Разработка технологии ферментного препарата из моллюска дрейссена (dreissena polymorpha pallas)
На правах рукописи
Литвинова Ольга Александровна
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ МОЛЛЮСКА ДРЕЙССЕНА (DREISSENA POLYMORPHA PALLAS)
05.18.04 Технология мясных, молочных, рыбных
продуктов и холодильных производств
05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Калининград – 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Калининградский государственный технический университет» (ФГОУ ВПО «КГТУ»).
Научный руководитель кандидат технический наук, доцент
Лысова Альбина Сергеевна
Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор
Шендерюк Владимир Ильич
доктор технических наук,
Новикова Маргарита Владимировна
Ведущая организация Федеральное унитарное предприятие
«Атлантический научно-исследовательский
институт рыбной промышленности
и океанографии» (ФУП «АтлантНИРО»)
Защита состоится «25» декабря 20090г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 307.007.01 при ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет» по адресу: 236022, г. Калининград, Советский проспект, 1, ауд. 255.
Факс: 8 (4012) 91-68-46
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет».
Автореферат разослан « » ноября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор технических наук, профессор Н.Л. Великанов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам, которые широко используются в различных областях промышленности (пищевая, текстильная, целлюлозно-бумажная, химическая, фармацевтическая и др.), а также сельском хозяйстве (кормовые добавки, ветеринарные препараты), медицине, экологии.
Однако, отечественная промышленность заметно отстает по объему производства и областям применения ферментных препаратов от ведущих стран мира (США, Япония, Дания, Нидерланды). Объяснением данного факта является ограниченная доступность ферментов, отсутствие в достаточном количестве исходного сырья, высокая цена.
Источниками ферментных препаратов являются: растительное сырье, органы и ткани наземных животных, микроорганизмы, гидробионты. Применение протеиназ растительного происхождения (фицин, бромелин, папаин) наиболее часто практикуется в южных странах: Индия, Бразилия, Новая Зеландия, реже - в нашем регионе. Необходимо отметить трудоемкость сбора и консервирования животного ферментсодержащего сырья (поджелудочная железа, слизистые оболочки, семенники половозрелых животных) на мясоперерабатывающих комбинатах, но, из поджелудочной железы получают главным образом, инсулин, в связи с чем существует проблема обеспечения этим сырьем производство ферментных препаратов. В настоящее время широкое применение нашли ферменты микробиологического происхождения, но они не всегда эффективны при созревании соленой рыбопродукции и не исключена возможность их остаточной обсемененности. Поэтому поиск новых доступных массовых источников ферментсодержащего сырья является весьма актуальным.
Вопросами совершенствования производства и применения ферментных препаратов занимались многие ученые: Грачева И.М., Черногорцев А.П., Слуцкая Т.Н., Шендерюк В.И., Константинова Л.Л., Паукова Л.М., Лысова А.С., Некрасова Г.Т., Новикова М.В., Новиков В.Ю., Мухин В.А., Пивненко Т.Н., Разумовская Р.Г., Байдалинова Л.С., Цибизова М.Е, Бердышев Г.Д., Сахаров И. Ю., и ряд других. В работах этих ученых показано, что ферментная система гидробионтов содержит высокоактивные комплексы протеолитических ферментов, которые могут найти широкое применение в различных отраслях народного хозяйства: при производстве белковых концентратов, изолятов, гидролизатов, белковых ферментативных масс, соусов и др. Применение коллагеназы облегчает удаление кожи с плавников ската, кальмаров, темной пленки с брюшной полости у ряда рыб, снятие чешуи, очистку креветок от панциря и др. Мышечная ткань целого ряда объектов рыбного промысла (пеламида, салака, тунец, судак, хек, путассу и др.), которые могли бы составить сырьевую базу для производства слабосоленой деликатесной продукции, имеет низкий уровень активности собственных протеиназ, что не позволяет достичь нужной степени созревания без дополнительного внесения протеолитических ферментных препаратов, интенсифицирующих процесс созревания.
Ферментные препараты, получаемые из гидробионтов, содержат оптимальную композицию ферментов, которые мягко и последовательно расщепляют белки рыб до компонентов, формирующих традиционный букет, свойственный созревшему продукту. Наибольшую ферментативную активность имеют нерыбные объекты промысла, в том числе двустворчатые моллюски.
В водах Каспийского и Аральского морей, около Балканского полуострова, в бассейнах Азовского, Чёрного, Балтийского морей, в Рыбинском, Угличском, Горьковском, Иваньковском, Учинском, Саратовском, Куйбышевском и Кременчугском водохранилищах, реках Кольского полуострова и Карелии, в водоемах практически всей Европы, Северной Америки, в том числе и в Великих озерах, в Калининградском регионе (Куршском и Вислинском заливах, Виштынецком и других озерах области) в большом количестве обитает малоиспользуемый в промышленности двустворчатый моллюск дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas, 1771). Исследованию расселения дрейссены посвящены работы ряда ученых [Аристова, 1971; Старобогатов, 1994; Johnson, Carlton, 1996; Ворошилова, 2008; Протасов, 2008; Щербина, 2008 и др.]. Учитывая существующие запасы дрейссены, её высокую способность к размножению и образованию значительных скоплений на небольшой площади [Истомина, 2008; Пряничникова, 2008; Санжак, 2008 и др.], можно констатировать, что существуют широкие возможности для промысла этого моллюска с целью прикладного использования.
