Роль прогениторных клеток костного мозга в ремоделировании левого желудочка при хронической сердечной недостаточности

На правах рукописи

ФАТХУДИНОВ Тимур Хайсамудинович

РОЛЬ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В РЕМОДЕЛИРОВАНИИ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук

Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Гольдштейн Дмитрий Вадимович

доктор медицинских наук,

профессор, чл. корр. РАМН Кактурский Лев Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна

доктор медицинских наук, профессор Шехтер Анатолий Борисович

доктор медицинских наук, профессор Яцковский Александр Никодимович

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии СО РАМН

Защита диссертации состоится «___» ________________2012 года в ____часов

на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул.Цюрупы, д.3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН

Автореферат разослан «____»________________ 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Крайне высокая распространенность сердечно-сосудистых заболеваний на сегодняшний день определяет актуальность изучения репаративной регенерации миокарда и методов, направленных на ее стимуляцию. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) занимает лидирующую позицию в структуре причин смертности населения в развитых странах мира и России [Агеев Ф.Е. и др., 2000, 2004]. Основными причинами развития ХСН являются ишемическая болезнь сердца (ИБС) и дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), в последнем случае ХСН отличается быстропрогрессирующим течением и неблагоприятным прогнозом [Шумаков В.И. и др., 2004]. В связи с этим существует необходимость в разработке принципиально новых методов лечения ХСН. Поэтому исследования в этом направлении имеют высокую медицинскую и социальную значимость.

Восстановительные процессы в миокарде обеспечиваются не только за счет образования рубца и гипертрофии сохранившихся кардиомиоцитов (КМЦ), но и участия резидентных и внесердечных прогениторных клеток [Bollini S. et al., 2001]. В репарации миокарда участвуют клетки крови, в том числе гемопоэтические и стромальные стволовые клетки, рециркулирующие из костного мозга [Dezawa M. et al., 2008]. По-прежнему остается неясным вопрос: обеспечивают ли эти клетки только реакцию стромы миокарда или все же они дифференцируются в КМЦ. Последнее предположение является основой концепции клеточной терапии миокарда, которая заключается в выделении и экспансии прогениторных клеток костного мозга и введении их в поврежденный миокард с целью замещения погибших КМЦ вновь образующимися [Dohmann H. et al., 2005, Behfar A. et al., 2010]. В работах многих авторов приводятся попытки доказать факт дифференцировки клеток костного мозга в КМЦ с помощью витального мечения и дифференцировочных маркеров [Perin E. et al., 2003, 2004, Ikegami Y. et al., 2010], но всегда остается открытым вопрос реутилизации метки и никогда нельзя исключить возможность слияния (fusion) клеток [Terada N. et al., 2002]. Поэтому сейчас самой распространенной, но убедительно не доказанной, является теория индукционной (паракринной) стимуляции регенерации при трансплантации прогениторных клеток костного мозга, которые, как известно, продуцируют большое количество цитокинов, факторов роста, дифференцировки, регулирующих репаративные процессы [Burchfield J.S. et al., 2008].

Недостаточно изученным является вопрос о влиянии экзогенных стволовых клеток на репарацию миокарда в отдаленные сроки после повреждения, в условиях постинфарктного кардиосклероза. Стоит ли нам ожидать кардиомиогенез после трансплантации клеток на данной стадии заболевания, когда микроокружение в области повреждения значительно отличается от такового в острый период и, вероятно, будет обусловливать иное поведение клеток.

Остается открытым вопрос: какие клетки костного мозга вносят больший вклад в репарацию миокарда, какой фенотип прогениторных клеток костного мозга лучше использовать для стимуляции репарации.

Несмотря на отсутствие четких представлений о механизмах репарации миокарда при трансплантации прогениторных клеток костного мозга, методы клеточной терапии миокарда активно изучаются в клинике и находятся на заключительных фазах клинических испытаний [Menasche P. et al., 2009]. Однако результаты, полученные в различных клинических исследованиях, неоднозначны и во многом противоречивы, и это обусловлено выбором неэффективных методов верификации результатов, неадекватных суррогатных точек для малых выборок и др.

Все вышесказанное свидетельствует об актуальности дальнейших исследований о роли прогениторных клеток костного мозга в репарации миокарда, что необходимо для разработки эффективных методов стимуляции регенерации.

Цель исследования – изучить участие трансплантированных интракоронарно различных типов прогениторных клеток костного мозга в репаративной регенерации миокарда при хронической сердечной недостаточности в эксперименте и клиническом исследовании.

Задачи:

1. Исследовать хоминг, выживаемость, локализацию, морфологию трансплантированных аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток костного мозга в сердце и других органах через 1 сутки, 2, 4, 8 нед. после введения при постинфарктном кардиосклерозе у крыс.
2. Определить направление дифференцировки трансплантированных аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток в условиях постинфарктного кардиосклероза.
3. Исследовать морфологию рубца в постинфарктном сердце через 2 и 4 недели после интракоронарного введения физиологического раствора, аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток.
4. Изучить динамику морфометрических параметров патологического ремоделирования левого желудочка через 2 и 4 недели после интракоронарного введения физиологического раствора, аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток.
5. Изучить неоангиогенез при репарации миокарда и участие в нем трансплантированных аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток.
6. Оценить возможные патоморфологические изменения в других органах, вызванные экспериментальным повреждением сердца и трансплантацией клеток.
7. Оценить изменения сократительной функции сердца после интракоронарной трансплантации аутогенных мононуклеарных клеток и ауто- и аллогенных мультипотентных стромальных клеток при постинфарктном кардиосклерозе у крыс.
8. Изучить безопасность и эффективность интракоронарной трансплантации аллогенных мультипотентных стромальных клеток при хронической сердечной недостаточности обусловленной дилатационной кардиомиопатией в пилотном клиническом исследовании.

Научная новизна

В настоящем исследовании изучена роль различных типов прогениторных клеток костного мозга в репаративной регенерации сердца при постинфарктном кардиосклерозе.

С помощью метода витального мечения трансплантированных клеток изучены направления миграции прогениторных клеток костного мозга. Показано, что даже после завершения воспалительных процессов в рубце сердца наблюдается хоминг клеток костного мозга. Количественно охарактеризовано распределение меченых клеток по органам при интракоронарной трансплантации клеток. Кроме сердца, клетки также активно заселяют селезенку, в печени и легких выявлены единичные меченые клетки.

Изучены направления дифференцировки трансплантированных клеток костного мозга в условиях экспериментальной модели постинфарктного кардиосклероза. Впервые были получены данные, свидетельствующие о дифференцировке трансплантированных в миокард клеток в фибробласты и миофибробласты. Полученные данные не подтверждают возможность дифференцировки клеток костного мозга в кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки при постинфарктном кардиосклерозе.

Трансплантация прогениторных клеток костного в отдаленные сроки после острого инфаркта миокарда, в условиях сформировавшегося кардиосклероза, обеспечивает стимуляцию фиброгенеза, но только в области рубца, и не приводит к экспансии фиброза в перифокальных зонах. Утолщение стенки левого желудочка в области рубца снижает напряжения на неповрежденные участки его стенки, что препятствует патологическому ремоделированию сердца.

Проведена сравнительная оценка безопасности и эффективности применения аутогенных нефракционированных мононуклеарных клеток и ауто- и алло-генных мультипотентных стромальных клеток костного мозга для лечения экспериментальной хронической сердечной недостаточности. Трансплантация аутогенных мультипотентных стромальных клеток обеспечивает стимуляцию ангиогенеза и обратного ремоделирования левого желудочка. Аллогенные мультипотентные стромальные клетки значительно уступают аутогенным по своей терапевтической активности, стимулируют ангиогенез и гипертрофию миокарда, не оказывая влияния на ремоделирование левого желудочка. По сравнению с мультипотентными стромальными клетками трансплантация мононуклеарных клеток неэффективна в отношении обратного ремоделирования левого желудочка.

Разработан протокол клинического исследования безопасности и эффективности аллогенной клеточной терапии больных хронической сердечной недостаточностью, обусловленной дилатационной кардиомиопатией, с тяжелым течением и неблагоприятным прогнозом. Предложенная тактика клеточной терапии оказалась безопасной в ближайший и отдаленный периоды наблюдения и приводит к снижению уровня мозгового натрий-уретического пептида и улучшению клинического состояния больных.

Научно-практическая значимость

Проведенное доклиническое исследование послужило экспериментальным обоснованием применения клеток костного мозга для лечения хронической сердечной недостаточности в клинической практике. Клиническое исследование продемонстрировало безопасность и эффективность предложенного метода клеточной терапии хронической сердечной недостаточности. В результате чего, было получено разрешение Минздравсоцразвития России на применение предложенного способа для лечения хронической сердечной недостаточности при дилатационной кардиомиопатии (Метод стимуляции репарации миокарда при дилатационной кардиомиопатии, ФС№2010/354 от 21 сентября 2010 г.).

