Роль ионов кальция в изменении реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов при интенсивной мышечной нагрузке
На правах рукописи
Павлов Николай Александрович
РОЛЬ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ИЗМЕНЕНИИ РЕАКТИВНОСТИ И МИКРОРЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ИНТЕНСИВНОЙ МЫШЕЧНОЙ НАГРУЗКЕ
03.03.01 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Белгород - 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина»
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Семенютин Владимир Владимирович
Официальные оппоненты:
Кулаченко Владимир Петрович,
доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина», кафедра морфологии и физиологии;
Крапивина Елена Владимировна,
доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», заведующая кафедрой эпизоотологии, микробиологии, паразитологии и ветсанэкспертизы.
Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский
институт физиологии, биохимии и питания
сельскохозяйственных животных
Защита состоится «27» июня 2013 года, в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 220.004.01 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина»
Адрес института: 308503, п. Майский, Белгородского района, Белгородской области, ул. Вавилова, 1, тел./факс (4722) 39-22-62.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина»
Автореферат разослан «___»___________2013 года
Учёный секретарь
диссертационного совета Литвинов Юрий Николаевич
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одним из важнейших макроэлементов, имеющихся во всех живых организмах, является кальций (Ca2+). Кроме того, что Ca2+ является строительным материалом для костей и зубов, он обладает высокой биологической активностью: влияет на проницаемость клеточных мембран, дифференцировку клеток, обеспечивает мышечные сокращения, в том числе сердечную деятельность, участвует в передаче сигналов в синапсах, свёртывании крови, деятельности желёз внутренней секреции и др. (G. N. Zimmerman, N. Fleischer, 1970; N. J. Rebecchi et al., 1982; S. A. Ronning, 1982; R. Wang, 1990; И. А. Држевецкая, Т. Н. Джандарова, 1992; Е. А. Александрова, 2001; N. C. Foster et al, 2001; H. Wais, 2001).
Широко представленными к настоящему времени являются работы об участии ионизированного кальция в реакциях мышечного сокращения. Так, мышечная подвижность зависит транспорта ионов кальция (Е. А. Александрова, 2001; Д. Бендол, 1970; О. В. Есырев, 1983; В. Д. Романенко, 1975; М. Д. Курский, 1986; В. Л. Козловский, 1995; П. Б. Цывьян, 1987; F. H. Braunewell, 2001; A. Fabiato, 1983, 1985; N. J. Rebecchi et al., 1982). Установлено, что функции всех разновидностей мышц контролируются при помощи ионов кальция, выступающих в качестве вторичного мессенджера (S. Ringer, 1882). Ионы кальция принимают участие в энергетическом контроле мышечной деятельности путём регуляции запасов АТФ (C. A. Tate, M. F. Hyek, G. E. Taffet, 1991). Основными причинами повреждения мышечной ткани при избыточной нагрузке являются прогрессирующая утрата способности мышц предотвращать изменения в уровне Ca2+ (J. G. Cannon et al., 1991), сжатии митохондрий, вакуолизации саркоплазматического ретикулума (R. B. Armstrong et al., 1983; J. Friden et al., 1989), изменениях Z-линий саркомера, а также активности респираторного взрыва нейтрофилов (A. N. Belcastro et al., 1988; P. M. Clarkson, 1988; J. Peake et al., 2004, 2005).
В последние годы стало известно о широком спектре влияний ионов кальция на гемоциты. Установлено, что Ca2+ снижает активность 5-липоксигеназы лимфоцитов, приводя к угнетению синтеза лейкотриенов (C. A. Rouzer et al., 1987), влияет на процесс фагоцитоза и миграцию нейтрофилов (T. Bengtsson et al., 1993; F. R. Maxfield, J. T. Mandeville, 1997), оказывает существенное влияние на структуру и стабильность клеточных мембран, кластеризацию кислых фосфолипидов (J. A. Scott, 1984; G. Tettamanti, М. Masserini, 1987).
Ионизированный кальций также играет важную роль в стабилизации плазмалеммы и участвует в регуляции клеточного объёма (Н. J. Schatzman, 1966; 1969; P. Caroni, Е. Carafoli, 1981; П. Г. Костюк, 1984; Д. О. Левицкий, 1990; H. Birgi, 1998).
