Комплекс методов исследования nk-клеток в норме и при патологии
На правах рукописи
МУРУГИН
ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ
КОМПЛЕКС МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ NK-КЛЕТОК В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ
03.03.03 – иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва, 2012 г.
Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.
| Научный руководитель: | Пащенков Михаил Владимирович кандидат медицинских наук. |
| Официальные оппоненты: | Яздовский Виктор Владимирович доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского. |
| Чекнев Сергей Борисович доктор медицинских наук, заведующий лабораторией, ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России. | |
| Ведущая организация: | ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора. |
Защита состоится 24 октября 2012 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций - Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу:
115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.
Автореферат разослан 20 сентября 2012 г.
Ученый секретарь
Совета по защите докторских и
кандидатских диссертаций
доктор медицинских наук Сеславина Лия Сергеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. NK-клетки являются важной составляющей иммунной системы; они играют важнейшую роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете. Нарушения функционирования NK-клеток лежат в основе патогенеза многих первичных и вторичных иммунодефицитов. Поэтому выявление функциональных дефектов NK-клеток позволит более детально оценить их вклад в патогенез этих заболеваний.
В настоящее время в лабораторной практике широко применяется только один стандартный метод оценки функциональной активности NK-клеток - тест на NK-активность фракции мононуклеарных клеток (МНК) по киллингу MHC-I-негативных клеток-мишеней. В то же время NK-активность определяется целым рядом параметров: процентным содержанием NK-клеток среди МНК, содержанием в литических гранулах NK-клеток перфорина и гранзимов, способность NK-клеток дегранулировать (т.е. высвобождать перфорин и гранзимы из гранул). Все эти параметры могут быть связаны с патогенезом заболеваний и имеют большую клиническую значимость.
В связи с этим разработка комплекса методов исследования NK-клеток, позволяющего оценить все эти параметры, является чрезвычайно актуальной задачей. Методологической основой данного комплекса методов является проточная цитометрия. Применение этого комплекса для обследования пациентов с первичными иммунодефицитами и инфекционными заболеваниями может быть использовано для совершенствования схем диагностики и лечения.
Цель работы. Разработка и применение комплекса методов исследования NK-клеток у здоровых лиц, при вирусных инфекциях и первичных иммунодефицитах.
Задачи
- Отработать методики оценки NK-активности, процентного содержания NK-клеток среди МНК, содержания литических гранул и внутриклеточного перфорина в NK-клетках, дегрануляции NK-клеток по экстернализации CD107a с помощью проточной цитометрии.
- Уточнить значимость CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток.
- Оценить применимость маркера CD63 для оценки дегрануляции NK-клеток.
- Применить комплекс методов, перечисленных в п.1, для исследования функций NK-клеток у здоровых лиц. Получить нормативные показатели. Проанализировать корреляционные связи между отдельными параметрами системы NK-клеток.
- Используя разработанный комплекс методов, оценить состояние системы NK-клеток при первичных иммунодефицитах (синдром Вискотта-Олдрича (СВО), хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ)), часто рецидивирующем герпесе (ЧРГ), а также у лиц пожилого возраста.
- Провести фенотипический анализ дегранулирующей субпопуляции NK-клеток.
Научная новизна. NK-клетки играют важную роль в защите от вирусных инфекций и злокачественных опухолей, а также в патогенезе ряда первичных и вторичных иммунодефицитов. Однако адекватная оценка функции NK-клеток в клинических условиях затруднена из-за отсутствия необходимой методологической базы. Научная значимость данной работы состоит в том, что впервые разработан и результативно применен методологический подход, позволяющий комплексно оценить ключевые функциональные параметры NK-клеток. Это позволило уточнить вклад NK-клеток в патогенез некоторых первичных и вторичных иммунодефицитов. Получен ряд обладающих новизной результатов.
Так, впервые прямо показан дефект дегрануляции NK-клеток у детей с первичным иммунодефицитом - синдромом Вискотта-Олдрича, что сопровождается снижением NK-активности при нормальном внутриклеточном содержании CD107a и перфорина в NK-клетках. Впервые показано отсутствие значимых нарушений дегрануляции NK-клеток и NK-активности у детей с хронической гранулематозной болезнью.
Также впервые обнаружен дефект дегрануляции NK-клеток у больных с часто рецидивирующим герпесом, наблюдающийся независимо от стадии заболевания (обострение или ремиссия).
Впервые обнаружено снижение дегрануляции NK-клеток у лиц пожилого возраста по сравнению с молодыми донорами. Нарушение дегрануляции NK-клеток у пожилых лиц не сопровождается снижением NK-активности и внутриклеточного содержания CD107a в NK-клетках.
Кроме того, в работе впервые показано, что CD107a является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции, чем CD63. Подтверждено, что CD107a является адекватным маркером дегрануляции NK-клеток.
Разработанный комплекс методов позволяет принимать более обдуманные решения по диагностике и тактике лечения первичных и вторичных иммунодефицитов, сопровождающихся нарушением функции NK-клеток. Результаты, полученные с помощью этого комплекса методов, дают возможность предположить локализацию генетического дефекта у пациентов с первичными иммунодефицитами и, таким образом, определить направление генотипирования. При вторичных иммунодефицитах результаты комплексного исследования NK-клеток могут учитываться при выборе терапии, направленной на коррекцию функциональных нарушений NK-клеток.
Практическая значимость. В работе подтверждено, что разработанный комплекс методов обладает клинической значимостью в оценке функции NK-клеток при первичных иммунодефицитах и вирусных инфекциях.
Методы, входящие в комплекс, дают возможность установить причину нарушения функции NK-клеток (снижение процентного содержания NK-клеток среди мононуклеаров, снижение способности NK-клеток к дегрануляции, снижение экспрессии цитотоксических белков NK-клетками). В зависимости от результатов исследования может проводиться целенаправленная диагностика, а также лечение, направленное на коррекцию выявленных нарушений. Разработанный комплекс методов исследования NK-клеток может применяться в лабораториях клинической иммунологии для выявления функциональных дефектов в системе NK-клеток при первичных и вторичных иммунодефицитах.
