Сравнительный иммуно-флуоресцентный анализ рекомбинационных характеристик геномов млекопитающих клеточная биология, цитология, гистология -

На правах рукописи

БАШЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

Сравнительный иммуно-флуоресцентный анализ рекомбинационных характеристик геномов млекопитающих

Клеточная биология, цитология, гистология- 03.03.04

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2011

Работа выполнена в лаборатории рекомбинационного и сегрегационного анализа Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологический наук, профессор

Бородин П.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Л.В.

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

кандидат биологических наук

Костерин О.Э.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН г. Москва

Защита диссертации состоится «___» ____________ 20___ г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект Ак. Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06,
факс (383) 333-12-78, e-mail: [email protected].

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «___» _____________ 20___ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Сравнительный анализ рекомбинационных характеристик геномов млекопитающих, выявление клеточных механизмов и эволюционных факторов, обеспечивающих межвидовые различия в частоте и распределении рекомбинационных событий, является актуальной проблемой клеточной и эволюционной биологии. Рекомбинация вносит значительный вклад в процессы генерации генетического разнообразия у организмов. Связанные с ней механизмы обеспечивают спаривание гомологов в мейозе и их сегрегацию. Нарушения этих механизмов ведут к образованию анеуплоидных гамет, что в свою очередь может приводить к бесплодию или рождению потомков с хромосомными аномалиями.

В настоящее время эволюционный смысл рекомбинации активно обсуждается в теоретических работах (Otto, Barton, 1997; Otto, Lenormand, 2002; Coop, Przeworski, 2007). Одни авторы видят в этих различиях адаптивный смысл (Otto and Barton, 2001), другие считают их нейтральными (Dumont, Payseur, 2008). Однако качество данных, на которых базируются эти дискуссии, вызывает ряд сомнений:

1. Сравнительно-эволюционный анализ рекомбинации в основном базируется на данных, полученных при генетическом картировании. Такой подход часто дает смещенные оценки частоты рекомбинации. Длины генетических карт, оцененные по частоте кроссинговера между отдельными маркерами, могут оказаться заниженными за счет недостатка информативных маркеров.

2. Довольно большой объем данных для сравнительного анализа частот рекомбинации был накоплен при подсчете общего числа хиазм на стадии диакинеза-метафазы I мейоза. Применимость данного подхода к млекопитающим ограничивается трудностями получения достаточного количества пригодных для анализа клеток на стадии диакинеза.

3. При анализе эволюции рекомбинации, как правило, используется произвольный набор видов, не сбалансированный ни по происхождению, ни по экологии.

В настоящее время разработаны цитологические методы, которые позволяют надежно локализовать точки кроссинговера на пахитенных хромосомах млекопитающих. Эти методы базируются на использовании меченных флуорохромами антител к MLH1, эукариотическому гомологу бактериального белка мисматч репарации. Было показано, что MLH1 входит в состав зрелых рекомбинационных узелков. Число и распределение точек локализации MLH1 на бивалентах в клетках на стадии пахитены точно соответствует числу и распределению хиазм в диакинезе мейоза (Anderson et al, 1999; Lynn et al., 2002). Установлено, что частота рекомбинации между двумя сцепленными генами, определенная по числу точек локализации MLH1 между FISH-пробами к этим генам, совпадает с оценкой частоты кроссинговера между ними, полученной в генетическом эксперименте (Froenicke et al, 2002). С использованием иммунолокализации MLH1 до начала нашей работы было проанализировано 19 видов млекопитающих (Borodin et al., 2008; Бородин и др., 2008; Hart et al., 2008; Vozdova, Rubes, 2010; Yang et al., 2011; Sun et al., 2005; Hassold et al., 2009; Garcia-Cruz et al., 2009; Dumont, Payseur, 2010). Мы использовали данный метод для анализа рекомбинации 17 видов млекопитающих.

Объектами исследования в данной работе были 3 представителя отряда хищных млекопитающих: домашняя собака (Canis familiaris), красная лисица (Vulpes vulpes), американская норка (Mustela vison) и 14 представителей отряда грызунов (подсемейство Arvicolinae). Эти виды млекопитающих различаются как по числу и морфологии хромосом, так и целому ряду особенностей их биологии (плодовитость, время смены поколений, экологическая пластичность и др.) и представляют собой удобную модель для исследования эволюции синапсиса и рекомбинации хромосом.

Цель и задачи работы. Целью данного исследования был сравнительный иммуно-флуоресцентный анализ рекомбинационных характеристик геномов у 17 видов млекопитающих и выявление эволюционных факторов и клеточных механизмов, обеспечивающих межвидовые различия.

Было намечено выполнение следующих задач:

1. С использованием иммунолокализации MLH1 оценить общее число кроссоверных событий на клетку и особенности их распределения по бивалентам.
2. Исследовать вовлеченность В-хромосом лисиц в рекомбинационный процесс и их влияние на рекомбинацию в А-хромосомах.
3. Исследовать особенности синапсиса и рекомбинации половых хромосом в профазе мейоза самцов млекопитающих.
4. Оценить относительную роль таких факторов, как число хромосом, число плеч хромосом, длина синаптонемных комплексов, сила интерференции в определении общего числа рекомбинационных событий.
5. Попытаться выяснить адаптивный смысл межвидовых различий в уровне рекомбинации.