Полученные научные данные о хоминге и направлениях дифференцировки клеток костного мозга при трансплантации в сердце при хронической сердечной недостаточности следует учитывать при разработке новых методов клеточной терапии.

Полученные данные могут быть использованы в процессе преподавания в вузах медицинского и биологического профиля по специальностям гистология, эмбриология, анатомия и патологическая анатомия.

Оригинальный способ интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации клеток может быть использован в научно-исследовательских разработках.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При постинфарктном кардиосклерозе ауто - и аллогенные прогениторные клетки костного мозга мигрируют в область повреждения, длительно выживают и не элиминируются иммунной системой после трансплантации. В сердце клетки костного мозга мигрируют в рубец, где они дифференцируются в фибробласты и миофибробласты и принимают участие в его формировании и перестройке, но не вызывают экспансию фиброза в перифокальных зонах.
2. В условиях постинфарктного кардиосклероза прогениторные клетки костного мозга, трансплантированные интракоронарно, не дифференцируются в кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки кровеносных сосудов.
3. Изолированные и культивированные аутогенные мультипотентные стромальные клетки обладают большими регенераторными потенциями по сравнению с аллогенными мультипотентными стромальными клетками и нефракционированными мононуклеарными клетками. Интракоронарная трансплантация аутогенных мультипотентных стромальных клеток приводит к стимуляции ангиогенеза и репаративных процессов миокарда, что проявляется в уменьшении дилатации левого желудочка, гипертрофии перифокального миокарда. Это обеспечивает улучшение функции сердца.
4. Интракоронарная клеточная трансплантация больным с тяжелой ХСН IIБ – III стадии при ДКМП является безопасным и эффективным методом лечения данного заболевания. При этом позитивный клинический эффект сохраняется в течение шести месяцев. Наиболее информативным критерием клинической эффективности клеточной терапии и эффективной суррогатной точкой является динамика уровня мозгового натрий-утретического пептида в плазме крови.

Внедрение в практику

Результаты проведенного исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на Кафедре гистологии и эмбриологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Российского национального исследовательского медицинского университета им. И.Н. Пирогова и Кафедре анатомии и гистологии животных ГБОУ ВПО Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина.

Степень личного вклада автора в результаты исследования

Автор планировал и непосредственно участвовал в проведении всех этапов экспериментального исследования, самостоятельно проводил сбор, обработку и анализ полученных данных, самостоятельно сформулировал основные положения диссертации. В клиническом исследовании автор принимал участие в разработке протокола клинического испытания, сборе и анализе данных, полученных при обследовании больных.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва, 2005), конференции «Реабилитационные технологии XXI века» (г. Саратов, 2006), Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (г. Москва, 2006), «Третьем Российском съезде интервенционных кардиоангиологов» (г. Москва, 2008), «Европейском конгрессе по стволовым клеткам» (г. Эдинбург, Великобритания, 2009), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (г. Москва, 2009), «Всемирном конгрессе по стволовым клеткам» (г. Сан-Франциско, США, 2010), на 5-ом конгрессе по регенеративной медицине (г. Лейпциг, Германия, 2011), на межлабораторной конференции НИИМЧ РАМН (ноябрь, 2011),

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 22 публикациях, из них – 10 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 3 патента РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, главы собственных исследований и их обсуждения, состоящей из 9 подразделов, заключения, выводов и списка литературы.

Объем диссертации составляет 265 страниц машинописного текста и включает 43 таблицы и 6 рисунков. Список литературы включает 348 источника, из которых 25 отечественных и 323 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа состоит из экспериментального и клинического исследований.

Экспериментальное исследование

Исследование выполнено в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии НИИ морфологии человека РАМН (протокол № 4 от 12.03.2008).

Всего в исследовании использовано 146 самцов крыс аутбредного стока Спрейг-Доули массой тела 180–200 г, полученных из питомника Филиал ИБХ РАН (г. Пущино). Всем животным проводили эксфузию костного мозга из бедренных и большеберцовых костей обеих задних конечностей. У всех животных воспроизводили ОИМ с 20-минутной реперфузией. Через 30 суток после моделирования ОИМ всем животным интракоронарным трансвентрикулярным способом вводили трансплантат (Табл. 1):

Через 1, 14, 30 и 60 суток после введения клеток оценивали безопасность и эффективность трансплантации с помощью функциональных и морфологических методов исследования.

Приготовление клеточного трансплантата

Эксфузию костного мозга выполняли под наркозом (кетамин + ксилазин, внутримышечно, в дозе 90-120 мг/кг + 10 мг/кг) путем пунктирования губчатого вещества бедренной и большеберцовой костей через полость коленного сустава.

Таблица 1. Группы исследования

Группа	Трансплантат	Кол-во животных				Кол-во клеток (млн. кл./кг)	Объем (мл/кг)	Конц. (кл./мл)
		Срок выведения из эксперимента (сут)
		1	14	30	60
Контроль	Физиологический раствор	0	13	14	0	0	5	0
МНК	Аутогенные МНК	4*	12+3*	11+3*	7*	25	5	5
аМСК	Аутогенные МСК	3*	11+3*	12+3*	4*	25	5	5
аллоМСК	Аллогенные МСК	4*	11+3*	12+3*	5*	25	5	5
Девит. клетки	Девитализирован-нные МНК	3*	0	0	2*	25	5	5
Общее количество животных на точку		14	56	58	18
Всего животных		146

Примечание: * - животные, которым вводили флуоресцентно-меченые клетки.

Выделение мононуклеарных клеток

Полученную костномозговую взвесь наслаивали на 3 мл раствора фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл) в стерильных 15 мл центрифужных пробирках. Пробирки центрифугировали при 1300 об/мин, 20 мин, 4 С. С помощью пипетки отбирали слой супернатанта непосредственно над слоем фиколла (интерфазное кольцо), в котором содержались мононуклеарные клетки и переносили в другую центрифужную пробирку со средой DMEM и снова центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин и удаляли супернатант.

Выделение и наращивание мультипотентных стромальных клеток

Культура МСК была выделена и охарактеризована согласно стандартным протоколам Лаборатории стволовых клеток ЗАО «Реметэкс» [Ржанинова А.А. и др., 2003]. При экспансии МСК проводили не более четырех пассажей при низкой посевной плотности. Полученные клетки замораживали в криозащитном растворе, содержащем 10 % высокоочищенный диметилсульфоксид и 90 % аутологичной сыворотки. Криопробирки помещали в программный замораживатель, где они подвергались охлаждению до - 80оС со скоростью 1 о/мин. После этого криопробирки помещали в емкость для хранения (сосуд Дьюара) и хранили в жидкой фазе азота до использования.

Приготовление клеточного трансплантата

Полученные МНК или МСК ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. На основании подсчета в камере Горяева полученное количество клеток разводили до концентрации 5 млн. кл./мл физиологического раствора. Жизнеспособность клеток определяли при окраске трипановым синим. В качестве трансплантата в контрольной группе использовали 1 мл физиологического раствора, жизнеспособность клеток в трансплантате составляла не менее 80%.

Приготовление трансплантата с девитализированными клетками

Полученные МНК ресуспендировали в 5 мл 4% раствора формалина на фосфатном буфере (pH=7,4) и инкубировали 30 мин при 4°С, после чего клетки отмывали от формалина многократным центрифугированием.

Витальное мечение клеток флуоресцентной меткой PKH26

Части животных вводили клетки, как живые, так и девитализированные, которые предварительно метили красной флуоресцентной мембранной меткой PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, Sigma), согласно протоколу производителя.

Модель постинфарктного кардиосклероза

Для моделирования постинфарктного кардиосклероза и хронической ХСН у крыс за 30 суток до трансплантации клеток воспроизводили трансмуральный инфаркт миокарда передней стенки и верхушки левого желудочка (ЛЖ) сердца по Селье [Selye H, 1960] с реперфузией. Животное наркотизировали смесью кетамин/ксилазин, внутримышечно в дозе 90-120 мг/кг + 10 мг/кг. Для обеспечения искусственной вентиляции легких проводили трахеальную интубацию и подсоединяли аппарат искусственной вентиляции легких (UGO BASILE, Rodent Ventilator).

Доступ к сердцу осуществляли по стандартной методике и накладывали лигатуру на левую коронарную артерию на 3 мм ниже ушка левого предсердия. При остром инфаркте на ЭКГ наблюдалось куполообразное поднятие сегмента ST, уменьшение зубца R или его замена комплексом QS. Также явным признаком развития окклюзии являлся цианоз передней стенки ЛЖ. После проведения 20 минутной окклюзии послойно ушивали операционную рану.