Из дрейссены уже выделен фермент 5-фосфодиэстераза, рекомендованный для применения в медицине в качестве лечебного препарата [Бердышев c соавт., 1977]. Ведутся работы по получению белковых гидролизатов из моллюска дрейссены различного происхождения, которые могут найти широкое применение в промышленности, в том числе пищевой, микробиологической, ветеринарной и медицинской [Новикова, Нгуен, 2009]. Однако в настоящее время отсутствуют исследования по получению и применению протеолитического комплекса ферментов из моллюска дрейссены, отсутствуют литературные данные по ее заготовке и хранению, рН - активности, влиянию температуры, сезонным изменениям активности протеолитических ферментов дрейссены. Принимая во внимание выше изложенное, а также биотехнологический потенциал дрейссены, представляется целесообразным изучение этого моллюска как потенциального ферментсодержащего сырья и разработка технологии получения из него ферментного препарата протеолитического действия.
Цель работы: разработать технологию протеолитического ферментного препарата из нового вида сырья – двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- исследовать био- и техно-химические показатели дрейссены;
- установить способы и сроки холодильного хранения дрейссены;
- исследовать влияние температуры, рН-среды и сезона вылова на активность протеолитических ферментов моллюска;
- обосновать технологию получения ферментного препарата протеолитического действия из целого моллюска дрейссены;
- разработать технологию получения ферментного препарата из дрейссены и определить его качественные показатели;
- провести производственные испытания полученного ферментного препарата в качестве созревателя в технологии рыбных пресервов;
- оценить эффективность внедрения разработанной технологии получения ферментного препарата из дрейссены;
- разработать проекты технологической инструкции и технических условий на ферментный препарат «Протофермол» из моллюска дрейссены.
Научная новизна работы. Впервые разработана технология ферментного препарата протеолитического действия из дрейссены (Dreissena polymorpha), взятого из озера Форелевое Калининградской области и изучена его био – и технохимическая характеристика. Установлены сроки и условия холодильного хранения дрейссены до обработки. Изучено влияние температуры, рН, сезона вылова на активность протеолитических ферментов дрейссены, позволяющий наиболее полно использовать биотехнологический потенциал моллюска. Получена математическая модель ключевого процесса автопротеолиза дрейссены в водно-спиртовом растворе, исследованы основные качественные характеристики ферментного препарата (протеолитическая активность, органолептические, физико-химические и микробиологические показатели). Установлена эффективность применения ферментного препарата «Протофермол» для интенсификации процесса созревания пресервов из разделанной салаки.
Практическая значимость работы. Разработана технология получения ферментного препарата протеолитического действия из двустворчатого моллюска дрейссены без предварительного отделения створок, обладающего высокой эффективностью в качестве созревателя для рыбной продукции (заявка на изобретение от 28.07.09. № 2009129081 «Способ получения ферментного препарата протеолитического действия»).
Разработан проект нормативной и технической документации на ферментный препарат «Протофермол» из целого моллюска дрейссены.
Показана эффективность применения ферментного препарата из дрейссены в качестве интенсификатора процесса созревания рыбных пресервов из слабо и несозревающего сырья.
Результаты экспериментальных исследований апробированы в производственных условиях в ООО «Рыбокомбинат «За Родину» (пос. Взморье Калининградской обл.), получили положительную оценку и рекомендованы к внедрению.
Положения, выносимые на защиту:
- результаты исследований био- и технохимических показателей моллюска дрейссены;
- влияние температуры, рН-среды, сезона вылова дрейссены из озера Форелевое на активность её протеолитических ферментов;
- обоснование технологических параметров получения ферментного препарата протеолитического действия из дрейссены.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на МНК «Инновации в науке и образовании - 2004», посвященной 10-летию КГТУ (Калининград, 2004), НПК «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Калининград, 2005), НПК «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы» (Москва, 2006), МНК ППС и студентов вуза «Социально-ориентированная экономика Калининградского региона: Проблемы и перспективы развития. М.: АНОВПОЦС РФ, 2007» (Москва, 2007), V съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2008), международной научно-практической конференции «Олимпиада 2014: Технологические и экологические аспекты производства продуктов здорового питания» (Краснодар, 2009), VII Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании – 2009» (Калининград, 2009).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из списка сокращений, введения, 3 глав, выводов, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на 170 страницах компьютерного текста, содержит 12 таблиц, 14 рисунков и 7 приложений. Библиография включает 208 источников, из которых – 37 на иностранных языках. В приложениях представлены балловая шкала оценки качества пресервов, проекты ТИ и ТУ на ферментный препарат, акт производственных испытаний, протокол дегустационного совещания, исходные требования к оборудованию для производства ферментного препарата, расчет экономической эффективности разработанной технологии.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во «Введении» обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследований, научная новизна, практическая значимость работы, положения, выносимые на защиту.
В первой главе «Обзор литературы» проанализированы существующие технологии получения ферментных препаратов протеолитического действия из различных видов сырья, показан биотехнологический потенциал недоиспользуемого на практике двустворчатого моллюска дрейссены. Анализ литературного материала позволил установить, что в настоящее время существует дефицит ферментсодержащего сырья и ферментных препаратов натурального происхождения, отсутствуют технологии получения ферментного препарата протеолитического действия из моллюска дрейссены.
Во второй главе «Организация эксперимента, объект и методы исследований» представлена схема исследований (рисунок 1), а также приведена характеристика объекта и методов исследования.