Научная новизна. С использованием иммунолокализации MLH1 впервые получены точные оценки общего числа рекомбинационных обменов для трех видов хищных млекопитающих и 14 видов грызунов. Показано, что у полевок количество рекомбинационных обменов на клетку положительно коррелирует с числом хромосом, а у остальных исследованных видов млекопитающих – с числом хромосомных плеч. Показано, что виды млекопитающих с продолжительным временем смены поколений имеют более высокий уровень рекомбинации, чем виды с быстрой сменой поколений. Впервые установлено, что В-хромосомы лисицы вовлекаются в процесс рекомбинации. Анализ синапсиса и рекомбинации половых хромосом серых полевок в контексте их филогении впервые позволил установить, что утрата способности к синапсису в ходе мужского мейоза произошла независимо и параллельно в нескольких филогенетических линиях.

Научно-практическая значимость. Результаты данной работы расширяют представления о факторах, определяющих уровень рекомбинации, и механизмах эволюции этого признака у млекопитающих. Полученные в работе данные о частоте и распределении рекомбинационных событий по хромосомам красной лисицы и американской норки могут быть использованы для построения генетических карт данных объектов пушного звероводства и предсказания эффективности селекционных программ.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Число рекомбинационных обменов на клетку положительно коррелирует с числом хромосом у полевок и с числом хромосомных плеч у остальных исследованных видов млекопитающих.
• В-хромосомы лисицы вовлекаются в процесс рекомбинации.
• Утрата способности к синапсису половых хромосом в мужском мейозе произошла независимо и параллельно в нескольких филогенетических линиях серых полевок.

Личный вклад автора. Автор самостоятельно приготовил препараты распластанных синаптонемных комплексов (СК) для проведения иммуно-цитохимических исследований 14 представителей отряда грызунов подсемейства Arvicolinae, провел иммуноокрашивание всех препаратов, фотографирование и анализ изображений на электронном и флуоресцентном микроскопе, а также обработку экспериментальных данных.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены на отчётной сессии ИЦиГ СО РАН в 2010 г., II международной конференции: “Происхождение и эволюция биосферы” (Лутраки, Греция, 2007), международной конференции “Эволюция видов группы Sorex araneus: цитогенетические и молекулярные аспекты” (Йорк, Великобритания, 2008), симпозиуме памяти Г.А Левитского: “Хромосомы и эволюция” (Санкт–Петербург, 2008), V Всероссийском съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Международных конференциях EMBO по мейозу (Исле-Сюр-Ла-Сорг, Франция, 2009 и Пестум, Италия, 2011), конференции “Целостность вида у млекопитающих: изолирующие барьеры и гибридизация” (Петергоф, 2010), Международной конференции EMBO по анеуплоидии и сегрегации (Эдинбург, Великобритания, 2010), Международном совещании IX съезда териологического общества при РАН “Териофауна России и сопредельных территорий” (Москва, 2011).

Публикации. Материал диссертации представлен в 20 публикациях, в том числе в 8 статьях в отечественных (3) и зарубежных (5) реферируемых журналах.

Структура и объём работы. Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы (190 источников). Общий объем составляет 106 страниц. Представлено 17 рисунков и 6 таблиц.

материалы и методы

Животные. Для приготовления цитологических препаратов были использованы семенники половозрелых самцов трех представителей отряда хищных млекопитающих: домашней собаки (Canis familiaris), красной лисицы (Vulpes vulpes), американской норки (Mustela vison), а также следующих 14 видов полевок подсемейства Arvicolinae: Myodes glareolus, M. rutilus, Eolagurus luteus, Lagurus lagurus, Microtus gregalis. Microtus brandtii, М. mandarinus, Microtus arvalis arvalis, M. arvalis obscurus, M. juldaschi, M. fortis, M. maximowiczii, M. mujanensis, M. levis.

Приготовление распластанных препаратов сперматоцитов. Препараты распластанных сперматоцитов были приготовлены по методу Петерса с соавторами (Peters et al., 1997). Семенные канальцы помещали в гипотонический экстракционный буфер на 30–60 мин. После этого канальцы измельчали в 0.1 M сахарозе. Суспензию гомогенизировали и наносили на предметные стекла, смоченные 1% раствором параформальдегида. Препараты высушивали, промывали в 0.4% растворе Fotoflo (Kodak) и высушивали на воздухе. Готовые препараты хранили в холодильнике при -20°С.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Анализ синапсиса в В-хромосомах лисицы и половых хромосом полевок проводили с использованием электронной микроскопии. Препараты окрашивали азотнокислым серебром по стандартному методу (Howel, Black, 1980). Окрашенные препараты погружали в 1% раствор пластика в хлороформе и высушивали. Под световым микроскопом алмазным метчиком вырезали круги пластика над районами препарата, содержащими профазные ядра. Круги пластика вместе с ядрами отделяли от предметного стекла с использованием 2.5% раствора плавиковой кислоты, переносили на сетки для электронной микроскопии и высушивали. Анализ проводили с использованием электронного микроскопа JEM100SX, (Jeol, Япония) при 80 кВ. Полученные негативы сканировали для последующей обработки в Corel PaintShop Photo Pro X3 (Corel Corporation).

