Тучные клетки в структуре медиастинальной плевры человека
На правах рукописи
ОВЧИННИКОВА
Анна Владимировна
ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ В СТРУКТУРЕ
МЕДИАСТИНАЛЬНОЙ ПЛЕВРЫ ЧЕЛОВЕКА
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток
2011
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования
«Владивостокский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Мотавкин Павел Александрович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Красников Юрий Александрович
ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России
кандидат биологических наук, доцент
Токмакова Наталья Павловна
ФГАОУ ВПО ДВФУ Минобрнауки России
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Дальневосточный государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Защита диссертации состоится «18» ноября 2011 года
на заседании диссертационного совета Д 208.007.01
при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России
по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Владивостокского государственного медицинского университета
по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2б.
Автореферат разослан «12» октября 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор Г.В. Рева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Здоровье и благополучие нации – главная забота государства и общества. Один из основных факторов неблагополучия в состоянии здоровья – нарастание аллергической нозологии (Бережная Н.М., 2003; Войткевич А.А., 1963). За последние годы значительно возросло количество таких системных заболеваний, как красная волчанка, склеродермия, неспецифический артрит. Высокая заболеваемость связана с факторами, нарушающими функции тучных клеток (Зуга М.В. с соавт., 1997; Быкова В.П., 1972; Арташян О.С. и др., 2006; Горышева Е.Н., Чага О.Ю., 1990). Этиология данных нозологических форм до настоящего времени до конца не изучена, прогноз неблагоприятный, лечение их отсутствует. История изучения тучных клеток насчитывает уже более 130 лет, однако вопрос об их функциях в физиологических и патологических условиях еще далек от окончательного разрешения (Гущин И.С., 1976; Клименко Н.А., Татарко С.В., 1995; Афанасьев Ю.И., Омельяненко Н.П., 2001).
Процесс старения – это отражение состояния соединительной ткани и тучных клеток как регуляторов местного гомеостаза, продуцентов межклеточного вещества, индукторов иммунофагоцитарного звена (Порядин Г.В. с соавт., 1991; Турыгин В.В. с соавт., 2004). В связи с этим мастоциты требуют на современном этапе более глубокого изучения. Мы исследовали эти клетки на препаратах медиастинальной плевры, которая занимает пограничное положение между легкими и органами средостения и имеет отношение к их физиологии и патологии (Зуга М.В., Мотавкин П.А., 2008). Препараты, приготовленные с плевры, дают возможность исследовать целые клетки в легких, получить наиболее полные данные. Помимо этого, мастоциты являются и регуляторами местного гомеостаза за счет обширных функциональных взаимодействий с клеточным окружением, наличием прямых и обратных связей с нервной, эндокринной и иммунной системами (Theoharides T.C., 1990, Линднер, 1980; Чебуркин А.А. и др., 2006; Мотавкин П.А., Каминский Ю.В., 1994; Черток В.М., Коцюба А.Е., 1993). Тучные клетки, экзоцитируя гистамин, являются активными участниками аллергических реакций, принимают участие в патогенезе бронхиальной астмы, отека Квинке, рецидивирующей крапивнице, нейродермите, которые предлагают выделить в особую группу болезней – мастопатии (Мотавкин П.А., Гельцер Б.И., 1994; Черток В.М. с соавт., 1994). Между тем, онтогенез этих клеток до сих пор до конца не изучен, а относительно медиастинальной плевры не известен.
Цель и задачи исследования. Для понимания этиологии таких болезней, а также морфогенеза, роста и дифференцировки рыхлой соединительной ткани, функций и значения ее клеток, в частности, мастоцитов, особое значение имеют возрастные (онтогенестические) исследования у человека. Поэтому, основная цель настоящей работы в том, чтобы установить время появления, максимального развития и инволюции тучных клеток медиастинальной плевры человека с учетом структурной организации этого органа.
В связи с этим в работе решались следующие задачи:
- Исследовать структурную организацию медиастинальной плевры.
- Установить возрастную динамику количественного содержания тучных клеток
- Выделить и обосновать наличие основных форм мастоцитов в тучноклеточной популяции плевры.
Научная новизна результатов исследования. Исследована в онтогенезе возрастная динамика количественного содержания тучных клеток. Выделены основные формы мастоцитов и установлено их соотношение во всех возрастных группах. Показа смена форм и размера клеток от плодов до старческого возраста, меняющееся количественное содержание биогенных аминов: максимальное в зрелом и минимальное в стареющем организме. Тучные клетки изучены с особенностями структуры, гемоциркуляции и иннервации медиастинальной плевры. Доказана иммуногенетическая функция этого органа.