В качестве объекта исследования использовали двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha) из озера Форелевое Калининградской области. Сбор материала проводили в период с 2002 по 2009 гг. Для исследований по сезонным изменениям активности ферментов сбор дрейссены осуществляли ежемесячно в течение 3-х лет. Для лова дрейссены применяли скребки и драги. Моллюсков извлекали вместе с фрагментами субстрата (раковинами моллюсков - унионид, кусками дерева и др.).
Рисунок 1 –Схема исследований
Моллюска отделяли от грунта, после чего промывали водой через сито, после
чего отделяли посторонних включений и некондиционного моллюска. Собранные пробы упаковывали в полиэтиленовые пакеты, их хранили при температуре минус (20 ±2) °С.
Химический состав мягкого тела дрейссены определяли общепринятыми методами: массовую долю белка, жира, воды, минеральных веществ по ГОСТ 7636, углеводы по методу Бертрана ГОСТ 3628.
При определении диапазонов рН- активности ферментов мягкого тела дрейссены применяли универсальную буферную смесь.
Доброкачественность сырья (моллюск дрейссена) в процессе холодильного хранения, готовых рыбных пресервов, а также надежность консервирования процесса автопротеолиза дрейссены оценивали по отношению содержания азота летучих оснований (АЛО) к формольно – титруемому азоту (ФТА), выраженному в процентах [Черногорцев, 1959]. Азот летучих оснований определяли по ГОСТ 7636.
При изучении влияния температуры, рН -среды, сезона вылова дрейссены на активность протеолитических ферментов осуществляли методом формольного титрования (мг%/час) по ГОСТ 7636.
Активность протеолитических ферментов (АПФ) мягкого тела дрейссены и ферментного препарата из него определяли модифицированным методом Ансона по ГОСТ 20264.2 на спектрофотометре Photoelectric colorimeter AP-101.
Качество рыбных пресервов с ферментным препаратом из дрейссены оценивали по показателю буферности, кислотности, массовой доли поваренной соли. Буферность определяли титриметрическим методом по ГОСТ 19182. Кислотность пресервов определяли по ГОСТ 27083 (в пересчете на уксусную кислоту). Массовую долю поваренной соли аргентометрическим методом ГОСТ 27207 (метод Мора). Массовую долю бензойнокислого натрия в пресервах – по ГОСТ 27001.
Органолептическую оценку ферментного препарата осуществляли описательными методами, используя 5-ти балловую шкалу с коэффициентами значимости и последующим построением профилограмм [Сафронова, 1985].
Микробиологические испытания ферментного препарата проводили по стандартным методикам: ГОСТ 10444.15, ГОСТ Р 50474, ГОСТ 30726, ГОСТ Р 50480, ГОСТ 10444.12; общую бактериальную обсемененность – по ГОСТ 20264.1; определение дрожжей и плесневых грибов – по ГОСТ 10444.12. Полученные результаты сравнивали с нормативными показателями.
Определение оптимальных технологических параметров получения ферментного препарата осуществляли путем моделирования процесса методом математического планирования эксперимента [Адлер с соавт., 1976; Мезенова, 1995] с применением ортогонального центрального композиционного плана (ОЦКП) второго порядка для двух факторов.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили стандартными методы вариационной статистики. Расчеты и построение графических зависимостей осуществляли с помощью программ Microsoft Office Excel 2003 и MathCAD 2000 при доверительной вероятности 95 %.
Апробирование ферментного препарата «Протофермол» в качестве интенсификатора процесса созревания пресервов из разделанной салаки проводили в условиях предприятия ООО «Рыбокомбинат «За Родину» (пос. Взморье Калининградской области).
Оценку эффективности разработанной технологии получения ферментного препарата осуществляли путем расчета технико-экономических показателей с учетом производственного аспекта, социальной и экологической составляющих.
В третьей главе «Результаты исследований и их обсуждение» в разделе «Исследование био- и техно-химических показателей моллюска дрейссены» приведены сравнительный химический состав дрейссены разных мест вылова и зеленой мидии (таблица 1), активности протеолитических ферментов дрейссены и влияние на неё различных факторов (рН, температуры, сезона вылова), определены сроки холодильного хранения дрейссены.
Таблица 1 – Химический состав мягкого тела некоторых двустворчатых моллюсков, %
| Объекты исследования | Сухие вещества | Белок (N*6,25) | Липиды | Минераль-ные вещества | Углеводы |
| Дрейссена (озеро Форелевое) | 19,53±1,02 | 14,74±0,15 | 1,62±0,05 | 1,22±0,02 | 1,95±,0,13 |
| Дрейссена (залив Куршю-Марес) * | 13,83±1,05 | 9,15±0,26 | 1,56±0,03 | 1,16±0,02 | 1,86±0,65 |
| Дрейссена (озеро Плещеево)** | 20,34±1,04 | 14,83±0,24 | 2,09±0,07 | 1,55±0,01 | 1,87±0,73 |
| Зеленая мидия (Вьетнам, район острова Кат Ба)** | 22,05±1,34 | 15,7±1,25 | 1,08±0,03 | 1,93±0,01 | 3,29±0,12 |
* — по [Скиркявичене, 1974]; **— по [Нгуен, Новикова, 2009].
По химическому составу (таблица 1) мягкое тело двустворчатого моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha) из озера Форелевое, не имеет значительных отличий от дрейссены других районов, а также от моллюска зеленая мидия (Mytilus perna viridis). Анализ представленных в таблице 1 данных, показывает, что по содержанию белка в мягком теле изучаемой нами дрейссены, а также дрейссены других районов вылова, её можно отнести к белковому сырью [по классификации Леванидова И.П.].
