Разработка биотехнологий получения иммобилизованных дрожжей и их применения в бродильных производствах
На правах рукописи
СТЕПАНОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ
РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВАХ
05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов (пивобезалкогольная, спиртовая и винодельческая промышленности)
05.18.10 Технология чая, табака и биологически активных веществ и субтропических культур
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва 2007
Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московском государственном университете пищевых производств» и на кафедре «Химическая Энзимология» Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова
| Научные руководители: | доктор биологических наук, профессор Грачева Ирина Михайловна |
| кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник Ефременко Елена Николаевна | |
| Официальные оппоненты: | доктор технических наук, доцент Карпенко Дмитрий Валерьевич |
| кандидат технических наук Морозов Анатолий Михайлович | |
| Ведущая организация: | Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Россельхозакадемии |
Защита состоится «29» мая 2007 г. в 12 00 часов в ауд. III-101 на заседании Диссертационного Совета Д 212.148.04 при ГОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП.
Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д.11, ГОУ ВПО МГУПП, ученому секретарю Совета.
Автореферат разослан «27» апреля 2007 г.
| Ученый секретарь Диссертационного Совета, д.т.н., доц. | Крюкова Е.В. |
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Во всех отраслях пищевой промышленности все большее значение приобретает проблема снижения себестоимости выпускаемой продукции с сохранением ее высокого качества и конкурентоспособности на рынке. Эта же проблема затрагивает и винодельческое производство.
В России сегодня жесткие требования предъявляются к качеству вина, производимому внутри страны и импортируемому из-за рубежа. Разработка новых технологий виноделия при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объем производимой продукции при сохранении ее высокого качества является актуальным решением современных задач виноделия.
Согласно известным публикациям, применение иммобилизованных клеток дрожжей во многих отраслях виноделия может обеспечивать повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции (Taillandier, 1994; Саришвили, 1996; Fumi, 1998; Silva, 2002; Tsakiris, 2004). Иммобилизованные дрожжевые клетки отличаются от свободных клеток повышенной устойчивостью к различным неблагоприятным условиям ведения процесса и возможностью их применения для получения готового продукта с более высоким содержанием этанола, в том числе в режиме непрерывных технологий, а также позволяют существенно упростить отделение готового продукта от биомассы дрожжей.
Наибольшую популярность при разработке препаратов на основе иммобилизованных клеток дрожжей для виноделия в качестве носителя приобрел гель альгината кальция, несмотря на то, что его структура, как правило, характеризуется низкой механической прочностью в присутствии компонентов вина (фосфат-ионов и органических кислот). Кроме того, установлено, что в подобных гелевых системах массообменные процессы внутри массы геля существенно затруднены вследствие мелкопористой структуры матрицы, что неизменно приводит к постепенному отмиранию клеток во внутренних слоях гранул биокатализатора и снижению его продуктивности.
Другой наиболее широко распространенной проблемой в виноделии при использовании иммобилизованных препаратов является накопление свободных клеток в вине в процессе брожения, вызывающее помутнение готового продукта и ухудшение его качества. Существуют различные предложения по преодолению накопления свободных клеток в сбраживаемой среде (Klein, 1992, Divies, 1995, Yokotsuka, 1997), однако, одним из наиболее эффективных подходов к преодолению этой проблемы является использование новых носителей. Так, применение для этих целей криогеля поливинилового спирта (ПВС), обладающего макропористой структурой, высокими прочностными и массообменными характеристиками наряду с высокой химической стабильностью, представляется перспективным решением указанных проблем.
Криогели ПВС формируются в результате замораживания концентрированных растворов ПВС, их выдерживания в замороженном состоянии в течение определенного времени и последующего оттаивания (Лозинский, 2002). В основе образования криогеля лежит структурирование полимера за счет образования множественных водородных связей. Очевидно, что для клеток необходима оптимизация условий проведения криоиммобилизации и установление оптимального состава биокатализатора (концентрации клеток и полимера в грануле) для обеспечения высокой жизнеспособности и метаболической активности иммобилизованных клеток.
В связи с этим, актуальной представляется разработка новой технологии получения высокоэффективного иммобилизованного биокатализатора с использованием криогеля ПВС в качестве носителя, позволяющей свести к минимуму накопление свободных клеток в среде при высокой продуктивности и стабильности функционирования иммобилизованных клеток.
Исследование характеристик разработанного биокатализатора и условий его возможного применения в различных областях виноделия являются актуальными, так как направлены на повышение качества готового продукта при одновременном упрощении технологического процесса.
Целью данной работы являлась разработка технологии получения нового высокоэффективного биокатализатора на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, и исследование его свойств при использовании в производстве различных спиртосодержащих напитков.
В ходе работы решались следующие основные задачи:
- выбор условий подготовки клеток дрожжей к криоиммобилизации на основе показателей метаболической активности клеток и их биохимических характеристик;
- оптимизация состава иммобилизованного биокатализатора по концентрации клеток и полимера, а также выбор условий формирования гранул биокатализатора;
- применение разработанного иммобилизованного биокатализатора в процессе шампанизации вина и исследование его свойств (продуктивность, операционная стабильность и стабильность при хранении);
- определение и сравнение основных характеристик готовой продукции (концентрации спирта, сахара, органических кислот и ароматических веществ), производимой с использованием разработанного препарата иммобилизованных клеток и свободных клеток дрожжей;
- выяснение возможности применения разработанного биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для кислотопонижения вина, устранения винных недобродов и получения вина по красному и белому методам;
- оценка возможности использования разработанного иммобилизованного биокатализатора для получения биоэтанола из различных отходов сельского хозяйства и промышленности, в том числе и пищевой.
Научная новизна работы. Получен новый биокатализатор на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для получения спиртосодержащих напитков. Новизна разработки подтверждена заявкой на патент РФ на изобретение способа получения иммобилизованного биокатализатора для получения различных спиртосодержащих напитков (заявка № 2006113768, приоритет от 24.04.2006).
Показана важность выбора условий наращивания клеток для их иммобилизации в криогель ПВС. Установлено влияние концентрации клеток, носителя и условий формирования гранул биокатализатора на его конечные характеристики, в частности, пористость матрицы носителя и бродильную активность иммобилизованных клеток.
