биомассы.



Выделен и охарактеризован новый штамм дрожжей Candida inconspicua А3 (идентифицирован методом ПЦР-анализа 28S-субъединицы рРНК), активно накапливающий биомассу, белок и витамины на молочной сыворотке и растительном сырье. Определен и оптимизирован состав питательных сред для ТФФ и ГФ выделенных дрожжей; четко продемонстрировано более интенсивное накопление биомассы и белка дрожжами на жидкой гетерогенной питательной среде по сравнению с гомогенной.

Впервые подобраны технологические режимы культивирования дрожжей C. inconspicua А3 на жидкой гетерогенной питательной среде, содержащей молочную сыворотку и растительное сырье в условиях ферментера. Проведена биохимическая, санитарно-гигиеническая и токсикологическая оценка полученного ДО, доказавшая его биологическую ценность и безопасность для потребителя. Показана возможность использования полученного ДО в хлебопечении.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные исследования явились основой для решения задачи по созданию технологии ДО пищи на основе молочной сыворотки и растительного сырья.

Предлагаемая технология переработки кислой молочной сыворотки существенно упрощена по сравнению с существующими за счет исключения стадий предобработки (раскислениения, деминерализации и пр.). Предложен способ повышения продуктивности дрожжевых культур и увеличения содержания белка и витаминов в дрожжевом обогатителе в несколько раз за счет введения в молочную сыворотку растительных субстратов.

Разработана и экспериментально обоснована технология получения из молочной сыворотки и растительного сырья жидких и твердых ДО. Показана их биологическая ценность и доказана безвредность. Наработана опытная партия ДО в условиях ОАО "Вимм-Билль-Данн". В производственных условиях секции хлебопекарных технологий МГУПП проведена апробация способа выпечки формового и подового хлеба на основе полученных ДО, повышающих биологическую ценность изделий.

Разработан проект технических условий получения дрожжевого обогатителя пищи и проект технологической инструкции по получению дрожжевого обогатителя пищи. Подана заявка на выдачу патента РФ на способ получения биологически активных полуфабрикатов (№2006142024 от 28.11.06).

Теоретические и прикладные положения диссертационной работы излагаются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий в Московском Государственном Университете пищевых производств, а также изложены в студенческом практикуме по селекции микроорганизмов, рекомендованном для студентов высших учебных заведений по специальности 271500 (240902) «Пищевая биотехнология», как способ формирования новых направлений в биотехнологии,.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания (Москва, 2004); Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации (Москва, 2004, 2005 и 2006); Третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005); Пятой ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ (Москва, 2005); Седьмом Международном Форуме «Высокие технологии XXI века» (Москва, 2006); Четвертой Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в т.ч. 2 статьи в научных журналах, подана 1 заявка на выдачу патента РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 260 источников, из них 60 иностранных источников, и 11 приложений. Работа изложена на 193 страницах машинописного текста, включает 38 таблиц и 21 рисунок.

1. Обзор литературы

В литературном обзоре рассмотрены общие представления о составе нормальной микрофлоры различных отделов ЖКТ, рассмотрены ее функции и механизмы антагонистической активности. Систематизированы литературные данные по БАД, приведена их классификация и краткая характеристика. Сделан обзор существующих способов применения дрожжей в изготовлении продуктов функционального назначения. Уделено внимание технологическим аспектам культивирования дрожжей. Рассмотрена общая характеристика молочной сыворотки. Систематизированы литературные данные о способах ее применения в различных отраслях промышленности, переработки и утилизации.

Анализ литературных данных выявил проблемы, существующие в данной области знаний, и позволил сформулировать цель и задачи данного исследования.

2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы и методы исследований

Объектом исследования служили штаммы дрожжей, выделенные из спонтанных микробных ценозов плодово-ягодного сырья и из ценозов ферментированных, в т.ч. кисломолочных, продуктов. Продукты высевали на пшеничные отруби, увлажненные до 50-55% 10%-ным раствором сахарозы с добавлением 50 мкг/мл гентамицина для подавления роста бактерий. После инкубации в аэробных условиях при температуре 26-32С выделяли доминирующие культуры и оценивали их продуктивность на отрубях, увлажненных молочной сывороткой. Критерием оценки служила концентрация дрожжевых клеток в 1 г субстрата, накопленная в процессе ТФФ. Подсчет клеток осуществляли микроскопически в камере Горяева с разведением исследуемого твердофазного субстрата водой. Идентификацию дрожжей проводили по общепринятой методике [Бабьева И.П., Голубев В.И., 1979] согласно определителям дрожжей, на сайте www.cbs.knaw.nl, а также по анализу последовательности нуклеотидов 28S-субъединицы участка рРНК [Фомичева Г.М. и др., 2006; Kurtzman C.P., Robnett C.J., 1998] на капиллярном автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant на базе межинститутского центра коллективного пользования «Геном» при Институте молекулярной биологии РАН.

В качестве основы питательных сред использовали 6%-ную кислую молочную сыворотку и растительное сырье: зерно и отходы его переработки, крупы, солодовые ростки, соломенную и травяную муку.

ТФФ в лабораторных условиях проводили в чашках Петри при высоте слоя 2-3 см и влажности субстрата 50-55%. Чашки помещали в термостат на 24-48 часов при температуре воздуха 30±2°С.

