Морфогенез нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека
Учреждение Российской академии медицинских наук
Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН
На правах рукописи
Кривова Юлия Сергеевна
МОРФОГЕНЕЗ НЕЙРОЭНДОКРИННОГО АППАРАТА
ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА
Специальность 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор Савельев Сергей Вячеславович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Яглов Валентин Васильевич
доктор биологических наук Плотников Егор Юрьевич
Ведущее учреждение:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский Университет дружбы народов»
Защита диссертации состоится «25» февраля 2010 г. в 14:00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН
Автореферат разослан «___» января 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук Михайлова Л.П.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Сахарный диабет первого типа – одно из самых распространенных аутоиммунных заболеваний, приводящее к нарушениям эндокринной функции поджелудочной железы вследствие гибели инсулин-продуцирующих -клеток (Злобина Е.Н., Дедов И.И., 1993; Один В.И., 2003; Балаболкин М.И. и соавт., 2005; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2007; Подгребельный А.Н. и соавт., 2007; Петеркова, В.А., Лаптев Д.Н., 2009). Самым эффективным современным методом коррекции углеводного обмена у больных сахарным диабетом первого типа является заместительная инсулинотерапия. Однако в настоящее время ведутся активные разработки методов трансплантации -клеток для восстановления метаболизма у больных сахарным диабетом (Петеркова, В.А., Лаптев Д.Н., 2009). В связи с чем большое число работ посвящено строению, особенностям физиологии, а также механизмам дифференцировки -клеток поджелудочной железы. Несмотря на большой объем накопленных данных, ряд вопросов остаются малоизученными.
Гистологические и иммуногистохимические данные свидетельствуют о том, что в поджелудочной железе млекопитающих эндокринные клетки панкреатических островков (островков Лангерганса) и структуры нервной системы (нервные волокна, тела нейронов, глиальные клетки) объединены в сложноорганизованные комплексы, которые были названы нейроинсулярными (Persson-Sjgren S. et al., 2001; Sunami E. et al., 2001). В нейроинсулярных комплексах I типа эндокринные клетки панкреатических островков интегрированы с телами нейронов и нервными волокнами, в нейроинсулярных комплексах II типа тела нейронов отсутствуют. Функциональная роль нейроинсулярных комплексов не ясна (Persson-Sjgren S. et al., 2001).
Другой интересной особенностью эндокринных клеток является их сходство по ряду биохимических и физиологических характеристик с нейронами. Известно, что в -клетках панкреатических островков экспрессируется ряд белков, характерных для нервной системы: S-100, GFAP (glial fibrillary acidic protein), GAD (glutamic acid decarboxylase), TH (tyrosin hydroxylase), NPY (neuropeptide Y), NSE (neuron specific enolase) и др. (Von Dorsche H.H. et al., 1989; Kim, J. et al., 1993; Teitelman G. et al., 1993; Tsui H. et al., 2003; Winer S. et al., 2003). Кроме того, при дифференцировке эндокринных клеток поджелудочной железы экспрессируется ряд факторов транскрипции, характерных для нервной системы – Ngn3 (neurogenin3), BETA2/NEUROD и др.
Во второй половине XX века разрабатывались разнообразные концепции, согласно которым сходство и интеграция нервных и эндокринных клеток в поджелудочной железе объяснялось их происхождением из одного эмбрионального зачатка – нейроэктодермы (Fujita T., 1976; Pearse A.G.E., 1976). Однако нейроэктодермальное происхождение эндокринных клеток было опровергнуто в ряде экспериментов с использованием химерных зародышей, а также по культивированию зачатка поджелудочной железы in vitro (Slack J.M., 1995). Для понимания причин сходства и интеграции эндокринных клеток поджелудочной железы с нейронами необходимы детальные сведения об организации и морфогенезе нейроэндокринного аппарата у млекопитающих. Работы, направленные на изучение этого вопроса малочисленны и выполнены преимущественно с использованием экспериментальных животных. Данные о строении и развитии нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека единичные, поэтому проведение исследований в этой области представляется актуальным.
Необходимость изучения нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека и его морфогенеза обусловлена также существованием нейральной модели развития сахарного диабета 1-го типа. На NOD-мышах (nonobese diabetic mice) было показано, что нервный аппарат панкреатических островков является первой мишенью аутоиммунной атаки (Saravia F. and Homo-Delarche F., 2003; Tsui H. et al., 2003; Razavi R. et al., 2006). Развитие аутоиммунной реакции на -клетки происходит из-за их сходства по ряду экспрессируемых белков с нейронами.
Вопрос об участии структур нервной системы в патогенезе сахарного диабета 1-го типа у человека не решен. Известно, что организация эндокринной части (Brissova M. et. al., 2005; Cabrera O. et al., 2006) и, возможно, нервного аппарата поджелудочной железы человека и мышей могут значительно различаться. Поэтому необходимы сведения о строении нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека. Важное значение имеет также выявление в эндокринных клетках поджелудочной железы нейральных белков, которые могут являться мишенями для развития аутоиммунной атаки.