Впервые показана возможность и перспективность использования одного и того же разработанного метода для получения биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных штаммов дрожжей, в частности, для применения в технологиях получения различных спиртосодержащих напитков, а также для получения биоэтанола из гидролизатов различных отходов промышленности и сельскохозяйственных культур.
Практическая значимость работы. Разработанный биокатализатор перспективен, с точки зрения его эффективного использования для получения различных спиртосодержащих напитков вместо традиционно применяемых для этих целей свободных клеток дрожжей.
Установлена возможность многократного использования биокатализатора при шампанизации вина по классической технологии, что может способствовать усовершенствованию существующего биотехнологического процесса с технологической, экологической и экономической точек зрения. Разработан лабораторный технологический регламент на получение иммобилизованного биокатализатора для шампанизации вина.
Показано существенное улучшение ароматических характеристик красных, белых и игристых вин, приготовленных с применением иммобилизованных клеток, что было подтверждено высокими дегустационными оценками от экспертов производственной дегустационной комиссии отдела химии и биохимии вина Национального института винограда и вина «Магарач» (г. Ялта, АР Крым).
Показана возможность успешного применения дрожжевых клеток, иммобилизованных по разработанному способу, в технологии производства биоспирта из отходов пищевых производств с выходом более 90% от теоретически возможного.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих Международных конференциях и конгрессах: Межд. конференции «От фундаментальной науки – к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, Россия, 2002); XII (Vitoria, Spain, 2004), XIII (Kingston, Canada, 2005), XIV Intern. Workshop on Bioencapsulation (Lausanna, Switzerland, 2006); 2-ом (2003), 3-ем (2005), 4-ом Москов. Межд. конгрессах «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); Всерос. симпозиуме с межд. участием «Биотехнология микробов» (Москва, Россия, 2004); 9-ой и 10-ой Межд. пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – Наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006); Intern. Congress on Bioprocessing in Food Production (Patras, Greece, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, 4 статьи в сборниках статей международных конференций, 7 тезисов докладов на международных конференциях и конгрессах, подана 1 заявка на патент РФ на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 175 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 265 ссылок, и приложения. Работа содержит 37 таблиц и 32 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Экспериментальная часть
Объекты исследования. При проведении шампанизации вина в работе использовался штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Шампанская-39, при сбраживании виноградных соков по красному и белому методам использовали следующие штаммы дрожжей S. vini: Каберне-5, Массандра-3, Кокур-3, Ленинградская, Кислотопонижающая, 47-К. В экспериментах по устранению недобродов и биологическому кислотопонижению вина, а также для получения биоэтанола из отходов промышленности и сельского хозяйства использовались дрожжи S. cerevisiae phv bayanus. Все штаммы дрожжей были получены из коллекции Отраслевой Лаборатории Технологии Игристых вин ВНИИПБиВП (г. Москва) и коллекции микроорганизмов НИВиВ “Магарач” (г.Ялта, АР Крым, Украина).
Методы исследования. В работе для накопления биомассы клеток использовалась полусинтетическая среда (рН 5,6), спиртосодержащие среды на основе виноматериала (рН 3,0-7,0) и среда на основе солодового сусла (рН 5,2). Культивирование клеток осуществлялось при 15-30°С в аэробных условиях при постоянном перемешивании (220 об/мин) на термостатируемой качалке IRC-1-U Adolf Kunner G Apparaebau (Швейцария).
Подсчет общего количества клеток дрожжей в образцах вина проводили в счетной камере Горяева, используя световой бинокулярный микроскоп XS 910 (Корея). Жизнеспособность и метаболическую активность иммобилизованных клеток контролировали, определяя концентрацию внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом, используя реагент фирмы «Люмтек» (Россия) и люминометр Microluminometr 3560 New Horizons Diagnostics Co (США). Получение биокатализатора на основе дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС (марка 16/1, «Аcros», Бельгия), осуществляли двумя методами: 1) в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН, согласно ранее известной методике (Мартыненко, 2004), используя криогрануляционную колонну, заполненную гидрофобной жидкостью; 2) суспензию клеток в растворе ПВС распределяли по различным формам, используя дозатор, и замораживали при –20оС в воздушной среде, выдерживали в замороженном состоянии 1418 ч, а затем размораживали при +2 +8оС.
Для шампанизации вина использовали белые сухие виноматериалы, которые смешивали с тиражным ликером для получения тиражной смеси с концентрацией сахарозы 22-24 г/л. Брожение проводили в шампанских бутылках объемом 0,375 л или флаконах для анаэробных культур объемом 15 мл в анаэробных условиях при 15°С в течение 28-35 сут. Для получения белых столовых вин использовали виноградный сок с концентрацией сахаров 215 г/л, полученный из одной партии винограда сорта «Рислинг». Брожение проводили в специальных колбах с газоотводными трубками объемом 0,2 л при 20°С в течение 12 сут. Для приготовления красных вин в работе использовали виноградный сок с концентрацией сахаров 270 г/л, приготовленный из одной партии винограда сортов «Каберне-Совиньон» и «Саперави». Брожение вели в анаэробных условиях при 25°С в течение 20 сут. Для кислотопонижения использовали виноградный сок, приготовленный из винограда сорта «Рислинг», содержащего 8,42 г/л яблочной кислоты, а также крыжовниковый сок, содержащий 15,1 г/л яблочной кислоты. Процесс вели при 20оС в течение 7 сут. При проведении дображивания вина использовали виноматериал, содержащий 10,5 об. % и 13,5 об. % спирта. Брожение вели в течение 20 сут при 20оС.
Для измерения давления СО2 в бутылках с шампанским использовали афрометр. Определение жирнокислотного состава липидов дрожжевых клеток осуществляли методом газожидкостной хроматографии на приборе ЛХМ-8 МД. Для определения массовой концентрации кислот использовали метод прямого титрования. Определение массовой доли сернистой кислоты проводили методом йодометрического титрования. Определение органических кислот проводили методом жидкостной хроматографии на приборе «Цвет – 3006» с кондуктометрическим детектором. Определение концентрации различных сахаров проводили методом газожидкостной хроматографии на приборе «КОНТРОН» с ультрафиолетовым детектором. Для определения концентрации глюкозы в образцах вина использовали глюкозидазный метод с применением стандартного реагента фирмы «Импакт» (Россия). Определение спиртов проводили на газовом хроматографе «Цвет 3700» с пламенно-ионизационным детектором. Анализ ароматических веществ осуществляли с помощью масс-спектрометрии на приборе НР-5988 А (США) и газовой хроматографии, используя прибор HP-5710 (США) с пламенно-ионизационным детектором. Микрофотографии гранул криогеля ПВС, получали, используя сканирующий электронный микроскоп Jeol JSM-S300LV (Япония) и световой микроскоп Intel Play QX3 (США). Ферментативная обработка различных отходов промышленности и сельского хозяйства, использовавшихся для получения биоэтанола, проводилась на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.