Интракоронарная трансвентрикулярная трансплантация

Клеточный трансплантат в опытных группах или физиологический раствор в контрольной вводили однократно через 30 суток после ОИМ в полость ЛЖ через катетер, введенный через наружную сонную артерию катетер, при кратковременном пережатии аорты ниже ее устья и места отхождения правой и левой коронарных артерий. Это обеспечивало во время сердечного выброса попадание трансплантата в коронарные кровеносные сосуды, а не в системный кровоток. Трансплантат вводили в полость ЛЖ в объеме 0,2 мл, после восстановления нормального давления в левом желудочке процедуру повторяли для введения всего объема трансплантата (1 мл, 5 млн. кл./мл).

Исследование функции сердца

Толерантность животных к физическим нагрузкам была изучена в тесте плавания перед трансплантацией и перед выведением животных из эксперимента.

ЭКГ регистрировали с помощью системы мониторирования “HemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) при наложении электродов на правую переднюю лапу, грудь и правую заднюю лапу. С помощью программы “AnalyzeHemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) рассчитывали параметры сигнала ЭКГ.

Артериальное давление и давление в левом желудочке сердца определяли с помощью электроманометрических датчиков DTXTM Plus TNF-R, Becton Dickinson и системы мониторирования “HemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия). С помощью программы анализа сигналов давления “AnalyzeHemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) были рассчитаны среднее артериальное давление, максимальное левожелудочковое давление и индексы контрактильности.

Морфологическое исследование

Выведение животных из эксперимента проводили в СО2-камере. При вскрытии исследовали полости тела и внутренних органов. Фиксировали органы, указанные в Табл. 2.

Таблица 2. Органы, исследованные различными морфологическими методами

Методы / Органы	Сердце	Печень	Легкие	Селезенка
Флуоресцентная микроскопия	50	50	50	50
Патоморфологическое исследование	96	96	96	96
Морфометрическое исследование	96	-	-	-
Имуногистохимическое исследование	24	-	-	-
Всего	266	146	146	146
	704

Селезенку, печень и легкие животных контрольной и опытных групп проводили стандартным способом: заливали в парафин и делали срезы толщиной 5-7 мкм на 3 разных уровнях, выбранных случайным образом. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Сердца животных заливали в парафин и делали серийные поперечные срезы толщиной 5-7 мкм на 10 уровнях на протяжении от верхушки сердца до предсердий. Препараты окрашивали пикросириусом красным для характеристики рубца и по Маллори для подсчета кровеносных сосудов. При морфометрическом исследовании серийных поперечных срезов сердец проводили измерения и рассчитывали следующие показатели [ Zhan-Qiang Shao, 2006]:

• Относительная площадь рубца = Площадь рубца/ Площадь стенки ЛЖ*100.
• Индекс дилатации ЛЖ = Площадь полости ЛЖ/Общая площадь ЛЖ*100.
• Индекс гипертрофии = Толщина стенки перифокальной области/Толщина стенки межжелудочковой перегородки*100.
• Толщина стенки в области рубца = Толщина стенки ЛЖ в области рубца /Толщина стенки межжелудочковой перегородки*100.

Из органов животных, которым вводили меченные PKH26 клетки, после криофиксации делали криосрезы и проводили анализ миграции клеток в органах с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss), подсчитывая количество меченых клеток в 50 полях зрения в каждой группе.

Иммунногистохимическое исследование

Для иммуногистохимического исследования использовали моноклональные антитела (Abcam) к CD68 (мембранный маркер макрофагов), Ki67 (ядерный маркер пролиферации), Fap (мембранный маркер реактивных фибробластов), ASMA (-гладкомышечный актин). В исследовании использовали как крио-, так и парафиновые срезы. Инкубацию с первичными антителами в разведении, рекомендуемом производителем, проводили в течение 24 часов при 4 °C. В качестве системы визуализации использовали биотин-стрептавидин-пероксидазный комплекс (инкубация в течение 20 мин.), ядра докрашивали гематоксилином Караччи.

Клиническое исследование

Исследование было проведено на основании решения Ученого совета (выписка из протокола заседания Ученого совета №4/1 от 28 марта 2005 г.) и Этического комитета (выписка из протокола заседания Локального этического комитета №32 от 3 июля 2008 г.) РНЦХ им. академика Б.В. Петровского РАМН и в соответствии с положениями Хельсинской декларации от 2000г. От всех пациентов было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Всего в исследование были включены 14 больных с ХСН, обусловленной ДКМП. Больных рандомизированно распределили в две подгруппы: основную (n=6), которым выполнили трансплантацию клеток и контрольную (n=8), которым проводили только медикаментозное лечение.

Характеристика групп

Все больные ХСН, включенные в исследование, были сопоставимы по клинико-функциональным, эхокардиографическим и лабораторным характеристикам. У всех пациентов отмечали клинические признаки застойной сердечной недостаточности по обоим кругам кровообращения: одышку, отеки нижних конечностей, гепатомегалию. У всех пациентов имелась выраженная дилатация полостей сердца, средний конечно-диастолический объем левого желудочка составил 256,3±91,9 мл в основной группе и 250,9±101,1 мл в контрольной группе. Уровень мозгового натрий-уретического пептида (brain natriuretic peptide, BNP) – объективного показателя, отражающего степень выраженности сердечной недостаточности, превышал норму в 8,9 раза в основной группе и в 9,2 раза в контрольной группе. Прогноз для жизни таких пациентов в случае изолированного медикаментозного лечения оставался крайне неблагоприятным [Krum H., 2005].

Клеточный трансплантат

Выделение и культивирование МСК костного мозга выполнялось в Лаборатории стволовых клеток ЗАО «Реметэкс» по утвержденному протоколу[Ржанинова А.А. и др., 2003]. По специфическим позитивным (CD44, CD90, CD105) и негативным (CD34, CD45) маркерам МСК определяли фенотип полученных культур. На данную методику было получено разрешение Минздравсоцразвития России («Способ получения и хранения культуры мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека» ФС №2010/288 от 5 августа 2010 г.).

Клеточную суспензию 1х109 клеток в 10 мл разводили до 50 мл в физиологическом растворе и вводили в левую и правую коронарные артерии с объемной скоростью 100 мл/час в условиях ангиографической лаборатории.

Методы исследования

Через 1 неделю, 1, 3, 6 и 12 месяцев всем пациентам проводили стандартное базовое клинико-лабораторное обследование. Критериями оценки эффективности лечения являлись: сократительная функция миокарда, концентрация мозгового натрий-уретического пептида (BNP), газотранспортная функция, толерантность к физическим нагрузкам и др.

Ключевым показателем эффективности клеточной терапии был уровень BNP в плазме крови.

Трансторакальное ЭхоКГ исследование выполняли на аппарате Vivid-7 Dimension (GE, USA) датчиком 3 – 3,5 МГц с одновременной регистрацией одного стандартного отведения ЭКГ.

Для оценки качества жизни использовались два опросника: миннесотский опросник «Жизнь с сердечной недостаточностью» (MLHFQ) и индекс активности (Duke Activity Status Index – DASI).

Статистический анализ

Определяли средние значения и стандартные ошибки среднего для абсолютных и процентных показателей. Абсолютные показатели при условии нормального распределения сравнивали с помощью критерия Стьюдента, при распределении, отличном от нормального, использовали тест Манна-Уитни. Сравнения процентных показателей проводили с помощью рангового однофакторного дисперсионного анализа Краскала-Уоллиса. Достоверность различий до и после вмешательства внутри одной группы оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона. Статистический анализ проводили с помощью программы SigmaPlot 11.0. Различия считали значимыми при достигнутом 5% уровне достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты экспериментального исследования

Смертность животных

Предложенная экспериментальная модель постинфарктного кардиосклероза и интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации характеризуется значительной инвазивностью и тяжело переносилась животными как опытной, так и контрольной групп. После операции по моделированию ОИМ и трансплантации погибло от 34,5 до 51,9% оперированных животных в разных группах, при этом различия с контрольной группой были не достоверны (z-тест, p>0,05). Животные погибали во время или через 1-2 дня после операций, что, очевидно, связано с тяжестью оперативного вмешательства при моделировании ОИМ и трансплантации. Кроме того, гибель животных отмечали и после теста на толерантность к физическим нагрузкам, что также, вероятно, связано с тяжестью клинического состояния животных.

Толерантность к физическим нагрузкам в тесте «Плавание»

Толерантность к физическим нагрузкам, определяемая по продолжительности плавания животных, является количественным показателем состояния функциональных систем организма, в особенности сердечно-сосудистой. Улучшение функционального состояния сердечно-сосудистой системы наблюдали после трансплантации как аутогенных, так и аллогенных МСК (Рис. 1).

Рис. 1. Динамика толерантности к физическим нагрузкам крыс после трансплантации клеток, по оси ординат - продолжительность плавания в минутах.