Научно-практическая значимость работы заключается в том, что тучные клетки исследованы на онтогенестическом материале человека. Результаты исследования могут быть использованы аллергологии и иммунологии, где важным звеном патогенеза могут быть и являются тучные клетки. Использование этих данных может повысить эффективность лечебных мероприятий при аллергологической нозологии. Данные работы могут быть использованы в морфологии, физиологии и фармакологии для изучения новых лекарственных веществ, направленных на коррекцию функции иммунной системы, показателем регулирования которой могло бы служить состояние тучных клеток. Основное содержание работы использовано при чтении лекций и на лабораторных занятиях кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Владивостокского государственного медицинского университета.
Апробация материалов диссертации. Результаты выполненного исследования выложены на VII Всероссийской конференции «Бабухинские чтения» (Орел, 2009); Российской конференции «Проблемы и перспективы современной науки» (Томск, 2009); X Тихоокеанской научно-практической конференции (Владивосток, 2009); Четвертой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Новосибирск, 2009); XI Тихоокеанской научно-практической конференции (Владивосток, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 1 – в журнале, рекомендуемом ВАК для публикации материалов кандидатских и докторских диссертаций.
Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания материалов и методов исследования, главы, представляющей результаты собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 125 страницах, иллюстрирована 39 микрофотографиями, рисунками, графиками, таблицами. Список литературы включает 223 наименования, из них 120 – отечественных и 123 – зарубежных.
На защиту выносятся следующие положения:
- Структурная организация медиастинальной плевры: ее микроциркуляторная система, чувствительная и эффекторная иннервация; участие в иммуногенезе.
- Форма, величина, структура и количество тучных клеток медиастинальной плевры динамично меняются в онтогенезе.
- Выделены две основные формы мастоцитов: круглые и овальные на основании разной возрастной динамики, величины содержания биогенных аминов, структурной, относительной и максимальной энтропии.
Соответствие диссертации паспорту специальности. Согласно формуле специальности, клеточная биология, цитология, гистология – область науки, занимающаяся исследованием происхождения, строения, развития, функционирования клеток и тканей, их взаимодействия в процессе жизнедеятельности организма как в норме, так и при различных патологических нарушениях. Отраженные в диссертации научные положения соответствуют формуле и области исследования специальности 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Изучалась медиастинальная плевра человека в пяти возрастных группах (II триместр беременности (12-24 недель), III триместр беременности (25 недель-до рождения), юношеский возраст (17-21 год), первый зрелый возраст (22-35 лет), старческий возраст (75-90 лет). Медиастинальная плевра забиралась не позднее 6 часов. Изучалась морфология медиастинальной плевры, ее иннервация и васкуляризация. Согласно поставленным целям и задачам работы, основное исследование было направлено на изучение тучных клеток, их количества, структурного и функционального состояния. Медиастинальная плевра – это часть париетального листка. У корня легкого она переходит в висцеральный листок, а внизу в диафрагмальную часть париетальной плевры, в связи с чем легко получить исследуемый материал. Она функционально связана как с легкими, так и с другими органами: сердцем, пищеводом. В каждой группе были исследованы медиастинальные плевры от пяти человек. Плевра разрезалась на фрагменты площадью от 0,25 до 1 см2. Орган исследовался в полном виде, что давало возможность получить достоверные результаты.
При исследовании была использована окраска препаратов гематоксилин-эозином. Тучные клетки выявлялись метиленовым-синим, специфически окрашивающим гепариновые гранулы. Истинная ацетилхолинестераза (АХЭ) и псевдохолинестераза (ХЭ) исследовались методом Келле (1954). АХЭ определяли, используя в качестве субстрата ацетилтиохолин йодистый, а ХЭ выявляли с помощью бутирилтиохолина бромистого. Катехоламины и индолалкиламины тучных клеток выявляли методом Фурнесса и Коста (1954) с обработкой материала глиоксиловой кислотой. Препараты изучались под микроскопом «Люмам-2Р» в сине-фиолетовой части спектра. Источником света служила лампа ДРШ-250-3. Использовались светофильтры ДС-1 и СЭМ-7. Результаты фиксировались на фотопленке Микрат-300. Этим же методом с помощью фотометрической насадки ФМЭЛ-1А под микроскопом МЛ-2 в сине-фиолетовом спектре лучей с длинной волны 410 нм определяли суммарное содержание моноаминов в тканевых базофилах. Для исследования клеток одномоментно брали 5 препаратов каждой возрастной группы, измеряли мастоциты в 10 полях зрения при увеличении в 200 раз. Интенсивность люминесценции вычисляли по методике Боренбойма с соавт. (1966) по формуле:
I=U1- U0,
где I – интенсивность люминесценции (в условных единицах)
U1 – показания усилителя при фотометрировании тучных клеток
U0 – показания усилителя свободного от клеток участка препарата.