При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях.
Результаты и их обсуждение
- Разработка способа получения иммобилизованного биокатализатора на основе дрожжевых клеток, иммобилизованных в криогель ПВС для шампанизации вина, и исследование его свойств
Иммобилизация дрожжей в криогель ПВС, согласно известному способу (Рис. 1А), включает в себя стадии накопления биомассы до глубокой стационарной фазы роста (72ч) на виноматериале при 15оС, приготовление суспензии клеток в растворе полимера, ее замораживание в среде гидрофобной жидкости и размораживание гранул. Эти условия, как было установлено, негативно влияют на жизнеспособность иммобилизованных клеток. Полученный при этом биокатализатор (Рис. 1А) характеризуется бродильной активностью, существенно сниженной по сравнению со свободными клетками дрожжей, что приводит к необходимости дополнительной активации иммобилизованных клеток и последующей их обработки ауторегуляторным фактором d-1 (Батраков, 1993) для устранения активного почкования иммобилизованных клеток. В связи с этим в работе необходимо было подобрать такие условия подготовки и иммобилизации клеток дрожжей в криогель ПВС, при которых обеспечивалась бы максимальная жизнеспособность и метаболическая активность дрожжей в сформированном биокатализаторе.
1.1. Выбор условий подготовки клеток дрожжей к иммобилизации в криогель ПВС
Разработка технологии получения нового высокоэффективного биокатализатора состояла из нескольких стадий (Рис. 2).
На первой стадии была исследована кинетика роста клеток дрожжей на питательных средах разного состава и с разными значениями рН. Основное внимание при культивировании клеток, которое проводили в аэробных условиях при разной температуре, уделялось величине удельной скорости роста клеток и максимальному выходу биомассы (Табл. 1).
Таблица 1. Кинетические параметры, характеризующие рост дрожжевых клеток при различных условиях культивирования
| Температура | аСреда | , ч-1 | td, ч | Максимальное накопление биомассы, г/л |
| 150С | A | 0,11 ± 0,01 | 6,3±0,6 | 6,5 ± 0,3 |
| Б | 0,12 ± 0,02 | 5,8±0,8 | 6,6 ± 0,4 | |
| В | 0,10 ± 0,01 | 6,9±0,6 | 6,4 ± 0,3 | |
| Г | 0,14 ± 0,02 | 4,9±0,8 | 15,0 ± 0,5 | |
| 200С | A | 0,15 ± 0,02 | 4,60 ± 0,3 | 6,8 ± 0,2 |
| Б | 0,16 ± 0,03 | 4,30 ± 0,1 | 6,9 ± 0,3 | |
| В | 0,15 ± 0,02 | 4,60 ± 0,3 | 7,0 ± 0,2 | |
| Г | 0,18 ± 0,01 | 3,85 ± 0,2 | 15,4 ± 0,4 | |
| 300С | A | 0,22 ± 0,03 | 3,15 ± 0,2 | 6,8 ± 0,1 |
| Б | 0,19 ± 0,01 | 3,65 ± 0,3 | 7,0 ± 0,2 | |
| В | 0,22 ± 0,02 | 3,15 ± 0,2 | 7,1 ± 0,2 | |
| Г | 0,28 ± 0,01 | 2,50 ± 0,1 | 15,4 ± 0,3 |
а-Виноматериал с pH 3,0 (A), рН 5,0 (Б) и рН 7,0 (В); полусинтетическая среда pH 5,6 (Г).
| А | Б |
Рис. 1. Принципиальная схема получения биокатализатора на основе криогеля ПВС:
А) по ранее известному методу (Мартыненко, 2004),
Б) по разработанному в работе методу.
Рис. 2. Общая схема проведения экспериментальных исследований в диссертационной работе.
Было установлено, что максимальные удельная скорость роста и уровень накопления биомассы дрожжей были получены на питательной полусинтетической среде (Рис. 1Б).
Далее проверялось влияние примененных условий культивирования дрожжей (состава среды, температуры и длительности процесса) на сбраживание свободными клетками виноматериала при 15оС в течение 4 недель (Рис. 3). Было показано, что бродильная активность дрожжей, выращенных на полусинтетической среде, практически не отличается от активности дрожжей, выращенных на виноматериале (Рис. 3). Однако, анализ биохимических характеристик этих клеток выявил существующие между ними различия. Было установлено, что удельная концентрация трегалозы в дрожжевых клетках, выращенных на полусинтетической среде почти на 120% и 30% выше, чем в клетках, культивирование которых проводили на виноматериале и солодовом сусле, соответственно (Табл. 2). А это значит, что клетки, выращенные на полусинтетической среде лучше были подготовлены к преодолению стрессовой ситуации, возникающей при их криоиммобилизации, так как известно, что трегалоза в дрожжах выполняет роль протектора целостности клеток при неблагоприятных условиях культивирования.
Рис. 3. Динамика накопления СО2 в процессе сбраживания виноматериала дрожжевыми клетками, предварительно выращенными при 30оС (а) и 20оС (б). Символы, ™ и – обозначают дрожжевые клетки, культивировавшиеся на виноматериале с рН 5,0; рН 7,0 и рН 3,0, соответственно; символ обозначает клетки, выращенные на полусинтетической среде (рН 5,6).
Высокий уровень внутриклеточного АТФ в дрожжевых клетках, выращенных на полусинтетической среде (Табл. 2), также свидетельствовал о более благоприятном энергетическом статусе этих клеток, с точки зрения их последующей иммобилизации, в сравнении с клетками, выращенными на виноматериале. Также было установлено, что величина удельной концентрации внутриклеточного АТФ имеет максимум в конце логарифмической фазы роста. Эту фазу сочли оптимальной для иммобилизации клеток.