Кроме того, методологическая база, примененная в данной работе, может служить основой для дальнейшего расширения комплекса методов исследования NK-клеток, в который может быть включено исследование экспрессии цитокинов при активации NK-клеток, а также исследование более широкого спектра цитотоксических белков.
Результаты диссертационной работы легли в основу методического пособия по оценке клеточного иммунитета.
Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе для студентов медицинских ВУЗов, в учебных программах повышения квалификации в системе последипломного образования.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Материалы исследований были представлены на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009) и XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 230 источников, и приложения. Работа содержит 36 таблиц и 19 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика обследованных групп. Возраст всех групп ниже представлен как медиана [10—90 процентили].
1. Группа пациентов с синдромом Вискотта-Олдрича — 15 мальчиков в возрасте 4 [1—14] лет, наблюдающихся в отделении иммунопатологии Детской городской клинической больницы №9 им. Г.Н.Сперанского г.Москвы (зав. отделением — профессор, д.м.н. А.П.Продеус). 8 пациентов на момент исследования получали иммуносупрессивную терапию.
2. Группа пациентов с хронической гранулематозной болезнью - 9 мальчиков в возрасте 9 [4—14] лет, наблюдавшихся в отделении клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы (зав. отделением — профессор, д.м.н. И.В.Кондратенко). 7 больных на момент исследования получали массивную антимикробную терапию.
3. Группа пациентов с часто рецидивирующим герпесом - 34 человека в возрасте 33 [24—50] лет, из них 11 мужчин и 23 женщины, наблюдавшихся в отделении аллергологии и иммунотерапии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (зав. отделением — профессор, д.м.н. А.Е.Шульженко). Большинство пациентов с ЧРГ имели генитальную локализацию высыпаний с частотой обострений от 2 до 6 в год. Подгруппа из 24 пациентов была исследована в динамике: в ходе обострения и во время ремиссии. Остальные 10 человек были исследованы только в обострении.
4. Три группы здоровых доноров, давших добровольное согласие на участие в исследовании:
- группа сравнения для детей с СВО и ХГБ — 28 доноров не старше 30 лет (возраст 25 [23—28] лет);
- группа сравнения для пациентов с ЧРГ — 56 здоровых доноров (возраст 27 [23—35] лет), из них 21 мужчина и 35 женщин. Эта группа включала в себя всех доноров первой группы. По возрастному и половому составу эта группа достоверно не отличалась от группы с ЧРГ;
- группа пожилых доноров — составили 15 человек (возраст 70 [67—77] лет), из них 10 мужчин и 5 женщин.
Исследование дегрануляции NK-клеток. Дегрануляцию NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии по экстернализации маркера CD107a после стимуляции in vitro. Использовали методику Alter et al. (2004) с модификациями. МНК выделяли из венозной крови на градиенте плотности фиколл-урографина, отмывали средой 199 (оба реагента ПанЭко, Россия) и ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), которая представляла собой RPMI-1640 (Панэко) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (РАА, Австрия) и 2 мМ L-глутамина (Sigma, США). В 96-луночные круглодонные планшеты вносили: моненсин (Sigma; конечная концентрация 10 мкМ), FITC-меченные антитела к CD107a (клон H4A3, BD Pharmingen, США; конечное разведение 1/200) и МНК (5105 клеток на лунку). В качестве индукторов дегрануляции NK-клеток использовали рецептор-зависимый стимул — клетки K562 (5105 клеток на лунку, соотношение эффектор:мишень = 1:1), а также рецептор-независимый стимул — форбол-12-миристат-13-ацетат + иономицин (ФМА+ИОН; конечные концентрации 100 нг/мл и 0,5 мкг/мл соответственно; оба Sigma). Максимальную дегрануляцию индуцировали ФМА+ИОН в комбинации с цитохалазином Б (ЦБ, Sigma, конечная концентрация 5 мкг/мл). В лунку отрицательного контроля вместо индукторов дегрануляции добавляли равный объем ПКС. Для контроля окраски на CD107a в еще одну контрольную лунку не добавляли антитела к CD107a.
Циклогексимид (ЦГ, Sigma, конечная концентрация 10 мкг/мл) добавляли к МНК за 15 мин до добавления индукторов дегрануляции.
После добавления всех ингредиентов содержимое лунок однократно перемешивали, после чего планшет центрифугировали для осаждения клеток и инкубировали 4 ч в СО2-инкубаторе (5% СО2, 37°С). Затем планшет еще раз центрифугировали, отбирали супернатант и ресуспендировали клетки в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, Панэко) с 0,02% азидом натрия и 0,02% ЭДТА для диссоциации клеточных агрегатов (5 мин, КТ). Затем клетки отмывали в ФСБ с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА, Панэко) и окрашивали PC5-меченными антителами к CD3 и PE-меченными антителами к CD56 (Beckman Coulter, США) для идентификации NK-клеток. Образцы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 с программным обеспечением CXP (все Beckman Coulter). NK-клетки идентифицировали как CD3–CD56+ лимфоциты. Рассчитывали процент CD107a+ NK-клеток по отношению ко всем NK-клеткам и ко всем МНК.
При исследовании фенотипа дегранулирующих NK-клеток докрашивание клеток после инкубации проводили PC5-меченными моноклональными антителами (МАТ) к CD3, PC7-меченными МАТ к CD56 и одним из следующих МАТ, меченных PE: CD8, CD57, CD94, CD159a, CD335 (все Beckman Coulter). При оценке CD63 в качестве маркера дегрануляции использовали PE-меченные МАТ к CD63 вместе с FITC-меченными МАТ к CD107a. После инкубации клетки докрашивали PC5-меченными МАТ к CD3 и PC7-меченными МАТ к CD56.