Приготовление препаратов для иммуно-флуоресцентной микроскопии. Иммуноокрашивание проводили по методике Андерсон с соавторами (1999). Препараты инкубировали с поликлональными антителами кролика против SCP3 - белка боковых элементов СК, моноклональными антителами мыши против белка MLH1 человека и антителами человека против центромерных белков ACA. Препараты отмывали и инкубировали с антителами осла против иммуноглобулинов кролика, конъюгированными с флуоресцентной меткой Cy3, антителами козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с флуоресцентной меткой FITC и антителами козы против иммуноглобулинов человека, конъюгированными с флуоресцентной меткой FITC, или антителами козы против иммуноглобулинов человека, конъюгированными с флуоресцентной меткой AMCA. Препараты отмывали в PBS, высушивали и наносили раствор антифэйда с красителем (Vectashield with DAPI) для окрашивания ДНК и предотвращения гашения флуоресценции.

Анализ и обработка изображений. Микроскопический анализ проводили в центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН. Препараты анализировали на микроскопе Axioplan 2 (ZEISS, Германия) снабженном CCD видеокамерой (CV M300, JAI Corporation, Япония), набором комплектов фильтров CHROMA и программным обеспечением ISIS4 (MetaSystems GmbH, Германия). Яркость и контраст изображений редактировали с использованием пакета PaintShopPro Photo X3.

Позицию центромеры в каждом биваленте определяли по положению флуоресцентного сигнала ACA. Регистрировали расстояния между точками локализации MLH1 и центромерами. Для анализа отбирали ядра сперматоцитов на стадии пахитены, содержащих полные наборы полностью синаптированных аутосомных бивалентов и XY-бивалент. Учитывали количество и положение сигналов MLH1 на каждом биваленте. Статистические расчеты производили с использованием пакета программ Free Statistics Software, Office for Research Development and Education, version 1.1.23-r7, http://www.wessa.net/. Все данные в тексте и таблицах представлены в виде средних значений и стандартных отклонений (M ± SD).

результаты

Рекомбинационные характеристики аутосом

Домашняя собака (Canis familiaris). Кариотип собаки состоит из 38 пар акроцентрических аутосом и XY половых хромосом (Рис. 1а). Нами было проанализировано 124 сперматоцита от 3 особей. Всего было локализовано 4959 сайтов рекомбинации вдоль 4712 индивидуальных аутосом. Средняя общая длина СК аутосомных бивалентов составила 246.0 ± 21.5 мкм. Это хорошо согласуется с данными, полученными другими авторами (Peterson et al., 1994). Среднее число сигналов MLH1 в аутосомных бивалентах составило 40.0 ± 1.4.

Мы не обнаружили достоверных различий в количестве сигналов MLH1 на клетку между особями (F2, 121 = 0.4, P = 0.69). Чтобы оценить общий размер генетической карты аутосом собаки в сантиморганах (сМ), умножили среднее число обменов (сигналов MLH1) на 50 единиц измерения карты (каждый кроссинговер соответствует 50 сМ).

Рис. 1. Сперматоциты домашней собаки (а), американской норки (б) и красной лисицы (в) на стадии пахитены после окрашивания DAPI (синий сигнал) и после иммуноокрашивания с использованием антител к белкам SCP3 (красный сигнал), MLH1 и центромерным белкам (зеленый сигнал). Сигналы центромер отличаются от сигналов MLH1 большей яркостью и более диффузным окрашиванием. Стрелками обозначены центромеры Х и Y хромосом. Масштаб: 5 мкм. Длина аутосомной карты собаки составила 2000 cM. Эта оценка хорошо согласуется с последними данными, полученными при генетическом картировании (1910 cM; Wong, et al., 2010). Такое хорошее соответствие данных, полученных нами с помощью MLH1 картирования, с данными, полученными при генетическом картировании, подтверждает надежность использованного нами подхода. Рис. 2 показывает распределение точек MLH1 по бивалентам, сгруппированным по их длине. Для первого бивалента характерно бимодальное распределение с главным пиком вблизи дистального конца и дополнительным пиком, расположенным в проксимальной части бивалента. Большие биваленты также демонстрируют пики на дистальных концах, но имеют довольно равномерное распределение сайтов MLH1 по плечам. В остальных бивалентах (8-38) наблюдается постепенное уменьшение частоты сигналов MLH1 от теломеры к центромере. Таким образом, все биваленты, несмотря на индивидуальные особенности, демонстрируют четко выраженные теломерные пики и снижение плотности обменов вблизи центромеры. Почти все сайты MLH1, отмеченные вблизи центромеры на больших бивалентах, были обнаружены у бивалентов, имеющих два обмена. По всей видимости, обмены, находящиеся в проксимальной части бивалента, оттесняются к центромере обменами, возникшими в дистальной части бивалента. Можно полагать, что пик в проксимальном районе бивалента 1 собаки объясняется интерференцией обменов, расположенных в дистальном районе бивалента. Среднее расстояние между соседними сигналами MLH1 на бивалентах с 1-ого по 7-ой, содержащих по два сигнала (N = 115), составило 60 ± 22 % от длины бивалента. Это расстояние оказалось в два раза больше ожидаемого в отсутствие интерференции.
	Рис. 2. Распределение сайтов локализации MLH1 по бивалентам собаки. По оси X отложено относительное расстояние сайтов от центромеры (цена деления – 10% длины бивалента), по оси Y – частота бивалентов, имеющих сайты MLH1 в данном интервале. Синие столбцы – биваленты, имеющие 1 сайт MLH1 на плечо, красные – биваленты с 2 сайтами MLH1 на плечо.