Таблица 2. Содержание трегалозы и удельная концентрация внутриклеточного АТФ в дрожжах, выращенных на различных питательных средах в аэробных условиях
| Среда для культивирования дрожжей | Время культивирования, ч | Трегалоза, мг/г сух биомассы | [АТФ] х 10-10 моль/мг клеток |
| Виноматериал pH 3,0 | 24 72 | 0,116 0,119 | 7,8 1,7 |
| Полусинтетическая среда рН 5,6 | 24 | 0,259 | 16,2 |
| Солодовое сусло рН 5,2 | 24 | 0,197 | 15,7 |
Анализ жирнокислотного состава липидов биомассы дрожжей показал, что уровень ненасыщенности жирных кислот в клетках, выращенных при 20оC в 2 раза выше, чем в клетках, выросших при 30оC (Табл. 3).
Таблица 3. Жирнокислотный состав дрожжевой биомассы, полученной при культивировании в различных условиях
| Жирные кислоты (длина углеродной цепи и количество двойных связей) | Содержание в % | ||||||||
| 20оC | 30оC | ||||||||
| аА | Б | В | Г | А | Б | В | Г | ||
| C 10:014:0 | 3,99 | 0,63 | 3,99 | 0,88 | 1,22 | 1,17 | 14,69 | 12,87 | |
| C 14:1 | 0,30 | 0,18 | 0,30 | 0,42 | 0,08 | н/о | 0,42 | н/о | |
| C 15:0 | 0,64 | 0,34 | 0,65 | 0,23 | 0.30 | 0,44 | н/о | 4,92 | |
| C 16:0 | 9,32 | 7,68 | 9,47 | 6,39 | 26,66 | 28,48 | 27,16 | 24,80 | |
| C 16:1 | 41,91 | 36,74 | 42,56 | 55,00 | 26,11 | 22,97 | 8,72 | 10,89 | |
| C 17:0 | 0,20 | 0,07 | н/о | 0,18 | 0,11 | н/о | н/о | 1,16 | |
| C 18:0 | 3,20 | 4,22 | 3,46 | 2,53 | 25,12 | 25,34 | 19,02 | 6,51 | |
| C 18:1 | 38,74 | 48,8 | 37,98 | 33,51 | 19,51 | 21,20 | 16,30 | 19,19 | |
| C 18:218:3 | 0,44 | 0,36 | 0,37 | 0,11 | 0,26 | 0,30 | 9,35 | 6,16 | |
| C 2023 | 1,26 | 0,98 | 1,22 | 0,75 | 0,63 | 0,1 | 4,34 | 13,5 | |
| Сумма ненасыщенных кислот | 82,65 | 86,67 | 82,43 | 89,71 | 46,47 | 44,52 | 37,96 | 42,32 | |
а) Виноматериал pH 3,0 (A), 5,0 (Б) и 7,0 (В); полусинтетическая среда pH 5,6 (Г);
н/о – не обнаружено.
Известно, что высокий общий уровень ненасыщенности мембранных липидов гарантирует поддержание проницаемости и текучести мембран, что, в свою очередь, обеспечивает хорошую адаптацию микроорганизмов к воздействию низких температур. Последний факт крайне важен для последующей криоиммобилизации клеток и, поэтому температура 20оC была принята как оптимальная для культивирования дрожжей перед иммобилизацией в криогель ПВС.
1.2. Оптимизация процесса формирования биокатализатора
Следующая стадия разработки технологии получения биокатализатора состояла в оптимизации состава биокатализатора и условий проведения иммобилизации (Рис. 2). Ранее известный метод включения клеток дрожжей в криогель ПВС (Рис. 1А) предполагал формирование гранул биокатализатора в среде гидрофобной жидкости (петролейного эфира), нежелательной для применения на производстве из-за своей пожароопасности, а также токсичности для клеток. В связи с этим было решено изменить условия иммобилизации и проводить ее на воздухе. Такой подход был апробирован впервые.
С помощью электронной микроскопии было проведено сравнительное исследование образцов иммобилизованных биокатализаторов, сформированных двумя разными способами (Рис. 4). Было показано, что макропоры носителя, полученного формированием на воздухе, имели существенно больший размер (до 50 мкм), чем поры носителя, сформированного по ранее известной методике (до 20 мкм) в среде гидрофобного растворителя. Такое изменение в структуре нового биокатализатора должно было способствовать улучшению массообменных процессов внутри гранул.
А  | Б  |
Рис. 4. Микрофотографии поверхности криогеля ПВС, формирование которого проводилось в среде гидрофобной жидкости (А) и в воздушной среде (Б).
В предварительных экспериментах было установлено, что введение ПВС в гранулы в концентрации менее 10% приводит к формированию криогеля с пониженной механической прочностью, в результате чего происходит его деформация и, как следствие этого, наблюдается выход клеток из матрицы носителя.
В работе была проварьирована концентрация полимера в составе получаемого биокатализатора в интервале от 10 до 17% с целью получения механически прочной матрицы с хорошими массообменными характеристиками.
Ранее было показано, что при снижении концентрации клеток в биокатализаторе до 2% наблюдается снижение числа свободных клеток, накапливающихся в вине к концу брожения (Мартыненко, 2001). Однако, известно, что большая концентрация клеток обеспечивает более высокие скорости процесса брожения, при этом органолептические показатели готовой продукции существенно зависят от концентрации клеток, участвующих в процессе брожения (Liger-Belair, 2004). В связи с этим, концентрацию клеток в биокатализаторе варьировали от 2 до 10% (масс.). Оптимизацию состава биокатализатора проводили с помощью математического аппарата, соответствующего аддитивно-решетчатому методу описания объекта.
В качестве основных оптимизируемых функций при выборе соотношений компонентов биокатализатора были выбраны давление углекислого газа (Рис. 5А) и концентрация свободных клеток (Рис. 5Б), которые накапливались при шампанизации вина классическим методом. Исходя из составленного ортогонально-решетчатого плана, были рассчитаны оценки эффектов уровней каждого фактора данного процесса. Полученные зависимости целевых функций от исследуемых факторов на варьируемых уровнях графически представлены на Рис. 5.
Рис. 5. Зависимость давления СО2 (А) и концентрации свободных клеток (Б), накапливающихся в шампанском, от исходных концентраций дрожжевых клеток и полимера в составе биокатализатора при его использовании в процессе сбраживания виноматериала в бутылках.