Примечание: * - p<0,05 при сравнении с контрольной группой

# - p<0,05 при сравнении с предыдущим сроком

Хоминг трансплантированных клеток костного мозга

Через 1, 14, 30 и 60 суток после трансплантации меченые клетки были выявлены в области повреждения. Это свидетельствует о том, что трансплантированные клетки выживали и активно мигрировали в область повреждения. По-видимому, в отдаленные сроки после ОИМ в области рубца сохраняется достаточная концентрация хемоатрактантов, обуславливающая иммобилизацию и хоминг клеток костного мозга [Askari A.T. et al., 2003]. При разработанном способе трансвентрикулярной интракоронарной трансплантации через 15 мин после введения меченые клетки можно было видеть в просвете кровеносных сосудов сердца, при этом клетки равномерно распределялись по коронарным сосудам всех тканей сердца и прикреплялись к их стенкам.

Через 1 сутки после трансплантации меченые клетки выявляли только в области повреждения сердца. При этом клетки локализовались в рубце и не были обнаружены в сохранившихся участках некроза и перифокальной области. Меченые клетки имели фибробластоподобный фенотип и располагались между пучками коллагеновых волокон.

При разработанном способе введения клетки попадали не только в венечный кровоток, но и в большой круг кровообращения, так как не все клетки во время сердечного выброса при пережатой аорте вымывались из полости ЛЖ. Во время следующего сердечного выброса они оказывались в большом круге кровообращения. Поэтому меченые клетки мы обнаруживали не только в сердце, но и в других органах. Мы исследовали наличие меченых клеток в селезенке, печени и легких, так как в последних, по данным литературы, чаще обнаруживают системно трансплантированные клетки [Grgaard H.K. et al., 2007; Hale S.L. et al., 2007].

Через 14 сут. после трансплантации характер распределения клеток по органам в разных опытных группах не различался (Рис. 2). Независимо от типа трансплантата большую часть меченых клеток обнаруживали в сердце и селезенке. Селезенку, по-видимому, клетки заселяли при попадании клеток в системный кровоток и, возможно, путем активной миграции трансплантированных клеток костного мозга в естественную для них нишу. Учитывая количество выявленных меченых клеток в печени и легких, можно предположить, что клетки костного мозга пассивно заносились в эти органы из системного кровотока.

Рис. 2. Распределение меченых трансплантированных клеток по органам через 14 и 30 сут. после введения крысам с постинфарктным кардиосклерозом, по оси ординат - количество меченых клеток в поле зрения (37070 кв. мкм.).

Примечание: * - p<0,05 при сравнении групп

Наибольший графтинг наблюдался при трансплантации аутогенных МНК. Это может быть обусловлено разнообразием клеточных популяций входящих в клеточный трансплантат. В состав мононуклеарной фракции костного мозга, кроме МСК, входят гемопоэтические клетки-предшественники, а также все ядросодержащие клетки костного мозга, которые могут мигрировать в область повреждения и принимать участие в воспалительных и репаративных процессах. Этим же можно объяснить высокую степень заселения МНК селезенки.

Значительный графтинг в миокард отмечали при трансплантации аутогенных МСК. При этом доля меченых клеток, выявленных в селезенке, была достоверно меньше, чем при трансплантации МНК. Таким образом, большая часть трансплантированных аутогенных МСК мигрировала и сохранялась в тканях сердца.

Минимальный графтинг был выявлен при трансплантации аллогенных МСК, причем во всех исследуемых органах. Это может свидетельствовать об элиминации аллогенных клеток иммуной системой.

Однако при гистологическом исследовании в опытных и контрольной группах не было выявлено признаков отторжения трансплантата и активной элиминации клеток, о чем свидетельствует отсутствие признаков воспаления и сохранение меченых клеток в рубце в течение двух месяцев без изменений их локализации и морфологии. При окрашивании препаратов моноклональными антителами (МАТ) к CD68 макрофаги обнаруживали в области рубца, как в опытной, так и контрольной группах. При этом единичные меченые клетки окрашивались МАТ к CD68, что может свидетельствовать как об их фагоцитозе, так и об их принадлежности к клеткам миелоидного ряда. Таким образом, можно утверждать, что в группе трансплантированных клеток макрофагальная инфильтрация рубца была выражена не более, чем в контрольной группе.

Через 30 суток трансплантированные клетки сохраняли свою локализацию в зоне повреждения. При оценке динамики количества меченные клеток в сердце через 14 и 30 сут. (Рис. 2) отмечали уменьшение количества МНК и аллогенных МСК на 30 сут. Количество меченых аутогенных МСК при этом не изменялось. На основании этого можно утверждать, что аутогенные МСК более длительно приживались в области повреждения. В селезенке, напротив, можно было видеть больше МНК, которые, по-видимому, активно мигрировали сюда из сердца.

Через 60 суток после трансплантации во всех опытных группах в сердце и других органах были выявлены меченые клетки. Трансплантированные клетки сохраняли жизнеспособность в течение всего наблюдения и не элиминировались иммунной системой. Во-первых, о жизнеспособности клеток свидетельствует сам факт хоминга, во-вторых, на срезах клетки, несущие флуоресцентную метку, имели вид неповрежденных, в-третьих, вокруг трансплантированных клеток не было выявлено выраженной лимфо-макрофагальной инфильтрации. Единичные клетки, возможно, элиминировались макрофагами, о чем свидетельствует окрашивание МАТ некоторых флуоресцентномеченых клеток, но при этом не было выявлено морфологических признаков реакции отторжения трансплантата.

Для исключения пассивной миграции в область повреждения и влияния на репаративные процессы девитализированных клеток было проведено исследование возможного хоминга этих клеток. Через 1 сутки после трансплантации ни одной меченой клетки не было выявлено в сердце, ни в области повреждения, ни в зоне нормального миокарда. В печени и легких также не было обнаружено меченых клеток. В красной пульпе селезенки можно было видеть единичные клетки. Через 60 суток после трансплантации девитализированные клетки уже не обнаруживали ни в одном из исследованных органов. Таким образом, не было получено данных, свидетельствующих о возможности пассивной миграции девитализированных клеток в ткани сердца при интракоронарном введении.

Пути дифференцировки трансплантированных клеток

Одним из основных вопросов при изучении роли клеток костного мозга в репарации миокарда является возможность этих клеток дифференцироваться в специализированные клетки сердца. Могут ли стромальные или гемопоэтические клетки-предшественники дифференцироваться в КМЦ, клетки кровеносных сосудов или другие немышечные клетки? In vitro показана возможность дифференцировки и тех и других в КМЦ, эндотелий, гладкомышечные клетки и др. Однако в условиях in vivo это совершенно не очевидно, и возможность этого по-прежнему обсуждается.

В нашем экспериментальном исследовании не было получено каких-либо данных, свидетельствующих о дифференцировке клеток костного мозга в специализированные клетки сердечной мышцы. Об этом свидетельствовали, прежде всего, локализация меченых клеток и их морфологические характеристики.

Не было обнаружено ни одного рабочего КМЦ, который в составе своей мембраны или цитоплазмы имел бы флуоресцентную метку. В перифокальном миокарде меченые клетки выявляли только в окружающей КМЦ соединительной ткани. Ни одной меченой клетки не было найдено в области неповрежденного миокарда. При такой локализации и морфологии, даже если меченые клетки положительно окрашивались МАТ к дифференцировочным маркерам КМЦ, можно утверждать, что трансплантированные клетки в течение двух месяцев эксперимента не дифференцировались в функционирующие рабочие КМЦ.

Также меченые клетки не выявляли в составе стенок новообразованных кровеносных сосудов рубца. Во внутренней и средней оболочках артерий, вен и капилляров не было обнаружено ни одной меченой клетки. Это позволяет утверждать, что трансплантированные прогениторные клетки костного мозга не принимают участия в образовании новых кровеносных сосудов рубца, не дифференцируются ни в эндотелиальные, ни в гладкомышечные клетки. Трансплантированных клеток также не было выявлено в составе кровеносных сосудов неповрежденного миокарда.

Учитывая локализацию и морфологию выявленных меченых клеток, мы предположили, что трансплантированные нами нативные прогениторные клетки костного мозга дифференцируются в фибробласты рубца. На сегодняшний день отсутствует специфический иммуногистохимический маркер фибробластов, который позволил бы нам отдифференцировать фибробласты от других клеток мезенхимного происхождения в сердце. В результате иммуногистохимическое исследование было проведено с помощью МАТ к маркеру реактивных фибробластов Fap (Fibroblast activated factor ) [Egeland T. et al., 2007]. Этот маркер специфичен для реактивных фибробластов, которые появляются при заживлении ран, формировании грануляционной ткани, некоторых саркомах и активно экспрессируют гомодимеры Fap.

В нашем исследовании Fap-позитивные клетки в значительном количестве обнаруживали в рубце как опытных, так и контрольной групп. Эти клетки, очевидно, представляют собой активные фибробласты, синтезирующие коллаген, и активно участвуют в формировании рубца. При этом некоторые меченые клетки окрашивалась МАТ к Fap, что свидетельствует о дифференцировке части трансплантированных клеток в реактивные фибробласты. Трансплантация клеток, в особенности аутогенных МСК, приводила к увеличению количества этих клеток в рубце.