Исследование NK-активности. NK-активность МНК исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней K562, меченных CFSE (5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловый эфир, Molecular Probes, США). Для мечения клетки K562 (107/мл в ФСБ) инкубировали с CFSE (0,6 мкМ) в течение 10 мин в темноте при 37°C, после чего отмывали, ресуспендировали в ПКС и добавляли в 96-луночный круглодонный планшет по 8103 клеток на лунку. МНК добавляли к клеткам-мишеням так, чтобы соотношение эффектор:мишень (Э:М) составило 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1 и 3,125:1. Для контроля спонтанной гибели клеток-мишеней использовали лунки, куда вместо МНК добавляли ПКС. Планшет центрифугировали для осаждения клеток и инкубировали 4 ч в СО2-инкубаторе. Затем клетки ресуспендировали и окрашивали пропидий-йодидом (PI, Sigma, конечная концентрация 1 мкг/мл, 10 мин при КТ в темноте). Пробы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500; определяли процент погибших мишеней (PI++CFSE+ событий) по отношению ко всем CFSE+ событиям. Процент киллинга рассчитывали по формуле:
% погибших мишеней в опыте – % спонтанной гибели
% киллинга = ————————————————————————100%.
100% – % спонтанной гибели
Литическая единица-20 (ЛЕ20) — это количество МНК, необходимое для киллинга 20% мишеней K562. Количество ЛЕ20 на 105 МНК рассчитывали по формуле:
105
ЛЕ20 на 105 МНК = —————————,
8103Э:М20
где 8103 — количество мишеней на лунку; Э:М20 — соотношение Э:М, при котором киллинг составил бы 20%. Если 20%-ный киллинг не достигался при Э:М=50:1, то количество ЛЕ20 на 105 МНК приравнивали к 0.
Внутриклеточная окраска на CD107a и перфорин. Свежевыделенные МНК ресуспендировали в ФСБ c 0,5% БСА и окрашивали PC5-меченными МАТ к CD3 (1/50) и PE-меченными МАТ к CD56 (1/50). Затем клетки отмывали в ФСБ и фиксировали 4% параформальдегидом на ФСБ (15 мин., 4°C), после чего пермеабилизировали с помощью 0,1% сапонина на ФСБ с 0,5% БСА и окрашивали внутриклеточно антителами к CD107a и перфорину (разведение антител 1/100). В каждом опыте делали изотип-контроль внутриклеточной окраски, используя иммуноглобулины того же изотипа и метки, что и специфические антитела. Клетки анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500. Экспрессию внутриклеточных молекул представляли как средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) клеток при окраске специфическими антителами минус СИФ при окраске изотип-контролем.
Сочетанный анализ дегрануляции и внутриклеточной экспрессии перфорина и гранзима A. Чтобы оценить остаточные уровни перфорина и гранзима A в NK-клетках после дегрануляции, реакцию дегрануляции ставили с FITC-меченными МАТ к CD107a, докрашивали клетки PC5-меченными МАТ к CD3 и PC7-меченными МАТ к CD56, после чего фиксировали и пермеабилизировали. Внутриклеточную окраску проводили с помощью PE-меченных МАТ к гранзиму A и перфорину (оба 1/50). Клетки отмывали и анализировали на цитометре Cytomics FC500 как описано выше.
Статистическая обработка результатов. Использовали программы GraphPad Instat 3.06 и Statsoft Statistica 6.0. Все данные представляли как медиана (10-й — 90-й процентиль). Если в группе было менее 10 измерений, то вместо 10-го и 90-го процентилей указывали минимум и максимум группы. Две группы сравнивали при помощи U-теста Манна-Уитни. Три группы сравнивали с помощью теста Крускала-Уоллиса; при получении в этом тесте значения p<0,05 проводили попарное сравнение групп с помощью U-теста Манна-Уитни. Парные измерения сравнивали с помощью теста Уилкоксона. Корреляции оценивали с помощью критерия Пирсона. Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05. Корреляции считали слабыми при |r|<0,4, средней силы — при |r|=0,40,7, сильными — при |r|>0,7.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Валидация CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток. NK-клетки экстернализируют CD107a при активации (Alter et al., 2004). Хотя роль CD107a как маркера дегрануляции была всесторонне изучена для CD8+ Т-клеток (Betts et al, 2003), для NK-клеток аналогичная работа не была проведена. Появление CD107a на поверхности NK-клеток может быть как результатом дегрануляции (т.е. внутриклеточного перераспределения уже имеющегося CD107a), так и следствием синтеза de novo (т.е. процесса, не связанного с дегрануляцией). Однако ЦГ (ингибитор синтеза белка) не влиял на экстернализацию CD107a, вызванную К562 и ФМА+ИОН+ЦБ (таблица 1), что исключает появление CD107a на поверхности в результате синтеза de novo.
Таблица 1. Процент NK-клеток, экстернализирующих CD107a при 4-часовой инкубации с указанными активаторами и ЦГ. Показаны медианы (минимум—максимум).
| Без активаторов | К562 | ФМА+ИОН+ЦБ | |
| –ЦГ | 0,8 (0,6-2,0) | 12,5 (7,1-25,9) | 88,3 (59,6-97,5) |
| +ЦГ (10 мкг/мл) | 0,8 (0,4-2,4) | 11,1 (6,4-26,6) | 85,1 (66,2-97,1) |
Если CD107a является маркером дегрануляции, то его появление на поверхности NK-клетки должно сопровождаться падением внутриклеточного содержания белков цитотоксических гранул, в частности гранзима А. Однако Tomescu et al. (2009) сообщили об одинаковом содержании перфорина и гранзимов в CD107a+ и CD107a– NK-клетках после дегрануляции. Для изучения этого вопроса исследовали внутриклеточный уровень гранзима A (СИФ) в NK-клетках, стимулированных К562 или ФМА+ИОН+ЦБ (рис. 1). При инкубации с клетками K562 уровень гранзима A в NK-клетках, не экстернализирующих CD107a (CD107aneg) существенно не менялся по сравнению с неактивированными NK-клетками, тогда как в NK-клетках с высокой экстернализацией CD107a (CD107ahigh) снижался более чем в 2 раза. При активации ФМА+ИОН+ЦБ уровень гранзима A в CD107aneg NK-клетках даже несколько возрастал, тогда как в CD107aint (экстернализирующих промежуточные уровни CD107a) и в CD107ahigh NK-клетках он был, соответственно, в 2 и 4 раза ниже, чем в CD107aneg. Таким образом, чем выше экстернализация CD107a, тем меньше остаточное содержание гранзима A в NK-клетках, что подтверждает роль CD107a как маркера дегрануляции.