Цель исследования – изучение морфогенеза нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека в пре- и постнатальном онтогенезе.
Задачи исследования
- Иммуногистохимическое исследование эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы у взрослого человека, нутрии и монгольской песчанки с использованием комплекса маркеров (антител к гормонам эндокринных клеток поджелудочной железы – инсулину и глюкагону и белкам нервной системы – SNAP-25, NCAM, нейрон-специфическому -III тубулину и периферину);
- Сравнение морфологической организации нейроэндокринных комплексов у взрослого человека, нутрии и монгольской песчанки;
- Иммуногистохимическое выявление нейральных белков (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфического -III тубулина и периферина) в эндокринных клетках поджелудочной железы человека (взрослые, плоды), нутрии и монгольской песчанки;
- Изучение морфогенеза панкреатических островков у плодов человека с 8-й по 40-ю недели развития с использованием гистологических и иммуногистохимических (маркирование антителами к инсулину и глюкагону) методов;
- Исследование закономерностей формообразования нервного аппарата поджелудочной железы человека в плодный период (с 8-й по 40-ю недели развития) на препаратах, маркированных антителами к белкам нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфическому -III тубулину и периферину);
- Анализ организации нейроэндокринных взаимодействий на разных сроках развития поджелудочной железы человека.
Положения, выносимые на защиту
- Обнаружены межвидовые отличия в структуре эндокринной части поджелудочной железы, которые выражаются в формах ее организации (панкреатические островки, одиночные эндокринные клетки или небольшие их кластеры), цитоархитектонике панкреатических островков и соотношении - и -клеток.
- Выявлено, что организация нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы различается между исследованными видами по распределению и антигенному составу нервных волокон в нейроэндокринных комплексах, присутствию нейроэндокринных комплексов I типа, наличию взаимодействий между структурами нервного аппарата и отдельными эндокринными клетками.
- Установлено, что в эндокринных клетках поджелудочной железы экспрессируются белки, характерные для нервной системы (SNAP-25, NCAM и нейрон-специфический -III тубулин).
- Найдена смена форм организации эндокринной части поджелудочной железы человека в онтогенезе (внешний эпителий, панкреатические островки плащевого типа, панкреатические островки мозаичного типа), а также изменение соотношения - и -клеток.
- Обнаружены онтогенетические изменения организации нервного аппарата поджелудочной железы человека. В плодный период нервные волокна и нервные ганглии более выражены и располагаются в ткани железы плотнее, чем у взрослых. В поджелудочной железе плодов представлены нейроэндокринные комплексы I и II типа. У взрослого человека выявляются лишь единичные нейроэндокринные комплексы II типа.
Научная новизна
В проведенном исследовании выполнен комплексный иммуногистохимический анализ строения и развития эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы человека. При дифференцировке эндокринной части поджелудочной железы человека обнаружено изменение соотношения - и -клеток: на 8–10-й неделе преобладают -клетки, с 11-й по 18-ю недели наблюдается примерно одинаковое соотношение - и -клеток, с 18-й по 32-ю недели преобладают -клетки, после 34-й недели преобладают -клетки. В онтогенезе поджелудочной железы человека выявлено изменение типов организации ее эндокринной части – от внешнего эпителия у ранних плодов (8–10 недель) к островкам плащевого типа у плодов с 12-й по 32-ю недели развития и мозаичным островкам у плодов более поздних сроков развития, детей, взрослых. Полученные данные свидетельствую о том, что морфогенез панкреатических островков продолжается, по крайней мере, до 34-й недели.
В эндокринных клетках поджелудочной железы человека обнаружена иммунопозитивная реакция на белки, характерные для нервной системы (SNAP-25, NCAM и нейрон-специфический -III тубулин). Наличие экспрессии SNAP-25 и нейрон-специфического -III тубулина в эндокринных клетках поджелудочной железы человека описано впервые. Проведено исследование экспрессии всех трех нейромаркеров в пренатальном онтогенезе поджелудочной железе человека. Нейрон-специфический -III тубулин и NCAM обнаружены в эндокринных клетках 14-ти недельных плодов и на всех последующих сроках развития; SNAP-25 – начиная с 16-й недели развития.
Анализ нервного аппарата поджелудочной железы человека впервые выполнен с использованием комплекса маркеров, как структурных (NCAM, нейрон-специфический -III тубулин и периферин), так и функциональных (SNAP-25), что позволило предложить детальное описание организации нервного аппарата поджелудочной железы у взрослого человека и его развития в плодный период (с 8-й по 40-ю недели).
Проведено сравнение организации эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы человека с двумя видами млекопитающих. Между исследованными видами обнаружены отличия в цитоархитектонике панкреатических островков, плотности распределения структур нервного аппарата и строении нейроэндокринных комплексов.