Мышечные нагрузки высокой интенсивности приводят к изменению количества циркулирующих лейкоцитов в крови. В литературных источниках данные о влиянии интенсивной мышечной нагрузки на уровень лейкоцитов носят противоречивый характер (R. Harris et al., 1992; D. M. Nance et al., 2007; D. A. Henson et al., 1998). Известно, что первые минуты выполнения физических упражнений сопровождаются гиперкальциемией, оказывающей влияние на структуру мембран, а также на рецепторный аппарат клеток (Н. Н. Лиманский, 1978).
Проблема согласованности физиологических процессов при избыточном поступлении кальция в организм в сочетании с интенсивной мышечной нагрузкой на сегодняшний день изучена недостаточно, в связи с чем и было предпринято данное исследование.
Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в изучении влияния ионов кальция на микрореологические и функциональные свойства лейкоцитов при интенсивной мышечной нагрузке.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние повышенного содержания ионов кальция на функциональные и морфометрические свойства лейкоцитов в условиях интенсивной мышечной нагрузки.
2. Исследовать влияние ионов кальция на функциональные и микрореологические свойства лейкоцитов: адгезию, миграцию, фагоцитоз, мембранный резерв и осморегуляторные реакции.
3. Оценить влияние ионов кальция на функциональные и морфометрические свойства лимфоцитов в опытах in vivo и in vitro в сравнительном аспекте.
Научная новизна. Впервые с использованием наносенсорных датчиков атомно-силового микроскопа получены данные об изменении объёма лимфоцитов при физиологической и повышенной концентрациях ионов кальция. Проведён сравнительный анализ морфометрических свойств лимфоцитов в условиях повышенной концентрации ионов кальция в опытах in vivo и in vitro. Впервые установлено, что повышенная концентрация кальция в опытах in vitro приводит к увеличению объёма клеток при уменьшении их распластанности.
Поступление ионов кальция повышенной концентрации приводит к изменениям, характерным для неспецифической реакции активации. Ионы кальция в повышенной концентрации при поступлении в организм с водой оказывают компенсаторное влияние на неспецифическую реакцию переактивации, вызванную действием интенсивной мышечной нагрузки. Сочетанное воздействие интенсивной мышечной нагрузки и употребления воды с повышенной концентрацией ионов кальция приводит к резкому увеличение хемотаксической активности лейкоцитов и более эффективному протекание осморегуляторных реакций лимфоцитов.
Теоретическая и практическая значимость. Данные, полученные при изучении влияния мышечной нагрузки высокой интенсивности на функциональные свойства лейкоцитов крови, дополняют имеющиеся в литературе сведения о физиологической роли ионов кальция. Полученные результаты могут быть использованы при оценке гипер- и гипокальциемических состояний, имеющих место при выполнении физических нагрузок высокой степени интенсивности.
Результаты настоящей работы могут служить основой для проведения дальнейших исследований, направленных на изучение молекулярных механизмов изменений, происходящих в цитоскелете, а также рецепторном аппарате лейкоцитов, что необходимо для установления причин ряда патологий, возникающих в результате мышечных нагрузок высокой степени интенсивности. Знание ключевых моментов в изменениях реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов упростит поиск лекарственных препаратов, корригирующих данные параметры.
Результаты исследований используются в учебном процессе при преподавании курсов «Физиология человека», «Физиология адаптационных процессов» и «Экологическая физиология» на кафедре анатомии и физиологии живых организмов Белгородского национального исследовательского университета.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 8-й Международной Пущинской школе – конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004), I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), XII Международном симпозиуме (Москва, 2007), III Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), V Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения В. Н. Черниговского (С.-Пб, 2007), Международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни» (Москва, 2008), XVI Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (Черноголовка, 2009), Международной научно-практической конференции «Здоровье в XXI веке» (Тула, 2010), XVII Международной научно-практической конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2013).
Положения, выносимые на защиту:
1. Ионы кальция в повышенной концентрации оказывают компенсаторное влияние при развитии неспецифической реакции переактивации, вызванной влиянием интенсивной мышечной нагрузки, тогда как в покое – вызывают изменения, характерные для неспецифической реакции активации.