Американская норка (Mustela vison). Кариотип американской норки состоит из 13 пар метацентрических и субметацентрических аутосом, пары небольших акроцентрических аутосом и пары метацентрических половых хромосом. На препаратах распластанных сперматоцитов мы можем надежно идентифицировать только хромосому 1 (самую большую хромосому) и хромосому 14 (единственную акроцентрическую хромосому в кариотипе) (Рис. 1б). Нами проанализировано 130 клеток, на стадии пахитены выделенных из семенников 5 животных (Рис. 1б). Всего было локализовано 3320 сайта рекомбинации вдоль 1820 индивидуальных аутосом. Средняя общая длина СК аутосомных бивалентов у норки составила 161.4 ± 22.0. Среднее число точек локализации MLH1 составило 25.5 ± 1.9. Общая длина генетической карты аутосом американской норки составила 1277 cM. Это хорошо согласуется с оценкой Anistoroaei et al. (2009), полученной при картировании 157 маркеров 1340 cM. Таким образом, у норки, как и у собаки, получено хорошее соответствие данных генетического и MLH1 картирования.

Мы составили график распределения точек MLH1 для 130 бивалентов 1 и 130 бивалентов 14, а также 1560 не идентифицированных метацентрических бивалентов (Рис. 3). Во всех бивалентах мы наблюдали четко выраженные теломерные пики и снижение плотности обменов вблизи центромеры. Такой паттерн распределения обменов характерен для всех млекопитающих, изученных на сегодняшний день (Anderson et al., 1999; Sun et al., 2004; Borodin et al., 2007, 2008). Эффект поляризации обменов в метацентрических хромосомах был выражен значительно сильнее, чем в акроцентрических (Рис. 3). Так, длина четырех наиболее дистальных участков (по 2 на каждом плече) первого бивалента норки составляет 84 cM и занимает всего 20% его физического размера, но на них приходится 70% длины генетической карты. Этот факт свидетельствует о том, что аллели генов, расположенные в проксимальных районах метацентрических хромосом, демонстрируют более значительное неравновесие по сцеплению, нежели аллели генов, находящиеся в теломерных районах бивалентов.

Рис. 3. Распределение сайтов локализации MLH1 по бивалентам норки: бивалент 1 (А), 14 (Б), остальные биваленты (В). Обозначения те же, что и на рис. 2.

Мы измерили дистанции между соседними сайтами MLH1 на 137 бивалентах, содержащих по два сайта MLH1 на одном плече. Среднее расстояние между соседними сайтами MLH1 составило 47 ± 2 % от длины плеча и оказалось больше ожидаемого в отсутствие интерференции. При этом кроссоверная интерференция в хромосомах норки выражена несколько слабее, чем в хромосомах собаки.

Красная лисица (Vulpes vulpes). Кариотип лисицы содержит 16 пар метацентрических и субметацентрических аутосом и пару половых хромосом, а также варьирующее число добавочных акроцентрических В-хромосом (0-10). В-хромосомы отличаются от хромосом основного набора по размеру. Средняя длина СК В-хромосом лисицы составила 1.67 ± 0.47 мкм, то есть почти в 6 раз меньше, чем средний размер самого маленького бивалента А-хромосом (10.6 ± 0.5 мкм) (Рис. 1в). Мы исследовали 427 сперматоцитов у 12 самцов лисиц: 6 из доместицируемой популяции и 6 из неселекционируемой популяции. Было картировано 12620 точек кроссинговера на 6832 аутосомах лисицы и 488 точек на 767 добавочных хромосомах. Средняя общая длина СК аутосомных бивалентов лисицы составила 210.7 ± 21.2 мкм. Среднее число сигналов MLH1 всех аутосом составило 29.6 ± 2.4. Мы обнаружили достоверные различия в количестве сигналов MLH1 на клетку между особями (F11,489 = 17.7, P < 0.001). Однако мы не обнаружили достоверных различий по среднему числу сигналов MLH1 между группами лисиц из доместицируемой (29.1± 2.6) и неселекционируемой (30.0 ± 2.2) популяций (F1,489 =0.14, P=0.7)

Длина генетической карты аутосом была оценена как 1480 сМ. Здесь, как и в случае видов, описанных выше, мы получили хорошее соответствие с результатами генетического картирования. Оценка длины карты, полученной на основе картирования 320 маркеров, составляла 1480.2 cM (Kukekova et al., 2007). Физический размер генома лисицы равен 2850 Мб (Wurster-Hill, 1988). На основе полученной нами цитологической оценки рекомбинационной длины генома мы можем оценить интенсивность рекомбинации у данного вида как 0.54 сМ/ Мб. Это значение ниже, чем полученная нами оценка интенсивности рекомбинации у собаки (0.78 cM/ Мб), но выше, чем значение, полученное для норки (0.48 cM/ Мб). Для исследования распределения сайтов MLH1 по бивалентам мы разбили 16 А-бивалентов лисицы на 4 размерные группы. Для каждой группы и для всех В-хромосом были составлены графики (Рис. 4).

Рис. 4. Распределение сайтов локализации MLH1 по бивалентам лисицы. Обозначения те же, что и на рис. 2.