Научно-практическая значимость
В проведенном исследовании обнаружена экспрессия ряда нейральных белков в эндокринных клетках поджелудочной железы человека, что подтверждает сходство эндокринных клеток с нейронами. Согласно нейральной модели развития сахарного диабета 1-го типа выявленные антигены (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфический -III тубулин) могут являться мишенями для развития аутоиммунной реакции на -клетки. Полученные данные могут служить основой для выявления аутоантител к SNAP-25, NCAM и нейрон-специфическому -III тубулину, с целью выяснения их роли в развитии сахарного диабета первого типа.
В результате исследования установлено, что нервный аппарат панкреатических островков человека отличается от других видов млекопитающих. Для взрослых характерно отсутствие нейроэндокринных комплексов первого типа; нейроэндокринные комплексы второго типа встречаются редко, в их составе выявляются лишь единичные нервные волокна. Эти различия необходимо учитывать при оценке роли нервного аппарата поджелудочной железы в патогенезе сахарного диабета 1-го типа у человека.
Полученные в результате работы данные представляют собой детальное описание формирования эндокринной части и нервного аппарата поджелудочной железы человека в плодный период (с 8-й по 40-ю недели развития), которые подтверждают и значительно дополняют имеющиеся к настоящему моменту сведения.
Результаты диссертационного исследования «Морфогенез нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы человека» используются при чтении курса «физиология человека и животных» на практических занятиях на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы
Основные результаты исследования доложены и обсуждены на научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2008); IX конгрессе международной ассоциации морфологов (Бухара, 2008); международной гистологической конференции (Тюмень, 2008), межлабораторной конференции в НИИ морфологии человека РАМН (декабрь, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста, состоит из 7 глав: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 5 таблицами. Список литературы включает 157 источников, из них 23 работы на русском языке.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на аутопсийном материале поджелудочной железы человека (плоды, новорожденные, дети, взрослые) из коллекции лаборатории развития нервной системы НИИ МЧ РАМН, а также собранном в 2007-2009 гг. в больницах Москвы: городских клинических больницах №72 и №81, Московском областном НИИ акушерства и гинекологии, детской городской клинической больнице св. Владимира, бюро судебно-медицинской экспертизы №1 Департамента здравоохранения г. Москвы. В работе использовано 38 плодов человека на разных сроках развития, 7 недоношенных новорожденных детей, проживших от нескольких часов до 28 суток, 1 доношенный новорожденный, 2-е детей (3 мес., 4г. 9 мес.), 5 взрослых.
При сборе образцов поджелудочной железы плодов человека учитывали пол, гестационный возраст, клинический диагноз матери и плода, причины прерывания беременности и причины смерти плода. Если клинические данные отсутствовали, определение возраста плодов проводили по теменно-копчиковой длине согласно морфометрическим таблицам (Петтен Б.М., 1959). Для детей и взрослых при сборе материала также учитывали пол, возраст, клинический и патологоанатомический диагноз.
Кроме того, в работе использованы образцы поджелудочных желез двух молодых нутрий (Myocastor coypus) (возраст: 2 мес. и 3 мес.) и пяти половозрелых монгольских песчанок (Meriones unguiculatus) (возраст 3 мес.).
Материал фиксировали в 10%-м кислом или нейтральном формалине (4%-ый параформальдегид на 0,1М фосфатном буфере, рН 7,5) или жидкости Буэна.
Методы гистологического исследования. Фиксированные образцы поджелудочной железы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и диоксане и заливали в парафиновые блоки. Изготовляли серийные срезы толщиной 10 мкм, которые окрашивали по Маллори и/или гематоксилином и эозином.
Методы иммуногистохимического исследования. В иммуногистохимических реакциях использовали антитела к гормонам эндокринных клеток поджелудочной железы (инсулину и глюкагону) и некоторым антигенам нервной системы: SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDa), NCAM (neural cell adhesion molecule), периферину и нейрон-специфическому -III тубулину.
Для исследования организации нейроэндокринных комплексов в поджелудочной железе нутрии и монгольской песчанки применяли методику двойного иммуногистохимического мечения на серийных срезах. Для каждого из видов одну серию срезов маркировали антителами к периферину и инсулину, другую – антителами к периферину и глюкагону. В качестве хромогена для выявления периферина использовали раствор DAB, содержащий 0,3% NiCl2 (черное окрашивание), в качестве хромогена для выявления инсулина и глюкагона использовали раствор DAB, без добавления NiCl2 (коричневое окрашивание).
Методы микроскопического исследования гистологических и иммуногистохимических препаратов. Все полученные препараты оценивали визуально с помощью микроскопа Leica DM2500. Видеозахват осуществляли с помощью камеры DFC290 и программы Image Scope M.
При просмотре гистологических препаратов описывали структуру поджелудочной железы всех образцов. Для плодов человека разных сроков развития отмечали степень зрелости экзокринной и эндокринной части, особенности их организации в зависимости от срока развития, характер кровоснабжения и иннервации, а также наличие или отсутствие патологических изменений.