Было установлено, что оптимальной для формирования биокатализатора, применяемого для шампанизации вина, однозначно, является 10%-ная концентрация ПВС. Окончательный вывод о том, что 10% концентрация клеток дрожжей в составе иммобилизованного препарата является лучшей, был сделан после дополнительных исследований характеристик получаемого шампанского (Табл. 4).
Таблица 4. Характеристики шампанского, приготовленного в бутылках, с применением дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС
| Исходная концентра-ция клеток в биокатали-заторе, % | Давление CO2, кПa | Свободные клетки, кл/мл вина | Сахароза, г/л | Спирт, об % | Титруемая кислот-ность, г/л | Дегустаци-онная оценка |
| 2а 2б 10б | 450 500 540 | (3,5 ± 0,3)105 (3,1 ± 0,3)103 (3,4 ± 0,4)103 | 1,6 1,4 1,1 | 11,30 11,60 11,85 | 7,4 7,3 7,2 | н/и 8,70 8,75 |
| Свободные клетки | 430 | (1,0 ± 0,1)107 | 1,8 | 11,0 | 7,4 | 8,60 |
а-Биокатализатор, сформированный по ранее известной методике, б-Биокатализатор, полученный по методике, разработанной в данной работе. н/и-не исследовали
Анализ содержания основных ароматических веществ в шампанском, полученном с помощью свободных и иммобилизованных дрожжей (Табл. 5), показал, что концентрации веществ, высокое содержание которых негативно отражается на качестве готового продукта (метанол, пропанол, изобутанол, уксусная кислота), были ниже на 10-17% по сравнению с шампанским, приготовленным с помощью свободных клеток дрожжей.
Таблица 5. Содержание различных ароматических веществ в шампанском, приготовленном с использованием свободных и иммобилизованных клеток дрожжей.
| Вещества, мг/л | Исходный виноматериал | Шампанское | |
| Свободные дрожжи | Иммобилизованные дрожжи | ||
| Уксусный альдегид | 673,7 | 549,1 | 500 |
| Этилацетат | 20,2 | 21,4 | 22,6 |
| Метанол | 22,4 | 24,71 | 14,11 |
| Пропанол | 9,8 | 9,8 | 8,0 |
| Изобутанол | 17,3 | 17,8 | 16,3 |
| Изоамиловый спирт | 141,2 | 122,6 | 107,4 |
| Уксусная кислота | 1207,9 | 838,2 | 688,2 |
| Бутиленгликоль | 1445,5 | 843 | 679 |
| Фенилэтиловый спирт | 152,1 | 126,5 | 81,9 |
| Глицерин | 16174,5 | 13603,8 | 12300 |
1.3. Исследование свойств разработанного биокатализатора и его применение для непрерывной шампанизации вина
Исследование операционной стабильности биокатализатора при многократном его использовании в процессе шампанизации вина в бутылках, а также стабильности биокаталитических характеристик иммобилизованных клеток после их длительного хранения в замороженном виде позволило установить после экстраполяции полученных данных (Рис. 6), что расчетный период полуинактивации полученного биокатализатора составляет 360 сут, а период полуинактивации при хранении 6,5 лет. Экспериментальные данные по бродильной активности были подтверждены результатами исследований концентрации внутриклеточного АТФ в клетках иммобилизованных дрожжей.
Рис. 6. Кинетика накопления давления углекислого газа в бутылках а) при многократном использовании биокатализатора, б) при использовании биокатализатора после его длительного хранения в замороженном виде. Стрелками показана замена сброженной среды на свежую того же состава.
Известно, что начальная концентрация клеток дрожжей в процессе вторичной ферментации определяет скорость процесса брожения, поэтому было исследовано влияние концентрации иммобилизованного биокатализатора в среде на скорость сбраживания виноматериала в бутылках (Рис. 7а). Конечный уровень давления CO2 во всех образцах независимо от исходной концентрации иммобилизованных клеток был практически одинаковым (~500 кПа) после 28 сут брожения. Однако, максимальная удельная скорость накопления этанола в сбраживаемом вине была установлена при введении в среду 18 г/л биокатализатора (Рис. 7б).
Именно использование этой концентрации позволило далее установить, что при проведении непрерывной шампанизации вина (Рис. 8) продуктивность 1 г биокатализатора составляет 120 мл/сут за исследованный период времени, что в 4 раз больше, чем при шампанизации вина в бутылках (30 мл/сут). При этом качество шампанского, получаемого в непрерывном режиме, по основным характеристикам практически (Табл. 6) не отличалось от шампанского, приготовленного в бутылках с использованием того же биокатализатора (Табл. 4).
 |  |
Рис. 7. Кинетика накопления CO2 в бутылках в процессе сбраживания виноматериала (а) и зависимость удельной скорости накопления этанола в сбраживаемой среде от концентрации биокатализатора (б). Символы, ™,, и ў обозначают следующие концентрации биокатализатора в вине: 0,45; 0,9; 9; 18 и 36 г/л, соответственно.
Рис. 8. Результаты проведения процесса резервуарной непрерывной шампанизации вина с применением клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС
Таблица 6. Характеристики шампанского, приготовленного резервуарным непрерывным способом с применением дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС
| Продолжи-тельность брожения, сут | Давление СО2, кПа | Остаточная концентрация сахара, г/л | Концентрация спирта, об. % | Титруемая кислотность, г/л | SO2, мг/л |
| 18 | 470 | 1,2 | 11,8 | 7,4 | 83,4 |
| 36 | 470 | 1,3 | 11,7 | 7,3 | 83,8 |
| 54 | 460 | 1,4 | 11,7 | 7,4 | 83,7 |
Для оценки механической прочности разработанного биокатализатора исследовали модуль упругости гранул (на сжатие) до и после их использования в процессе непрерывной шампанизации вина (Табл. 7). Было установлено, что разработанный биокатализатор обладает существенно улучшенными показателями механической прочности по сравнению с биокатализатором на основе Са-альгинатного геля.
Экономические расчеты показали (Табл. 8), что при использовании биокатализатора, предложенного в данной работе, для получения 10 л шампанского затраты, связанные с получением необходимого для этого количества препарата, будут в 2-17 раз меньше, чем при использовании для тех же целей известных сегодня сухих, суспензионных или иммобилизованных препаратов шампанских дрожжей.