2. Повышенная концентрация ионов кальция в сочетании с интенсивной мышечной нагрузкой приводит к повышению эффективности осморегуляторных реакций лимфоцитов. Снижение величины использования мембранного резерва лимфоцитами после интенсивной мышечной нагрузки происходит в результате уменьшения морфометрических показателей клеток.
3. Увеличение объёма лимфоцитов при воздействии повышенной концентрации ионов кальция в опытах in vitro происходит в условиях компактизации клеток при уменьшении их распластанности.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 1 монография и 6 научных работ, 3 из которых находятся в перечне изданий ВАК, рекомендуемых для публикации диссертационных исследований.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 15 таблиц, 37 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы, включающего 268 источников (60 отечественных и 208 зарубежных публикаций).
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектом исследований служили лейкоциты крови крыс (самцы) линии Вистар массой 350-400 г, содержащихся на стандартном рационе. Для проведения экспериментов животных делили на группы (табл. 1).
Таблица 1 – Схема опытов
| Эксперименты in vivo | Эксперименты in vitro |
| 1. Контрольная группа | 1. Контрольная группа |
| 2. Группа животных после интенсивной мышечной нагрузки (ИМН) | |
| 3. Группа животных после интенсивной мышечной нагрузки на фоне употребления воды с повышенным содержанием ионов кальция (ИМН Ca2+) | 2. Группа животных, лейкоциты которых инкубировали с раствором, имеющим повышенную концентрацию ионов кальция (П Ca2+) |
| 4. Группа животных, употреблявшая воду с повышенным содержанием ионов кальция (П Ca2+) |
Исследуемые факторы воздействия:
1. Интенсивная мышечная нагрузка до полного утомления: животные плавали с грузом (масса груза составляла 10 % от массы тела) в воде температурой 30 °С в течение 40 минут (В. Я. Русин, 1976, V. I. Morozov et al., 2006).
2. Употребление «жёсткой» воды подразумевало получение животными в течение 6 месяцев воды, содержащей повышенное количество ионов кальция. Содержание кальция в воде, потребляемой животными, находилось в пределах допустимых норм для СанПин 2.1.4.559-96 «Вода питьевая» (Ca2+ = 66,5 мг/л, Mg2+ = 1,91 мг/л). Концентрацию Ca2+ в сыворотке крови определяли колориметрическим методом на полуавтоматическом анализаторе ФП 90 П «Лабсистемс» (С. В. Надеждин, М. З. Фёдорова, Л. Ф. Перистая, 2007).
3. Изучение действия двух факторов (ИМН и П Ca2+). Концентрация Ca2+ = 66,5 мг/л.
Для оценки развития стресс-реакции проводили изучение морфологических изменений в надпочечниках крыс (В. В. Виноградов, 1998).
Оценка миграционной способности лейкоцитов крови
Для изучения локомоционной активности лейкоцитов использовали тест-систему миграции клеток под агарозой (С. Д. Дуглас, П. Г. Куи, 1983) в модифицированном варианте (М. З. Фёдорова, В. Н. Левин, 1997).
Оценка адгезионной активности лейкоцитов крови
Для изучения адгезионной способности белых клеток крови за основу был взят метод J-L. Mege et al. (1989). В стеклянный капилляр (D = 4 мм, l = 47 мм) помещали 10 мкл суспензии лейкоцитов и разбавляли 50 мкл физиологического раствора. Капилляр инкубировали во влажной камере в течение 60 минут при температуре 37 С. После инкубации клетки смывали физиологическим раствором NaCl (0,9 %) при напряжении сдвига ~ 30 Н/м2. Напряжение сдвига рассчитывалось по формуле: =P·D/4·l, где – напряжение сдвига, Н/м2; P – давление, действующее на клетки при смыве, Н/м2; D – диаметр капилляра, м; l – длина капилляра, м. Вычисляли процент адгезировавших клеток; определяли число адгезировавших клеток на единицу объёма суспензии. Из лейкоцитарной суспензии готовили мазки, которые фиксировали этанолом и окрашивали азур-эозином по Романовскому. Подсчитывали соотношение лимфоцитов и гранулоцитов с целью выявления степени адгезионных свойств этих клеток и определения гранулоцитарно-лимфоцитарного индекса (ГЛИ).