Рисунок 1. Экстернализация CD107a и внутриклеточное содержание гранзима A в CD3–CD56+ NK-клетках здорового донора после 4-часовой инкубации без активаторов, с клетками К562 (1:1) или с ФМА+ИОН+ЦБ. Регионами на графиках выделены клетки, не экспрессирующие поверхностный CD107a (neg, от negative), экспрессирующие промежуточные (int, от intermediate) и высокие (high) уровни СD107a. Цифры на графиках — СИФ гранзима A в соответствующих регионах.
Аналогичные данные были получены и для внутриклеточного содержания перфорина.
Киллинг MHC-I-негативных мишеней, таких, как клетки K562, осуществляют только NK-клетки. Действительно, при инкубации МНК с клетками K562 только NK-клетки (СD3–CD56+) экстернализировали CD107a; СD3+CD56+ Т-клетки отвечали слабо, а СD3+CD56– Т-клетки не отвечали вовсе (таблица 2).
Таблица 2. Экстернализация CD107a различными субпопуляциями лимфоцитов здоровых доноров (до 50 лет) при 4-часовой инкубации. Показаны медианы, в скобках — 10-й и 90-й процентили. N=40.
| Субпопуляция лимфоцитов | % CD107a+ клеток | |
| Без активаторов | К562 | |
| CD3–CD56+ NK-клетки | 0,4 (0,1-0,8) | 11,2 (5,1-21,8) |
| СD3+CD56+ Т-клетки | 0,6 (0,2-1,2) | 1,9 (0,9-4,9) |
| СD3+CD56– Т-клетки | 0,2 (0,0-0,4) | 0,3 (0,1-0,8) |
Учитывая вышеизложенное, была проанализирована связь между экстернализацией CD107a NK-клетками и NK-активностью МНК. Была выявлена корреляция между процентом NK-клеток, экстернализирующих CD107a, и NK-активностью у здоровых доноров (таблица 3). Коэффициент корреляции был выше, если процент CD107a-экстернализирующих NK-клеток выражали по отношению ко всем МНК (r=0,72, p<0,001), а не по отношению к NK-клеткам (r=0,42, p<0,05). Это легко объяснимо тем обстоятельством, что для оценки NK-активности использовались МНК, а не изолированная популяция NK-клеток. Была выявлена также тривиальная связь между NK-активностью и процентом NK-клеток среди МНК (r=0,64, p<0,001), однако эта корреляция была слабее, чем корреляция между NK-активностью и процентом CD107a-экстернализирующих NK-клеток (выраженным по отношению ко всем МНК). NK-активность не коррелировала с СИФ CD107a на CD107a+ NK-клетках и c внутриклеточным содержанием CD107a и перфорина в NK-клетках до дегрануляции.
В совокупности, приведенные данные подтверждают, что CD107a является информативным маркером дегрануляции NK-клеток.
Таблица 3. Коэффициенты корреляции (r) между NK-активностью МНК и указанными параметрами NK-клеток у здоровых доноров.
| Параметр 1 | Параметр 2 (NK-активность) | r |
| % NK-клеток среди МНК | % киллинга при Э:М = 50:1 | 0,64*** |
| % NK-клеток, дегранулирующих в ответ на K562, по отношению ко всем NK-клеткам | % киллинга при Э:М = 50:1 | 0,42* |
| % NK-клеток, дегранулирующих в ответ на K562, по отношению ко всем МНК | % киллинга при Э:М = 50:1 | 0,72*** |
| СИФ CD107a на NK-клетках, дегранулирующих в ответ на K562 | % киллинга при Э:М = 50:1 | 0,03 |
| Внутриклеточное содержание CD107a в NK-клетках (СИФ) | % киллинга при Э:М = 50:1 | 0,19 |
| Внутриклеточное содержание перфорина в NK-клетках (СИФ) | % киллинга при Э:М = 50:1 | 0,07 |
*p < 0,05, ***р< 0,001
CD63 как маркер дегрануляции NK-клеток. Сравнивали кинетику появления CD107a и CD63 на поверхности NK-клеток в ходе инкубации. Оказалось, что при стимуляции клетками К562 маркер CD107a раньше появляется на мембране NK-клеток, чем CD63. Так, в течение первых 15 минут инкубации с К562 экстернализация CD107a и CD63 наблюдается, соответственно, на 3,8 (2,6-9,8)% и 0,7 (0,5-1,2)% NK-клеток, в течение первых 30 минут — на 4,3 (3,3-10,5)% и 1,8 (0,5-3,7)%. При более длительной инкубации (2 и 4 ч) процент NK-клеток, экстернализировавших СD63, становится незначительно выше, чем процент экстернализировавших CD107a. При стимуляции ФМА+ИОН+ЦБ процент NK-клеток, экстернализировавших CD107a, был минимум в 1,5 раза выше, чем процент CD63+ клеток, во все сроки инкубации. При инкубации без индукторов дегрануляции экстернализация CD107a наблюдалась менее чем на 1% NK-клеток. Однако экстернализация CD63 в этих условиях постепенно нарастала и к 4 ч составляла 2,6 (1,3-7,4) %.
Учитывая более высокую спонтанную экстернализацию CD63 и менее выраженную индуцированную, особенно при активации ФМА+ИОН+ЦБ, а также относительно позднее появление CD63 на поверхности NK-клеток, CD63 является менее чувствительным и менее специфичным маркером дегрануляции NK-клеток, чем CD107a.
Показатели функционального состояния NK-клеток у лиц пожилого возраста. У пожилых лиц (65 лет и старше) по сравнению с молодыми (40 лет и моложе) было резко снижено процентное содержание NK-клеток, дегранулирующих в ответ как на рецепторный стимул (клетки К562), так и на нерецепторные стимулы — ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ, причем указанные межвозрастные различия наблюдались как у мужчин, так и у женщин (таблица 4). Внутриклеточная экспрессия CD107a в NK-клетках у пожилых не была снижена, что исключает роль этого фактора в снижении экстернализации CD107a.