При оценке иммуногистохимических препаратов отмечали наличие или отсутствие специфической иммунопозитивной реакции, распределение иммунореактивного материала в ткани железы, распределение иммунореактивного материала внутри клеток (ядерная или цитоплазматическая локализация).
Для подтверждения качественных данных проводили вычисление двух количественных параметров: среднего диаметра панкреатических островков и коэффициента заполненности (Кз) эндокринными клетками.
Помимо этого на гистологических препаратах поджелудочной железы плодов человека с 14-ой по 40-ю измеряли диаметр панкреатических островков.
Измерение диаметра островков проводили на гистологических препаратах в программе Image Scope M, с использованием функции «измеритель расстояний». Для всех плодов с 14-й по 40-ю недели развития измеряли максимальный диаметр 100 произвольных панкреатических островков, данные вносили в таблицу в программе Microsoft Exel и вычисляли среднее значение для каждого плода.
Коэффициент заполненности (Кз) вычисляется программой Image Scope M автоматически и представляет собой отношение суммарной площади окрашенного материала в кадре к общей площади кадра. Этот параметр измеряли для всех плодов человека с 8-й по 40-ю недели развития. Вычисление Кз -клетками проводили для 40 произвольных областей на срезах маркированных антителами к инсулину. Вычисление Кз -клетками проводили для 40 произвольных областей на срезах маркированных антителами к глюкагону. Данные вносили в таблицу Microsoft Exel и вычисляли среднее значение Кз и Кз для каждого образца.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Развитие эндокринной части поджелудочной железы человека
Полученные иммуногистохимические данные по экспрессии инсулина и глюкагона в зачатке поджелудочной железы человека в ранний плодный период (с 8-й по 12-ю недели) соответствуют имеющимся в литературе сведениям. У всех исследованных 8-недельных плодов эндокринная часть поджелудочной железы была представлена внешним эпителием – единичные инсулин- и глюкагон-иммунореактивные клетки присутствовали среди эпителиальных клеток формирующихся протоков железы, что подтверждает их энтеродермального происхождение. Сходные данные получены ранее Polak М. и соавт. (2000) и Piper K. и соавт. (2004). По данным другой группы авторов, клетки, дающие позитивную реакцию на глюкагон, выявляются в зачатке поджелудочной железы человека лишь на 9-й неделе развития (Jeon J. et al., 2009).
Измерение коэффициента заполненности показало, с 8-й по 12-ю недели развития количество эндокринных клеток резко возрастает: Кз составляет 0,004 на 8-й неделе, 0, 037 на 12-й неделе; Кз составляет 0,001 на 8-й неделе, 0, 039 на 12-й неделе. На этих сроках изменяется и соотношение двух типов эндокринных клеток – на 8–9-й неделе в поджелудочной железе преобладают -клетки, с 12-й по 18-ю недели соотношение - и -клеток одинаковое или -клетки преобладают. Для всех плодов с 18-й по 32-ю недели развития характерно, что Кз превышает Кз, т.е. в поджелудочной железе преобладают -клетки. На поздних сроках развития (34–40 недель), у детей и взрослых в поджлелудочной железе преобладают -клетки (Кз превышает Кз). В литературе также имеются сведения о том, что соотношение - и -клеток в течение пренатального и раннего постнатального периода варьирует (Милованов А.П., Савельев С.В., 2006).
В поджелудочной железе ранних плодов (8–10 недель) эндокринные клетки распределены поодиночке или небольшими группами среди эпителиальных клеток первичных протоков железы. К 12-й неделе развития в зачатке поджелудочной железы появляются первые кластеры, имеющие плащевую организацию (центральная часть заполнена -клетками, а -клетки локализованы на периферии). Кластеры плащевого типа преобладают в поджелудочной железе плодов с 12-й по 32-ю недели развития. После 34-й недели развития в поджелудочной железе появляются кластеры с мозаичным распределением - и -клеток.
Литературные данные о времени формирования зрелых панкреатических островков варьируют. По мнению Piper K. и соавт. (2004) панкреатические островки у человека формируются к 12–13-й неделе развития, поскольку на этих сроках эндокринные клетки уже контактируют с капиллярами и содержат маркеры зрелых - и -клеток. Однако цитоархитектоника панкреатических островков плодов человека и взрослых отличаются. Как показывают наши и литературные данные, в плодный период большинство кластеров эндокринных клеток имеют плащевую организацию: -клетки располагаются в центральной части островка, -клетки локализованы преимущественно на периферии (Фалин Л.И., 1966; Jeon J. et al., 2009). Для взрослых характерно мозаичное распределение - и -клеток в панкреатических островках (Brissova M. et. al., 2005; Cabrera O. et al., 2006). Полученные нами данные демонстрируют, что характерное для поджелудочной железы взрослых преобладание -клеток, а также появление кластеров с мозаичным распределением - и -клеток, наблюдается после 34-й недели развития.
В проведенном исследовании установлено, что в онтогенезе поджелудочной железы человека наблюдается изменение соотношения - и -клеток, а также смена форм организации ее эндокринной части.