При окрашивании криосрезов МАТ к –гладкомышечному актину (-SMA), которые избирательно окрашивали не только гладкомышечные клетки средней оболочки кровеносных сосудов, но и фибробластоподобные клетки, располагающиеся в толще рубца. Последние можно идентифицировать как миофибробласты, т.е. разновидность фибробластов, которые наряду с продукцией компонентов межклеточного вещества соединительной ткани способны к сокращению. Среди гладкомышечных клеток кровеносных сосудов не было обнаружено меченых клеток. А при сопоставлении флуоресцентномеченых клеток и клеток, окрашенных МАТ, было выявлено, что некоторые меченые клетки в рубце окрашиваются МАТ к -SMA, т.е. являются миофибробластами. При подсчете миофибробластов в рубце, было выявлено, что их количество возрастает после трансплантации клеток.

Таким образом, наше предположение, что трансплантированные клетки дифференцируются в клетки фибробластического дифферона подтвердились тремя фактами. Во-первых, все меченные клетки локализовались между пучками коллагеновых волокон, и флуоресцентная метка не выявлялась в составе КМЦ и внутренней и средней оболочки кровеносных сосудов. Во-вторых, меченые клетки имели характерный фибробластоподобный фенотип. В-третьих, часть меченых клеток положительно окрашивались МАТ к маркерам реактивных фибробластов и миофибробластов.

Морфология рубца постинфарктного сердца

Через 14 и 30 суток после трансплантации клеток (44 и 60 сут. после ОИМ) во всех группах в области передней и боковой стенок левого желудочка наблюдали сформированные обширные очаги фиброзной ткани. Объем поражения миокарда ЛЖ варьировал у разных животных и определялся размером ОИМ при перевязке левой нисходящей коронарной артерии (Рис. 3). Рубец был представлен плотной фиброзной тканью с толстыми пучками коллагеновых волокон, вдоль которых располагались немногочисленные клетки веретеновидной формы. Фиброзная ткань рубца имела нечеткую границу с перифокальной зоной, пучки коллагеновых волокон располагались между мышечными волокнами. У некоторых животных формировалась хроническая аневризма передней и/или левой стенки левого желудочка. По краям от аневризмы или рубца отмечали выраженную гипертрофию миокарда, у некоторых животных, напротив, наблюдали истончение стенки ЛЖ с дилатацией его полости. КМЦ перифокальной зоны были увеличены в размерах, часто двуядерные, гипертрофированы. Размеры рубца, толщина стенки аневризмы, дилатация полости ЛЖ варьировали у разных животных. В контрольной группе рубец был рыхлого строения, чаще наблюдали сформированную аневризму ЛЖ и менее выраженную гипертрофию перифокального миокарда. Во всех опытных группах рубец был более компактным, пучки коллагеновых волокон были более толстыми и имели регулярную пространственную ориентацию.

Рис. 3. Постинфарктный кардиосклероз через 44 сут. после ОИМ, световая микроскопия, окрашивание пикросириусом красным, А – панорама поперечного среза сердца в контрольной группе, х25, В – панорама поперечного среза сердца в группе аутогенный МСК, х25.

Учитывая, что трансплантированные клетки мигрировали в рубец, выживали и дифференцировались в фибробласты и миофибробласты, мы предположили, что эти клетки могут принимать участие в формировании и перестройке рубца.

При трансплантации МНК и аутогенных МСК общее количество клеток в рубце было достоверно больше, чем в контрольной группе и при трансплантации аллогенных МСК. После трансплантации МНК «клеточность» была выше, чем при введении аутогенные МСК, что может быть связано с большим графтингом этих клеток. Аллогенные МСК, по-видимому, постепенно элиминировались иммунной системой, так как через 30 сут. после трансплантации общее количество клеток рубца в этой группе уменьшалось. В остальных группах «клеточность» на разных сроках после ОИМ не изменялась (Рис. 4). Таким образом, можно предположить, что увеличение общего количества клеток в рубце обусловлено присутствием трансплантированных клеток.

Пролиферацию клеток в рубце оценивали с помощью иммуногистохимического окрашивания МАТ к Ki67, маркеру пролиферации. При этом в рубце, эпикарде и кровеносных сосудах было выявлено значительное количество пролиферирующих клеток и в контрольной, и опытных группах. В перифокальном и нормальном миокарде МАТ Ki67 окрашивали только немышечные клетки в перимизии. В рубце некоторые меченые клетки также окрашивались этими антителами. Количество пролиферирующих клеток в рубце увеличивалось после трансплантации клеток, в особенности аутогенных МСК. Таким образом, трансплантация клеток приводила к стимуляции пролиферации клеток в рубце, и, кроме того, сами трансплантированные клетки сохраняли пролиферативную активность.

О зрелости рубца можно судить по соотношению толстых и тонких пучков коллагеновых волокон. После окрашивания гистологических препаратов пикросириусом красным при микроскопии в поляризованном свете толстые пучки коллагеновых волокон (коллаген I типа) выглядят красными, а тонкие (коллаген III типа) – зелеными. Сотношение «красных» и «зеленых» пучков коллагена рассматривали как морфометрический показатель зрелости рубца [Dayan D. et al., 1989].

При сравнении толщины пучков коллагеновых волокон в рубце опытных и контрольной групп было показано, что через 14 сут. после трансплантации во всех опытных группах рубец был более зрелым (Рис. 4). Через 30 сут. этот показатель выравнивался во всех группах. Таким образом, можно утверждать, что созревание рубца за счет трансплантированных клеток происходит более интенсивно. При этом сохраняется высокая плотность клеток в рубце, что свидетельствует о его активной перестройке.

Рис. 4. Динамика общего количества клеток и соотношения толстых и тонких пучков коллагеновых волокон в рубце после трансплантации, по оси ординат – количество клеток и доля (%) толстых пучков коллагеновых волокон.

Примечание: * - p<0,05 при сравнении с контрольной группой

# - p<0,05 при сравнении с предыдущим сроком

Трансплантация клеток на стадии сформированного постинфарктного кардиосклероза обеспечивает активацию ремоделирования рубца и его созревания. Интракоронарно введенные клетки мигрируют только в рубец, дифференцируются в фибробласты и миофибробласты, активно синтезируют компоненты межклеточного вещества, способствуют его упорядоченной организации и наращиванию прочности рубцовой стенки.

Обратное ремоделирование левого желудочка сердца

Обширная гибель миокарда и последующее его замещение рубцовой тканью приводит к активации компенсаторных механизмов, которые запускают процесс, так называемого, ремоделирования ЛЖ. И этот процесс продолжается в течение всей жизни больного после ОИМ [Беленков Ю.Н.,2000; Никитин Н.П. и др., 1999; Lindpaintner K.et al., 1992]. Под ремоделированием ЛЖ понимают структурно-геометрические изменения сердечной мышцы в процессе адаптации к новым условиям функционирования [Blyakhman F.A. et al., 1995].

Основываясь на фактах хоминга и дифференцировки трансплантированных клеток в функционально активные клетки рубца, участия клеток костного мозга в перестройке рубца, целесообразно было предположить, что трансплантация клеток может препятствовать патологическому ремоделированию и даже способствовать обратному ремоделированию. Для подтверждения этой гипотезы было проведено морфометрическое исследование панорам поперечных срезов сердца на 10 уровнях от верхушки до основания ЛЖ (Рис. 5.).

Относительная площадь рубца через 14 сут. после трансплантации не различалась между группами. Через 30 сут. после трансплантации аутогенных МСК размер рубца был достоверно меньше, чем в контрольной группе и при введении МНК. Но при этом показатель не изменился по сравнению с предыдущим сроком. При трансплантации МНК через 30 сут. отмечали наибольшую относительную площадь рубца.

Толщина стенки ЛЖ в области рубца не различалась между группами через 14 сут. после трансплантации, а через 30 сут. наблюдали утолщение рубцовой стенки после трансплантации МНК и аутогенные МСК, чего не наблюдали в контрольной группе и при введении аллогенных клеток. По-видимому, трансплантация МНК стимулирует фибропластические процессы, как в рубце, так и перифокальном миокарде. А аутогенные МСК стимулируют фиброз только в рубце, тем самым укрепляя его стенку. Толщина рубцовой стенки в контрольной группе не изменялась на протяжении всего исследования.

Более выраженная гипертрофия перифокального миокарда была выявлена только через 30 сут. после трансплантации МСК, как аутогенных, так и аллогенных. В контрольной группе и при трансплантации МНК этот морфометрический показатель не изменялся во времени и не различался между группами. Учитывая направление миграции и дифференцировки трансплантированных клеток, гипертрофия перифокального миокарда, по-видимому, стимулировалась за счет паракринной индукции [Hongzhe L. et al., 2009]. Вероятно, МСК продуцируют большее количество паракринных факторов, действующих на перифокальные КМЦ.