Все биваленты демонстрируют выраженные теломерные пики и снижение плотности обменов вблизи центромеры. В метацентрических бивалентах лисицы перицентромерное подавление рекомбинации было более выраженным, чем в акроцентрических бивалентах собаки. Мы измерили расстояние между соседними сигналами MLH1 на бивалентах, содержащих по два сигнала (N = 128) в пределах одного плеча. Среднее расстояние составило 49.0 ± 1.8 %. Это значение, которое можно рассматривать как оценку кроссоверной интерференции, близко к значению, полученному нами для норки, и ниже оценки, полученной для собаки.

Мы обратили особое внимание на рекомбинацию в В-хромосомах. Нами был обнаружен одиночный сайт MLH1 на 61% линейных синаптических конфигураций В-хромосом. Большинство тривалентов содержали один сайт MLH1, который обычно располагался в районе переключения партнеров спаривания. Мы не обнаружили корреляции между числом синаптических конфигураций В-хромосом и числом сайтов MLH1 на А-аутосомах (r = 0.01, p>0.05). Распределение по бивалентам В-хромосом точно соответствовало тому, что наблюдалось на хромосомах основного набора: высокая частота сигналов в дистальной части бивалентов и постепенное снижение частоты обменов в области центромеры (Рис. 4).

Полевки подсемейства Arvicolinae. Мы проанализировали 1691 сперматоцитов, выделенных из семенников 34 самцов, представляющих 14 видов полевок подсемейства Arvicolinae. Рекомбинационные характеристики аутосом этих видов приведены в таблице 1.

Исследованные нами виды полевок различаются по частоте рекомбинации. Наиболее низкая частота кроссинговера обнаружена у Microtus brandtii (16.4± 0.6 точек рекомбинации на клетку), наиболее высокая у Myodes glareolus (29.8± 1.6). В целом, среднее число рекомбинационных событий на клетку у исследованных видов лишь незначительно превышало гаплоидное число аутосом. Среднее число сайтов MLH1на хромосому было равно 1.1. Примечательно, что у большинства видов (10 из 14) число рекомбинационных событий на клетку было ниже гаплоидного числа плеч аутосом. Это показывает, что распространенное убеждение о необходимости наличия хотя бы одной хиазмы на плечо (Pardo-Manuel de Villena and Sapienza, 2001) не подтверждается фактами, по крайней мере, на млекопитающих. Довольно высокий процент безобменных плеч был обнаружен при анализе рекомбинации у обыкновенной бурозубки и человека (Sun et al., 2006; Borodin et al., 2008).

Совпадение числа рекомбинационных событий на клетку и гаплоидного числа хромосом у исследованных видов показывает, что функция рекомбинации у полевок сводится к образованию в среднем одной хиазмы на бивалент, необходимой и достаточной для нормальной сегрегации гомологов.

Синапсис и рекомбинация половых хромосом млекопитающих. Х и Y хромосомы исследованных нами видов хищных млекопитающих были весьма сходны по своему поведению в профазе I мейоза у самцов. Они сближались в зиготене и образовывали СК между терминальными районами.

У собаки синапсис наблюдался между концом Xp плеча и почти всем Yq плечом (Рис. 1а). Этот факт хорошо согласуется с локализацией псевдоаутосомного района на половых хромосомах собаки, установленной с использованием ДНК-проб (Toder et al., 1997). Мы обнаружили единичный сигнал MLH1 в районе спаривания X-Y (Рис. 3). Этот сигнал, как правило, локализовался очень близко к теломерным районам Xp-Yq плеч.

У американской норки район синапсиса был также локализован на дистальных концах Xp и Yq плеч. Мы наблюдали сигналы MLH1 в районе спаривания X и Y хромосом в большинстве исследованных клеток. Нам не удалось оценить длину района спаривания, так как на стадии средней и поздней пахитены половые хромосомы норки довольно сильно конденсируются, переплетаются, формируя плотное половое тельце, и становятся плохо различимыми. (Рис. 1б). У красной лисицы Yq плечо было тесно связано с Xp плечом по всей длине. Мы наблюдали одиночный сигнал MLH1 в районе спаривания X-Y в 80% анализируемых клеток, обычно он располагался очень близко к теломерам Xp-Yq плеч (Рис. 1в).

У полевок подсемейства Arvicolinae известно два типа поведения X и Y в профазе мейоза самцов – синаптический и асинаптический. Мы впервые установили, что к синаптическому типу относятся такие виды, как Lagurus lagurus, Eоlagurus luteus, Microtus fortis (ранее данный вид был ошибочно отнесен к асинаптическому типу), M. maximowiczii, M. mujanensis. Мы также подтвердили принадлежность к этому типу таких видов, как Myodes rutilus, Myodes glareolus и M. mandarinus. Половые хромосомы данных видов демонстрировали поведение, типичное для половых хромосом большинства млекопитающих. Они сближались в зиготене и образовывали синаптонемный комплекс между дистальным прителомерным районом Х хромосомы и всем коротким плечом Y хромосомы. Хотя размер района спаривания был очень мал у всех исследованных видов (менее 1 мкм), в нем в 70 - 80% клеток мы наблюдали одиночные сигналы MLH1 (Рис. 5).