Для электронномикроскопических исследований материал фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида, изготовленного на фосфатном буфере (pH 7,3) и дополнительно в 1% растворе четырехокисного осмия. Материал заливали в смесь эпона-812 и эралдита. Изготовленные на ультратоме срезы контрастировали 3% уранилацетатом и затем ацетатом свинца и изучали под элетронным микроскопом.
Количество и размеры тучных клеток установлены с помощью компьютерной системы на микроскопе «OLIMPUS» по программе видео-тест – размер 5,0. Определялась средняя арифметическая стандартная ошибка, критерии различий. Коэффициент дегрануляции тучных клеток вычислялся путем деления дегранулирующих клеток на общее количество тучных клеток.
Таблица 1
Методы, объем исследований и количество приготовленных препаратов
| Методика | Объем исследований | Количество препаратов | |
| Гематоксилин-эозин | 5 | 10 | |
| Метиленовая синь | 15 | 30 | |
| Импрегнация по Кахалю | 6 | 12 | |
| Метод Келле | Ацетилхолинестераза | 4 | 4 |
| Холинестераза | 4 | 4 | |
| Метод Фурнесса и Коста | 10 | 10 | |
| Электронная микроскопия | 3 | 18 | |
Информационно-математические методы
Для получения информационной характеристики состояния исследуемых групп клеток по их форме, мы использовали частоту встречаемости круглых и овальных клеток. Количество случайных событий оценивали величиной их частоты. Для этого определяли отношение числа круглых (
) и овальных (
) клеток к общему числу тучных клеток в пяти (
) возрастных группах: 
, где 
- вероятность встречаемости j – ых клеток (клеток любой формы) (при j=1 – круглых, j=2 - овальных) в i – ой (любой) возрастной группе (
), 
- среднее число тучных клеток в в i – ой возрастной группе.
На основании этих данных рассчитали информационные показатели: структурную энтропию (H), коэффициент избыточности (R), относительную энтропию (h), максимальную энтропию системы (
) (Гланц С., 1999).
Общее состояние i – ой возрастной группы характеризуется информационной энтропией по частоте встречаемости круглых или овальных клеток. Данные значения вычисляли по формуле Шеннона для одиночного случая:
, где 
- значение показателя структурной энтропии для j – ых клеток (при j=1 – круглых, j=2 - овальных) в i – ой возрастной группе (
).
Для оценки степени неопределенности системы использовали понятие максимальной энтропии, которое определяется по формуле:
.
Показатель относительной энтропии h: 
;
Меру надежности биологической системы определяли, вычислив коэффициент избыточности или коэффициент относительной организации системы R: 
(Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002).
Сравнение выбранной совокупности с популяцией
Для сравнения выбранной нами совокупности с популяцией используем метод оценки с помощью 95% доверительного интервала для среднего значения. Доверительный интервал (ДИ) определяем как 
, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего, t – значение t – критерия для соответствующего числа степеней свободы 
и числа степеней свободы 
. В нашем случае t = 2,776445. Если рассчитанный ДИ не включает популяционное среднее, то с определенной долей уверенности (с вероятностью 95%) можно считать, что выборка статистически значимо отличается от генеральной совокупности.
Сравнение возрастных групп выбранной совокупности между собой
Для решения данной задачи используем метод расчета доверительного интервала для разности средних значений.
- рассчитаем среднеквадратичное отклонение для разности средних m
,
где m - среднеквадратичное отклонение.
- вычисляем границы ДИ для разности между средними значениями признака
в двух выборках: 
, где, t – значение t-критерия для соответствующего числа степеней свободы 
и числа степеней свободы 
.
Интерпретация результатов: если ДИ для разности средних включает ноль, то следует считать, что различия между группами по анализируемому признаку отсутствуют. Если 95% длительности ДИ не включают ноль, то следует считать, что различие между группами достоверно с вероятностью ошибки 
.
Проверка гипотезы о различии относительных величин
Требуется оценить значимость различия относительных величин частоты интересующего события в двух выборках. Для этого рассчитывается t – критерий Стьюдента по формуле:
,
где 
- относительная частота наступления события в первой и во второй выборках,
m - среднеквадратичная ошибка частоты наступления события в первой и во второй выборках, рассчитывается по формуле:
,
где n – число элементов в выборке.