Таким образом, разработанный биокатализатор, несомненно, обладает высокой конкурентоспособностью на внутреннем и внешнем рынках, так как позволяет значительно удешевить производство шампанского.
Таблица 7. Модуль упругости гелей и криогелей, полученных из различных полимеров
| Носитель | Диаметр гранул, мм | Модуль упругости, кПа |
| Са-алинатный гель (2,0% масс.) (Chang, 2001) | 2,0 | 1,7±0,2 |
| Криогель ПВС (10% масс.), полученный по ранее известной методике (Рис. 1А) | 1,5-3,5 | 52,5±6,3 |
| Криогель ПВС (10% масс.), полученный по разработанной технологии - до брожения - после использования в процессе непрерывной шампанизации вина | 3,5-5 | 63,4±3,5 65,5±3,3 |
Таблица 8. Затраты на препарат дрожжевых клеток, количество которого необходимо для шампанизации 10 л вина
| Препарат | Что собой представляет | Дозировка, г (по сух. веществам) | Цена, руб |
| «Pasteur Champagne (Davis 595)», (Red Star Yeast Company LLC, США) | Сухие шампанские дрожжи | 3,5 | 15,50 |
| «LALVIN EC 1118» (Lallemand, Канада) | Сухие шампаские дрожжи | 5 | 33,75 |
| «Wyeast 4021» (Wyeast Laboratories, США) | Жидкая культура шампанских дрожжей | 7 | 44,40 |
| «Immoferm» (Erbloh Getranketech Geisenheim, Германия) | Высушенные иммобилизованные в Са-альгинатный гель дрожжи | 4 | 159, 84 |
| Разработанный в данной работе | Дрожжи, иммобилизованные в криогель ПВС | 4 | 8,10 |
2. Применение разработанного биокатализатора для решения различных технологических задач в виноделии
2.1. Получение вина по белому и красному методам при использовании свободных и иммобилизованных клеток дрожжей S. vini
Так как при шампанизации вина разработанный биокатализатор характеризовался эффективной работой, было решено апробировать его для реализации других задач в виноделии, в частности, для получения виноградных вин.
Так же, как и ранее для шампанских дрожжей, была изучена кинетика роста винных дрожжей. Полученная дрожжевая биомасса была иммобилизована по способу, разработанному для шампанских дрожжей. Было показано (Рис. 9), что концентрации спирта и сахарозы в полученном вине, приготовленном с использованием как иммобилизованных, так и свободных клеток разных штаммов винных дрожжей, практически одинаковы, немногим большая концентрация спирта и меньшая сахарозы отмечалась в пробах с вином, приготовленным с помощью иммобилизованных дрожжей.
Рис. 9. Динамика накопления этанола (а) и потребления сахарозы (б) при сбраживании виноградного сока свободными и иммобилизованными клетками дрожжей. Дрожжевые штаммы S. vini, использованные в этих экспериментах (свободные и иммобилизованные клетки обозначены черными и белыми символами, соответственно):,™ - 47 K;, - Кокур-3; ў,Ј - Ленинградская; ї,Ї -Кислотопонижающая, p, r - Массандра-3.
Анализ основных органических кислот в полученных винах не показал существенных отличий при использовании, как свободных, так и иммобилизованных клеток (Табл. 9). Однако, более глубокий анализ качества полученного вина позволил установить, что, концентрации высших спиртов (пропанола, изобутанола, изоамилового спирта), метанола, и этилацетата, высокие концентрации которых нежелательны для вина, были меньше в 1,5-150 раз в вине, полученном с использованием разных штаммов иммобилизованных винных дрожжей по сравнению с вином, приготовленным при использовании тех же клеток в свободном состоянии (Табл. 10).
Таблица 9. Концентрация органических кислот в белом вине, полученном с использованием разных штаммов свободных и иммобилизованных клеток дрожжей
| Кислоты, мг/л | Штамм дрожжей S. vini | |||||||||
| 47 К | Кокур-3 | Массандра-3 | Ленинградская | Кислотопо-нижающая | ||||||
| С | И | С | И | С | И | С | И | С | И | |
| Винная | 3566 | 3326 | 3387 | 3355 | 3494 | 3264 | 3332 | 3337 | 3483 | 3438 |
| Яблочная | 1709 | 1375 | 1729 | 1842 | 1841 | 1939 | 1013 | 1896 | 1617 | 2139 |
| Молочная | 736 | 535 | 620 | 534 | 463 | 487 | 1288 | 575 | 427 | 525 |
| Янтарная | 1820 | 1512 | 1256 | 1285 | 1483 | 1252 | 1410 | 1276 | 1160 | 1137 |
| Уксусная | 391 | 371 | 377 | 398 | 368 | 357 | 421 | 389 | 415 | 422 |
| Лимонная | 83 | 66 | 64 | 54 | 57 | 57 | 61 | 60 | 73 | 64 |
| Фумаровая | 27 | 19 | 29 | 26 | 25 | 27 | 22 | 27 | 16 | 23 |
И - Иммобилизованные дрожжи, С-свободные клетки
Таблица 10. Содержание различных ароматических веществ в столовом белом вине, приготовленном с использованием различных штаммов свободных и иммобилизованных клеток винных дрожжей
| Основные ароматические компоненты вина, мг/л | Штамм дрожжей S. vini | |||||||||
| 47 К | Кокур-3 | Массандра-3 | Ленинградская | Кислотопо-нижающая | ||||||
| С | И | С | И | С | И | С | И | С | И | |
| Этилацетат | 6,6 | 0,7 | 53,1 | 0,3 | 23,6 | 14,2 | 50,7 | 10,0 | 62,5 | 15,3 |
| Метанол | 18,6 | 12,0 | 57,6 | 12,0 | 34,2 | 21,6 | 60,6 | 22,8 | 51,0 | 35,4 |
| Пропанол | 4,5 | 2,5 | 31,3 | 3,5 | 11,0 | 8,3 | 25,3 | 6,0 | 25,3 | 9,2 |
| Изобутанол | 7,3 | 3,2 | 62,1 | 3,0 | 20,8 | 12,7 | 61,8 | 11,9 | 46,2 | 17,8 |
| Изоамиловый спирт | 60,4 | 33,0 | 410,2 | 31,0 | 162,7 | 114,2 | 422,1 | 90,8 | 417,5 | 134,6 |
| Глицерин, г/л | 11,3 | 9,0 | 9,1 | 9,1 | 12,3 | 13,9 | 9,9 | 11,6 | 9,9 | 9,7 |
| Дегустацион-ная оценка | 7,80 | 8,00 | 7,80 | 8,00 | 7,60 | 7,70 | 7,80 | 7,90 | 7,65 | 7,80 |
И - Иммобилизованные дрожжи, С-свободные клетки
Дегустация образцов белых столовых вин, полученных с использованием свободных и иммобилизованных клеток винных дрожжей, показала преимущество использования клеток в иммобилизованном виде (Табл. 10). Образцы вина, полученного с использованием иммобилизованных клеток дрожжей штаммов S. vini «47К», «Кокур-3» и «Ленинградская», были оценены экспертами производственной дегустационной комиссии Национального института винограда и вина «Магарач» (г. Ялта, АР Крым) как образцы очень хорошего качества с развитыми сортовыми особенностями в букете и слаженным гармоничным вкусом (Табл. 10).