ГФ вели в качалочных колбах на круговой лабораторной качалке при 180-220 об./мин. и в ферментере фирмы Biotron (Южная Корея) емкостью 40 дм3 с лопастной многоярусной мешалкой и кольцеобразным барботером. Продолжительность ферментации – 18-24 ч, температура 30±2°С. Оптимизацию состава питательной среды для культивирования дрожжевых культур проводили методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта [Бирюков В. В., Кантере В. М., 1985].

Содержание белка определяли по ГОСТ 23327-98 методом Къельдаля, РВ и крахмала - цианидным методом, влажность – по ГОСТ 29143-91 и ГОСТ 9404-88. Величину рН измеряли потенциометрическим методом. Содержание сахаров определяли по ГОСТ 29247-91, витаминов - методом ВЭЖХ на хроматографе Varian Dynamax по ГОСТ 30627-98. Аминокислотный состав ДО определяли на аминокислотном анализаторе Hitachi-835 по методике, предлагаемой производителем. Содержание кадмия и свинца определяли по ГОСТ Р 51301-99, ртути – по ГОСТ 26927-86, мышьяка – по ГОСТ 26930-86, пестицидов – в соответствии с общепринятым методикам [Клисенко М.А., 1992]. Микробиологический контроль полученных ДО проводили общепринятыми методами [СанПиН 2.3.2.1078-01, ГОСТ 9225-84].

Качество хлебобулочных изделий, приготовленных безопарным способом с использованием полученных ДО, оценивали по органолептическим и физико-химическим показателям, принятым в хлебопекарной отрасли [Пучкова Л. И., 1997].

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel 2003 Microsoft Office.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1. Выделение и первичный отбор дрожжей из дрожжесодержащих

материалов

Из естественных микробных ценозов плодово-ягодного сырья (облепиха, малина, кизил, ежевика и др.) и ферментированных (квашеная капуста, моченые яблоки и пр.), в том числе кисломолочных (кефир, айран, кумыс и др.), продуктов были выделены 274 новые дрожжевые культуры. В табл. 1 представлена продуктивность дрожжей, проявивших наибольшую интенсивность роста при первичном посеве на сывороточно-отрубевую питательную среду.

Таблица 1

Продуктивность дрожжей на сывороточно-отрубевой среде

№ п/п Дрожжи Продуктивность, млрд кл/г № п/п Дрожжи Продуктивность, млрд кл/г
24 часа 48 часов 24 часа 48 часов
1 2 3 4 5 6 7 8
1 К1 0,240 0,870 41 А1 0,880 1,150
2 К2 0,190 0,150 42 А2 1,130 3,700
3 К3 0,360 0,360 43 А3 2,030 4,850
4 К4 0,880 2,970 44 А4 0,890 2,320
5 К5 1,250 4,680 45 А5 1,250 2,540
6 К6 0,050 0,150 46 П1 0,380 0,750
7 К7 0,140 1,290 47 П2 0,100 0,050
8 К8 0,390 1,940 48 П3 ед кл ед кл
9 К9 1,770 2,540 49 П4 0,980 3,520
10 К10 0,350 0,740 50 П5 0,350 0,490
11 К11 1,640 4,530 51 П6 ед кл ед кл
12 К12 0,790 3,430 52 П7 0,050 0,250
13 К13 1,060 3,900 53 П8 0,200 0,250
14 К14 0,350 0,450 54 П9 0,760 3,920
15 К15 1,110 2,900 55 П10 0,380 0,640
16 К16 0,380 1,610 56 П11 0,770 3,560
17 К17 0,480 0,930 57 П12 0,030 0,040
18 К18 0,710 0,850 58 П13 0,490 0,550
19 К19 1,760 2,450 59 П14 0,130 0,130
20 К20 1,150 3,400 60 П15 0,470 0,750
21 К21 1,000 1,030 61 П16 0,180 0,780
22 К22 0,880 2,950 62 П17 ед кл ед кл
23 К23 0,810 2,990 63 П18 2,290 3,790
24 К24 0,730 3,930 64 П19 0,780 0,680
25 К25 1,000 1,700 65 П20 0,160 0,260
26 К26 0,360 0,880 66 П21 1,490 3,870
27 К27 0,050 0,050 67 П22 ед кл ед кл
28 К28 1,470 4,120 68 П23 0,380 0,480
29 К29 0,370 0,770 69 П24 0,290 0,600
30 К30 0,130 1,200 70 П25 ед кл ед кл
31 К31 0,970 0,750 71 П26 ед кл ед кл
32 К32 0,280 2,800 72 П27 0,030 0,050
33 К33 1,050 3,670 73 П28 0,460 0,690
34 К34 0,250 0,780 74 П29 ед кл ед кл
35 К35 0,220 3,000 75 П30 0,100 0,240
Продолжение таблицы 1
1 2 3 4 5 6 7 8
36 К36 ед кл ед кл 76 П31 0,150 0,250
37 К37 1,250 1,100 77 П32 ед кл ед кл
38 К38 0,060 0,060 78 П33 2,360 3,890
39 К39 0,990 3,350 79 П34 0,180 0,800
40 Кум* 0,350 1,550 80 С.f.** 2,130 4,160

*кумыс;

** Candida famata – эталонная культура, которая уже более 9 лет используется для производства БАД «Фервитал».

Наиболее продуктивные из выделенных культур были идентифицированы до рода. Дрожжи К5 были идентифицированы как Debaryomyces, К11 - как Pichia, А3 - как Issatchenkia, кумысные дрожжи - как Torula. Наиболее технологичным из перечисленных оказался штамм А3, в связи с чем было проведено секвенирование участка рРНК 28S-субъединицы длинной 440 нуклеотидов этого штамма с использованием ПЦР с целью точной идентификации до вида. Выявленная последовательность нуклеотидов оказалась полностью гомологична характерной для Candida inconspicua.