Рис. 5. Электронная (а) и иммунофлуоресцентная (б) микрофотографии XY бивалента M. mandarinus. СК – красный сигнал, MLH1 – зеленый, центромеры – синий. Стрелками показаны центромеры X и Y хромосом.

Из перечисленных видов M. mandarinus продемонстрировал наиболее необычный характер синапсиса и рекомбинации половых хромосом. Самцы, использованные в данном исследовании, имели метацентрические Х хромосомы и телоцентрические Y хромосомы. В половине пахитеннных клеток мы наблюдали синапсис между проксимальной частью Y хромосомы и дистальной частью Xp. Такие XY биваленты обычно содержали одиночные сигналы MLH1 очень близко к центромере Y хромосомы. Двадцать процентов клеток содержали кольцевой XY бивалент с двумя явными районами спаривания примерно одинакового размера, один между проксимальной частью Y хромосомы и дистальной частью Xp, другой между дистальными частями Yи Xq (Рис. 5а). К нашему удивлению, второй район спаривания часто содержал сайт связывания MLH1 (Рис. 5б). Мы также наблюдали клетки с неспаренными X и Y хромосомами.

Асинапсис половых хромосом в профазе мужского мейоза мы впервые обнаружили у M. gregalis, M. brandtii и M. juldaschi и подтвердили у M. levis, M. arvalis arvalis и M. arvalis obscurus. Половые хромосомы перечисленных выше видов сближались на стадии зиготены, совместно перемещались на периферию ядра, образуя половое тельце, но не вступали ни в синапсис, ни в рекомбинацию.

ОБСУЖДЕНИЕ

Клеточные механизмы, определяющие число и распределение сайтов рекомбинации в аутосомах млекопитающих. В результате проведенного нами сравнительного иммуно-флуоресцентного анализа были впервые получены точные оценки общего числа рекомбинационных обменов для трех видов хищных млекопитающих и 14 видов грызунов. Мы провели мета-анализ этих результатов с использованием данных, полученных тем же методом на других 19 видах млекопитающих (Таб. 1). Это позволило выявить основные клеточные механизмы, ответственные за формирование межвидовых различий по уровню рекомбинации.

Поскольку полевки подсемейства Arvicolinae составляют 40% из этого списка, мы анализировали их отдельно.

У полевок и остальных млекопитающих такие особенности организации генома, как число хромосом (2n), число плеч аутосом (2Fna) и общая длина СК определяют 94% и 77% изменчивости по уровню рекомбинации соответственно (P<0.001). Однако относительный вклад этих параметров оказался разным. У полевок основным детерминантом уровня рекомбинации было число хромосом, в то время как у всех остальных млекопитающих число плеч аутосом (Табл. 2).

Гаплоидное число хромосом определяет нижний предел общего числа рекомбинаций на клетку. Наличие, по крайней мере, одного кроссинговера на бивалент гарантирует нормальную сегрегацию гомологов. Число множественных кроссоверов на плечо хромосомы ограничено кроссоверной интерференцией. Таким образом, интерференцию можно рассматривать как клеточный механизм, контролирующий верхний предел уровня рекомбинации (Falque et al., 2007). Наш анализ интерференции у хищных выявил существенные межвидовые отличия по силе интерференции.

Мы полагаем, что этот фактор может вносить существенный вклад в межвидовые различия в уровне рекомбинации.

Таблица 1. Межвидовые различия млекопитающих по общему уровню рекомбинации в аутосомах

Отряд	Вид	Среднее (± дисперсия) число кроссинговеров на клетку		Источник
Insectivora	Sorex araneus		21.9		1
	S. minutus		30.0		2
Carnivora	Canis familiaris		40.0±1.4		3
	Vulpes vulpes		29.6±2.4		4
	Mustela vison		25.5 ±1.9		5
	Felis catus		42.5		6
Cetartiodactyla	Bos taurus		42.0		7
	Connochaetes gnou		42.0		8
	Tragelaphus imberbis		46.0		8
	Muntiacus reevesi		29.8		9
Perissodactyla	Equus ferus		52.0		10
Primates	Homo sapiens		49.8		11
	Macaca mulatta		39.0		12
	Cebus paraguayanus		43.2		13
Rodentia	Rattus norvegicus		34.5		14
	Peromyscus maniculatus		23.7		14
	Mus caroli		29.7		14
	M. castaneus		21.8		14
	M. spicilegus		24.2		14
	Mus domesticus Mus musculus		22.9 28.5		14 14
	Myodes rutilus		28.9±1.5		15
	M. glareolus		29.8±1.6		15
	Lagurus lagurus		28.2±1.5		15
	Eolagurus luteus		28.8±1.4		15
	Microtus gregalis		18.0±1.1		16
	Microtus. brandtii		16.4±0.6		15
	M. mandarinus		24.4±1.1		15
	M. fortis		27.7±2.0		15
	M. maximowiczii		22.3±1.3		16
	M. mujanensis		20.9±1.3		16
	M. juldaschi		26.9±0.9		15
	M. levis		28.6±2.2		16
	M. arvalis arvalis		27.6±1.2		15
	M. arvalis obscurus		26.5±1.0		15
	M. pennsylvanicus		28.9		14

1 Borodin et al., 2008, 2 Бородин, неопубл. данные, 3 Basheva et al., 2008, 4 Basheva et al., 2010, 5 Borodin, Basheva et al., 2009, 6 Бородин и др., 2008, 7 Hart et al., 2008, 8 Vozdova, Rubes, 2010, 9 Yang et al., 2011, 10 Baumann et al., 2011, 11 Sun et al., 2005, 12 Hassold et al., 2009, 13 Garcia-Cruz et al., 2009, 14 Dumont and Payseur, 2010, 15 данная работа, 16 Бородин, Башева и др., 2010.