Аналогичные результаты были получены и при использовании разработанного биокатализатора в технологии получения красных вин (Табл. 11). Органолептическая оценка, также как и ранее для шампанских и белых вин, была выше у образцов вина, полученного при использовании иммобилизованных клеток. Вина характеризовались хорошим качеством с развитым, характерным для красных столовых вин, богатым букетом и слаженным вкусом.
Таблица 11. Содержание различных ароматических веществ в столовом красном вине, приготовленном с использованием различных штаммов свободных и иммобилизованных клеток винных дрожжей
| Основные ароматические компоненты вина, мг/л | Штамм дрожжей S. vini | |||||
| 47 К | Каберне-5 | Массандра-3 | ||||
| С | И | С | И | С | И | |
| Этилацетат | 18,3 | 18,2 | 24,8 | 13,0 | 18,9 | 18,1 |
| Метанол | 29,0 | 28,6 | 52,4 | 27,0 | 48,6 | 46,8 |
| Пропанол | 37,9 | 34,6 | 31,35 | 9,7 | 38,9 | 37,7 |
| Изобутанол | 37,6 | 32,1 | 37,0 | 6,8 | 37,1 | 34,3 |
| Уксусная кислота | 125,0 | 91,0 | 315,0 | 104,0 | 216,0 | 175,9 |
| Изоамиловый спирт | 166,0 | 146,5 | 329,3 | 158,7 | 289,8 | 166,9 |
| Глицерин, г/л | 11000 | 10500 | 10700 | 10300 | 11000 | 10700 |
| Дегустационная оценка | 7,80 | 7,90 | 7,70 | 7,80 | 7,60 | 7,75 |
И - Иммобилизованные дрожжи, С-свободные клетки
2.2. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей S. cerevisiae phv bayanus для устранения винных недобродов и для биологического кислотопонижения вина, получаемого из различных плодово-ягодных соков
Учитывая то, что иммобилизованные дрожжи значительно устойчивее к воздействию различных ингибирующих веществ, чем свободные клетки, было решено испытать их для устранения винных недобродов.
Было показано, что в результате дображивания виноматериалов с использованием иммобилизованного биокатализатора концентрация этанола (г/л) может быть увеличена на 6-28% от исходного уровня (Рис. 10).
Также было апробировано использование иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для кислотопонижения вина, получаемого из виноградного и крыжовникового соков. Было установлено, что в результате спирто-яблочно-молочнокислого сбраживания соков с применением разработанного биокатализатора, получается вино с концентрацией этанола 45-86 г/л и пониженным содержанием яблочной кислоты на 18-23% от исходного уровня (Рис. 11).
Рис. 10. Кинетика дображивания виноматериалов с разной исходной концентрацией этанола свободными и иммобилизованными в криогель ПВС клетками дрожжей. Свободные и иммобилизованные клетки дрожжей обозначены черными и белыми символами, соответственно; виноматериал с концентрацией спирта 10,5 об. % и 13,5 об. % обозначен, соответственно, круглыми и треугольными символами.
 |  |
Рис. 11. Динамика накопления молочной кислоты и потребления яблочной кислоты в процессе спирто-яблочно-молочнокислого брожения с использованием иммобилизованных клеток дрожжей виноградного сока (А) и сока из крыжовника (Б). Кислоты обозначены символами: =- яблочная, ™- молочная.
3. Применение разработанного биокатализатора для получения спирта из различных отходов
Так как клетки, иммобилизованные по предложенной в работе технологии, обладали высокой метаболической активностью и были успешно применены для решения разнообразных задач в виноделии, то была исследована возможность их применения для получения спирта из различных отходов сельского хозяйства и промышленности.
В работе исследовалась возможность сбраживания растворов соевого порошка, как отхода пищевой промышленности с предобработкой растворов сои -галактозидазой и без нее (Табл. 10). Также исследовалась возможность сбраживания иммобилизованными и свободными клетками дрожжей гидролизатов различных целлюлозосодержащих отходов (Табл. 11).
Таблица 10. Динамика накопления этанола в растворах сои с ферментативной обработкой и без нее при проведении брожения с участием иммобилизованных и свободных клеток дрожжей в течение 24 ч
| Клетки дрожжей | Раствор сои | Этанол, г/л | Выход спирта от теор. возможного, % |
| Свободные Иммобилизованные | Без ферментативной обработки | 31,56 33,14 | 55,70 58,45 |
| Свободные Иммобилизованные | Обработанный -галактозидазой | 50,50 53,65 | 85,01 90,32 |
Таблица 11. Концентрация спирта, накапливающегося при сбраживании глюкозосодержащих сред, полученных после гидролиза различных целлюлозосодержащих отходов, свободными и иммобилизованными клетками дрожжей в течение 90 ч
| Отход | Глюкоза, г/л | Дрожжи | Выход спирта от теор. возможного, % |
| Багасса | 18,5 | Свободные Иммобилизованные | 92,0 94,8 |
| Пшеничная солома | 24,0 | Свободные Иммобилизованные | 87,8 92,8 |
| Неосветленные волокна свекловичного жома | 13,0 | Свободные Иммобилизованные | 91,3 93,5 |
| Пергамент | 23,0 | Свободные Иммобилизованные | 93,0 93,6 |
Более полное сбраживание сахаров наблюдалось в пробах при использовании иммобилизованных дрожжей независимо от исходной среды. Было установлено (Табл 10 и 11), что концентрация этанола (г/л) в 4,5-10 раз была выше в пробах при сбраживании ферментативно предобработанной сои.