Таблица 2 – Активность протеолитических ферментов мягкого тела дрейссены (озеро Форелевое)
| Дата вылова моллюска | Активность протеолитических ферментов (субстрат 2 %-ный казеинат натрия) | |
| мкмоль тирозина / г мягкого тела · мин | мкмоль тирозина / г белка мягкого тела · мин | |
| 15 июня 2004 | 0,90 | 13,24 |
| 2 августа 2004 | 0,65 | 9,56 |
| 12 апреля 2005 | 1,24 | 18,24 |
| 15 июля 2005 | 0,82 | 12,06 |
| 3 февраля 2006 | 0,61 | 8,97 |
| 4 августа 2006 | 0,80 | 11,97 |
Изучение протеолитической активности ферментов мягкого тела дрейссены в период 2003-2005 гг. при естественном значении рН мышечной такни моллюска 6,7 показала, что на протяжении всего периода активность протеолитических ферментов дрейссены находилась в пределах от 0,61 до 1,24 ед/г (таблица 2).
Полученные нами собственные данные по активности протеолитических ферментов дрейссены, а также опубликованные результаты [Dabrovski, Glogowski, 1974], позволили сделать заключение о рациональности использования двустворчатого моллюска дрейссены в качестве ферментсодержащего сырья для получения препарата протеолитического действия.
С целью обоснования сроков холодильного хранения дрейссены и его влияния на качество моллюска, сырье хранили в охлажденном и мороженом виде. Охлаждение моллюска проводили на воздухе при температуре +4-2°С (СанПиН 2.3.2.1324-03 Гигиенические требования к срокам годности и условиям хранения пищевых продуктов) и во льду. Результаты исследований показали, что данные способы охлаждения позволяют сохранять моллюска без снижения активности ферментов и видимых признаков порчи не более 12 часов. Способ охлаждения в жидкой среде был нами сразу отклонен в связи с возможными потерями водорастворимых белков, обладающих ферментативной активностью.
Наиболее перспективным способом хранения сырья является замораживание. Для установления сроков хранения дрейссены в мороженом виде определяли показатели доброкачественности АЛО/ФТА ·100% и активность протеолитических ферментов моллюска. Известно, что если микробиологические процессы не превалируют над автолитическими, то отношение АЛО/ФТА ·100% является величиной постоянной, не превышающей 8,0 % [Черногорцев, 1960]. В эксперименте исследовалась дрейссена взятая из озера в июне 2007г. Хранение сырья осуществляли с июня по ноябрь 2007 г. включительно при температуре минус (20±2) °С.
Рисунок 2 – Влияние сроков холодильного хранения дрейссены на активность протеолитических ферментов сырья
В результате проведенных экспериментов установлено (рисунок 2), что в ходе хранения дрейссены при температуре минус (20±2) °С активность протеолитических ферментов (АПФ) в течение первого месяца хранения не изменялась и оставалась на исходном уровне 0,49 мкмоль тирозина/мл·мин. К середине второго месяца активность ферментов возросла на 8 %, что можно объяснить процессом денатурации белковой молекулы и более легкой атакуемости белка собственными ферментами дрейссены.
Показатель доброкачественности сырья АЛО/ФТА ·100% в начале хранении равнялся 6,7 %. При дальнейшем хранении он постепенно возрастал и к пятому месяцу достиг 8,0 %, что позволило установить предельный срок хранения дрейссены без снижения её качества и сделать вывод, что гарантированным сроком хранения дрейссены при указанных режимах (температура минус 20°С (±2 °С) следует считать пять месяцев.
Влияние температуры, рН- среды на активность протеолитических ферментов моллюска дрейссены и сезонные изменения активности протеолитических ферментов представлены на рисунках 3, 4, 5.
При исследовании рН - активности (рисунок 3) нами обнаружены два ясно выраженных оптимума. Первый – на участке рН 4,0-6,0, который можно принять за «пепсиновый», второй оптимум – на участке рН 9,0-10,0, этот комплекс протеаз может быть принят за «трипсиновый». Установлено, что проводить автопротеолиз дрейссены можно достаточно эффективно в широком диапазоне рН, а именно при значениях от 4 до 11, в том числе и при естественном значении рН мягкого тела дрейссены2(рН26,7). 
Рисунок 3 - Влияние рН на изменение Рисунок 4 - Влияние температуры
АПФ мягкого тела дрейссены на изменение АПФ мягкого
тела дрейссены
Рисунок 5 – Сезонные изменение активности протеолитических ферментов дрейссены
Данные на рисунке 4 показывают, что протеолитические ферменты дрейссены проявляют максимальную активность в диапазоне температур 45…55 °С.
Результаты исследований сезонных изменений активности протеолитических ферментов дрейссены (рисунок 5) показывают, что максимальная АПФ (7,5 мг%/ч) проявляется в весенние месяцы (апрель-май).
В этот период в дрейссене интенсивно протекают процессы синтеза белка и он характеризуется как подготовительный к размножению.
Факторами интенсификации активности ферментов являются также пробуждение моллюсков от зимнего покоя с повышением температуры воды и увеличением темпа их роста [Ляшенко, 1989]. В осенний посленерестовый период в связи с ослаблением обменных процессов в мягком теле дрейссены отмечена минимальная активность протеолитических ферментов (от 0,78 до 1,5 мг% /ч).