Оценка фагоцитарной способности лейкоцитов крови
Изучение поглотительной способности лейкоцитов проводилось по методике С. Д. Дугласа, П. Г. Куи (1983). В пробирку объёмом 2 мл помещали дрожжевые клетки, добавляли суспензию лейкоцитов и инкубировали в термостате в течение 30 минут при температуре 37 С. По истечении времени инкубации готовили мазки, фиксировали метанолом и окрашивали азур-эозином по Романовскому. При помощи светового микроскопа подсчитывали количество фагоцитировавших нейтрофилов — фагоцитарную активность и количество дрожжевых клеток, поглощённых в среднем одним нейтрофилом — фагоцитарный индекс.
Оценка мембранного резерва, осмотической стойкости и осморегуляторных реакций лейкоцитов крови
Осмотическая резистентность и осморегуляторные реакции клеток направлены на восстановление объёма в средах с низкой осмолярностью. Для их изучения использовали методику гипоосмотического набухания лейкоцитов (М. З. Фёдорова, В. Н. Левин, 1997). В опытах in vitro измерения морфометрических параметров осуществляли в полуконтактном режиме сканирования на атомно-силовом микроскопе. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента (LibreOffice Calc 3.4.3 и Gnumeric 1.10.13).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Вклад ионов кальция и интенсивной мышечной нагрузки в развитие неспецифической адаптационной реакции организма
В результате исследования трёх названных факторов установлено, что интенсивная мышечная нагрузка вызывала в организме изменения, характерные для неспецифической адаптационной реакции переактивации. Подтверждением этого являлось достоверное увеличение доли коркового вещества надпочечников на 4,2 % (75,0 ± 0,4 % против 70,8 ± 0,7 % в контроле, p<0,01), увеличение количества лимфоцитов на 22 %, снижение количества нейтрофилов на 21,5 %. Алиментарное поступление в организм воды с повышенным содержанием ионов Ca2+ вызывало изменения, близкие к неспецифической адаптационной реакции активации. Об этом свидетельствовало увеличение на 15 % количества лимфоцитов в периферической крови (82 ± 1,5 % против 67 ± 1,6 % в контроле, p<0,01) и снижение на 15 % количества нейтрофилов (15 ± 1,5 % против 30 ± 1,7 % в контроле, p<0,01). Кроме того, наблюдалась тенденция к увеличению на 7,7 % общего количества лейкоцитов в периферической крови (18,2 ± 0,5 тыс./мкл против 16,9 ± 1,7 тыс./мкл, p<0,01).
При сочетанном воздействии (ИМН + П Ca2+) наблюдался вклад ионов кальция в неспецифическую реакцию переактивации, вызванную интенсивной физической нагрузкой. Так, у животных данной группы отмеченные нами изменения носили более сглаженный характер по сравнению с группой ИМН. Так, доля коркового вещества надпочечников в данной группе увеличивалась на 3,4 % (74,2 ± 0,5 % против 70,8 ± 0,7 % в контроле, p<0,01), количество лимфоцитов возрастало на 21 % (88 ± 1,6 % против 67 ± 1,6 % в контроле, p<0,01), количество нейтрофилов снижалось на 20 % (10 ± 1,2 % против 30 ± 1,7 % в контроле, p<0,01). Кроме того, прослеживалась тенденция к увеличению общего количества лейкоцитов относительно интактной группы (17,8 ± 1,2 тыс./мкл против 16,9 ± 1,7 тыс./мкл в контроле).
3.2. Этапы фагоцитарного процесса
3.2.1. Миграция
После выполнения ИМН происходило увеличение площади стимулированной миграции лейкоцитов на 36,5 % (11,3 ± 0,3 мм2 против 8,1 ± 0,4 мм2 в контроле, p<0,01). Увеличение показателя хемотаксического дифференциала под воздействием интенсивной физической нагрузки указывало на усиление хемотаксической активности белых клеток крови в данной опытной группе (31,1 ± 1,9 % против 29,7 ± 3,9 % в контроле, p<0,01). Известно, что первые минуты выполнения мышечной нагрузки сопровождаются ростом уровня кальция вплоть до гиперкальциемического состояния, что, вероятно, оказывает влияние на структуру мембран, а также на рецепторный аппарат лейкоцитов (Н. Н. Лиманский, 1974, 1978; Г. Г. Цыбизов, 1979; J. F. Aloia et al., 1985; S. Ljunghall et al., 1984; Н. Ф. Мишина, 1981; Н. Ф. Мишина, Э. В. Миронова, 1981; N. M. Vora et al., 1983).