Выводы
- Разработана технология получения биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей S. cerevisiae Шампанская –39 для использования в технологии шампанизации вина.
- Установлено на основе биохимических характеристик клеток (концентрации внутриклеточного АТФ, содержанию трегалозы и жирнокислотному пулу липидов клеток), что целесообразно наращивание биомассы дрожжей для включения в криогель ПВС при 20оС до конца логарифмической фазы роста на полусинтетической питательной среде.
- Выявлена возможность использования разработанного иммобилизованного биокатализатора для шампанизации вина классическим и непрерывным методами, обеспечивающими получение высококачественного продукта.
- Показана возможность многократного использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей в процессе шампанизации вина. Расчетные периоды полуинактивации биокатализатора при его эксплуатации и хранении при -20оС составили 150 сут. и 6,5 лет, соответственно.
- Определена высокая эффективность использования разработанного иммобилизованного биокатализатора в технологии получения виноградных вин по красному и белому методам. Установлено, что вина, приготовленные с использованием иммобилизованных клеток разных штаммов дрожжей S. vini, характеризуются высоким качеством и по органолептическим характеристикам (вкус, букет, запах) превосходят вина, получаемые с использованием свободных клеток.
- Установлена возможность использования разработанного биокатализатора для устранения винных недобродов с исходно высокой концентрацией этанола (10,5-13,5 об.%). Определено, что после дображивания концентрация спирта в вине увеличивается на 6-28 %.
- Показано использование иммобилизованного биокатализатора, полученного согласно разработанному способу, для биологического кислотопонижения вина, полученного из различных плодово-ягодных соков.
- Выявлена высокая эффективность применения разработанного иммобилизованного биокатализатора на основе криогеля ПВС в технологии получения биоэтанола из ферметативных гидролизатов различного полисахаридсодержащего сырья. Выход конечного продукта составил более 90% от теоретически возможного. Впервые была показана возможность эффективного сбраживания ферментативно обработанных соевых отходов пищевой промышленности.
- Экономическая оценка затрат на получение разработанного биокатализатора показала его высокую конкурентоспособность на внешнем и внутреннем рынках, так как его применение по сравнению с известными зарубежными иммобилизованными и сухими препаратами дрожжей позволяет удешевить производство шампанского в 1,9-19 раз.
Список работ по теме диссертации
- Степанов Н.А., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М., Ефременко Е.Н. Применение иммобилизованных клеток дрожжей для производства спиртосодержащих напитков.// Изв. вузов. Пищевая технология, 2006 № 6, с.45-47.
- Efremenko E., Stepanov N., Martinenko N., Gracheva I. Cultivation conditions preferable for yeast cells to be immobilized into poly(vinyl alcohol) and used in bottled sparkling wine production. // Chem.Ind.Chem.Engin.Quart., 2006 V.12 (1), p.18-23.
- Stepanov N.A., Efremenko E.N. Perspective heterogenous biocatalyst for the wine fermentation. // In book: Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publishers Inc., N.-Y., 2006, p.67-75.
- Степанов Н.А., Мартыненко Н.Н., Ефременко Е.Н. Оптимизация условий получения активного биокатализатора для шампанизации вина на основе дрожжевых клеток, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта. // Межд. конференция «От фундаментальной науки – к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии», Тверь, Россия, 15 ноября, 2002 с.100-102.
- Stepanov N. A., Efremenko E. N. Different approaches to the prevention of cell release from biocatalyst used for preparation of sparkling wine. // XII Intern. Workshop on Bioencapsulation, Vitoria (Spain), 24-26 September, 2004, p. 190-193.
- Stepanov N. A., Efremenko E. N. Highly active immobilized yeast for secondary wine making. // XIII Intern. Workshop on Bioencapsulation, Kingston, Canada, 24-26 June, 2005, p. 65-66.
- Stepanov N., Efremenko E. Optimization of sparkling wine production with immobilized biocatalyst. // XIV Intern. Workshop on Bioencapsulation, Lausanna, Switzerland, 5-7 October, 2006, p. 313-316.
- Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М. Способ получения иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков. // Заявка на патент РФ на изобретение № 2006113768, приоритет от 24.04.2006.
- Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для шампанизации вина. // 2-й Москов. Межд. конгресс. «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003, с.234.
- Степанов Н. А., Ефременко Е. Н. Получение биокатализатора на основе поливинилового спирта для производства игристых вин с обеспечением минимального выхода клеток из матрицы носителя. // Всерос. симпозиум с межд. участием «Биотехнология микробов», Москва, Россия, 20-23 октября, 2004, с. 84.
- Степанов Н.А., Ефременко Е.Н., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М. Биокаталитическая система на основе иммобилизованных дрожжей для шампанизации вина. // 3-й Моск. Межд. конгресс. «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 марта, 2005, с. 214.
- Степанов Н. А., Ефременко Е. Н., Мартыненко Н. Н. Иммобилизованный биокатализатор с улучшенными характеристиками для получения игристых вин. // 9-я Межд. пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – Наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля, 2005, с. 364.
- Степанов Н. А., Мартыненко Н. Н., Ефременко Е. Н. Иммобилизация дрожжей в криогель поливинилового спирта - эффективный подход к улучшению биотехнологии получения вина. // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 18-21 апреля, 2006, с. 397.
- Stepanov N. A., Martinenko N. N., Efremenko E. N. Multipurpose biocatalyst for production of Alcoholic beverages. // Intern. Congress on Bioprocessing in Food production, 18-21 June, Patras, Greece, 2006, p.173.
- Степанов Н. А. Сенько О. В., Спиричева О. В., Лозинский В. И., Синицын А. П., Ефременко Е. Н. Примение клеток дрожжей и мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта для получения этанола из различного сырья. // 4-й Моск. Межд. конгресс. «Биотехнология – состояние и перспективы развития», Москва, 12-16 марта, 2007, 308.