Резюмируя полученные результаты можно заключить, что наиболее целесообразным периодом заготовки дрейссены в качестве ферментсодержащего сырья является период с марта по июнь.
В разделе «Моделирование и оптимизация технологического процесса получения ферментного препарата» получена математическая модель и установлены оптимальные параметры ключевого процесса автопротеолиза дрейссены в водно-спиртовом растворе с использованием ортогонального центрального композиционного плана (ОЦКП) второго порядка для двух факторов. План эксперимента и результаты его реализации представлены в таблице 3.
В качестве варьируемых частных факторов, подлежащих оптимизации, были выделены продолжительность ферментации (ч) и температура ферментации t (°С). Параметром оптимизации математической модели была выбрана совокупная безразмерная характеристика y, объединяющая два частных отклика – удельную активность протеолитических ферментов дрейссены и выход ферментного препарата.
С целью установления влияния факторов, подлежащих оптимизации (температура, продолжительность), концентрацию консерванта (10 %-ный водно-спиртовой раствор) и соотношение моллюск : раствор, равное 2:1, в эксперименте поддерживали на постоянных рациональных уровнях, определенных в дополнительных экспериментах.
Математическая обработка экспериментальных данных по алгоритмам ОЦКП второго порядка позволила получить модель исследуемого процесса (рисунок 6).
Оптимальные значения факторов, графически представленные в виде координат точки экстремума: продолжительность – 40 ч, температура – +47°С.
Таблица 3 – План эксперимента и результаты его реализации по моделированию и оптимизации технологии получения протеолитического ферментного препарата из дрейссены
| Номер опыта | План эксперимента | Частные отклики | Обобщен-ный параметр оптимиза-ции, y | ||||
| Продолжительность ферментации, ч | Температура ферментации, С | ПА, ед/мг белка | Выход ферментного препарата, % | ||||
| по матрице x1 | натураль-но | по матрице x2 | натураль-но t | ||||
| 1 | +1 | 48 | +1 | 60 | 0,11 | 46,67 | 0,93 |
| 2 | -1 | 24 | +1 | 60 | 0,53 | 33,33 | 0,79 |
| 3 | +1 | 48 | -1 | 40 | 1,09 | 53,23 | 0,41 |
| 4 | -1 | 24 | -1 | 40 | 0,28 | 33,13 | 0,93 |
| 5 | +1 | 48 | 0 | 50 | 0,34 | 47,12 | 0,79 |
| 6 | -1 | 24 | 0 | 50 | 1,30 | 46,62 | 0,32 |
| 7 | 0 | 36 | +1 | 60 | 0,26 | 46,63 | 0,84 |
| 8 | 0 | 36 | -1 | 40 | 0,61 | 53,33 | 0,64 |
| 9 | 0 | 36 | 0 | 50 | 1,01 | 46,63 | 0,44 |
Примечание: «Идеалы» частных безразмерных откликов, принятые по результатам испытаний: ПА= 3 ед/мг белка; выход ферментного препарата от массы автолизата =50 %.
Рисунок 6 – Графическая интерпретация полученной модели исследуемого процесса автопротеолиза
Проверка полученных значений, проведенная путем постановки многократных экспериментов при данных условиях, позволила уточнить диапазон рациональных значений процесса : продолжительность автопротеолиза дрейссены – от 36 до 40 ч при поддержании в системе температуры в диапазоне от +42 до +47 °С.
В разделе «Технология получения ферментного препарата из моллюска дрейссены» на основании результатов собственных исследований, а также анализа существующих технологий получения ферментных препаратов из рыбного сырья [Черногорцев, 1973; Слуцкая, 1987; Паукова, 1988; Шендерюк, 1979], обоснована технология получения ферментного препарата «Протофермол» из моллюска дрейссены, схема которой представлена на рисунке 7.
Рисунок 7 –Схема технологического процесса получения ферментного препарата «Протофермол» из моллюска дрейссены
В качестве сырья для производства ферментного препарата используют дрейссену - сырец, охлажденную или мороженую. Мороженое сырье размораживают на воздухе при температуре не выше 20C, промывают проточной водой температурой 15 – 20°С для удаления остатка грунта, песка, выдерживают для стекания воды 5-10 мин. Затем целую дрейссену, без предварительного отделения створок загружают в ферментер, куда подают 10-15%-ный водно-спиртовой раствор в качестве консерванта при соотношении моллюск : раствор 2:1. Консервированную массу нагревают до температуры автопротеолиза (47°С) путем подачи в зарубашечное пространство ферментера горячей воды температурой 80°С. Нагрев осуществляют при непрерывной работе мешалки, чтобы исключить «заваривание» сырья возле стенок ферментера, а следовательно, и инактивацию ферментов. После достижения указанной температуры ферментируемой массы идет непосредственно процесс автопротеолиза, который продолжается в течение 36-40 ч, при этом температурный режим поддерживается на заданном уровне автоматически.
После автопротеолиза жидкую фракцию (раствор ферментов) отделяют от непрогидролизовавшегося плотного остатка в центрифуге со скоростью вращения ротора 3000-5000 об/мин, в течение 30-45мин. Жидкую фракцию направляют на сепарирование для отделения жира, а затем на сушку, которая осуществляется на вакуум-сушильной установке при температуре не выше 30C или на распылительной сушилке до массовой доли воды в препарате не более 8,0 %. Плотный остаток собирают для передачи на производство кормовых продуктов.