У животных из группы П Ca2+ отмечалось увеличение площади спонтанной миграции клеток на 41,3 % (8,9 ± 0,3 мм2 против 6,3 ± 0,3 мм2 в контроле, p<0,01). Стимулирование самопроизвольной миграции лейкоцитов, вероятнее всего, происходит за счёт способности кальция в ионизированной форме вызывать изменения в клеточном цитоскелете, о чём свидетельствуют литературные данные (А. И. Григорьев, И. М. Ларина, 1992; B. F. Trump, I. K. Berezedky, 1982). Снижение величины показателя хемотаксического дифференциала на 23 % свидетельствовало об уменьшении хемотаксической активности лейкоцитов (6,7 ± 1,8 % против 29,7 ± 3,9 % в контроле, p<0,01).
Сочетанное влияние повышенной концентрации ионов кальция на фоне интенсивной мышечной нагрузки приводило к снижению площади спонтанной миграции лейкоцитов на 17 % (p<0,01) относительно животных группы П Ca2+, и к увеличению площади стимулированной миграции на 28,4 % (p<0,01) относительно контрольной группы.
Показатель хемотаксического дифференциала в группе с сочетанием двух нагрузок был наибольшим среди всех экспериментальных групп – (41,6 ± 1,5 % против 29,7 ± 3,9 % в контроле). На наш взгляд, это свидетельствует о стимулированном влиянии ионов кальция на хемотаксическую активность лейкоцитов на фоне неспецифической адаптационной реакции, вызванной действием ИМН, так как хемотаксический дифференциал характеризует отношение площади стимулированной миграции к площади клеточного ареала при самопроизвольной миграции лейкоцитов.
3.2.2. Адгезия
У всех животных опытных групп наблюдалась тенденция к снижению количества адгезировавших лейкоцитов по сравнению с контролем. После интенсивной мышечной нагрузки наблюдалось уменьшение данного показателя на 30 % (18,1 ± 4,0 % против 48,8 ± 12,2 % в контроле), тогда как в группе, употреблявшей «жёсткую» воду, данный показатель снижался лишь на 14 % (34,4 ± 10,1 % против 48,8 ± 12,2 % в контроле). Уменьшение показателя гранулоцитарно-лимфоцитарного индекса свидетельствовало об увеличении адгезионных свойств нейтрофилов. После выполнения интенсивной мышечной нагрузки регистрировалось снижение ГЛИ на 95 % (0,02 ± 0,01 отн.ед. против 0,41 ± 0,10 отн.ед. в контроле, p<0,01). Следует отметить, что многими авторами так же отмечалось снижение выработки лимфоцитарных интегринов LFA - 1 и VLA - 4 после физической нагрузки высокой интенсивности (J. Jordan, R. Beneke et al., 1997; M. Gleeson, 2000; J. Peake, G. Wilson et al., 2004). Уменьшение содержания данных рецепторов адгезии обусловливает отсоединение лимфоцитов от поверхности, в результате чего не происходит формирование адгезионного контакта. Кроме того, зарубежными исследователями показано, что интенсивная мышечная нагрузка либо не оказывает влияния на нейтрофильный интегрин MAC-1 (J. Jordan, R. Beneke et al., 1997), либо способствует увеличению его выработки (J. M. Peake, G. Wilson et al., 2004; M. J. Wiedeman et al., 1996; S. F. Van Eeden, J. Granton et al., 1999).