Индекс дилатации является интегральным показателем, отражающим патологическое ремоделирование ЛЖ. Так как на его значения влияют размер и толщина рубца, степень гипертрофии перифокального миокарда, а также состояние стенки всего ЛЖ. Как видно на диаграмме (Рис. 5), прогрессирующее патологическое ремоделирование наблюдали в контрольной группе и при трансплантации МНК, так как индекс дилатации в этих группах был больше, чем в группах с введением МСК уже через 14 сут. после трансплантации, а через 30 сут. значительно увеличился. Трансплантация аутогенных МСК, напротив, приводила к уменьшению дилатации ЛЖ 14 суто., и эта тенденция сохранялась и через 30 сут., т.е. наблюдалось обратное ремоделирование ЛЖ. Трансплантация аллогенных МСК не вызывала изменений этого морфометрического показателя на всех сроках наблюдения.

Рис. 5. Динамика морфометрических показателей ремоделирования ЛЖ после трансплантации, по оси ординат – значение соответствующих индексов в процентах.

Примечание: * - p<0,05 при сравнении с контрольной группой

# - p<0,05 при сравнении с предыдущим сроком

Таким образом, трансплантация клеток не приводит к уменьшению размера рубца ЛЖ, что является закономерным, если учитывать отсутствие кардиомиогенеза за счет трансплантированных клеток. Последние были выявлены только в рубце и принимали активное участие в его перестройке. Однако только трансплантация аутогенных МСК приводила к обратному ремоделированию ЛЖ по всем основным морфометрическим показателям, характеризующим этот процесс. Несмотря на то, что и МНК, и МСК мигрируют в область повреждения и дифференцируются в клетки фибробластического дифферона, не во всех группах факт миграции приводит к обратному ремоделированию ЛЖ. Гипертрофию перифокального миокарда наблюдали также только при трансплантации аутогенных и аллогенных МСК. Вероятно, стимуляция гипертрофии происходит за счет паракринных факторов, продуцируемых МСК в области повреждения. Так, было показано, что через неделю после трансплантации МСК в перифокальной зоне происходит активация (фосфорилирование) p70S6 протеинкиназы (МАПК, митоген-активированная протеин киназа), ключевого медиатора клеточной гипертрофии [Hongzhe L. et al., 2009].

Трансплантация прогениторных клеток костного мозга на стадии постинфарктного кардиосклероза стимулирует фибропластические процессы в рубце. Стимуляция фиброзообразования может носить как отрицательный, так и положительный характер. Все определяется местом стимуляции фибропластических процессов. Повышение активности фибробластов и миофибробластов в перимизии перифокального и отдаленного миокарда приводит к экспансии рубца, прогрессированию патологического ремоделирования и формированию аневризмы. Стимуляция фиброза непосредственно в рубце, сопровождающаяся его утолщением без экспансии в перифокальную зону, приводит к укреплению стенки сердца в области рубца. Утолщение стенки ЛЖ, обусловленное как гипертрофией, так и утолщением рубца, приводит, в соответствии с законом Лапласа, к уменьшению напряжения на стенки ЛЖ. Более того, даже при любом давлении в аорте и объеме левого желудочка постнагрузка на волокна миокарда обратно пропорциональна толщине миокарда. Снижение напряжения стенок ЛЖ, в особенности, постнагрузка, уменьшает прогрессирование патологического ремоделирования или даже способствует обратному ремоделированию.

Ангиогенез, участие в нем трансплантированных клеток

В нашем исследовании не было получено данных, свидетельствующих о дифференцировке трансплантированных клеток ни в эндотелий, ни в гладкие миоциты кровеносных сосудов. Но при этом после трансплантации клеток наблюдали выраженную стимуляцию ангиогенеза (Рис. 6).

Через 14 сут. после трансплантации количество кровеносных сосудов между контрольной группой и при введении МНК не отличалось. Достоверно большим было количество кровеносных сосудов после введения аутогенных МСК. Через 30 сут. во всех опытных группах количество кровеносных сосудов превышало таковое в контрольной. Наибольшее количество сосудов наблюдали при введении аутогенные МСК.

Более показательным, чем определение количества кровеносных сосудов, является оценка объемной плотности, так как при увеличении площади кровеносного сосуда уменьшается их количество в поле зрения (Рис. 6). Через 30 сут. во всех опытных группах объемная плотность была выше, чем в контрольной. Но после трансплантации аутогенных МСК отмечали уменьшение объемной плотности по сравнению с предыдущим сроком при увеличении количества кровеносных сосудов, что свидетельствует о созревании кровеносных сосудов и образовании сосудов артериального типа.

Рис. 6. Динамика количества и объемной плотности кровеносных сосудов в рубце после трансплантации, по оси ординат – количество кровеносных сосудов и доля (%) площади кровеносных сосудов к площади поля зрения.

Примечание: * - p<0,05 при сравнении с контрольной группой

# - p<0,05 при сравнении с предыдущим сроком

Рубец является динамической структурой, и для ее ремоделирования, адаптации к новым условиям гемодинамики и функционирования сердца также необходимо адекватное кровоснабжение. При трансплантации клеток, в особенности МСК, как аллогенных, так и аутогенных наблюдали выраженную стимуляцию ангиогенеза. Это, по-видимому, также внесло существенный вклад в укрепление рубцовой стенки и гипертрофию перифокального миокарда. По-видимому, основным механизмом стимуляции ангиогенеза является синтез и выделение трансплантированными клетками ангиогенных факторов, таких, как VEGF, Ang1 и 2, FGF, PDGF и др. [Kinnaird T. et al., 2009], что происходит при трансплантации как аутогенных, так аллогенных клеток костного мозга.

Морфологические изменения в других органах после острого инфаркта миокарда и трансплантации клеток костного мозга

У животных, погибших на ранних сроках после моделирования инфаркта миокарда, отмечался обширный некроз передней стенки ЛЖ сердца. При вскрытии животных через 1, 14, 30 и 60 суток после трансплантации у всех животных отмечали рубцовые изменения верхушки, передней и боковой стенок ЛЖ. Выраженных макроскопических изменений других органов, их размеров и массы не наблюдалось.

В селезенке, печени и легких наблюдали слабо выраженные признаки ХСН, которые можно рассматривать как реактивные в рамках постинфарктного кардиосклероза, отмечали их с одинаковой частотой и выраженностью во всех группах.

Других патологических признаков, очагов воспаления, очагов фиброза, образования оссификатов или карнификатов, опухолевых образований в исследованных органах выявлено не было.

Результаты клинического исследования

Проведенное экспериментальное исследование продемонстрировало безопасность и эффективность трансплантации аутогенных и аллогенных МСК при ХСН у крыс. Это послужило доклиническим обоснованием применения данного подхода в клинической практике и позволило нам провести ограниченное пилотное клиническое исследование. В исследование были включены больные с тяжелой ХСН (III-IV ФК по NYHA), обусловленной ДКМП. Выбор варианта клеточного трансплантата был обусловлен продемонстрированной в эксперименте безопасностью применения аллогенных МСК. Несмотря на то, что аутогенные МСК показали более выраженную терапевтическую активность в отношения ХСН, нами было принято решение трансплантировать аллогенные клетки. Т.к. ДКМП ассоциирована с целым рядом генетических мутаций [Olson TM., 2006], применение для клеточной терапии аутогенных клеток, несущих в себе эти мутации, может не привести к положительным результатам. Кроме того, для МСК показано, что они являются иммунопривилегированными, не несут на своей поверхности антигены главного комплекса гистосовместимости II класса, обладают иммуносупрессивной и противовоспалительной активностью [Ryan J.M. et al., 2005].

Безопасность интракоронарной аллогенной трансплантации мультипотентных стромальных клеток костного мозга

Для оценки безопасности трансплантации 1х109 аллогенных МСК определяли следующие возможные осложнения: нарушения сердечного ритма, тромбоз или эмболии коронарной артерии, иммунные реакции. Для выявления осложнений в отдаленный послеоперационный период (в течение года) проводилось комплексное обследование пациентов.

После интракоронарной трансплантации у всех больных в течение суток мониторировали ЭКГ. При этом не было зафиксировано желудочковой тахикардии или иных опасных для жизни нарушений ритма и проводимости. Ишемию миокарда, возможную в результате тромбоза или эмболии коронарных сосудов, оценивали по смещению сегмента ST, концентрации ферментов – маркеров лизиса КМЦ: АСТ, АЛТ, КФК.

Интраоперационно и в ближайшем послеоперационном периоде клинически ни одного приступа стенокардии не выявляли ни у одного из пациентов, подъема или депрессии сегмента ST также не наблюдали, отсутствовали изменения комплекса QRS. Лабораторные маркеры ОИМ находились в пределах нормальных значений и не изменялись по сравнению с исходным уровнем.