Интерпретация результатов:
1) 
- различие не значимо.
2) 
- различие значимо.
Значение 
- критическое значение критерия Стьюдента при уровне значимости 
, числе степеней свободы 
. В данном расчете использовались значения 
(Гланц С., 1999).
Результаты исследования и их обсуждение
В каждом органе мастоциты, помимо общих и весьма характерных признаков в виде базофильной гранулосодержащей субстанции, имеют некоторые отличительные количественные и качественные характеристики, а также особенности топографии, зависящие от структуры ткани, плотности сосудисто-капиллярной сети, особенностей иннервации органа.
Ввиду изложенных обстоятельств, первоочередной вопрос, который мы считали решать – это исследование структурной организации медиастинальной плевры. В медиастинальной плевре можно выделить три слоя. Первый слой, обращенный в сторону легких, образован плоскими (до 0,5 мкм толщиной) мезотелиоцитами диаметром от 30 до 45 мкм. Довольно крупное пузырьковидное ядро с центрально расположенным ядрышком занимает до 1/3 клетки. Поверхность мезотелиоцита усеяна микроворсинками высотой около 9 нм, которые увеличивают выделительную и всасывательную поверхность. Надо полагать, что эти процессы совершаются с большой эффективностью и, очевидно, с немалой затратой энергии. Наличие большого числа мелких (от 0,5 до 1 мкм) митохондрий свидетельствует о высоких энергетических возможностях клетки.
Под эпителием располагается рыхлая соединительная ткань, которую довольно условно можно обособить как слой богатый клеточными элементами и тонкими пучками коллагеновых волокон. Рядом и вдоль последних лежат фибробласты с хорошо развитой шероховатой эндоплазматической сетью, что свидетельствует об активном синтезе проколлагена (Ахалая М.Я., 2006). Представлен весь набор клеток иммунной защиты. В ограниченном по величине солитарном лимфатическом узелке имеются лимфоциты (их большинство), единичные макрофаги с обилием лизосом и до 3-х – 5-ти плазматоцитов с богато развитой гранулярной эндоплазматической сетью. Все это указывает на то, что медиастинальнаую плевру можно считать иммуногенным органом (Хрущев И.Г., 1973; Юрина Н.А. Радостина А.И., 1990; Theoharides T.C., 1990). Вероятно, предположение о функциональном значении медиастинальной плевры, как органе иммуногенеза, сделан нами впервые. Наличие тучных клеток и эозинофилов, не являющихся иммуноцитами, но непременно участвующими в иммунных реакциях является лишним подтверждением вывода об иммунологических свойствах медиастинальной плевры (Юрина Н.А., Радостина А.И., 1990).
Глубокий слой состоит из параллельных пучков коллагеновых волокон, подстилаемых фиброцитами, завершающими структуру плевры. Этот слой, несмотря на тонкость, определяет механическую прочность плевры.
Медиастинальная плевра имеет кровеносные сосуды, составляющие микроциркуляторное русло. Обращают на себя внимание капиллярные эндотелиоциты, их сильно истонченная не ядерная часть цитоплазмы содержит пиноцитозные везикулы от 100 до 700 нм, что значительно превышает транспортные пузырьки в микрососудах других органов. Это еще одно свидетельство, указывающее на активную роль медиастинальной плевры в поддержании влажности в межплевральном пространстве, облегчающим экскурсию легких. Среди артериол преобладают сосуды замыкающего типа, способные эффективно регулировать кровоток – снижать и увеличивать наполнение кровью капилляров. Артериолы имеют холин- и моноаминергическую иннервацию. Наши данные подтверждают наличие в плевре моноаминергических нервных волокон, установленных ранее (Зуга М.В., Мотавкин П.А., 1997).
Вся медиастинальная плевра содержит густую сеть нервных волокон. Помимо эффекторных – холин- и адренергических, у густом нервном сплетении выделяются толстые проводники 12–15 мкм, очевидно, мякотные чувствительного типа. Их функция определяется достаточно точно – толстые волокна образуют терминали усовидного и клубочкового типа, в которых не трудно признать нервные рецепторы (Куприянов В.В., Мотавкин П.А., 1973). Они обеспечивают сигнализацию в соответствующие нервные центры о состоянии кровотока, обменных процессах в плевре, подвижности легких. Их особое значение состоит в том, что плевра является органом ноцицептивной чувствительности. Болевые сигналы воспринимаются не только концевыми нервными аппаратами, но и сетью тонких амиелиновых нервных волокон, которыми богата плевра.