Экспрессия нейральных белков в эндокринных клетках поджелудочной железы
В эндокринных клетках поджелудочной железы у исследованных видов была обнаружена иммунопозитивная реакция на белки нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфический -III тубулин), что подтверждает сходство эндокринных клеток с нейронами. Наличие экспрессии нейральных белков, таких как S-100, тирозин гидроксилазы, нейрон-специфической энолазы, нейропептида Y, глиального фибриллярного кислого белка и др. описано в литературе, как для экспериментальных животных, так и для человека (Von Dorsche H.H., 1989; Kim, J. et al., 1993; Teitelman G. et al., 1993; Tsui H. et al., 2003; Winer S. et al., 2003).
При маркировании антителами к SNAP-25 иммунопозитивная реакция обнаружена в эндокринных клетках поджелудочной железы у всех исследованных видов (человек, нутрия, монгольская песчанка). Согласно литературным данным, этот белок присутствует в эндокринных клетках поджелудочной железы млекопитающих (мыши, крысы) и принимает участие Ca++-зависимом экзоцитозе инсулина (Jacobsson J. et al., 1994; Sadoul K. et al., 1995; Wheeller M.D. et al., 1996). Полученные данные по распределению SNAP-25 соответствуют литературным и впервые демонстрируют присутствие этого белка в эндокринных клетках поджелудочной железы не только у млекопитающих, но и у человека.
Важное значение может иметь выявление экспрессии SNAP-25 в эндокринных клетках при развитии поджелудочной железы человека. При отсутствии этого белка в эндокринных клетках Ca++-зависимый экзоцитоз инсулина и, вероятно, других гормонов эндокринных клеток, не происходит. Появление экспрессии SNAP-25 может свидетельствовать о начале Ca++-зависимого экзоцитоза гормонов, то есть о начале функциональной активности эндокринных клеток. По нашим данным экспрессия SNAP-25 в эндокринных клетках поджелудочной железы начинается на 16-й неделе развития.
В эндокринных клетках поджелудочной железы у человека и нутрии обнаружена иммунопозитивная реакция на NCAM, что соответствует литературным данным (Eidelman S. et al., 1989; Langley O.K. et al., 1989; Rouiller D.G. et al., 1990; Moller C.J. et al., 1992). В работах, выполненных на мышах и крысах, показано, что NCAM принимает участие в сегрегации эндокринных клеток и формировании нормальной цитоархитектоники панкреатических островков (Cirulli V. et al., 1994; Esni F. et al., 1999). При исследовании экспрессии NCAM в онтогенезе поджелудочной железы человека обнаружено, что этот маркер выявляется в эндокринных клетках с 14-й недели развития, спустя 2 недели после появления первых кластеров плащевого типа. Таким образом, молекула NCAM не является необходимой для большинства событий морфогенеза панкреатических островков у человека. Существует гипотеза, что миграция эндокринных клеток из эпителия первичных протоков в кластеры, локализованные в строме железы, происходит за счет образования гомофильных связей между молекулами NCAM нервных волокон и эндокринных клеток (Fujisawa M. et al., 2003).
В проведенном исследовании впервые обнаружена иммунопозитивная реакция на нейрон-специфический -III тубулин в эндокринных клетках поджелудочной железы человека. Наиболее интенсивная реакция на этот белок наблюдается в эндокринных клетках при развитии поджелудочной железы, достигая пика к 16-й неделе развития, и снижаясь к рождению и у взрослых. Для человека ранее отмечалась экспрессия нейрон-специфического -III тубулина в митотических веретенах предшественников нейронов (Memberg S.P. and Hall A.K., 1995). Для понимания роли нейрон-специфического -III тубулина в эмбриональной дифференцировке и функции эндокринных клеток поджелудочной железы необходимы дальнейшие исследования.
Реакция на периферин в эндокринных клетках поджелудочной железы у всех видов была иммунонегативной, хотя, по данным литературы, периферин экспрессируется в -клетках эмбриональной поджелудочной железы мышей и линиях -клеток (Escurat M. et al., 1991).
Нервный аппарат поджелудочной железы человека
Применение иммуногистохимических методов позволило выявить в поджелудочной железе человека типичные нервные ганглии и пучки нервных волокон различного диаметра, локализованные в соединительнотканной строме и паренхиме железы. Кроме того, в паренхиме железы обнаружена сеть тонких нервных волокон, проходящих самостоятельно или вдоль сосудов, которая выявляется также с помощью антител к S-100, NSE, GAP-43, Pgp9.5 (Fink T. et al., 1994; Castorinа S. et al., 1996). Характер распределения SNAP-25, NCAM и нейрон-специфического -III тубулина в структурах нервного аппарата поджелудочной железы был сходным. Иммунопозитивная реакция на эти три маркера наблюдалась в ганглионарных нейронах, пучках нервных волокон различного диаметра и в сети тонких нервных волокон. При реакции на периферин во всех случаях выявляется меньше тонких нервных волокон в паренхиме железы, чем в реакциях на другие три маркера. При этом четкая иммунопозитивная реакция на периферин сохраняется в крупных пучках нервных волокон и нервных ганглиях. Наши данные не позволяют точно судить о причинах различий по набору экспрессируемых белков в структурах нервной системы поджелудочной железы. По-видимому, выявленные нами различия связаны с тем, что периферин не экспрессируется в части периферических нервных волокон, входящих в поджелудочную железу. Для подтверждения этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования с применением двойной иммунофлуоресцентной метки и выявлением источников иннервации поджелудочной железы, не реагирующих с антителами к периферину.