Непосредственно до и после трансплантации клеток проводили диагностическую ангиокоронарографию, признаков тромбоза и эмболии выявлено не было.

Трансплантация клеток не вызывала значимых изменений гемодинамики. Среднее систолическое АД до введения клеток, непосредственно после трансплантации и через 1 сут. и 7 сут. достоверно не изменялось.

В отдаленный послеоперационный период при проведении комплексного обследования не было выявлено признаков обострения заболеваний, несвязанных с основным, включая онкологические.

Таким образом, интракоронарная трансплантация аллогенных МСК является безопасной процедурой как в ранний, так отдаленный послеоперационный периоды.

Эффективность интракоронарной аллогенной трансплантации мультипотентных стромальных клеток костного мозга

Функциональное состояние сердечно-сосудистой системы

Функциональное состояние больных оценивали при помощи теста 6-ти минутной ходьбы, который позволяет определить толерантность больных к физической нагрузке. В обеих группах через неделю после подбора оптимальной медикаментозной терапии в сочетании с трансплантацией клеток и без нее наблюдали достоверное увеличение толерантности к физическим нагрузкам по сравнению с исходным уровнем. Дистанция 6-ти минутного теста увеличилась в опытной группе на 63,9%, а в контрольной на 48,6% (Рис. 7). В опытной группе положительная динамика сохранялась и через 1 и 3 месяца, при этом в контрольной с 1 по 12 месяцы наблюдали отрицательную динамику с уменьшением дистанции ходьбы существенно ниже исходно уровня. В опытной группе ухудшение функционального состояния совпадало с ухудшением клинического статуса пациентов. К 6 месяцу значительно снижалась толерантность к физическим нагрузкам, а к 12 месяцу этот показатель возвращался к исходному уровню.

Функциональный класс ХСН по NYHA (New York Heart Association) является расчетным показателем и определяется по результатам теста 6-минутной ходьбы или по пиковому потреблению кислорода. Мы определяли функциональный класс по толерантности к физической нагрузке, и, соответственно, аналогичная динамика наблюдалась нами при оценке данного показателя.

Рис. 7. Динамика толерантности к физическим нагрузкам и функционального класса ХСН по NYHA больных после трансплантации клеток и больных, получавших только медикаментозное лечение, по оси ординат – количество метров за 6 минут ходьбы и функциональный класс по NYHA.

Примечание: * - p<0,05 при сравнении с контрольной группой

# - p<0,05 при сравнении с предыдущим сроком

Положительная динамика функционального состояния больных в опытной и контрольной группах через 1 неделю наблюдения объясняется подбором оптимальной терапии и усилением контроля за ней. В опытной группе положительная динамика сохранялась до 3 месяцев, тогда как в контрольной группе к 1 месяцу уже развивалась отрицательная динамика функционального состояния. Таким образом, можно утверждать, что аллогенная трансплантация МСК костного мозга приводит к улучшению функционального состояния пациентов. Положительная динамика функционального состояния по срокам совпадала с позитивными изменениями клинического состояния: улучшение функционального и клинического статусов больных развивалось постепенно и достигало своего максимума через 1-3 месяца после трансплантации клеток. Далее оно сохранялось на достигнутом позитивном уровне примерно до 6-7 месяцев отдаленного периода, после чего проявлялась тенденция к постепенному ухудшению.

Уровень мозгового натрий-уретического пептида в плазме крови

Наиболее информативным и прогностически ценным в диагностике ХСН являются натрий-уретические пептиды [Suzuki E. t al., 1992]. Как известно, в норме предсердный натрий-уретический пептид синтезируется секреторными КМЦ предсердий и играет ключевую роль в регуляции объема циркулирующей крови и тонуса сосудистой стенки. При развитии заболеваний сердца, в особенности ХСН, КМЦ ЛЖ начинают синтезировать BNP. Содержание в крови BNP, являясь наиболее информативным маркером прогрессирования и дисфункции ХСН, коррелирует с функциональным классом сердечной недостаточности, концентрация BNP повышается пропорционально угрозе остановки сердца и является прогностическим показателем летального исхода. Поэтому уровень BNP часто используется в качестве суррогатной точки при клинических испытаниях эффективности лекарственных средств в отношении ХСН.

В норме уровень BNP не превышает 100 пг/мл. У больных, включенных в наше исследование, среднее значение этого показателя в плазме крови составило 895,6±126,7 и 924,2±201,3 пг/мл в опытной и контрольной группах соответственно, что превышало норму более чем в 8,9 раз. Это еще раз подтверждает тяжесть состояния и неблагоприятный прогноз у больных, включенных в исследование.

Динамика изменения уровня BNP во многом повторяла изменения функционального и клинического состояния пациентов. Уже через неделю после трансплантации клеток уровень BNP достоверно снизился до 687,3±70,8 пг/мл (Рис. 8). В контрольной группе наблюдали незначительное снижение уровня этого показателя, но уже через 1 месяц он начинал прогрессивно увеличиваться и к концу наблюдения достигал 1403,9±182,7 пг/мл, что свидетельствовало о прогрессировании ХСН и соответствовало субъективными показателями. В опытной группе уровень BNP сохранялся на исходном уровне в течение всего года и был достоверно меньше, чем в контрольной группе.

Рис. 8. Динамика уровня мозгового натрий-уретичесткого пептида в плазме крови после трансплантации клеток и больных, получавших только медикаментозное лечение, по оси ординат – концентрация BNP в плазме крови пг/мл.

Примечание: * - p<0,05 при сравнении с контрольной группой

# - p<0,05 при сравнении с предыдущим сроком

Таким образом, трансплантация аллогенных МСК уже через неделю приводила к снижению концентрации BNP, и в дальнейшем, в течение всего периода наблюдения, он оставался близким к исходному уровню. Это может свидетельствовать о стабилизации состояния пациента и отсутствии прогрессирования заболевания. В контрольной группе, напротив, наблюдали прогрессирование ХСН, что подтверждалось и другими показателями. Можно утверждать, что прогноз у больных опытной группы был более благоприятным.

Сократительная функция левого желудочка сердца

Показателями сократительной функции ЛЖ являются фракция выброса (ФВ) и ударный объем (УО) ЛЖ, определяемые с помощью эхокардиографии (ЭхоКГ). В течение всего периода наблюдения статистически достоверной разницы между группами по этому показателю выявлено не было. Исходно в опытной группе ФВ была ниже, чем в контрольной, 20,5±1,6 и 26,1±6,0 соответственно. В опытной группе наблюдали незначительное увеличение ФВ, тогда как в контрольной группе, напротив, снижение, но выявленные изменения были статистически не достоверные.

Значимым изменением ФВ считается 5%. Повышение ФВ на 5% наблюдали в опытной группе на 3 месяце наблюдения, но при этом достоверных различий между показателями в опытной и контрольной группах не было. В контрольной группе к 12 месяцу наблюдения ФВ, напротив, снизилась на 5%, но различия также не достоверны.

УО – это объем крови, выбрасываемый ЛЖ за одну систолу, также характеризует насосную функцию сердца. Соответственно динамике изменений ФВ различий между группами на всех сроках наблюдения также не было выявлено. Наблюдалось его увеличение в опытной группе и уменьшение в контрольной, но при этом отличия от исходного уровня не достоверны.

Остальные эхокардиографические показатели ремоделирования ЛЖ также не изменялись после трансплантации клеток. Такими же они оставались и в контрольной группе, хотя клинические проявления прогрессирования ХСН отмечали с помощью других методов обследования.

Таким образом, после трансплантации клеток не происходило обратного ремоделирования ЛЖ и насосная функция сердца не изменялась. Единственное, что можно утверждать, что она оставалась на постоянном уровне в течение года. Необходимо отметить, что полученный результат клеточной терапии для пациентов со II-IV ФК ХСН по NYHA с крайне неблагоприятным прогнозом можно рассматривать как положительный.

Интракоронарная трансплантация аллогенных мультипотентных стромальных клеток больным с тяжелой ХСН на фоне ДКМП не сопровождается какими-либо осложнениями и побочными эффектами и, следовательно, является безопасной процедурой. Клеточная трансплантация позволяет уменьшить тяжесть сердечной недостаточности. Положительный эффект развивается, начиная с первой недели после трансплантации, и длится до 6 месяцев, поэтому целесообразно проводить повторные трансплантации клеток. Клеточная терапия аллогенными МСК повышает эффективность предоперационной подготовки больных, а также улучшает результаты оперативного лечения ХСН при дилатационной кардиомиопатии.

Учитывая результаты экспериментального исследования, можно предположить, что основную роль в уменьшении степени выраженности сердечной недостаточности при трансплантации клеток сыграл индукционный паракринный эффект. Трансплантированные клетки выделяют большое количество биологически активных веществ, которые влияют как на микроокружение, стимулируя КМЦ реципиентов, так и на весь организм в целом, влияя на гуморальные механизмы развития ХСН [Burchfield J., Dimmeler S., 2008]. В нашем исследовании мы наблюдали уменьшение сердечной недостаточности, что и отразилось на уровне BNP и функциональном и клиническом состоянии пациентов.