Топография тучных клеток плевры имеет общие сходства с их расположением в других органах. Большинство мастоцитов локализовано около и по длине мелких кровеносных сосудов в ряд и по-одиночке. Сосудистых тучных клеток большинство. Помимо сосудистых мастоцитов имеются клетки свободно лежащие в плевре. Их меньше и топография их не имеет каких-то других особенностей. Из «тканевых» клеток (название условное) встречаются агрегаты из 3-5 мастоцитов преимущественно крупных размеров с единичными гигантскими клетками диаметром до 70 мкм. Мастоциты сходной величины зарегистрированы и в других органах в столь же малом количестве (Юрина Н.А. Радостина А.И., 1990).
В литературе мастоциты делят на несколько видов на основании уровня дифференцированности и функционального состояния (Виноградов В.В., Воробьева Н.В., 1973; Мотавкин П.А., Божко Г.Г., 1985; Мотавкин П.А., Черток В.М., Шульга С.Д., 1979). Мы обнаружили в медиастинальной плевре, за исключением регранулирующих клеток, все остальные типы. За основу выделения типов мы взяли три признака: а) количество специфических гранул и их положение; б) численность органелл, в частности митохондрий, и эндоплазматического ретикулума; в) цвета и величины гранул, указывающих на содержание гепарина (Виноградов В.В., Воробьева Н.В., 1973).
Юные мастоциты имеют вытянутое тело с наличием умеренно развитой гладкой эндоплазматической сети, малого размера шаровидных митохондрий, рассеянных по цитоплазме, центрально расположенное ядро с хроматином, лежащим широким слоем вдоль внутренней поверхности ядерной мембраны. Специфические гепариновые гранулы, расположенные небольшими группами на полюсах клетки, имеют малую электронную плотность и цвет от розового до синего, указывающий на разное содержание гепарина. Юные формы встречаются во всех возрастных группах, но численность их падает в стареющем организме, видимо из-за сокращенной миграции промастоцитов и их родительских форм из красного костного мозга (Kovanen P.T., 2009).
Второй тип образует группу созревающих мастоцитов. Их цитоплазму заполняют гранулы с плотным гепарином, шаровидной и редко вытянутой овальной формы. Большинство гранул крупные до 1-1,2 мкм, гранулы малого размера (0,3 мкм) значительно меньше. Гранулы рассредоточены по всей цитоплазме с широкими промежутками в которых можно видеть островки гладкого ретикулума, отдельные митохондрии и короткие трубочки с ограниченным числом рибосом шероховатой эндоплазматической сети. Электронная плотность большинства гранул высокая, их цвет густой синий.
Третий тип мы называем зрелым мастоцитом. Ядро клетки сдвинуто на периферию, цитоплазма густо заполнена гранулами разной электронной плотности, преимущественно крупных размеров. Помимо гранул шаровидной формы имеются вытянуто-овальные, иногда в преобладающих количествах, цитоплазма содержит небольшого размера митохондрии, элементы гладкого и редко шероховатого эндоплазматического ретикулума.
Четвертый тип – это дегранулирующие тучные клетки. Освобождение мастоцита от гранул совершается двумя способами: путем гранулолизиса и путем экскреции целых гранул. В обоих процессах принимают участие химазы мастоцита – протеаза и триптаза, делающие проходимой плазматическую мембрану, образующие для выхода гранул в межклеточную среду поры и каналы (Holgate S.T., 1996; Arbabian М., Graziano F.M., Jicinsky J., 1989).
Дегрануляция – это обычная реакция тучных клеток, легко устанавливаемая с помощью основных красителей. В зависимости от состояния ткани или органа она может рассматриваться как явление полностью физиологическое, участвующее в развитии и обновлении основного вещества, но может носить предельно выраженный характер с гиперсекрецией гистамина и химаз, и тогда считаться патологической. Например, при идиопатическом фиброзе и бронхиальной астме число мастоцитов увеличивается по сравнению с нормой (41 клетки на 1 мм2) во много раз (342 и 135 мм2 соответственно) и большинство из них дегранулирует (Fortoul T.I., Вarrios R., 1990). В наших исследованиях коэффициент дегрануляции имеет возрастную динамику и коррелирует с количественным содержанием мастоцитов в мм2 плевры. Он имеет наиболее высокие показатели и достоверные статистические различия при сравнении плодов III триместра, с юношеским и первым зрелым возрастом. В юношеском возрасте происходит рост легких, в чем непременно участвует вся плевра, включая и медиастинальную (Волкова О.В., Пекарский И.И., 1976; Ларюшкина А.В., Черток В.М., 2000). В первом зрелом возрасте происходит энергичная смена и замена основного вещества, учитывая, что его строители – фибробласты живут не более 1,5-2 года (Ахалая М.Я.,2006) (рис.1).