Употребление экспериментальными животными воды с П Ca2+ не приводило к столь выраженному изменению адгезионных свойств лейкоцитов в отличие от таковых у животных группы ИМН (0,29 ± 0,20 отн.ед. против 0,41 ± 0,10 отн.ед. в контроле). Изменения, происходящие в группе с сочетанием двух нагрузок, так же, как и в остальных опытных группах, характеризовались уменьшением адгезионных свойств лимфоцитов на фоне увеличения адгезионных свойств нейтрофилов. Однако по сравнению с группой, подвергавшейся интенсивной мышечной нагрузке, изменения были менее выраженными.
3.2.3. Фагоцитоз
При изучении поглотительной способности лейкоцитов нами были отмечены: достоверное увеличение их фагоцитарной активности после ИМН (на 29 %, p<0,01); тенденция к увеличению фагоцитарной активности в группе П Ca2+ и её увеличение на 21 % в группе с сочетанным воздействием (p<0,01). Показатель фагоцитарного индекса во всех опытных группах оставался без значительных изменений.
3.3. Основные морфометрические параметры лейкоцитов при воздействии внешних нагрузок
Интенсивная мышечная нагрузка приводила к достоверному снижению диаметра лимфоцитов на 12 % (6,70 ± 0,04 мкм против 5,90 ± 0,07 мкм в контроле, p<0,01), тогда как увеличение диаметра нейтрофилов отмечено на уровне тенденции. В группе П Ca2+ диаметр нейтрофилов, инкубированных в изотоническом растворе NaCl, был на 6,9 % меньше, чем в группе животных с двухфакторным воздействием. Употребление «жёсткой» воды не оказывало влияния на размеры лимфоцитов (NaCl 0,9 %). В то же время сочетанное воздействие двух нагрузок вызывало уменьшение диаметра лимфоцитов на 7,5 % по сравнению с группой П Ca2+. Возможно, повышенное содержание ионов кальция в воде оказывает компенсаторное влияние на лимфоциты.
3.3.1. Оценка мембранного резерва
Лейкоциты млекопитающих обладают значительным резервом площади цитоплазматической мембраны, формирующей её складчатость. Мембранный резерв выявляется при набухании клеток в сильно-гипотонической среде (0,2 %). Известно, что наибольший резерв цитоплазматической мембраны характерен для лимфоцитов. В проведённом нами исследовании их мембранный резерв в интактной группе составил 36,4 %, а таковой нейтрофилов — 31 % от общей площади плазмалеммы. Для проведения сравнительного анализа резерва цитоплазматической мембраны был определён относительный мембранный резерв (отношение абсолютной величины мембранного резерва к исходному объёму клетки). Результаты представлены на рисунке 1.
Рис. 1 – Относительный мембранный резерв лейкоцитов
Как видно из рисунка 1, после ИМН отмечалась наибольшая реализация резерва клеточной мембраны нейтрофилами в отличие от лимфоцитарных клеток.
Употребление «жёсткой» воды также стимулировало использование мембранного резерва нейтрофилами, но не оказывало подобного воздействия на его реализацию лимфоцитами крови по сравнению с контролем. В группе ИМН + П Ca2+мембранный резерв лимфоцитов использовался полнее по сравнению с группой ИМН. Воздействие ионов Ca2+ компенсировалось влиянием мышечной нагрузки, которая способствовала включению механизмов регуляции кальциевого гомеостаза в организме. После интенсивной мышечной нагрузки мембранный резерв полнее использовался нейтрофилами, тогда как у лимфоцитов отмечалось его более «экономное» использование. Незначительное использование мембранного резерва лимфоцитами в результате интенсивной мышечной нагрузки, вероятно, можно объяснить пониженной выработкой молекул АТФ. Кроме того, мышечная нагрузка до полного утомления приводила к уменьшению размера лимфоцитов в изотонической среде (диаметр был меньше, чем в контрольной группе), что также ограничивало их возможность реализации резерва плазмалеммы. Таким образом, по результатам наших исследований нейтрофилы показали бльшую активность в отношении использования мембранного резерва, нежели лимфоциты, причём вне зависимости от условий эксперимента.
3.3.2. Осморегуляторные реакции лейкоцитов
Изучение осморегуляторных реакций, характеризующихся восстановлением размера клеток после длительной инкубации (1 час) в 0,45 % растворе NaCl, показало, что как после ИМН, так и двухфакторного воздействия лимфоциты способны, практически, полностью восстанавливать свой исходный объём (Рис. 2). В группе П Ca2+ реакции осморегуляции как лимфоцитов, так и нейтрофилов были слабовыраженными по сравнению с контролем.