Оценку нервного аппарата панкреатических островков у взрослых проводили на препаратах, маркированных антителами к периферину и нейрон-специфическому -III тубулину, поскольку иммунопозитивная реакция на SNAP-25 и NCAM в эндокринных клетках мешает выявлению нервных волокон. Оценка нервного аппарата панкреатических островков человека (взрослые, плоды) SNAP-25- и NCAM-позитивными нервными волокнами затруднена из-за наличия интенсивной иммунопозитивной реакции в эндокринных клетках. Внутри панкреатических островков взрослого человека нервные волокна, иммунореактивные к периферину или нейрон-специфическому -III тубулину, обнаружены лишь в отдельных единичных случаях. Таким образом, по нашим и литературным данным структуры нервной системы иннервируют преимущественно ацинарную часть поджелудочной железы, в панкреатических островках нервные волокна встречаются в единичных случаях (Fink T. et al., 1994; Castorinа S. et al., 1996).
Нами были выявлены различия по обилию тонких паренхиматозных нервных волокон между исследованными образцами поджелудочной железы взрослых и детей. Эти различия, вероятно, носят индивидуальный характер. Однако, для анализа индивидуальной изменчивости нервной сети поджелудочной железы необходимы дальнейшие количественные исследования на большем числе образцов. Кроме того, как показывают данные литературы и результаты, полученные нами в предыдущих исследованиях, изменения в уровне экспрессии различных нейральных белков могут происходить при развитии различных заболеваний поджелудочной железы (Fink T. et al., 1994).
Развитие нервного аппарата поджелудочной железы человека
Формирование нервного аппарата при развитии поджелудочной железы человека можно условно разделить на три этапа. На первом этапе (с 8-й по 12-ю недели развития) нервный аппарат поджелудочной железы представлен слабо разветвленными пучками нервных волокон и нервными ганглиями, которые локализованы в мезенхиме. На этих сроках в структурах нервного аппарата обнаружена экспрессия только двух маркеров (NCAM и нейрон-специфического -III тубулина).
Второй этап морфогенеза нервного аппарата поджелудочной железы (с 14-й по 32–34-ю недели) характеризуется постепенным разветвлением нервной сети и образованием связей между структурами нервного аппарата и экзокринной и эндокринной частью железы. В структурах нервного аппарата поджелудочной железы 14-недельных плодов впервые выявляется экспрессия SNAP-25 и периферина. Реакция на периферин в поджелудочной железе 14-недельных плодов очень слабая. Интенсивная реакция на этот белок наблюдается лишь к 16-й неделе развития. Таким образом, к 16-й неделе развития структуры нервного аппарата поджелудочной железы сходны по набору экспрессируемых белков с взрослыми.
В отличие от остальных использованных маркеров (NCAM, периферин и нейрон-специфический -III тубулин), которые являются структурными молекулами, SNAP-25 является функциональным белком, который обеспечивает выделение медиаторов в нервных окончаниях (Oyler G.A. et al., 1989). Иммунонегативная реакция на этот белок в нервных волокнах и нейронах поджелудочной железы до 14-й недели свидетельствует об отсутствии синаптической передачи, по крайней мере, до 14-й недели развития.
Поджелудочная железа плодов человека на всех сроках развития иннервирована гораздо обильнее, чем у взрослых (структуры нервной системы у плодов человека расположены плотнее, чем у взрослых). Кроме того, на серийных срезах обнаружено, что нервные волокна и нервные ганглии в поджелудочной железе плодов тесно взаимосвязаны, что свидетельствует об интеграции структур нервной системы в поджелудочной железе плодов человека.
Формирование связей между панкреатическими островками и структурами нервного аппарата впервые визуализируется у 14-недельных плодов. Эти нейроэндокринные комплексы выявляются в поджелудочной железе плодов человека и на всех последующих сроках развития. Причем количество и разнообразие форм нейроэндокринных комплексов у плодов человека значительно превосходит взрослых. Если для взрослых характерны лишь единичные нервные волокна, контактирующие с панкреатическими островками, то у плодов выявляются два типа нейроэндокринных комплексов, характерных для ряда млекопитающих (Persson-Sjgren S. et al., 2001; Sunami E. et al., 2001; Burris R. and Hebrok M., 2007). Нейроэндокринные комплексы I типа состоят из панкреатических островков, интегрированных с группами ганглионарных нейронов и нервными волокнами. Нейроэндокринные комплексы II типа представляют собой панкреатические островки, интегрированные только с нервными волокнами. Формирование нейроэндокринных комплексов у человека происходит в эмбриогенезе, в отличие от грызунов (мышь, монгольская песчанка, золотистый хомяк), для которых характерно постнатальное развитие панкреатических островков и установление связей между ними и нервными волокнами (Burris R. and Hebrok M., 2007; Thomas N.W. and Findlay J.A., 1978; Gegrell L., 1975).