Рис. 1. Коэффициент дегрануляции тучных клеток.
Принимая во внимание два этих обстоятельства, можно, как мы полагаем, объяснить и высокий коэффициент дегрануляции мастоцитов и рассматривать его как физиологическое явление. Дегрануляция, заканчивающая жизненный цикл мастоцита характеризуется существенным изменением формы. Вокруг фрагментов клетки образуются лимфоидно-гистиоцитарные инфильтраты и не исключено наличие в них NK-киллеров, которые первыми оказываются около мертвого и, следовательно, инородного тела (Мотавкин П.А., 1992).
Долгое время считалось, что тучные клетки имеют один жизненный цикл и заканчивают его дегрануляцией. Поэтому мастоциты считали моноциклическими клетками (Виноградов В.В., Воробьева Н.В., 1973). О полицикличности клеток стали писать в 90-е года XX столетия (Юрина Н.А. Радостина А.И., 1990).
В клинической пульмонологии и экспериментальных исследованиях принято выделять и учитывать два типа мастоцитов – интактные и дегранулирующие (Wasserman S.I., 1990).
При исследовании тучных клеток у людей разного возраста обычно ограничиваются динамикой количественного состава и коэффициентом их дегрануляции. Проведенное нами изучение мастоцитов с более подробным морфометрическим и математическим анализом вскрыло новые весьма интересные закономерности.
При исследовании содержания клеток в равной площади (мм2) для всех возрастных групп вырисовывается следующая закономерность. Их меньше всего имеется у плодов II триместра. А затем содержание клеток последовательно повышается до первого зрелого возраста и достоверно по сравнению с ними снижается в старости. Содержание мастоцитов в этом возрасте достоверно превышает число клеток у плодов II и III триместра и уступает по абсолютному показателю, (но статистически не достоверно) при сравнении с юношеским возрастом (рис. 2).
Рис. 2. Количественное содержание тучных клеток в 1 мм2 в возрастных группах.
Полученная закономерность совпадает с возрастной динамикой, установленной для других органов (Зуфаров К.А., Садыкова З.Ш., Юлдашев М.А., Азизова Ф.Х., 2002). Между тем, в каждой возрастной группе меняется соотношение между малыми, средними и крупными клетками. Основной закономерностью следует считать снижение малых и нарастание числа мастоцитов с максимальной величиной, что согласуется с меняющейся величиной периметра клетки и ее площадью.
Увеличение числа крупных клеток по сравнению с мастоцитами малого размера можно рассматривать как возрастной компенсаторный процесс, не снижающего синтез гепарингликана, участвующего в поддержании структурно-функционального состояния основного межклеточного вещества соединительной ткани. Известно, что в стареющем организме все синтетические процессы заметно снижаются. Во всех возрастных группах встречались единичные палочковидные клетки, мастоциты в форме тонкого полуободка, исключая старческий возраст, где деформированные тучные клетки иногда выявлялись целыми полями. Мы относим их к клеткам, заканчивающим жизненный цикл. Возможно это были истощенные мастоциты, в процессе дегрануляции.
С возрастом меняются не только численные показатели, характеризующие популяцию в целом, но меняется и в количественных отношениях разная форма мастоцитов (рис. 3). Среди клеток мы выделили две основных – круглые и овальные мастоциты и подвергли их более
Рис. 3. Относительное содержание тучных клеток разной формы.
тщательным количественным исследованиям. Морфометрические исследования двух основных форм мастоцита – круглых и овальных показывают снижение первых и увеличение содержания вторых. Это происходит в связи со сменой с возрастом внутренней среды организма, что ведет к появлению новых эпигенетических факторов, которые определяют появление индуцибельных генов, характерных для определенной формы клеток.
В каждой из групп малые, средние и крупные мастоциты имеют свою возрастную динамику. Среди круглых форм происходит резкое снижение клеток с наименьшим диаметром: с 58,82% и 69,57% у плодов до 5% в возрасте 75-90 лет, т.е. около 11–13 раз.
Малые овальные мастоциты снижаются умереннее с 63,64% у плодов второй половины беременности до 22,58% у пожилых людей, т.е чуть меньше трех раз. Относительное содержание по возрастным группам колеблется не значительно, фактически остается статистически не достоверным (рис. 4).
Рис. 4. Относительное содержание тучных клеток малого размера.
Тогда как среди овальных мастоцитов среднего размера доля их возрастает с 23,53% до 55% (рис. 5).