В табл. 2 представлены основные морфологические, культуральные и физиологические признаки штамма C. inconspicua А3.

Таблица 2

Основные морфологические, культуральные и физиологические признаки штамма C. inconspicua А3.

Признак Значение Признак Значение
Описание штриха Молочного цвета, густой консистенции Ассимиляция источников углерода: Глюкоза Галактоза Сахароза Мальтоза Целлобиоза Трегалоза Лактоза Мелибиоза Раффиноза Мелецитоза Инулин Крахмал D-ксилоза L-арабиноза D-арабиноза D-рибоза L-рамноза Глюкозамин Глицерин Эритрит Рибит Дульцит Маннит Сорбит Салицин Нитраты Молочная кислота Янтарная кислота Лимонная кислота Да Да Да Да Нет Нет Да Нет Да Нет Нет Нет Да Нет Нет Нет Нет Да Да Нет Нет Нет Слабо Да/Слабо Нет Нет Да Да Нет
Форма клеток Круглые, овальные
Размер клеток от (1,5 – 3,5)(3 – 6,5) до (3 – 5,5)(5,5 – 7,5) мкм
Бесполые и мицели-альные структуры почкование глобалистическое, многостороннее, образуют псевдомицеллий
Рост в среде без витаминов Нет (потребность в пиридоксине, тиамине и биотине)
Галотолерантность 6 – 10% NaCl
Рост при температуре: 250С 280С 340С 370С 400С 420С Да Да Да Да Да Да
Гидролиз мочевины Нет
Расщепление арбутина Слабо
Образование крахмала Нет
Образование этанола Да

Поскольку в работе планировалось использовать молочную сыворотку и крахмалосодержащее сырье у выделенных штаммов определяли активность -амилазы и -галактозидазы. Наибольшую амилолитическую активность наблюдали у дрожжей C. inconspicua А3: 57 ед/см3. Об активности -галактозидазы судили по скорости гидролиза лактозы в процессе развития на ней дрожжевых культур (рис.1) и характеризовали ее по периоду полупревращения.

Рис. 1. Гидролиз лактозы дрожжевыми культурами.

Как видно, наиболее активно лактозу расщепляют дрожжи рода Torula: период полупревращения составляет 7 часов. Дрожжи C. inconspicua А3 гидролизуют 50% лактозы за 13 часов.

2.2.2. Накопление дрожжевой биомассы в условиях ТФФ

Из литературных данных [Бабьева И.П., Чернов И.Ю., 2004] известно, что дрожжи растут в широком диапазоне рН, поэтому мы предварительно определили оптимальное значение рН молочной сыворотки: для дрожжей C. inconspicua А3, Debaryomyces sp. и Torula sp. оптимум рН составил 4,5, а для дрожжей Candida famata и Pichia sp. – 5,5.

Таблица 3

Накопление клеток дрожжами при ТФФ на различных субстратах, увлажненных до 50-55% молочной сывороткой.