Полученный сухой ферментный препарат «Протофермол» расфасовывали в герметически укупоренные полиэтиленовые пакеты и хранили при нерегулируемой положительной температуре (17±2)°С в течение восьми месяцев. Изменения протеолитической активности ферментного препарата в течение указанного срока хранения не наблюдалось и равнялось исходному значению (1,6 ед/г). Хранение ферментного препарата и исследование изменения его качества продолжается.
На получение ферментного препарата «Протофермол» разработаны проекты нормативной и технической документации (ТИ, ТУ).
В разделе «Исследование показателей качества ферментного препарата» представлены характеристики органолептических, физико-химических и микробиологических показателей качества сухого ферментного препарата «Протофермол». В таблице 4 представлены органолептические показатели качества сухого ферментного препарата.
Таблица 4 – Органолептические показатели качества сухого ферментного препарата «Протофермол»
| Наименование показателей | Характеристика |
| Внешний вид | Рассыпчатый порошок |
| Цвет | От желтого до светло-коричневого |
| Запах | Свойственный, без постороннего запаха |
Учитывая, что запах является важным показателем, влияющим на вкус и запах рыбных пресервов, приготавливаемый с использованием данного ферментного препарата, изучали композицию запаха, используя профильный метод. На рисунке 8 приведена профилограмма запаха ферментного препарата «Протофермол».
Рисунок 8 – Профилограмма запаха ферментного препарата
Полученная профилограмма показывает, что для образцов данного ферментного препарата наиболее характерен аромат сушеных морепродуктов с оттенком растительных компонентов, характеризующийся как натуральный, приятный, свойственный данной продукции.
Физико-химические показатели сухого ферментного препарата представлены в таблице 5.
Таблица 5 – Физико-химические показатели качества сухого ферментного препарата «Протофермол»
| Наименование показателей | Характеристика |
| Массовая доля воды, % | 7,9±0,2 |
| Протеолитическая активность (ПА), ед/г | 1,5±0,01 |
| Этиловый спирт (консервант) | отсутствует |
Выход готового продукта составляет 3,2-3,5 % от массы моллюска со створками.
Микробиологические показатели сухого ферментного препарата приведены в таблице 6. В ферментном препарате были также обнаружены дрожжи и плесени в количестве 7,9·102 (КОЕ/г) и установлено отсутствие патогенной микрофлоры. Сравнивая полученные результаты с нормативными показателями (СанПиН 2.3.2.1293-03 Гигиенические требования по применению пищевых добавок, 2003), можно констатировать, что по данным санитарно-гигиеническим показателям полученный ферментный препарат соответствует требованиям, предъявляемым к ферментным препаратам, применяемым в пищевой промышленности.
Таблица 6 – Микробиологические показатели сухого ферментного препарата «Протофермол»
| Наименование показателей | Нормативный показатель | Фактическое содержание |
| Количество мезофильно аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, КОЕ в 1г продукта, не более | 1 ·104 | 0,8 ·104 |
| Бактерии группы кишечных палочек (колиформы) в 0,1 г продукта | не допускаются | не обнаружены |
| E. coli в 25 г продукта | не допускаются | не обнаружены |
| Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, в 25 г продукта | не допускаются | не обнаружены |
Таким образом, полученные характеристики сухого ферментного препарата «Протофермол» свидетельствуют о его высокой протеолитической активности, стойкости при хранении, микробиологической безопасности.
Оставшаяся после гидролиза твердая часть, представляющую собой ценный по химическому составу плотный остаток непрогидролизованных мягких тканей и створок дрейссены (вода – 70±0,25; белок – 4,3±0,18; липиды – 10,1±0,28; минеральные вещества – 13±0,21%) рекомендуется направлять на производство кормов для сельскохозяйственных животных.
В разделе «Обоснование влияния дозировки ферментного препарата на скорость процесса созревания рыбных пресервов» проведены исследования по установлению оптимальной дозировки ферментного препарата «Протофермол» при изготовлении рыбных пресервов.
Рисунок 9 – Накопление азота свободных аминогрупп в мышечной ткани из салаки в процессе хранения пресервов
С этой целью была приготовлена опытная партия слабосоленых пресервов из разделанной салаки в уксусно-масляной заливке с добавлением 10%-ного ферментного препарата в количестве 3 % (кривая 1), 4 % (кривая 2) и 5 %(кривая 3) от массы салаки. Пресервы в уксусно-масляной заливке готовили по действующей технологической инструкции на производство пресервов из разделанной рыбы.
Степень созревания пресервов определяли методом формольного титрования по накоплению азота свободных аминогрупп. Анализ полученных данных (рисунок 9) свидетельствует, что ферментный препарат «Протофермол» значительно ускоряет процесс созревания слабосоленых пресервов из разделанной салаки в уксусно-масляной заливке.
Первые признаки, характерные созревшим пресервам, отмечены на десятые сутки хранения. При добавлении ферментного препарата «Протофермол» в количестве 4 % от массы салаки содержание азота свободных аминогрупп в мясе рыбы достигает 120 мг% на десятые сутки хранения. На 15 сутки пресервы, приготовленные с добавлением «Протофермол» в количестве 4 %, уже имели нежную консистенцию, приятный внешний вид, запах и вкус - свойственные созревшей рыбе данного вида.
Пресервы с добавлением ферментного препарата в количестве 3 % от массы салаки значительно отставали по темпам роста азота свободных аминогрупп и степени созревания.