В онтогенезе поджелудочной железы человека мы наблюдаем закладку избыточного количества нервных волокон и нервных ганглиев. Значение столь обильной иннервации поджелудочной железы, и панкреатических островков в частности, в эмбриогенезе человека не ясно. Очевидно, что наблюдаемые различия между нервным аппаратом поджелудочной железы плодов и взрослых могут иметь функциональное значение для дифференцировки поджелудочной железы.
На поздних сроках развития (после 34-й недели) при увеличении размеров поджелудочной железы распределение структур нервной системы (нервных волокон, нервных ганглиев, паренхиматозной сети тонких нервных волокон) становиться более разреженным. Нейроэндокринные комплексы встречаются редко. То есть, нервный аппарат поджелудочной железы на 34–40-й неделях развития становится сходным с таковым у взрослых не только по набору экспрессируемых белков, но и по распределению структур нервной системы в ткани железы.
Сравнение нейроэндокринных комплексов у человека, нутрии и монгольской песчанки
Нервный аппарат поджелудочной железы нутрии и монгольской песчанки сходен с человеком по характеру распределения SNAP-25, NCAM, нейрон-специфического -III тубулина и периферина (у всех видов периферин не выявляется в части тонких паренхиматозных нервных волокон). Из исследованных видов наиболее обильно иннервирована поджелудочная железа нутрии.
По литературным данным для млекопитающих характерны нейроинсулярные комплексы первого и второго типа (Kobayashi S. and Fujita T., 1969; Forssmann W.G. and Greenberg J., 1978; Thomas N.W. and Findlay J.A., 1978; Donev, 1984; Persson-Sjgren S. et al., 2001; Sunami E. et al., 2001; Burris R. and Hebrok M., 2007). Разные виды млекопитающих могут отличаться по количеству нервных волокон, образующих периинсулярную нервную сеть, а также по наличию или отсутствию нейроинсулярных комплексов первого типа, в состав которых входят тела ганглионарных нейронов (Kobayashi S. and Fujita T., 1969; Donev, 1984; Sunami E. et al., 2001).
В проведенном нами исследовании обнаружены межвидовые отличия по количеству нервных волокон, иннервирующих панкреатические островки, и по характеру распределения нервных волокон внутри островков. Для нутрии и человека характерно, как и для других млекопитающих (Kobayashi S. and Fujita T., 1969; Donev, 1984; Sunami E. et al., 2001), что нервные волокна локализованы преимущественно на периферии панкреатических островков; внутри островков встречаются лишь отдельные редкие нервы. В панкреатических островках обнаружены многочисленные нервные волокна, равномерно распределенные по всему островку. Из сказанного выше видно, что характер иннервации панкреатических островков монгольской песчанки (с равномерным распределением нервных волокон) заметно отличается от человека, нутрии и других видов млекопитающих. Подобное распределение нервных волокон в панкреатических островках млекопитающих ранее не отмечалось. Среди исследованных видов наиболее обильно иннервированы панкреатические островки нутрии и монгольской песчанки. У взрослого человека нервные волокна выявляются в панкреатических островках в единичных случаях.
Нейроинсулярные комплексы I типа в поджелудочной железе взрослого человека и монгольской песчанки не обнаружены. Хотя у монгольской песчанки выявлены нервные ганглии, локализованные вблизи панкреатических островков и контактирующие с соединительнотканной оболочкой островка. Типичные нейроинсулярные комплексы первого типа, в которых тела ганглионарных нейронов локализованы под соединительнотканной капсулой островка и контактируют с эндокринными клетками, обнаружены у нутрии и в поджелудочной железе плодов человека. Таким образом, отличия в организации нейроэндокринных взаимодействий могут наблюдаться не только у разных видов, но и на разных стадиях онтогенеза поджелудочной железы.
Применение методики двойного иммуногистохимического маркирования серийных срезов и анализ пространственной организации нейроэндокринных взаимодействий в поджелудочной железе нутрии позволили показать, что помимо нейроинсулярных комплексов I и II типа, в поджелудочной железе нутрии существуют и другие формы взаимодействия нервной системы с эндокринной тканью.
Во-первых, это комплексы, состоящие нескольких островков и отдельных эндокринных клеток, связанных друг с другом нервными волокнами, или объединенных с одним нервным ганглием. Во-вторых, это взаимодействия между элементами периферической нервной системы и отдельными эндокринными клетками и их небольшими группами, не входящими в состав островков. Подобные взаимодействия могут являться одной из форм нейроэндокринных комплексов, характерных для поджелудочной железы нутрии. Возможно также, что они представляют собой начальные этапы образования крупных нейроинсулярных комплексов I и II типов.