Например, у кошки при меньшем 2n, меньшем 2Fna и более коротком СК, но более слабой интерференции, чем у собаки, наблюдается более высокое число кроссоверов на клетку (t178 = 15.4, P < 0.001).

Изменение силы интерференции под действием отбора может служить механизмом адаптивных мелких изменений уровня рекомбинации в дополнение к таким механизмам сильных изменений, как фиксация хромосомных перестроек, меняющих 2n и 2Fna (центрических и тандемных слияний и разделений, перицентрических инверсий и смещений центромер). У большинства млекопитающих интерференция действует в пределах плеча и ослабляется при переходе за центромеру. Поэтому у них образуется, по меньшей мере, один обмен на плечо и наблюдается высокая корреляция между 2Fna и общим числом обменов. У полевок интерференция настолько сильна, что возникновение обмена на одном плече предотвращает образование еще одного обмена на другом.

Таблица 2. Результаты множественного регрессионного анализа факторов, влияющих на число кроссинговеров на клетку
	Коэффициенты регрессии (b±s.d)
Выборка	2n	2Fna	Длина СК
Полевки (N=15)	0.43±0.06*	0.06±0.04	0.04±0.02
Другие млекопитающие (N=21)	-0.03±0.13	0.36±0.09*	0.09±0.03*

*- P<0.001

Биологический смысл межвидовых различий по уровню рекомбинации в аутосомах млекопитающих. Было предпринято несколько попыток связать общую частоту рекомбинации с экологическими характеристиками и образом жизни разных видов млекопитающих. Наиболее интересным было тестирование двух гипотез: Красной королевы и конкуренции сибсов (Burt, Bell, 1987).

Согласно первой гипотезе, уровень рекомбинации должен быть тем больше, чем больше время смены поколений. Если поколения сменяются через короткое время (несколько месяцев), то высока вероятность, что потомки живут в тех же условиях, что и их родители и, следовательно, родительские комбинации аллелей сохраняют адаптивные преимущества. Если же разрыв между поколениями составляет несколько лет, то потомки оказываются в несколько ином мире, с иными критериями приспособленности. В таком случае новые комбинации аллелей могут оказаться лучше старых. Согласно второй гипотезе, уровень рекомбинации должен быть пропорционален числу потомков. Чем он больше, тем больше они должны различаться, чтобы избежать конкуренции друг с другом.

Анализ, проведенный Бартом и Бэллом (Burt, Bell, 1987) показал, что превышение числа хиазм над гаплоидным числом хромосом не коррелирует со средним размером помета, и демонстрирует высокую положительную корреляцию с временем смены поколений. На основании этих данных авторы отвергли гипотезу конкуренции сибсов и подтвердили справедливость гипотезы Красной королевы.

С использованием множественного регрессионного анализа мы поверили эти гипотезы на выборке видов, представленных в табл. 1. На выборке из 15 видов полевок мы не обнаружили связи исследуемого признака ни со временем смены поколений, ни с уровнем плодовитости. У всех исследованных нами видов полевок число обменов на клетку практически совпадало с гаплоидным числом хромосом, то есть было минимально достаточным для нормального расхождения хромосом. Поскольку эти виды характеризуются быстрой сменой поколений, отбор был, по-видимому, направлен на консервацию адаптивных аллельных комбинаций и уменьшение комбинативной изменчивости. Это было достигнуто как за счет увеличения интерференции, так и за счет накопления перестроек, уменьшающих число хромосом – Робертсоновских и тандемных слияний (Lemskaya et al., 2009).

У всех остальных млекопитающих, включенных в мета-анализ (21 вид), мы обнаружили высоко достоверную положительную связь между временем смены поколений и превышением числа кроссоверов над гаплоидным числом хромосом (Табл. 4). Связь этого показателя с размером помета была не значимой. Таким образом, мы подтвердили применимость гипотезы Красной королевы для объяснения межвидовых различий в уровне рекомбинации у большинства млекопитающих. По-видимому, при увеличении времени смены поколений отбор приводил к повышению уровня рекомбинации. При этом само повышение уровня рекомбинации могло достигаться за счет снижения интерференции.

Таблица 4. Результаты множественного регрессионного анализа факторов жизненной истории, влияющих на превышение числа кроссинговеров над гаплоидным числом хромосом.
	Коэффициенты регрессии (b±s.d)
Выборка	Время смены поколений (log мес.)	Размер помета
Полевки (N=15)	-3.62±3.74	-0.03±0.21
Другие млекопитающие (N=21)	7.56±2.82*	-0.66±0.76