Рис. 5. Относительное содержание тучных клеток среднего размера.
Крупные тучные клетки круглой и овальной формы у плодов нами не установлены. Содержание их в старческом возрасте увеличивается до 50,50% круглых и до 41,94% овальных (рис. 6).
Рис. 6. Относительное содержание тучных клеток крупного размера.
Согласно значений коэффициента формы клеток круглые мастоциты сохраняют постоянство формы на протяжении исследованного онтогенеза. В то же время тучные клетки овальной формы от возраста к возрасту увеличивают коэффициент формы, что указывает на возрастание размера и все большие отличает их от круглых мастоцитов (рис. 7).
Рис. 7. Коэффициент клеток круглой и овальной формы.
Исследование относительной, структурной и максимальной энтропий, а также коэффициента избыточности доказывает, что круглые и овальные мастоциты являются самостоятельными клеточными формами и не переходят одна в другую.
Таким образом, в процессе онтогенеза увеличивается число клеток крупного размера суммарно среди круглых и овальных с преобладанием последних и сокращается общая доля мастоцитов малого размера. У нас имеется лишь одно объяснение причины смены малых клеток на крупные мастоциты. Вероятно, увеличение клеток среднего и, особенно, крупного размера связано с активным функционированием органов дыхания во-первых, и во-вторых, суммарнoe сокращение мастоцитов, компенсируется крупными клетками, которые восполняют и в меньшем числе своевременный и достоверный синтез сульфатированного гликозаминогликана.
Следовательно, по ряду морфометрических параметров, тучные клетки – круглые и овальные отличаются друг от друга. Как указано в обзоре литературы, они располагают двумя группами медиаторов. Одна группа генетически обусловленная, представлена биогенными аминами: гистамином, серотонином, триптамином и дофамином. Другую группу составляют фенотипически индуцированные новой пространственной информацией – простагландины, лейкотриены, фактор активации тромбоцитов (Маркина Л.Д., 1981; Мелешкин С.В., Плейшаков В.П., 1974).
Мы исследовали биогенные амины, суммарно выявленные специфическим методом Фурнесса и Коста. Подвергнули их количественному люминесцентно-микроскопическому исследованию с целью установления наличия или сходства и возможных различий в химизме круглых и овальных мастоцитов. О наличии катехоламина, (например, дофамина), судили по наличию зеленой, а – индолалкиламинов, (например, серотонине) - желтой люминесценции. Хотя свечение не дает абсолютных представлений, оно позволяет все же судить о присутствии того или иного вещества. В наших исследованиях для решения поставленной задачи - различать круглые и овальные клетки, значение имели количественные показатели.
Содержание биогенных аминов в круглых клетках достоверно уменьшилось с возрастом. Если у плодов II триместра биогенные амины составили 12,11±0,26 условных единиц, то у людей старческого возраста сокращалось до 7,1±0,21. Суммарно вся популяция круглых клеток медиастинальной плевры теряла около 31% всех биогенных аминов. В овальных клетках количество биогенных аминов первоначально, включая юношеский возраст, увеличилось, а затем достоверно уменьшилось до 11,0±0,1, что было достоверно выше содержания биогенных аминов в круглых клетках соответствующего возраста. Суммарное содержание биогенных аминов в клетках овальной формы на всех исследованных этапах жизни человека превышало наличие таковых в элементах круглой формы (рис. 8).
Цветовой показатель люминесценции позволил с наибольшей достоверностью диагностировать различие биогенных аминов в круглых и овальных клетках. В круглых клетках цвет люминесценции постоянно был желто-зеленым, что указывало на присутствие катехоламина – дофамина, и индолалкиламина – серотонина. Овальные мастоциты только у плодов согласно их желто-зеленому свечению содержали биогенные амины тождественные круглым клеткам. На остальных возрастных этапах овальные клетки имели желтую люминесценцию и, видимо, были наполнены серотонином и триптамином. Мы не исключаем полностью наличия катехоламинов, их содержание могло экранироваться индолалкиламинами (Мотавкин П.А., Маркина Л.Д., Божко Г.Г., 1981). Кроме того, наличие в тучных клетках гистамина бесспорно на всех этапах онтогенеза и в обеих популяциях клеток. В наших исследованиях гистамин не учитывался.
Рис. 8. Распределение биогенных аминов в тучных клетках.
Таким образом, содержание биогенных аминов в клетках количественно и, вероятно, качественно имеет различия между овальными и круглыми мастоцитами. Морфометрические и цитохимические данные, полученные нами в отношении мастоцитов находятся в рамках парадигмы: форма это потенциальная функция. Воздействие катехоламинов и индолалкиламинов на ткани и органы происходит разными путями и через разные плазмолеммные рецепторы и вызывает неоднозначные ответные реакции.