ВЫВОДЫ
- В онтогенезе поджелудочной железы человека наблюдается смена форм организации ее эндокринной части: внешний эпителий у 8–10-ти недельных плодов, панкреатические островки плащевого типа у плодов с 12-й по 32-ю недели развития, панкреатические островки мозаичного типа у поздних плодов (после 34-й недели), детей, взрослых.
- При развитии поджелудочной железы человека выявлено изменение соотношения - и -клеток. На 8–9-й неделе развития в поджелудочной железе преобладают -клетки. С 12-й по 18-ю недели соотношение - и -клеток одинаковое или -клетки преобладают. Для всех плодов с 18-й по 32-ю недели развития характерно преобладание в поджелудочной железе -клеток. На поздних сроках развития (34–40 недель), у детей и взрослых в поджелудочной железе преобладают -клетки.
- С помощью иммуногистохимических методов в эндокринных клетках поджелудочной железы обнаружена экспрессия белков, характерных для нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфического -III тубулина). При развитии поджелудочной железы человека NCAM и нейрон-специфический -III тубулин выявляются в эндокринных клетках с 14-й недели развития, экспрессия SNAP-25 начинается на 16-й неделе развития.
- При помощи антител к белкам нервной системы (SNAP-25, NCAM, нейрон-специфическому -III тубулину, периферину) установлено, что наряду с известными нервными ганглиями и пучками нервных волокон различного диаметра, существует сеть тонких нервных волокон в паренхиме поджелудочной железы. В телах ганглионарных нейронов и пучках нервных волокон экспрессируются все четыре исследованных маркера, тогда как в части тонких нервных волокон периферин не экспрессируется, что свидетельствует о гетерогенном белковом составе структур нервного аппарата поджелудочной железы.
- Экспрессия нейральных белков в структурах нервного аппарата поджелудочной железы начинается на разных сроках ее развития. В ганглионарных нейронах и пучках нервных волокон 8-недельных плодов экспрессируются NCAM и нейрон-специфический -III тубулин. Экспрессия SNAP-25 и периферина начинается с 14-й недели развития.
- Нейроэндокринный аппарат поджелудочной железы человека меняется в онтогенезе. При развитии поджелудочной железы нервные волокна и ганглии располагаются плотнее, чем у взрослого человека. В поджелудочной железе плодов человека после 14-й недели развития выявлены нейроэндокринные комплексы I и II типов. Для детей и взрослых характерны единичные нейроэндокринные комплексы II типа, нейроэндокринные комплексы I типа не обнаружены.
- В проведенном исследовании выявлены межвидовые различия в организации нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы. У всех исследованных видов присутствуют нейроэндокринные комплексы II типа, которые отличаются по обилию и характеру распределения нервных волокон. Нейроэндокринные комплексы I типа обнаружены только у нутрии и плодов человека.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Кривова Ю.С., Барабанов В.М., Савельев С.В. Иммуногистохимическое исследование развития нервной и эндокринной ткани в поджелудочной железе человека // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии». Самара. – 2009. – С. 265-266.
- Кривова Ю.С., Барабанов В.М., Савельева Е.С., Савельев С.В. Иммуногистохимическое выявление SNAP-25, NCAM и инсулина в поджелудочной железе нутрии (Myocastor coypus) // Бюлл. эксперим. биологии и мед. – 2007. – Т. 144. – №11. – С. 582-585.
- Кривова Ю.С., Барабанов В.М., Савельева Е.С., Савельев С.В.
Нейроэндокринные комплексы в поджелудочной железе нутрии (Myocastor coypus) (иммуногистохимическое исследование) // Морфология. – 2009. – Т. 135. – №3. – С. 59-62. - Кривова Ю.С., Барабанов В.М., Савельев С.В. Иммуногистохимическое исследование структуры нейроэндокринных взаимодействий в поджелудочной железе нутрии (Myocastor coypus) // Материалы международной гистологической конференции. Тюмень. Морфология. – 2008. – 133. – №3. – С. 59.
- Кривова Ю.С., Барабанов В.М., Савельев С.В. Иммуногистохимическое исследование нейроэндокринных взаимодействий в поджелудочной железе нутрии // Материалы докладов IX конгресса международной ассоциации морфологов. Бухара. Морфология. – 2008. – 133. – №2. – С. 68-69.
- Савельев С.В., Барабанов В.М., Кривова Ю.С., Прощина А.Е. Неврогенные механизмы развития сахарного диабета 1-го типа // Архив патологии. – 2008. – №6. – С. 9-13.
- Кривова Ю.С., Прощина А.Е., Фокин Е.И., Барабанов В.М., Савельев С.В. Иммуногистохимическое исследование эндокринных клеток и нервного аппарата поджелудочной железы человека в норме и при сахарном диабете I типа // В сб. Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. Москва. – 2008. – С. 80 - 83.
Соискатель Ю.С. Кривова