Таблица 4. Процент NK-клеток, дегранулирующих в ходе инкубации с указанными активаторами (по отношению ко всем NK-клеткам). Показаны медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили.
| Без активаторов | К562 | ФМА+ИОН | ФМА+ИОН+ЦБ | ||
| Все | Молодые (n=38) | 0,38 (0,2–0,8) | 12,2 (5,2–22,3) | 12,2 (5,2–26,1) | 67,4 (22–88,3) |
| Пожилые (n=15) | 0,29 (0,1–0,5) | 3,9 (2,3–7,3)*** | 1,9 (0,4–7,6)*** | 17,1 (0,5–39,3)*** | |
| Мужчины | Молодые (n=14) | 0,37 (0,2–0,7) | 11,7 (7,5–15,6) | 10,7 (5,8–16,3) | 57,2 (30,1–82,9) |
| Пожилые (n=10) | 0,28 (0,1–0,5) | 3,4 (2,1–8,6)** | 1,8 (0,4–5,3)** | 26,0 (10,0–48,9)* | |
| Женщины | Молодые (n=24) | 0,38 (0,2–0,8) | 12,7 (5,2–24,7) | 14,0 (5,1–29,3) | 67,4 (28,6–88,8) |
| Пожилые (n=5) | 0,29 (0,2–0,4) | 5,0 (3,9–7,2)* | 2,0 (0,4–7,7)** | 8,7 (0,6–27,9)*** |
*p < 0,05, **p < 0,01, ***р <0,001 при сравнении с соответствующей подгруппой молодых доноров (тест Манна-Уитни).
Несмотря на сниженную дегрануляцию NK-клеток, показатели NK-активности МНК в двух возрастных группах практически не различались (таблица 5). Нормальная NK-активность при сниженной дегрануляции у пожилых не объяснялась повышенным содержанием NK-клеток среди МНК: у пожилых доноров процент NK-клеток составил 8,0 (2,9—15,4)% от всех МНК, у молодых — 9,0 (5,1—16,8)% (p = 0,41).
Таблица 5. NK-активность МНК у пожилых и молодых доноров. Даны проценты киллинга мишеней K562 для различных соотношений Э:М, а также количество ЛЕ20 на 105 МНК (медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили).
| Соотношение Э:М | ЛЕ20 на 105 МНК | |||||
| 3,125:1 | 6,25:1 | 12,5:1 | 25:1 | 50:1 | ||
| Молодые (n=38) | 5,8 (1,5–10,6) | 9,6 (4,4–24,5) | 19,4 (10,1–39,4) | 32,9 (15,8–64,1) | 43,6 (26,3–72,8) | 0,94 (0,4–2,3) |
| Пожилые (n=15) | 5,1 (3,9–10,3) | 9,7 (4,6–17,8) | 20,1 (8,5–41,7) | 31,2 (14,2–55,6) | 43,0 (25,0–65,0) | 1,0 (0,4–2,1) |
Также у пожилых лиц, по сравнению с молодыми, была нарушена корреляция между дегрануляцией NK-клеток и показателями NK-активности, при сохранной корреляции между процентом NK-клеток среди МНК и NK-активностью (таблица 6). В целом, данные позволяют предположить, что хотя киллинг клеток K562 и у молодых, и у пожилых осуществляется NK-клетками, киллерная активность NK-клеток у пожилых в меньшей степени зависит от дегрануляции.
Таблица 6. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами NK-клеток в исследованных группах.
| Параметр 1 | Параметр 2 (NK-активность) | Группы | |
| Молодые | Пожилые | ||
| % всех NK-клеток среди МНК | % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 | 0,59** | 0,8** |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,82*** | 0,78** | |
| % NK-клеток, дегранулирующих в ответ на K562, по отношению к NK-клеткам | % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 | 0,46* | –0,17 |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,47* | –0,2 | |
| % NK-клеток, дегранулирующих в ответ на K562, по отношению ко всем МНК | % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 | 0,7*** | 0,61* |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,86*** | 0,57 | |
*p < 0,05, **р< 0,01, ***p < 0,001.
Показатели функционального состояния NK-клеток при СВО. У больных СВО, по сравнению со здоровыми донорами, была резко снижена доля NK-клеток, дегранулирующих в ответ на стимуляцию клетками K562 (почти до значений спонтанной дегрануляции) (рис. 2, таблица 7). Ответ на нерецепторную стимуляцию (ФМА+ИОН, ФМА+ИОН+ЦБ) был снижен менее значительно. Снижение дегрануляции у больных СВО не зависело от проводимой на момент исследования иммуносупрессивной терапии. Внутриклеточное содержание CD107a и перфорина — маркеров литических гранул — укладывались в диапазон значений донорской группы. Следовательно, снижение экстернализации CD107a NK-клетками при СВО обусловлено не снижением исходного содержания CD107a и/или литических гранул, а нарушением дегрануляции. В соответствии с резко сниженной дегрануляцией, NK-активность МНК у больных СВО была резко снижена (% киллинга мишеней, количество ЛЕ20 на 105 МНК) (таблица 8). Корреляции между NK-активностью МНК и показателями дегрануляции NK-клеток, имеющиеся в группе доноров, в группе больных СВО полностью отсутствовали (таблица 9). Процентное содержание всех NK-клеток среди МНК у больных СВО составило 5,3 (1,1–22,2)%, что было ниже, чем у доноров (9,4 (5,2–19,1)%), однако из-за большого разброса значений в группе СВО различие не было достоверным.
Таким образом, при СВО снижена дегрануляция NK-клеток преимущественно в ответ на рецепторный стимул (K562), что сопровождается резким снижением NK-активности. Это говорит о том, что при СВО нарушено в первую очередь образование иммунологического синапса, тогда как механизмы, отвечающие за перемещения гранул в NK-клетках, относительно сохранны.