В работе изложена структура, васкуляризация и иннервация медиастинальной плевры, топография, количественная и качественная характеристика тучных клеток, как регуляторов местного гомеостаза в пяти онтогенестических группах у человека.
ВЫВОДЫ
- Медиастинальная плевра как орган имеет тканевую, клеточную организацию, развитое микроциркуляторное русло, эффекторную и чувствительную иннервацию.
- В плевре установлены ограниченной величины солитарные лимфоидные фолликулы с наличием макрофагов, лимфоцитов и плазматических клеток. Преобладание плазмацитов с хорошо развитой шероховатой плазматической сетью свидетельствует об активной секреции антител, а плевру, согласно клеточного состава, можно считать органом иммуногенеза, что особенно имеет значение в детском возрасте.
- Плевра богата тучными клетками, содержание которых имеет онтогенестические закономерности: численность мастоцитов увеличивается в юношеском и зрелом возрасте и уменьшается в старости. При этом сокращается количество клеток малого размера и увеличивается содержание крупных мастоцитов.
- Качественными и количественными люминесцентно-микро-скопическими исследованиями в тучных клетках установлены биогенные моноамины, суммарное содержание которых с возрастом человека уменьшается и становится достоверно меньшим в старости. По цвету люминесценции идентифицированы катехоламины (зеленая люминесценция) и индолалкиламины (желтая люминесценция).
- Достоверно установлены две самостоятельные (очевидно генетически) формы мастоцитов: круглые и овальные, различающиеся по морфометрическим и математическим признакам:
а) в онтогенезе доля круглых тучных клеток уменьшается до 39,22%, а доля овальных тучных клеток увеличивается до 60,78%;
б) круглые клетки во всех исследуемых группах имеют одинаковый коэффициент формы, что свидетельствует о том, что их форма и размеры постоянны и не меняются в онтогенезе;
в) коэффициент формы овальных клеток прогрессивно увеличивается и достигает максимума в старческом возрасте. На протяжении онтогенеза овальные клетки сохраняют форму и увеличивают размеры;
г) в круглых клетках всех исследованных групп людей имеются катехоламины и индолалкиламины;
д) в овальных клетках оба вида аминов содержатся только у плодов второго триместра. В остальных возрастных группах идентифицированы индолалкиламины;
6. Исследования относительной, структурной и максимальной энтропии, а также коэффициента избыточности доказывает, что круглые и овальные клетки – это две самостоятельные независимые формы мастоцитов.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Овчинникова А.В., Коновко А.А., Едранов С.С. Реакция тучных клеток слизистой и серозной оболочек на повреждение // Тихоокеанский медицинский журнал. Владивосток, 2008. №1. С. 58–60.
2. Овчинникова А.В., Рева Г.В. Гистофизиология тучных клеток в онтогенезе человека // Альманах «Ретиноиды», Материалы VII Всероссийской конференции. Орел, 2009. №29. С. 45–47.
3. Овчинникова А.В., Рева Г.В., Филина Н.В. Характеристика тучных клеток человека // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: материалы IV Всероссийской науч.-практ. конф. с международным участием. Новосибирск, 2009. С. 204–205.
4. Овчинникова А.В., Холоденко Г.М., Рева Г.В. Особенности дегрануляции тучных клеток различных оболочек у человека // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы X Тихоокеанской науч.-практ. конф. Владивосток, 2009. С. 38–39.
5. Овчинникова А.В., Филина Н.В., Ващенко Е.В. Роль тучных клеток в процессе физиологической и репаративной регенерации соединительной ткани дренажной зоны глаза человека // Современный мир, природа и человек: сб. науч. трудов. Томск, 2009. С.25–28.
6. Овчинникова А.В., Холоденко Г.М., Рева Г.В. Количественная оценка и особенности дегрануляции тучных клеток различных оболочек у человека // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы XI Тихоокеанской науч.-практ. конф. Владивосток, 2010. С. 25.
Овчинникова Анна Владимировна
ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ В СТРУКТУРЕ
МЕДИАСТИНАЛЬНОЙ ПЛЕВРЫ ЧЕЛОВЕКА
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Подписано в печать 06.10.2011
Формат 6090 1/16. Усл. п.л. 1,0.
Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 677
Отпечатано на участке оперативной полиграфии
типографии ООО «Рея»
г. Владивосток, ул. Адм. Юмашева, 42б