№ п/п Твердый субстрат Продуктивность дрожжей, млрд кл/г
Candida inconspicua Debaryomyces sp. Pichia sp. Torula sp. Candida famata
24 часа 48 часов 24 часа 48 часов 24 часа 48 часов 24 часа 48 часов 24 часа 48 часов
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 Отруби 5,450 6,510 2,870 4,900 3,700 6,400 1,030 1,500 2,370 5,260
2 Солодовые ростки 5,200 7,860 2,900 5,350 4,000 7,020 1,000 1,850 3,250 6,340
3 Соломенная мука 1,300 4,780 1,260 3,200 2,000 4,250 0,600 0,900 1,800 3,760
4 Пшеничный шрот* 0,730 1,000 - - 0,390 0,650 - - 0,740 0,800
5 Солодовые ростки + отруби (1:1) 4,700 8,630 3,650 6,400 4,000 7,900 1,100 2,300 5,250 7,510
6 Солодовые ростки + отруби (2:1) 3,600 7,450 4,270 6,000 4,020 7,630 0,820 1,700 3,810 7,000
7 Солодовые ростки + пшеничный шрот (1:1) 5,860 9,500 4,350 7,810 5,200 9,100 1,820 2,600 4,750 8,810
8 Солодовые ростки + пшеничный шрот (1:2) 2,330 4,000 3,100 3,260 2,540 3,800 0,510 0,760 1,480 3,100
9 Солодовые ростки + соломенная мука (1:1) 2,850 6,600 2,900 4,600 4,060 6,000 0,650 1,230 2,800 5,480
10 Солодовые ростки + соломенная мука (2:1) 4,210 6,800 2,760 4,990 3,040 6,500 0,650 1,380 3,000 6,100
11 Отруби + пшеничный шрот (1:1) 5,300 9,890 4,800 8,470 5,000 9,230 1,000 2,100 7,020 9,240
Продолжение таблицы 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
12 Отруби + пшеничный шрот (1:2) 1,460 3,860 1,100 3,000 1,200 3,800 0,490 0,630 2,500 3,180
13 Отруби + соломенная мука (1:1) 2,900 5,200 2,380 4,150 2,140 5,890 0,290 1,010 1,760 4,310
14 Отруби + соломенная мука (2:1) 3,260 6,000 2,380 4,700 3,070 5,910 0,920 1,220 2,160 4,880
15 Пшеничный шрот + соломенная мука (1:1) 4,010 5,900 2,760 4,320 3,280 5,700 0,960 1,020 3,020 4,900
16 Пшеничный шрот + соломенная мука (2:1) 1,100 2,000 1,000 1,860 1,200 2,560 0,280 0,630 1,220 1,580
17 Ячменный пенсак 2,120 4,280 2,030 3,300 1,780 3,990 0,100 0,560 2,650 3,050
18 Перловая крупа 2,300 4,710 1,690 3,890 2,900 4,700 0,300 0,700 1,780 3,830
19 Пшеничная крупа 2,560 4,560 1,030 3,700 2,610 4,390 0,190 0,600 1,560 3,300
20 Ячменный пенсак + отруби (3:1) 2,300 5,130 1,580 4,620 3,400 5,320 0,280 1,000 2,350 4,600
21 Перловая крупа + отруби (3:1) 4,260 6,000 2,870 5,030 3,020 5,910 0,800 1,320 1,660 4,880
22 Пшеничная крупа + отруби (3:1) 2,420 5,560 2,000 4,800 3,020 5,600 0,560 1,200 2,100 4,700

*получен после экстракции витамина Е из пшеничных хлопьев

Результаты опытов по наращиванию биомассы дрожжей на различных твердых растительных субстратах и их композициях, увлажненных молочной сывороткой до 50-55%-й влажности показали (см. табл. 3), что оптимальными для этой цели являются сочетания твердого носителя с пористым разрыхляющим компонентом (вариант 21 и 22 в табл. 3), или же рыхлого формообразующего носителя с дополнительным источником легкодоступных ростовых веществ в соотношении 1:1 (варианты № 7, 11 в табл. 3). Наиболее продуктивным в условиях ТФФ показал себя штамм C. inconspicua А3.

2.2.3. Накопление дрожжевой биомассы в условиях ГФ

Естественной формой существования микроорганизмов в природе является иммобилизованное состояние [Costertton J.W. et al., 1995], поэтому для повышения выхода биомассы было предложено вносить в молочную сыворотку различные твердые растительные субстраты.

Жидкие гетерогенные среды, использованные нами в работе, условно можно разделить на 2 группы: с пористым компонентом и с крупами. Оптимальные значения рН для каждой дрожжевой культуры при развитии на средах данного типа оказались такими же, как и в случае ТФФ. Данные о влиянии содержания твердого пористого компонента на накопление клеток дрожжами суммированы в табл.4.

Таблица 4

Влияние введения твердого растительного компонента в питательную среду на основе кислой молочной сыворотки на накопление клеток дрожжами

Субстрат СВ*, % Дрожжи
Candida inconspicua Debaryo-myces sp Pichia sp Torula sp Candida famata
1 2 3 4 5 6 7
6 (контроль) 0,440 ед клетки 0,640 0,390 ед клетки
Отруби 7 0,500 ед клетки 0,700 0,500 ед клетки
8 0,800 0,350 0,740 0,500 0,200
9 1,060 0,370 0,790 0,500 0,200
10 1,200 0,420 0,800 0,520 0,460
11 1,470 0,500 0,800 0,680 0,750
12 1,500 0,520 0,890 0,700 1,110
13 1,530 0,580 0,940 0,740 1,350
14 1,300 0,300 0,380 0,500 ед клетки
Солодовые ростки 7 0,450 ед клетки 0,650 0,400 ед клетки
8 0,570 0,050 0,680 0,400 0,130
9 0,600 0,090 0,670 0,420 0,280
10 0,600 0,130 0,690 0,420 0,510
11 0,620 0,200 0,700 0,450 0,700
12 0,700 0,230 0,720 0,480 0,730
13 0,750 0,480 0,850 0,600 1,100
14 0,700 ед клетки 0,800 0,530 0,980
Продолжение таблицы 4
1 2 3 4 5 6 7
Соломенная мука 7 0,460 ед клетки 0,680 0,400 ед клетки
8 0,460 0,020 0,700 0,400 0,290
9 0,500 0,090 0,710 0,420 0,330
10 0,510 0,100 0,740 0,420 0,540
11 0,500 0,110 0,740 0,470 0,800
12 0,570 0,170 0,740 0,480 0,900
13 0,600 0,200 0,760 0,520 0,960
14 0,350 ед клетки 0,520 0,400 0,500
Пшеничный шрот 7 0,560 ед клетки 0,650 0,430 0,200
8 0,620 0,120 0,700 0,480 0,250
9 0,740 0,200 0,720 0,500 0,750
10 0,760 0,290 0,800 0,500 0,750
11 0,800 0,300 0,800 0,520 0,820
12 0,930 0,350 0,850 0,600 0,930
13 1,250 0,400 0,900 0,670 1,200
14 0,690 0,300 0,760 0,500 0,830

* сумма сухих веществ питательной среды, из которых 6% - СВ сыворотки, а остальные – СВ твердого растительного компонента.