Таблица 7. Процент NK-клеток, дегранулирующих в ходе инкубации с указанными активаторами, по отношению ко всем NK-клеткам. Показаны медианы, в скобках — 10-й и 90-й процентили.
| Группа | Без активаторов | К562 | ФМА+ИОН | ФМА+ИОН+ЦБ |
| Доноры (n=28) | 0,5 (0,2–0,9) | 14,1 (7,1–24,1) | 11,6 (5,1–23,5) | 65,8 (15,3–88,6) |
| СВО (n=15) | 0,6 (0,1–1,0) | 1,6 (1,1–3,4)*** | 5,8 (0,5–10,1)* | 32,6 (5,7–64,6)** |
| ХГБ (n=9) | 0,7 (0,2–1,2) | 9,7 (3,8–15,7) | 24,6 (13,7–32,3) | 46,0 (11,5–59,4)* |
*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 8. NK-активность МНК больных СВО и ХГБ по сравнению со здоровыми донорами. Показаны медианы, в скобках — 10-й и 90-й процентили.
| Группа | % киллинга мишеней при данном соотношении Э:М | ЛЕ20 на 105 МНК | ||||
| 3,125:1 | 6,25:1 | 12,5:1 | 25:1 | 50:1 | ||
| Доноры | 6,2 (2,1–12,4) | 10,9 (4,9–23,9) | 19,8 (11,6–49,6) | 33,2 (16,9–66,0) | 46,5 (26,5–74,1) | 1,0 (0,3-2,3) |
| СВО | 8,4 (0,0–17,4) | 5,7 (0,0–10,2)** | 7,2 (0,0–14,5)** | 5,5 (0,2–17,5)*** | 5,6 (0,0–27,7)*** | 0,0 (0-0,3)*** |
| ХГБ | 7,4 (1,4–17,7) | 6,5 (0,9–25,4) | 13,9 (4,6–39,2) | 23,3 (11,7–46,5) | 36,6 (19,3–63,9) | 0,7 (0,2-2,5) |
*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 9. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами NK-клеток в исследованных группах.
| Параметр 1 | Параметр 2 (NK-активность) | Группы | ||
| Доноры | СВО | ХГБ | ||
| % NK-клеток среди МНК | % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 | 0,57* | –0,12 | 0,47 |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,84*** | –0,13 | 0,38 | |
| % NK-клеток, дегранул. в ответ на K562, по отношению к NK-клеткам | % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 | 0,51* | 0,2 | 0,51 |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,37 | –0,1 | 0,29 | |
| % NK-клеток, дегранул. в ответ на K562, по отношению ко всем МНК | % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 | 0,72** | –0,1 | 0,82** |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,79*** | –0,11 | 0,6 | |
* p < 0,05, **р< 0,01, ***p < 0,001.
Показатели функционального состояния NK-клеток при ХГБ. В отличие пациентов с СВО, у пациентов с ХГБ проценты дегранулирующих NK-клеток, рассчитанные по отношению ко всем NK-клеткам, при стимуляции K562 достоверно не отличались от показателей здоровых доноров (таблица 7, рис. 2). При стимуляции ФМА+ИОН имелась тенденция к повышенной дегрануляции, тогда как при стимуляции ФМА+ИОН+ЦБ ответ был ниже, чем у здоровых доноров. Дегрануляция в ответ на все виды стимуляции не зависела от получения больными ХГБ антимикробной терапии. Процентное содержание NK-клеток среди МНК при ХГБ составило 5,4 (2,3–9,7)%, что было достоверно ниже, чем у здоровых доноров (9,4 (5,2–19,1)%; p < 0,05). NK-активность у больных ХГБ была несколько ниже, чем у доноров, однако достоверных отличий от донорской группы выявлено не было (таблица 8).
Рисунок 2. Экстернализация CD107a NK-клетками здорового донора (верхний ряд), больного СВО (средний ряд) и больного ХГБ (нижний ряд) при 4-часовой инкубации МНК в отсутствии активаторов, с клетками К562 (1:1), с ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ. Показаны только CD3–CD56+ NK-клетки. Цифры на графиках — проценты NK-клеток, экстернализировавших CD107a, по отношению ко всем NK-клеткам.
Корреляции между дегрануляцией NK-клеток и NK-активностью у пациентов с ХГБ были сохранены (таблица 9). Таким образом, нарушений дегрануляции NK-клеток при ХГБ выявлено не было.
Показатели функционального состояния NK-клеток при ЧРГ. У пациентов с ЧРГ и в стадии обострения, и в стадии ремиссии наблюдалось умеренное снижение процентов NK-клеток, дегранулирующих в ответ как на рецепторный стимул (K562), так и на нерецепторные стимулы (ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ) (таблица 10). При парном сравнении показателей дегрануляции, полученных у одних и тех же пациентов в динамике (в обострении и в ремиссии), достоверных различий выявлено не было.
Таблица 10. Проценты NK-клеток, дегранулирующих при инкубации с указанными активаторами, по отношению ко всем NK-клеткам. Показаны медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили.
| Группа | Без активаторов | К562 | ФМА+ИОН | ФМА+ИОН+ЦБ |
| Доноры (n=40) | 0,4 (0,1–0,8) | 11,2 (5,1–21,8) | 11,8 (5,2–23,9) | 66,8 (32,5–88,5) |
| ЧРГ, обострение (n=33) | 0,5 (0,1–1,2) | 7,7 (3,0–15,7)* | 4,3 (1,3–12,5)*** | 49,4 (16,9–68,0)** |
| ЧРГ, ремиссия (n=24) | 0,3 (0,1–0,7) | 8,2 (4,8–14,5)* | 5,5 (1,7–11,0)*** | 39,1 (25,4–68,6)** |
*p < 0,05, **p < 0,01, ***р< 0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 11. NK-активность МНК у больных ЧРГ и доноров. Показаны медианы, в скобках - 10-й—90-й процентили.
| Группа | % киллинга мишеней при данном Э:М | Кол-во ЛЕ20 на 105 МНК | ||||
| 3,125:1 | 6,25:1 | 12,5:1 | 25:1 | 50:1 | ||
| Доноры (n=51) | 4,6 (1,3-10,1) | 9,6 (4,0-22,3) | 19,3 (10,1-39,6) | 29,9 (15,7-61,6) | 41,5 (26,4-72,7) | 0,93 (0,36-2,6) |
| ЧРГ, обострение (n=28) | 4,2 (0,1-12,5) | 9,2 (0,0-32,8) | 18,2 (2,8-39,1) | 29,8 (7,0-51,1) | 35,3 (12,6-56,2) | 0,77 (0-2,73) |
| ЧРГ, ремиссия (n=23) | 2,3 (0,0-14,2) | 5,2 (1,1-29,7) | 13,9 (3,7-46,1) | 20,8 (9,8-60,4) | 32,5 (17,5-72,8)* | 0,41 (0-2,46)* |
*р < 0,05 при сравнении с группой здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 12. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами NK-клеток в трех исследованных группах.