Рис. 2 – Относительное изменение объёма лейкоцитов по сравнению с изотоническим раствором NaCl после часовой инкубации в умеренно-гипотоническом растворе
3.4. Влияние ионов кальция на функциональные и микрореологические свойства лимфоцитов
Объём лимфоцитов в опытной группе составлял 80,80±1,03 мкм3 (0,9% раствор NaCl) и 96,70±1,20 мкм3 (0,2% раствор NaCl), а в контрольной группе 54,90±0,90 мкм3 и 87,30±4,50 мкм3, соответственно. В опытной группе при инкубации в 0,2% растворе NaCl объём увеличивается на 19,7%, тогда как в контрольной группе этот показатель составляет 59,0% (p<0,05) (Рис. 3).
Рис. 3 – АСМ изображение лейкоцитов, подверженных кальциевой нагрузке, при инкубации в 0,9% (А) и 0,2% (Б) растворе NaCl
Параметры высоты лимфоцитов опытной группы превышали значения, полученные в контрольной группе, на 36,4%. Значения коэффициента уплощённости лимфоцитов опытной группы свидетельствуют о снижении их распластанности в результате воздействия повышенной концентрации ионов кальция на 23% (0,9% раствор NaCl) и на 41% (0,2% раствор NaCl) (табл. 2).
Таблица 2 – Показатели высоты лейкоцитов крови (M ± m)
| Группа | Средняя высота клеток, мкм | Коэффициент уплощённости, отн. ед. | ||
| NaCl (0,9%) | NaCl (0,2%) | NaCl (0,9%) | NaCl (0,2%) | |
| Контроль | 1,1 ± 0,2 | 1,1 ± 0,4 | 74,1 ± 2,1 | 109,7 ± 3,7 b |
| Ca2+ | 1,5 ± 0,1 a | 1,5 ± 0,2 a | 56,9 ± 1,1 a | 64,8 ± 1,2 a b |
a — достоверность различий по сравнению с контрольной группой (p<0,05);
b — достоверность различий по сравнению с изотоническим раствором (p<0,05).
На основании полученных данных были рассчитаны значения абсолютного и относительного мембранного резервов, которые представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Влияние кальция на мембранный резерв лейкоцитов
| Группа | Абсолютный мембранный резерв, мкм2 | Относительный мембранный резерв, % |
| Контроль | 136,4 | 50,9 |
| Ca2+ | 9,8 | 2,2 |
Как видно из таблицы 3, после инкубации клеток в растворе кальция доля используемого мембранного резерва снижалась на 48,7 % по сравнению с контролем. Интегральный анализ, полученных в данном эксперименте результатов, позволяет сделать вывод о том, что увеличение лейкоцитов в объёме при воздействии повышенной концентрации ионов Ca2+ происходит в условиях компактизации клеток и уменьшении их распластанности.
ВЫВОДЫ
1. Употребление воды с повышенным содержанием ионов кальция вызывает в клеточном составе крови изменения, характерные для неспецифической реакции активации: лимфоцитоз, нейтропению в периферической крови, тенденцию к увеличению доли коркового вещества надпочечников. Повышенное содержание ионов кальция в питьевой воде приводит к увеличению адгезионных свойств (снижение на 29 % величины гранулоцитарно-лимфоцитарного индекса) и фагоцитарной способности нейтрофилов, а также к снижению хемотаксической активности лейкоцитов (на 77,4 %). В сочетании с интенсивной мышечной нагрузкой происходит резкое увеличение хемотаксической активности лейкоцитов и более полное протекание осморегуляторных реакций лимфоцитов.
2. Интенсивная мышечная нагрузка вызывает неспецифическую реакцию переактивации, о чём свидетельствуют выраженный лимфоцитоз на 22 % и увеличение доли коркового вещества надпочечников на 4,2 %. Стимулирующее влияние интенсивной мышечной нагрузки на функциональные свойства лейкоцитов проявляется в увеличении их адгезионной, миграционной и поглотительной способностей.