Как видно из таблицы 4, выход дрожжевой биомассы увеличивается при увеличении содержания СВ в среде и достигает максимума при содержании СВ 13% (продуктивность возрастает по сравнению с контролем в среднем в 2 - 4 раза в зависимости от штамма), притом наибольшее количество клеток дрожжи накапливают при внесении в среду отрубей и пшеничного шрота. Как и в случае с ТФФ, наиболее продуктивным оказался штамм C. inconspicua А3.

Для обеззараживания питательных сред на основе молочной сыворотки и круп в результате проведенных исследований была выбрана пастеризация при 600С в течение 60 мин: подобная предобработка значительно снижает степень обсемененности посторонней микрофлорой и сравнительно малоэнергоемка (табл. 5).

Таблица 5

Влияние режима обработки питательной среды на основе молочной сыворотки и перловой крупы (25%СВ) на накопление клеток дрожжами Candida inconspicua

Режим обработки Сте­пень набу­хания* КМАФАнМ, КОЕ/см3 РВ % Крахмал % Продук­тивность, млрд кл/см3 КМАФАнМ, КОЕ/см3
По факту СанПиН 2.3.2.1078-01 По факту СанПиН 2.3.2.1078-01
Пастери­зация 0,43 1·103 не более 105 3,0 2,7 1,200 2,3·103 не более 105
Стерили­зация 0,80 - 8,9 8,1 0,100 -
Заварива­ние 0,67 104 5,1 4,6 0,570 1,5·105

*отношение фактически впитанной влаги к максимально возможной

Культивирование дрожжей C. inconspicua А3 на гетерогенных средах, содержащих молочную сыворотку и различные крупы, показало, что увеличение содержания СВ до 14% за счет добавления круп не стимулирует рост дрожжей. Возрастание продуктивности наблюдается при суммарном содержании СВ 15% и достигает максимума при 33%. На среде с перловой крупой дрожжи накапливают несколько больше клеток, чем с пшеничной (1,800 и 1,700 млрд кл/см3 соответственно), и на 20% больше, чем на среде с 13% СВ при добавлении отрубей (1,530 млрд кл/см3).

Одним из важнейших показателей пищевой ценности продукта является содержание белка. Поэтому определяли влияние внесения перловой крупы в питательную среду на основе молочной сыворотки на накопление клеток дрожжами C. inconspicua А3 и содержание белка в жидкой фазе (см. рис. 2).

Рис. 2. Влияние внесения перловой крупы в питательную среду на основе молочной сыворотки на накопление клеток дрожжами C. inconspicua А3 и содержание белка в жидкой фазе.

Как видно из рис.2, содержание белка возрастает с увеличением количества дрожжевых клеток. Максимум накопления биомассы (1,860 млрд/см3) и наибольшее

содержание белка (77,53 мг/см3) наблюдается при содержании в среде 33% СВ. При этом содержание белка возрастает по сравнению с начальным более чем в 3 раза.

Следует отметить общую для всех вариантов гетерогенных сред на основе молочной сыворотки тенденцию снижения продуктивности дрожжей при достижении определенного содержания СВ в среде за счет введения твердого компонента: для пористых компонентов это 14%СВ, а для круп – 38%СВ.

Полученные данные (табл. 4, рис.2) полностью подтверждают высказанное выше предположение о стимулирующем влиянии твердых частиц на накопление биомассы (клеток) культурами дрожжей. Такой эффект, по-видимому, может быть в равной степени обусловлен как поступлением дополнительных питательных веществ из твердых субстратов, так и непосредственно иммобилизованным состоянием клеток. Таким образом, для культивирования дрожжей в условиях ГФ на молочной сыворотке представляется целесообразным внесение пористых растительных компонентов (отруби, пшеничный шрот) в количестве 13% СВ или круп в количестве 33% СВ.

2.2.3.1. Подбор и оптимизация состава питательных сред для культивирования дрожжей в условиях ГФ

Для того, чтобы полученная на молочной сыворотке дрожжевая биомасса по своему составу приближалась к молочному белку, в сыворотку вносят минеральные соли: сернокислый аммоний, двузамещенный фосфорнокислый калий, хлористый калий и мочевину [Храмцов А.Г., Нестеренко П.Г., 2004]. Внесение в среду 1,4-1,8 г/дм3 (NH4)2SO4 и 0,6 – 1,0 г/дм3 КН2РО4, в зависимости от штамма позволило увеличить содержание белка на 8-12%, а продуктивность – на 10-13%. Для штамма Candida inconspicua удалось повысить содержание белка до 86,87 мг/см3 и содержание клеток до 2,150 млрд/см3 путем внесения 1,8 г/дм3 сульфата аммония и 1,0 г/дм3 двузамещенного фосфорнокислого калия.