| Параметр 1 | Параметр 2 (NK-активность) | Группы | ||
| Доноры | ЧРГ (обостр.) | ЧРГ (рем.) | ||
| % NK-клеток среди МНК | % убитых мишеней при Э:М = 50:1 | 0,64*** | 0,59** | 0,64** |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,76*** | 0,52** | 0,74*** | |
| % NK-клеток, дегранулирующих в ответ на K562, по отношению к NK-клеткам | % убитых мишеней при Э:М = 50:1 | 0,42* | 0,42* | 0,70*** |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,42* | 0,49* | 0,66*** | |
| % NK-клеток, дегранулирующих в ответ на K562, по отношению ко всем МНК | % убитых мишеней при Э:М = 50:1 | 0,72*** | 0,53* | 0,79*** |
| ЛЕ20 на 105 МНК | 0,81*** | 0,56* | 0,92*** | |
Значения достоверностей для коэффициентов корреляции: *p < 0,05, **p < 0,01, ***р< 0,001.
Несмотря на снижение дегрануляции и в обострении, и в ремиссии, NK-активность МНК (по сравнению с донорами) была достоверно снижена только в стадию ремиссии. В стадию обострения заболевания показатели NK-активности не отличалась от таковых у доноров (таблица 11).
Внутриклеточные уровни маркеров литических гранул (CD107a и перфорина) в NK-клетках, а также процентное содержание NK-клеток среди МНК, у пациентов с ЧРГ не были изменены по сравнению со здоровыми донорами.
Во всех трех группах (здоровые доноры, ЧРГ в обострении, ЧРГ в ремиссии) имела место достоверная корреляция между NK-активностью МНК и процентным содержанием NK-клеток среди МНК, а также между NK-активностью и процентами NK-клеток, дегранулирующих в ответ на клетки K562 (таблица 12). Однако при обострении ЧРГ коэффициенты корреляции между NK-активностью и процентом всех NK-клеток среди МНК были ниже, чем у доноров и у пациентов с ЧРГ в стадии ремиссии. То же касалось и корреляции между NK-активностью и процентами дегранулирующих NK-клеток. Эти данные показывают, что NK-активность МНК при обострении ЧРГ в меньшей степени зависит от дегрануляции NK-клеток. Одной из причин этого может быть активация других, не связанных с дегрануляцией, механизмов цитотоксичности NK-клеток при обострении ЧРГ. Пониженная дегрануляция NK-клеток и обусловленное этим снижение NK-активности, наблюдаемые в ремиссии, могут создавать благоприятные условия для нового обострения ЧРГ.
Гетерогенность NK-клеток в тесте на дегрануляцию. Тест на экстернализацию CD107a позволил установить, что лишь меньшая часть NK-клеток (в частности, меньшая часть высокоцитотоксичной субпопуляции CD56dim NK-клеток) дегранулирует при взаимодействии с клетками К562. Эти данные сходны с данными других групп (Alter et al., 2004; Bryceson et al., 2005; Anfossi et al., 2006). «Недегранулирующие» NK-клетки, тем не менее, тоже активируются, о чем свидетельствует падение на них поверхностной экспрессии CD16 и CD314 (рис. 3).
Рисунок 3. Снижение уровня поверхностного CD16 и CD314 при активации и дегрануляции NK-клеток здоровых доноров. СИФ CD16 (4 донора; A) и CD314 (7 доноров; Б) на NK-клетках, инкубированных 4 ч без активаторов и на CD107a– и CD107a+ NK-клетках, инкубированных с K562. *p<0,05, **p<0,01; Б — тест Уилкоксона, А — парный t-тест (различия в тесте Уилкоксона недостоверны из-за малого N). Горизонтальные линии на А и Б — медианы.
Можно предположить, что среди циркулирующих NK-клеток (CD56dim NK-клеток) присутствует субпопуляция с немедленными эффекторными свойствами, и именно эта «эффекторная» субпопуляция дегранулирует при кратковременной (до 4 ч) инкубации с клетками-мишенями. Penack et al. (2005) показали, что только CD107a+, но не CD107a– NK-клетки, отсортированные после 4-часовой коинкубации с мишенями, обладают NK-активностью при повторном взаимодействии с мишенями. Если «эффекторная» субпопуляция NK-клеток существует, то она, вероятно, должна обладать характерным набором маркеров, который отличал бы ее от остальных NK-клеток.
Окраска на дополнительные поверхностные маркеры показала, что при инкубации с клетками K562 процент дегранулирующих NK-клеток выше в субпопуляциях CD94bright и CD159a+ по сравнению с CD94dim и CD159a–, а также в субпопуляции CD335dim по сравнению с CD335bright (таблица 13). CD8+/CD8– и CD57+/CD57– NK-клетки не различались по дегрануляционному ответу. Более того, сочетание маркеров CD94 и CD335 позволило выявить CD94brightCD335dim субпопуляцию, обладающую особенно высоким дегрануляционным ответом на клетки K562 — 18,9 (13,0-27,7)%.