При добавлении ферментного препарата «Протофермол» в количестве 5 % от массы салаки наблюдался быстрый рост азота свободных аминогрупп. К концу первого месяца хранения пресервы характеризовались повышенной размягченностью поверхностных слоев мяса, содержание азота свободных аминогрупп в мясе салаки составило 275 мг%, появились первые признаки, характерные перезревшему продукту (мажущаяся консистенция, привкус горечи).
При производстве пресервов нами была использована дозировка ферментного препарата 4% от массы рыбы.
В разделе «Производственные испытания ферментного препарата в технологии рыбных пресервов» приведены результаты апробации ферментного препарата «Протофермол» в качестве созревателя пресервов из разделанной салаки, проведенной в условиях предприятия ООО «Рыбокомбинат «За Родину» (пос. Взморье Калининградской области).
На базе действующего оборудования были изготовлены две промышленные партии малосоленых пресервов из салаки филе-кусочки в уксусно-масляной заливке с добавлением ферментного препарата «Протофермол» (экспериментальная партия) и без него (контрольная партия) в соответствии с действующей технологической инструкцией на пресервы из разделанной рыбы [Сборник ТИ по производству рыбных консервов и пресервов, 1989]. «Протофермол» вводили в жидкую часть заливки в виде 10 %-ного водного раствора (4 % от массы рыбы).
Результаты оценки качества экспериментальной и контрольной партии малосоленых пресервов из салаки в уксусно-масляной заливке после двухнедельного хранения при температуре минус 2 °С приведены в таблице 7. Ферментный препарат
Таблица 7 – Показатели качества экспериментальной и контрольной партии малосоленых пресервов из салаки в уксусно-масляной заливке
| Показатели качества пресервов | Образцы пресервов | |
| С добавлением ферментного препарата «Протофермол» (экспериментальная партия) | Без добавления ферментного препарата (контрольная партия) | |
| Внешний вид: - цвет | цвет филе-кусочков светло-серый, чистый, без налета белкового коагулята | |
| - запах и вкус | приятный, с признаками, характерными для созревшего продукта | с незначительным оттенком сырости |
| - консистенция | мягковатая, нежная, сочная | плотная, недостаточно сочная, признак нежности отсутствует |
| Массовая доля поваренной соли, % | 4,20 | 4,10 |
| Кислотность (в пересчете на уксусную кислоту), % | 0,53 | 0,62 |
| Бензойнокислый натрий, % | 0,08 | 0,09 |
| Массовая доля: - рыбы, % - заливки, % | 78,00 22,00 | 77,80 22,20 |
| Буферность, град | 110,00 | 45,00 |
| АЛО/ФТА · 100, % | 7,20 | 6,50 |
В процессе хранения экспериментальных и контрольных промышленных партий пресервов определяли степень их созревания по показателю буферность.
Из полученных данных следует, что пресервы из салаки с добавлением фермент-
ного препарата уже на 7 сутки имели буферность 75 град, на 14-ые сутки – 110 град и характеризовались нежной консистенцией с ароматом и вкусом, свойственным созревшей рыбе. Буферность пресервов без добавления ферментного препарата на 14 сутки хранения была равна 45 град, консистенция плотная, запах – с незначительным оттенком сырости, пресервы не достигли нужных гастрономических показателей. По всем нормативным показателям пресервы экспериментальной партии соответствовали требованиям, регламентированным в ГОСТ 7453 «Пресервы из разделанной рыбы».
Качество готовой продукции получило положительную оценку у специалистов предприятия, а технология производства пресервов из слабо созревающего рыбного сырья с применением ферментного препарата «Протофермол», полученного из двустворчатого моллюска дрейссена, рекомендована к внедрению. Результаты проведенных исследований удостоверены актом производственных испытаний пресервов с применением ферментного препарата «Протофермол» и протоколом дегустационного совещания специалистов.
В разделе «Оценка эффективности разработанной технологии» показаны социальная и экологическая составляющая разработки с учетом производственного аспекта. Сделан расчет экономической эффективности, который показал, что прибыль от внедрения разработанной технологии получения ферментных препаратов из моллюска дрейссены себестоимостью 670 руб./ кг может составлять более 3 млн. руб./год, при окупаемости в течение четырех с половиной лет и рентабельности выпуска продукции – 25 %.
ВЫВОДЫ
- Исследована био- и техно-химическая характеристика моллюска дрейссена (Dreissena polymorpha Pallas) из озера Форелевое Калининградской области. Установлено, что по химическому составу моллюск относится к белковым объектам промысла; протеолитическая активность мягкого тела дрейссены - 0,61 - 1,24 ед/г (по казеинату натрия).
- Определены способы и сроки хранения охлажденной и мороженной дрейссены. Установлено, что дрейссену можно хранить в охлажденном виде при температуре +4-2С не более 12 часов, в мороженом - при температуре минус (20±2)°С – в течение пяти месяцев.
- Определены диапазоны рН - активности протеолитических ферментов моллюска. Обнаружены два ясно выраженных оптимума – на участке рН 4,0-6,0 («пепсиновый»), второй – на участке рН 9,0-10,0 («трипсиновый»). Максимальная активность протеолитических ферментов моллюска обнаружена при рН 5,0.
- Установлено, что максимальная активность протеолитических ферментов моллюска дрейссены проявляется в диапазоне температур 45…55 °С.