Подбор состава питательных сред (рН, концентрация солей и %СВ) выполнялся с достаточно большим шагом в исследуемом параметре, поэтому мы провели оптимизацию состава питательных сред с помощью метода аддитивно-решетчатого описания объекта. Оптимизация заключалась в выборе уровней каждого фактора, обеспечивающих наибольший эффект. Полученный в результате реализации этого метода состав питательных сред представлен в табл. 6.

Таблица 6

Оптимальный состав питательных сред для культивирования дрожжей в условиях ГФ, полученный реализацией метода аддитивно-решетчатого описания эксперимента

Дрожжи Концен­трация круп, % CB рН молоч­ной сыво­ротки Концен­трация (NH4)2SO4, г/дм3 Концентрация КН2РО4, г/дм3
Сandida inconspicua 31 4,5 1,6 1,0
Debaryomyces sp 31 4,5 1,8 0,8
Pichia sp 31 5,5 1,2 0,8
Torula sp 33 4,5 1,6 0,8
Candida famata 33 5,5 1,2 1,0

2.2.4. Определение состава и биологической ценности ДО

Важными показателями биологической ценности пищевых продуктов и различных БАД являются содержание белка, витаминов, пищевых волокон и др. БАВ. Критерием биологической ценности белка является его аминокислотный состав, особенно содержание тех аминокислот, которые находятся в нем в наименьшем количестве. В табл. 7 приведен состав молочной сыворотки и полученного на оптимизированной питательной среде дрожжевого обогатителя пищи на базе молочной сыворотки и перловой крупы с использованием штамма дрожжей C. inconspicua А3, а на рисунке 3 – аминокислотный состав исходной молочной сыворотки и ДО на ее основе.

Таблица 7

Состав молочной сыворотки и ДО на основе молочной сыворотки и перловой крупы

№ п/п Показатель Значение
Молочная сыворотка ДО
1 Титр дрожжевых клеток, 109 кл/см3 - 2,15
2 Титруемая кислотность, 0Т 60 89
3 Лактоза, г/100 см3 3,5 1,05
4 Глюкоза, мг/100 см3 70 -
5 Галактоза, мг/100 см3 63 -
6 Сахароза, мг/100 см3 200 -
7 Белок, г/100 см3 0,88 8,7
8 Витамины, мкг%: В2 В6 РР 6,64 2,87 0,84 23,68 36,25 390,6
9 Этиловый спирт, г/100 см3 - 0,92

*- незаменимые аминокислоты

Рис. 3. Аминокислотный состав молочной сыворотки и ДО на основе молочной сыворотки и перловой крупы

Из рисунка 3 видно, что в процессе ферментации молочной сыворотки дрожжами Сandida inconspicua происходит увеличение содержания эссенциальных аминокислот. По метионину оно составляет 50%, по валину, лизину и фенилаланину – 40%, а по треонину, изолейцину и лейцину – немногим более 30%. Количество серусодержащих аминокислот (цистин, метионин) невелико в опытном образце, а цистин полностью отсутствует в контрольном. Ароматические аминокислоты представлены тирозином и фенилаланином, причем тирозин отсутствует в исходной молочной сыворотке. Содержание таких аминокислот как серин, пролин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты увеличилось в опытном образце по сравнению с контролем в среднем на 42%. Содержание аланина и аргинина возросло на 75 и 83,3 % соответственно, содержание аргинина и глицина – вдвое.

Следует отметить, что по процентному соотношению аминокислот белок полученного ДО мало отличается от исходного сывороточного белка, то есть качественный состав белка ДО близок к сывороточному белку, который является наиболее ценным по скору незаменимых аминокислот

На основании полученных результатов (табл. 7 и рис. 3) можно сделать вывод, что полученный ДО обладает свойствами, позволяющими придавать продуктам свойства лечебно-профилактических и диетических продуктов за счет белка, сбалансированного по аминокислотному составу, и высокого содержания витаминов группы В и РР.

2.2.5. Химический и микробиологический анализ ДО

Действующая нормативная документация предъявляет к молочной сыворотке и ее производным определенные требования по безопасности для потребителя [СанПиН 2.3.2.1078-01, ГОСТ 30178-96, ГОСТ 26927-86, ГОСТ Р 51301-99].

Результаты анализов (табл. 8) и проведенные исследования острой токсичности, показавшие, что ДО относится к классу нетоксичных веществ, свидетельствуют о соответствии полученных ДО требованиям нормативно-технической документации. Таблица 8

Химические и микробиологические показатели полученного ДО

Наименование Фактическое значение Единица измерения Норматив
Токсичные элементы: ртуть мышьяк кадмий свинец не обнаружен 0,007 не обнаружен 0,03 мг/л не более 0,005 не более 0,05 не более 0,03 не более 0,1
Пестициды: ГХЦ ДДТ не обнаружен не обнаружен мг/л не более 0,05 не более 0,05
Радионуклиды: Cs-137 Sr-90 0,3 0 Бк/кг не более 100 не более 25
КМАФАнМ 2,3*103 КОЕ/см3 не более 2*105
БГКП не обнаружено КОЕ/см3 не доп. в 0,01 см3

2.2.6. Определение оптимальных параметров культивирования дрожжей в условиях ферментера