Таблица 13. Процентное содержание дегранулирующих (CD107a+) клеток в указанных субпопуляциях CD56dim NK-клеток. Медианы (10-й—90-й процентили).
| Маркер (кол-во опытов) | Субпопуляция | % дегранулирующих NK-клеток | |
| Без активаторов | K562 | ||
| CD8 (n=8) | CD8+ | 0,2 (0,0-0,4) | 7,2 (3,6-16,8) |
| CD8– | 0,5 (0,1-0,7) | 7,7 (3,6-13,6) | |
| CD57 (n=8) | CD57+ | 0,2 (0,0-0,6) | 6,6 (2,5-16,7) |
| CD57– | 0,6 (0,2-1,0) | 9,0 (3,6-15,4) | |
| CD94 (n=8) | CD94bright | 0,2 (0,1-0,6) | 9,6 (3,3-18,6)* |
| CD94dim | 0,6 (0,2-0,9) | 5,1 (3,0-13,4) | |
| CD159a (n=5) | CD159a+ | 0,3 (0,1-0,5) | 6,9 (4,8-15,9)* |
| CD159a– | 0,3 (0,2-0,5) | 5,2 (3,2-7,7) | |
| CD335 (n=5) | CD335bright | 0,2 (0,0-0,4) | 2,9 (2,4-6,3)* |
| CD335dim | 0,4 (0,3-0,5) | 7,7 (5,4-15,2) | |
*p < 0,05 при сравнении CD94bright и CD94dim, CD159a+ и CD159–, CD335bright и CD335dim субпопуляций, при стимуляции K562 (тест Уилкоксона).
Результаты по CD94 и CD159a согласуются с данными Anfossi et al. (2006) и могут рассматриваться как свидетельство «обучения» NK-клеток: согласно концепции обучения, цитотоксический потенциал приобретают только те NK-клетки, которые экспрессируют хотя бы один ингибиторный рецептор, способный распознать собственный антиген MHC (например, CD94/CD159a). Результаты по CD335 являются новыми. Пока не ясно, почему NK-клетки, экспрессирующие более высокие уровни активационного рецептора CD335 (NKp46), дегранулируют менее интенсивно. Однако следует отметить, что дегрануляция той или иной степени выраженности отмечалась во всех исследованных субпопуляциях NK-клеток (таблица 13); другими словами, ни один из исследованных маркеров не является «абсолютным» маркером «эффекторных» NK-клеток.
ВЫВОДЫ
- Разработан комплекс методов, позволяющий оценивать основные показатели NK-клеток: процентное содержание NK-клеток среди МНК, субпопуляционный состав NK-клеток, NK-активность МНК, дегрануляцию NK-клеток и их субпопуляций по экстернализации CD107a при рецепторной и нерецепторной стимуляции, определение внутриклеточного содержания CD107а и перфорина в NK-клетках. Методологической основой комплекса является проточная цитометрия.
- Подтверждено значение CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток.
- CD107a является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции NK-клеток, чем CD63.
- Лишь небольшая часть циркулирующих NK-клеток и их CD56dim субпопуляции дегранулирует при взаимодействии с NK-чувствительными клетками-мишенями K562. При этом значительная часть NK-клеток активируется, но не дегранулирует.
- Более высокий процент дегранулирующих клеток наблюдается в субпопуляциях CD56dim NK-клеток, экспрессирующих CD159a (CD159a+), высокий уровень CD94 (CD94bright) и низкий уровень CD335 (CD335dim).
- У здоровых доноров в возрасте до 50 лет NK-активность МНК коррелирует с процентным содержанием NK-клеток среди МНК и с процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с клетками K562. NK-активность МНК не коррелирует с внутриклеточным содержанием перфорина в NK-клетках и с количеством гранул, выбрасываемых в среднем одной NK-клеткой при взаимодействии с клетками K562.
- У лиц пожилого возраста (старше 65 лет) снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на различные виды стимуляции при неизмененной NK-активности МНК; нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562.
- При синдроме Вискотта-Олдрича резко снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на рецепторный стимул (K562), в меньшей степени на нерецепторные стимулы, что сопровождается резким снижением NK-активности у этих больных; корреляция между показателями дегрануляции NK-клеток и NK-активностью МНК отсутствует.
- При хронической гранулематозной болезни функциональные показатели NK-клеток существенно не изменены.
- У пациентов с часто рецидивирующим герпесом как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии умеренно снижена дегрануляция NK-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение NK-активности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Муругин В.В., Муругина Н.Е., Продеус А.П., Зимин С.Б., Кондратенко И.В., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Дегрануляция NK-клеток у больных синдромом Вискотта-Олдрича и хронической гранулематозной болезнью. Иммунология, 2009, т.30(6), стр.376-382.
- Пащенков М.В., Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пинегин Б.В. Выявление и характеризация цитолитических CD8+ и CD4+ Т-клеток. Иммунология, 2010, т.31(1), стр.4-12.
- Муругин В.В., Зуйкова И.Н., Муругина Н.Е., Шульженко А.Е., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дефицит дегрануляции NK-клеток у больных хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекцией. Иммунология, 2010, т.31(6),стр.284-289.
- Murugin V.V., Zuikova I.N., Murugina N.E., Shulzhenko A.E., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Reduced degranulation of NK cells in patients with frequently recurring herpes. Clin. Vaccine Immunol., 2011, v.18, p.1410-1415.
- Муругин В.В., Муругина Н.Е., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дегрануляция NK- и T-клеток у лиц пожилого возраста. Иммунология, 2011, т.32(5), стр.239-243.
- Муругин В.В., Муругина Н.Е., Продеус А.П., Зимин С.Б., Кондратенко И.В., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дегрануляция NK-клеток и CD8+ Т-клеток у больных синдромом Вискотта-Олдрича и хронической гранулематозной болезнью. Российский Аллергологический Журнал, 2009, т.3, стр.142.
- Муругина Н.Е., Муругин В.В., Чирвон Е.А., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Применение многоканальной проточной цитометрии для изучения цитотоксических CD8+ и CD4+ Т-клеток. Российский Аллергологический Журнал, 2009, т.3, стр.158.
- Пащенков М.В., Симонова А.В., Аршинова С.С., Мартынов А.И., Ярилин А.А., Пинегин Б.В., Кулаков В.В.,Климова С.В., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Донецкова А.Д., Литвина М.М., Муругин В.В. Оценка клеточного иммунитета. Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики, Москва, 2009, стр.18-21.
- Муругин В.В., Муругина Н.Е., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дегрануляция Т- и NK-клеток у лиц пожилого возраста. Российский Аллергологический Журнал, 2011, т.4, стр.246-247.
- Пащенков М.В., Муругин В.В., Пинегин Б.В. Применение мультипараметрической проточной цитометрии для одновременной оценки функции и фенотипа NK-клеток. Российский Аллергологический Журнал, 2011, т.4, стр.283-284.