- Исследовано изменение активности протеолитических ферментов дрейссены по сезонам. Установлено, что максимальная активность ферментов (7,5 мг%/час) проявляется в весенние месяцы (апрель-май), наименьшая (0,78-1,5 мг%/час) - в осенний посленерестовый период. Рекомендуемый период вылова дрейссены в качестве ферментсодержащего сырья март-июнь.
- Оптимизированы параметры (температура, продолжительность) основного технологического процесса получения ферментного препарата – автопротеолиза тканей дрейссены в 10-15%-ном водно-спиртовом растворе путем проведения математического моделирования по специальным алгоритмам ОЦКП второго порядка. Рациональные значения параметров процесса составили: продолжительность – от 36 до 40 ч, температура – от 42 до 47 °С.
- Разработана технология получения ферментного препарата протеолитического действия «Протофермол» из целого моллюска дрейссены, исключающая трудоемкий процесс отделения мягкого тела от створок дрейссены; выход ферментного препарата составил 3,5% от массы исходного сырья.
- Определены органолептические, физико-химические и микробиологические показатели качества сухого ферментного препарата «Протофермол» подтверждающие его высокую протеолитическую активность (1,5-1,6 ед/г), стойкость при хранении и микробиологическая безопасность.
- Показана целесообразность применения полученного ферментного препарата «Протофермол». Обоснована его дозировка для ускорения процесса созревания рыбных пресервов в качестве интенсификатора созревания. Пресервы с наилучшими органолептическими и физико-химическими показателями были получены при дозировке ферментного препарата 4% от массы рыбы (пресервы созревали на 14-ые сутки, при этом буферность достигает 110 градусов).
- Ферментный препарат апробирован в промышленных условиях на ООО «Рыбокомбинат «За Родину» и рекомендован специалистами предприятия к внедрению в качестве интенсификатора процесса созревания пресервов из слабо и несозревающего сырья.
- Разработаны проекты технологической инструкции и технических условий на ферментный препарат «Протофермол» из моллюска дрейссены.
- Проведена оценка экономической эффективности разработанной технологии. Срок окупаемости предлагаемой технологии составляет 4,4 года при рентабельности производства – 25%. Прибыль от внедрения технологии ферментного препарата из моллюска дрейссены при объеме выпуска 25 т/год составляет более 3 млн. руб./год, что характеризует перспективность предложенной технологии ферментного препарата, а низкая себестоимость – 670 руб./ кг - доступность для потребителя.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
В изданиях рекомендованных ВАК:
1. Судник О.А. Перспективы использования двустворчатого моллюска Dreissena polymorpha Pallas для получения комплекса протеолитических ферментов / О.А. Судник // РыбПром, 2009. -№2. -С. 54-55.
2. Судник О.А. Протеолитические ферменты дрейссены и технология их получения / О.А.Судник, А.С. Лысова, О.Я. Мезенова // Известия вузов. Пищевая технология, 2009.-№4. -С. 54-56.
В других изданиях:
3. Лысова А.С. Изучение технохимической характеристики и активности протеолитических ферментов дрейссены / А.С. Лысова, О.А. Судник // Материалы научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2004», посвященной 10-летию КГТУ.- Калининград, 2004.- С.103-104.
4. Лысова А.С. Технология получения ферментного препарата из моллюска дрейссены (Dreissena polymorpha Pallas) / А.С. Лысова, О.А. Судник // Тезисы НПК «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем».- М., 2005.- С. 51-52.
5. Лысова А.С. Изучение характеристики двустворчатого моллюска Dreissena polymorpha Pallas как нового источника ферментсодержащего сырья / А.С. Лысова, О.А. Судник // Рыбная промышленность, 2007.- №1.-С. 20-22.
6. Лысова А.С. Обоснование технологии ферментного препарата из моллюска дрейссены / А.С. Лысова, О.А. Судник // Материалы МНК ППС и студентов вуза «Социально-ориентированная экономика Калининградского региона: Проблемы и перспективы развития».- М.: АНОВПОЦС РФ, 2007.-С. 147-152.
7. Судник О.А. Обоснование режимов хранения дрейссены – сырца / О.А. Судник, А.С. Лысова // Материалы НПК «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы».- М., 2006.-С. 113-114.
8. Судник О.А. Влияние сезона вылова на активность протеолитических ферментов двустворчатого моллюска Dreissena polymorpha Pallas / О.А. Судник, А.С. Лысова // Материалы пятого съезда ОБР им. Ю.А. Овчинникова.- М., 2008.-С. 164-165.
9. Судник О.А. Характеристика протеолитических комплексов ферментов двустворчатого моллюска дрейссены (Dreissena polymoprpha Pallas) / О.А. Судник, А.С. Лысова // Вестник молодежной науки.- Калининград, 2009.-С.195-199.
10. Судник О.А. Применение математического планирования эксперимента при разработке технологии получения комплекса протеолитических ферментных препаратов МНК / О.А. Судник, А.С. Лысова // «Олимпиада 2014: Технологические и экологиечские аспекты производства продуктов здорового питания».- Краснодар, 2009.- С. 291-292.
11. Судник О.А. Оптимизация технологии получения протеолитических ферментных препаратов из двустворчатого моллюска / О.А. Судник, А.С. Лысова // VII Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании – 2009».-Калининград:ФГОУ ВПО КГТУ, 2009.-С. 358-360.
Заказ № _____. Подп. в печать 12.11.2009. Формат 6084/16
Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 90 экз.
Отпечатано УОП ФГОУ ВПО «КГТУ». Калининград, Советский пр-кт, 1.