3. Интенсивная мышечная нагрузка способствует наибольшей реализации мембранного резерва нейтрофилами (39,3 % против 29,7 % в контроле) по сравнению с двухфакторным воздействием и кальциевой нагрузкой. Отмеченная повышенная концентрация ионов кальция выступает в качестве компенсаторного механизма при действии интенсивной мышечной нагрузки.
4. Употребление воды с повышенным содержанием ионов кальция не оказывает влияния на геометрические характеристики лимфоцитов и нейтрофилов. Интенсивная мышечная нагрузка приводит к уменьшению диаметра (на 11,9 %), площади поверхности (на 22,5 %) и объёма (на 31,7 %) лимфоцитов, что также отражается на снижении величины используемого мембранного резерва лимфоцитами крови.
5. Показано, что в условиях in vivo осморегуляторные реакции как нейтрофилов, так и лимфоцитов незначительно выражены при кальциевой нагрузке. Тогда как при дополнительном воздействии мышечной нагрузки лимфоциты реагировали активнее нейтрофилов.
6. Показано, что в условиях in vitro увеличение объёма лимфоцитов при кальциевой нагрузке происходит в условиях компактизации клеток при уменьшении их распластанности. Ионы кальция эквивалентной концентрации, поступающие с питьевой водой, не оказывают влияния на морфометрические характеристики лимфоцитов крови.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для оценки адаптационных возможностей организма, а также выявления нарушений защитных реакций рекомендуется использование методик, характеризующих функциональные свойства и реактивность лейкоцитов.
2. Изучение функциональных свойств и резервных возможностей лейкоцитов имеет важное прогностическое значение в связи с участием этого клеточного пула в обеспечении защитных реакций организма.
3. Полученные данные о морфофункциональных преобразованиях лейкоцитов в изменённых условиях существования позволят обеспечить изыскание и выбор корригирующих средств, направленных на сохранение здоровья человека и животных.
4. При составлении схемы лечения заболевания и назначении лекарственных препаратов, содержащих кальций или влияющих на его баланс в организме, необходимо учитывать его непосредственное влияние на состояние мембраны лимфоцитов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в ведущих рецензируемых изданиях,
рекомендованных действующим перечнем ВАК
1. Федорова М.З., Павлов Н.А., Зубарева Е.В., Надеждин С.В., Симонов В.В., Забиняков Н.А., Тверитина Е.С. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфометрических показателей клеток крови // Биофизика, 2008, т. 53, вып. 6. – С. 1014-1018.
2. Павлов Н.А., Надеждин С.В. Реакции лейкоцитов крови крыс на растворимые и нерастворимые формы металлов в опытах in vivo и in vitro // Научные ведомости БелГУ, 2010, № 21 (92), вып. 13. – С. 103-106.
3. Михайлова С.Г., Павлов Н.А. Влияние кальциевой нагрузки на функциональные свойства лейкоцитов в опытах in vivo и in vitro // Научные ведомости БелГУ, 2011, № 15 (110), вып. 16. – С. 59-63.
Прочие публикации, содержащие основные научные результаты диссертации
4. Павлов Н. А. Адгезионные свойства лейкоцитов при адаптации организма к различным факторам среды // Сборник тезисов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2006. –С. 157.
5. Fedorova M. Z., Pavlov N. A., Zubareva E. V., Simonov V. V. Influence of ecological factors on the use of blood lymphocytes membrane reserve in the in vitro experiments // Journal of vascular research, 2008, v. 45, suppl. 2. – P. 96.
6. Надеждин С. В., Павлов Н. А., Яржомбек И. О., Харченко А. И. Изменение свойств мембраны лимфоцитов под влиянием ионов кальция // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Сборник материалов конференции. – Курск, 2011. – С.335-336.
7. Павлов Н. А. Роль ионов кальция в изменении реактивности и микро-реологических свойств лейкоцитов при изолированном действии и в условиях интенсивной мышечной деятельности. – М.: АЛЬПЕРИЯ, 2012. – 94 с.
Подписано в печать 17.05.13.
Печ.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 77
308503 п.Майский Белгородской области
Типография БелГСХА им. В.Я. Горина