С целью масштабирования результатов, полученных в лабораторных условиях, а также для оценки влияния ряда факторов, таких как обеспеченность культуры кислородом, избыточное давление и регулирование активной кислотности среды на развитие дрожжевой культуры в условиях исследовательской лаборатории ОАО «Вимм-Билль-Данн» были проведены ферментации C. inconspicua А3 в ферментере объемом 40 дм3 с коэффициентом заполнения 0,5 при различных вариантах параметров культивирования (рис. 4). Полученные данные свидетельствуют, что наибольшая продуктивность в накоплении биомассы достигается при наилучшем обеспечении культуры кислородом за счет активного барботирования потоком воздуха (2 дм3/миндм3) и повышенном избыточном давлении (40 кПа), а эффективная стабилизация обсемененности остаточной бактериальной микрофлорой наблюдается при условиях, аналогичных выращиванию в колбах на качалке; при этом рН-статирование не обеспечивает дополнительного увеличения продуктивности дрожжей и стабилизации бактериальной обсемененности.

2.2.7. Применение полученного ДО в хлебопечении

Наиболее распространенными продуктами питания, потребляемыми населением, являются хлеб и хлебобулочные изделия. Большинство хлебобулочных изделий, особенно из муки высшего сорта, содержат малые количества белка, свободных аминокислот, витаминов и некоторых других физиологически важных компонентов, недостаточное содержание которых в пище приводит к нарушению обменных процессов и возникновению различных заболеваний. Поэтому в производственных условиях секции хлебных технологий МГУПП была проведена серия выпечек образцов хлеба, изготовленного по традиционной рецептуре, и хлеба с добавлением ДО на основе молочной сыворотки и перловой крупы, определены их органолептические и физико-химические показатели.

На основании проведенной оценки органолептических и физико-химических показателей образцов был сделан вывод о том, что внесение ДО в количестве 60 % в рецептуры пшеничного формового и подового хлеба не снижает качества изделий и способствует увеличению их биологической ценности за счет белка (увеличение содержания на 38%), сбалансированного по аминокислотному составу (скор незаменимых аминокислот повышается на 37%) и витаминов группы В и РР (в среднем на 41%).

 Изменение рН (А), численности-0

Рис. 4. Изменение рН (А), численности дрожжевых клеток (по прямому счету в камере Горяева – Б) и бактериальной обсемененности (по результатам посева – В) в ходе ферментации дрожжами Сandida inconspicua молочной сыворотки, содержащей отруби (13% СВ) при различных параметрах культивирования.

2.2.8. Технологическая схема процесса получения ДО

На основании проведенных исследований были разработаны 2 типовые блок-схемы процесса получения ДО - жидких и сухих – на основе молочной сыворотки и растительного сырья. Также предложено аппаратурное оформление технологических процессов. На рис. 5 представлена технологическая схема производства жидкого ДО.

2.2.9. Расчет экономической эффективности разработанной технологии ДО и применения их в хлебопекарной промышленности

Расчет экономической эффективности разработанной технологии ДО показал, что стоимость 1 кг сухого ДО составит 8,70 руб, 1 м3 жидкого ДО – 37,32 руб. Учитывая, что в хлебобулочные изделия предполагается вносить 60 % ДО, заменяя им 20% пшеничной муки высшего сорта, была рассчитана приблизительная розничная цена одного хлебобулочного изделия массой 400 г, которая составила 10,68 руб. (для сравнения: цена хлебобулочного изделия, выпеченного без внесения ДО – 7,77 руб., а цельнозернового хлеба – около 20 руб.). При этом биологическая ценность хлебобулочных изделий повышается за счет сбалансированного по аминокислотному составу белка и витаминов, что позволяет сделать вывод о технологической и экономической целесообразности данного способа приготовления хлебобулочных изделий при позиционировании их в качестве продуктов функционального питания.

3. Выводы

  1. Кисломолочные продукты являются эффективным источником для выделения новых культур дрожжей, перспективных для целей биоконверсии молочной сыворотки и растительного сырья.
  2. Дрожжи, выделенные из молочнокислых продуктов и интенсивно растущие на молочной сыворотке, обнаружены в родах Candida, Piсhia, Torula, Debaryomyces.
  3. Наиболее перспективная культура дрожжей для биоконверсии молочной сыворотки идентифицирована методом ПЦР- анализа как Candida inconspicua.
  4. В качестве питательных сред для ТФФ выделенных дрожжей рекомендуются комплексные питательные среды, содержащие молочную сыворотку и плотные и рыхлые растительные субстраты. Подобран и оптимизирован состав жидких гетерогенных сред для ГФ дрожжевых культур методом аддитивно-решетчатого описания объекта (рН, %СВ, количество вносимых солей).