*- P<0.001

Эволюция синапсиса и рекомбинации в половых хромосомах. В результате данной работы был существенно расширен список как синаптических, так и асиптических видов подсемейства Arvicolinae. Ранее регулярный асинапсис половых хромосом в профазе мужского мейоза был обнаружен у многих видов рода Microtus: у всех исследованных представителей подродов Microtus, Agricola, Blanfordimys Sumeriomys и Terricola (Ashley et al., 1989; Borodin et al., 1995; Megias-Nogales et al., 2003). Некоторое время считалось, что асинапсис половых хромосом это свойство всего рода Microtus. Однако затем было показано, что у самцов M. oeconomus и двух родственных видов, принадлежащих к азиатской филогенетической линии, наблюдается нормальный синапсис половых хромосом (Ashley, 1994; Borodin et al., 1995; Borodin et al., 1997; Mekada et al., 2001); оставалось неизвестным, происходит ли при этом рекомбинация. Исследованные нами M. fortis, M. mujanensis и M. maximowiczii также принадлежат к данной линии (Jaarola et al., 2004), и поэтому не удивительно, что мы обнаружили у них нормальное спаривание Х и Y хромосом. Более того, мы впервые показали, что у данных видов половые хромосомы рекомбинируют в районе спаривания. Мы также обнаружили нормальный синапсис и рекомбинацию между половыми хромосомами у Lagurus lagurus и Eolagurus luteus.

Эти факты можно было бы рассматривать как подтверждение высказанной ранее гипотезы о том, что нормальный синапсис, присущий полевкам азиатской филогенетической линии, является предковым свойством, присущим всем остальным представителям подсемейства Arvicolinae, а утрата этого свойства произошла у общего предка всех остальных представителей рода Microtus (Borodin et al., 1995; Borodin et al., 1997). Однако, обнаружение асинапсиса у M. gregalis и Microtus brandtii ставит эту гипотезу под сомнение. Большинство специалистов полагают, что данные виды занимают базальное положение в роде Microtus (Jaarola et al., 2004). Это заставляет нас отказаться от гипотезы об однократном, монофилететическом возникновении асинапсиса половых хромосом у «асинаптических» видов рода Microtus. По-видимому, механизм нерекомбинационного сближения и ахиазматического расхождения X и Y хромосом возник у общего предка целой группы родов подсемейства Arvicolinae. Это создало предпосылки для дальнейшей параллельной и независимой утраты синапсиса половых хромосом в разных филогенетических линиях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены точные оценки общего числа рекомбинационных обменов на клетку для трех видов хищных млекопитающих и 14 видов грызунов.
2. С помощью мета-анализа показано, что число рекомбинационных обменов на клетку положительно коррелирует с числом хромосом у 14 видов полевок и числом хромосомных плеч у 21 вида млекопитающих.
3. Обнаружена высокая положительная корреляция между превышением числа рекомбинационных обменов над гаплоидным числом хромосом и временем смены поколений у всех включенных в мета-анализ млекопитающих, за исключением полевок.
4. Впервые установлено, что В-хромосомы лисицы вовлекаются в процесс рекомбинации.
5. Анализ синапсиса и рекомбинации половых хромосом серых полевок в контексте их филогении впервые позволил установить, что утрата способности к синапсису в ходе мужского мейоза произошла независимо и параллельно в нескольких филогенетических линиях.

Список статей по теме диссертации, опубликованных в рецензируемых журналах:

1. Бородин П.М., Башева Е.А., Белоногова Н.М., Торгашева А.А. Рекомбинация и эволюция // Вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. №1/2. С. 197-205.
2. Basheva E.A., Bidau C.J., Borodin P.M. General pattern of meiotic recombination in male dogs estimated by MLH1 and RAD51 immunolocalization // Chromosome Res. 2008. V. 16. P.709-719.
3. Borodin P.M., Basheva E.A., Zhelezova A.I. Immunocytological analysis of meiotic recombination in the American mink (Mustela vison) // Anim. Genet. 2009. V. 40.  P. 235-238.
4. Бородин П.М., Башева Е.А., Голенищев Ф.Н., Дашкевич О.А., Картавцева И.Н., Потапов М.А., Сакаева Г.Р., Торгашева А.А., Фрисман Л.В. Иммунофлуоресцентный и электронно-микроскопический анализ спаривания и рекомбинации хромосом в мейозе четырех видов полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia) // Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 1. С. 89-95.
5. Basheva E.A., Torgasheva A.A., Sakaeva G.R., Bidau C., Borodin P.M. A- and B-chromosome pairing and recombination in male meiosis of the silver fox (Vulpes vulpes L., 1758, Carnivora, Canidae) // Chromosome Res. 2010. V. 18. P. 689-696.
6. Бородин П.М., Башева Е.А., Торгашева А.А., Голенищев Ф.Н., Картавцева И.В. Синапсис и рекомбинация хромосом у муйской полевки (Microtus mujanensis) // Вестник НГУ. 2010. Т. 8. № 3. С.124-130.
7. Borodin P.M., Basheva E.A., Dashkevich O.A., Golenishchev F.N., Kartavtseva I.V. X-Y Chromosome Synapsis and Recombination in 3 Vole Species of Asian Lineage of the Genus Microtus (Rodentia: Arvicolinae) // Cytogenetic and Genome Res. 2011. V. 132. P. 129–133.
8. Borodin P.M., Basheva E.A., Torgasheva A.A., Dashkevich O.A., Golenishchev F.N., Kartavtseva I.V., Mekada K., Dumont B.L. Multiple independent evolutionary losses of XY pairing at meiosis in the gray voles // Chromosome Res. 2011. DOI 10.1007/s10577-011-9261-0