-1-молочная сыворотка, СВ6%

-2-растворы солей

-3-крупа

-4-питательная среда

-5-пастеризованная и охлажденная ПС

-6-посевной материал

-7-воздух атмосферный

-8-воздух стерильный

-9-воздух отработанный

-10-канализационный сток

-11-вода оборотная прямая

-12-вода оборотная обратная

-13-дрожжевой обогатитель

-14-дрожжевой обогатитель пастеризованный и охлажденный

-15-пар

-16-готовый продукт

Рис. 5. Технологическая схема производства жидкого дрожжевого обогатителя путем ГФ

  1. Для ГФ выделенных дрожжей рекомендуются гетерогенные среды на основе молочной сыворотки и пористых субстратов (13 СВ%) или круп (31-33 СВ%).
  2. Подобраны оптимальные параметры культивирования дрожжей на жидких гетерогенных средах с рыхлым растительным компонентом в условиях ферментера для максимального накопления дрожжевых клеток: перемешивание – 200 об/мин, барботаж воздухом – 2 дм3/мин·дм3; избыточное давление – 40 кПа, без рН-статирования; а для стабилизации остаточной бактериальной обсемененности - перемешивание – 200 об/мин, без барботажа, без избыточного давления и без рН-статирования.
  3. Разработаны технологические схемы производства дрожжевых обогатителей: жидкого - с содержанием СВ 30-35%, сухого – с влажностью 5-10%; предложено аппаратурное оформление разработанных схем.
  4. Исследована биологическая ценность полученного жидкого обогатителя, проведен микробиологический, химический анализы и токсикологическое исследование, показавшие его безвредность.
  5. Теоретически обоснована и практически доказана возможность использования нового полученного жидкого дрожжевого обогатителя в рецептуре хлебобулочных изделий.
  6. Новые хлебобулочные изделия, несмотря на их более высокую себестоимость, могут быть рекомендованы для использования в качестве продуктов функционального назначения, что позволяет прогнозировать их перспективность на рынке.

4. Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Борисенко Е.Г., Солдатова С.Ю., Филатова Г.Л., Лыско К.А. Растительно-дрожжевые функциональные продукты: технология и применение. //В сб.: Международная конференция "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы". Москва, 2-4 июня 2004, стр.171-172.
  2. Борисенко Е.Г., Лыско К.А., Солдатова С.Ю. Разработка технологии дрожжевого нутрипарафармацевтика на базе растительного сырья.// В сб.: Отчетная научно-техническая конференция "Технология живых систем", раздел 4, М.: МГУПП, 2004, с. 77-80.
  3. Борисенко Е.Г., Лыско К.А. Студенческий практикум по селекции микроорганизмов как способ формирования новых направлений в биотехнологии.//В сб.: Межвузовская научно-методическая конференция «Содержание образования и технология обучения – место и роль в системе обеспечения качества подготовки специалистов». М.: МГУПП, 2005, стр. 317-321.
  4. Борисенко Е.Г., Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р., Солдатова С.Ю. Дрожжевые функциональные продукты: технология и применение.// В сб.: Научно-практическая конференция «Значение биотехнологии для здорового питания и решение медико-социальных проблем». Калининград, 22-23 июня 2005, стр. 13-14.
  5. Борисенко Е.Г., Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р. Микробные биотехнологии в интенсификации производства продовольствия.// В сб.: III съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 25-27 октября 2005, стр. 141-143
  6. Борисенко Е.Г., Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р. Микробные обогатители пищи и кормов: технология и применение.//В сб.: III Юбилейная международная выставка-конференция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации». М.: МГУПП, 2005, ч. 1., стр. 127-132.
  7. Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р., Борисенко Е.Г. Биоконверсия растительного сырья: пищевые продукты и корма на его основе.// В сб.: Труды IV ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН – ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 14-16 декабря 2005, стр. 308-314.
  8. Борисенко Е.Г., Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р. Инновационные биотехнологии в производстве продовольствия.//В сб.: Конференция VII Международный форум «Высокие технологии XXI века». Москва, 24-27 апреля 2006, стр. 285-287.
  9. Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р., Борисенко Е.Г. Дрожжевые обогатители пищи и кормов на базе растительного сырья и молочной сыворотки.//В сб.: IV Международная научно-практическая конференция «Технологии и продукты здорового питания».М.: МГУПП, 2006, ч.1, стр. 206-212.
  10. Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р., Ганькина Е.В., Борисенко Е.Г. Дрожжевые технологии в производстве продуктов питания.//Пищевая промышленность, 11/2006, стр. 54-55.
  11. Шамсутдинова В.Р., Лыско К.А. Дрожжевые нутриенты на основе аэробной ферментации органического сырья.//В сб.: IV Международная конференция-выставка «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации». М.: МГУПП, 2006, ч. 3, стр. 95-98.
  12. Лыско К.А., Шамсутдинова В.Р., Борисенко Е.Г., Троякова С.А., Терешина Е.Н. Дрожжевые обогатители пищи и кормов на основе молочной сыворотки и зернового сырья.//Хранение и переработка сельхозсырья, 3/2007, стр. 52-54.

5. Список использованных сокращений

БАВ – биологически активные вещества; БАД – биологически активная добавка; ЖКТ – желудочно-кишечный тракт; ГФ – глубинная ферментация; ТФФ - твердофазная ферментация; ДО – дрожжевой (-ые) обогатитель (-ли); ПЦР – полимеразно-цепная реакция; ГХЦ – гексахлорциклогексан; РВ – редуцирующие вещества; СВ – сухие вещества.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.т.н., профессору Е.Г. Борисенко за помощь в выполнении работы, а также родителям, друзьям, коллегам, И.Н. Мозговой и В.Г. Блиадзе за помощь и поддержку.


[1] Примечание: список сокращений представлен в конце реферата



 





<


 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.