Однако выявлено отсутствие взаимосвязи между динамикой BNP и эхокардиографическими показателями. Вместе с тем, другие диагностические методы, к которым относятся уровень мозгового натрийуретического пептида в плазме крови, 6-минутный тест, пиковое потребление кислорода в большей степени коррелируют с клиническим улучшением и прогнозом при ХСН [Li N., Wang J.A., 2006].

Необходимо отметить, что на протяжении всего периода наблюдения после трансплантации показатели насосной функции сердца, а также размеры и объемы левого желудочка, не ухудшались. Таким образом, можно предположить, что благодаря клеточной трансплантации была достигнута стабилизация состояния и предотвращено дальнейшее прогрессирование сердечной недостаточности.

Выводы

1. При хронической сердечной недостаточности в условиях экспериментального постинфарктного кардиосклероза и в клинических наблюдениях дилатационной кардиомиопатии трансплантированные интракоронарно прогениторные клетки костного мозга стимулируют репаративную регенерацию сердца, что приводит к улучшению его функции.
2. На экспериментальной модели постинфарктного кардиосклероза установлено, что трансплантированные интракоронарно витально-меченые прогениторные клетки костного мозга мигрируют в область повреждения и участвуют в репаративных процессах. В течение двух месяцев трансплантированные клетки сохраняют жизнеспособность и локализуются в сердце только в области рубца. Трансплантированные клетки также активно заселяют селезенку, в легких и печени выявляются только единичные меченые клетки.
3. При постинфарктном кардиосклерозе трансплантированные клетки костного мозга не дифференцируются в кардиомиоциты и клетки кровеносных сосудов, что подтверждается отсутствием в них флуоресцентной метки трансплантированных клеток. В рубце прогениторные клетки костного мозга дифференцируются в фибробласты и миофибробласты с характерной локализацией и морфологией. Часть меченых трансплантированных клеток экспрессируют иммуногистохимические маркеры реактивных фибробластов и миофибробластов.
4. Прогениторные клетки костного мозга принимают активное участие в формировании и ремоделировании рубца, что проявляется в увеличении общего количества клеток, их пролиферативной активности, повышении степени зрелости коллагеновых волокон и утолщении стенки левого желудочка в области рубца, но не приводит к экспансии фиброза.
5. По сравнению с аллогенными клетками интракоронарное введение аутогенных мультипотентных стромальных клеток приводит к более выраженной стимуляции репаративных процессов миокарда и обратному ремоделированию левого желудочка. После трансплантации аутогенных клеток через 2 и 4 нед. наблюдается уменьшение дилатации полости левого желудочка, утолщение стенки левого желудочка в области рубца и гипертрофия перифокального миокарда.
6. При трансплантации мононуклеарных клеток костного мозга утолщение стенки левого желудочка в области рубца сопровождалось увеличением дилатации левого желудочка, что свидетельствует о прогрессировании патологического ремоделирования.
7. Трансплантация прогениторных клеток костного мозга стимулирует ангиогенез в рубце, что проявляется увеличением количества и объемной плотности кровеносных сосудов. Трансплантированные меченые клетки не обнаруживаются в стенке новообразованных кровеносных сосудов. Более выраженная стимуляция ангиогенеза обеспечивается при трансплантации аутогенных мультипотентных стромальных клеток.
8. Интракоронарное введение прогениторных клеток костного мозга экспериментальным животным с постинфарктным кардиосклерозом обеспечивает улучшение сократительной функции сердца, что проявляется увеличением показателей системного и внутрижелудочкового давления, индекса контрактильности левого желудочка и толерантности к физическим нагрузкам.
9. Трансплантация прогениторных клеток костного мозга не сопровождается патологическими изменениями в сердце, селезенке, печени и легких. В исследуемых органах животных опытных и контрольной групп были выявлены морфологические признаки общего хронического венозного полнокровия.
10. В клиническом исследовании показано, что интракоронарная трансплантация аллогенных мультипотентных стромальных клеток больным дилатационной кардиомиопатией с тяжелой хронической сердечной недостаточностью IIБ – III стадий приводит к улучшению клинического состояния больных, увеличению толерантности к физическим нагрузкам, пикового потребления кислорода и уменьшению уровня мозгового натрийуретического пептида в плазме крови. Выявленный положительный клинический эффект развивается с первой недели после трансплантации клеток и сохранялся в течение шести месяцев после чего состояние больных возвращается к исходному уровню. Определения уровня мозгового натрий-уретического пептида является наиболее информативным показателем эффективности клеточной терапии, так как статистически достоверных изменений основных эхокардиографических показателей не выявлено.
11. Интракоронарная трансплантация аллогенных мультипотентных стромальных клеток больным дилатационной кардиомиопатией с хронической сердечной недостаточностью является безопасной процедурой. При наблюдении больных в течение года после трансплантации клеток не выявлено каких-либо осложнений и побочных эффектов.

Практические рекомендации

1. Интракоронарный трансвентрикулярный способ трансплантации клеток позволяет эффективно вводить клетки в коронарные сосуды мелким лабораторным животным.
2. Интракоронарная трансплантация аллогенных МСК больным с ХСН при ДКМП является безопасным и эффективным способом лечения и может входить в состав комплексного лечения ХСН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кириллов А.М., Фатхудинов Т.Х., Дьячков А.В., Коротеев А.В., Гольдштейн Д.В., Бочков Н.П. Трансплантации аллогенных клеток при лечении пациентов с дилатационной кардиомиопатией // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2007. – №4. – с.226-231.
2. Бокерия Л.А., Беришвили И.И., Вахромеева М.Н., Гольдштейн Д.В., Фатхудинов Т.Х., Ржанинова А.А., Солнышков И.В., Быченко А.Б. Трансмиокардиальная лазерная реваскуляризацмя в сочетании с трансплантацией аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у повторных больных с диффузным поражением коронарных артерий, Предварительное исследование // Бюллетень научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН Сердечно-сосудистые заболевания. – 2008. – т. 9. – № 3. – с.71-85.
3. Фатхудинов Т.Х., Дьячков А.В., Коротеев А.В., Гольдштейн Д.В., Бочков Н.П. Безопасность и эффективность трансплантации аллогенных мультипотентных стромальных клеток при хирургическом лечении дилатационной кардиомиопатии // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2009. – №4. – с.10-17.
4. Ахмедов Ш.Д., Афанасьев С.А., Дьякова М.Л., Фатхудинов Т.Х., Кактурский Л.В. Использование бесклеточного матрикса для формирования новых кровеносных сосудов и сердца методом тканевой инженерии // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – т. IV. –№2. – 2009. – с.32-39.
5. Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., Бухарова Т.Б., Слащёва Г.А., Хохлова О.В., Мурашев А.Н., Гольдштейн Д.В. Репарация миокарда при трансплантации мононуклеарных клеток костного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2010. – №4. – с.203-211.
6. Фатхудинов Т.Х., Слащёва Г.А., Большакова Г.Б., Хохлова О.Н., Арутюнян И.В., Бухарова Т.Б., Мурашев А.Н., Гольдштейн Д.В. Направления миграции мононуклеаров костного мозга при интракоронарном трансвентрикулярном введении // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2010. – №1. – c. 222-229.
7. Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., Комиссарова С.В., Арутюнян И.В., Ржанинова А.А., Гольдштейн Д.В. Ангиогенез при трансплантации ауто- и аллогенных клеток // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – т.149. – №4. – с.442-447.
8. Бухарова Т.Б., Антонов Е.Н., Попов В.К., Фатхудинов Т.Х., Попова А.В., Бочкова С.А., Баграташвили В.Н., Гольдштейн Д.В. Биосовместимость тканеинженерных конструкций на основе пористых полилактидных носителей, полученных методом селективного лазерного спекания, и мультипотентных стромальных клеток костного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2010. – №1. – с.40-46.
9. Фатхудинов Т.Х., Байкова Ю.П., Большакова Г.Б., Бухарова Т.Б., Дубовая Т.К., Кактурский Л.В., Гольдштейн Д.В.  Влияние трансплантации мононуклеаров красного костного мозга на ангиогенез у крыс // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2011. - №. 3. – с. 132 – 136.
10. Байкова Ю.П., Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., Бухарова Т.Б., Дубовая Т.К., Кактурский Л.В., Гольдштейн Д.В. Пути дифференцировки мононуклеарных клеток костного мозга при трансплантации в постинфарктное сердце // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2011. - №. 3. – с. 140 – 146.
11. Патент №2299073 от 11 ноября 2005 г. «Биотрансплантат и способ лечения хронической сердечной недостаточности (варианты)», авторы: Гольдштейн Д.В., Макаров А.В., Волков А.В., Фатхудинов Т.Х., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А., Горностаева С.Н., Пулин А.А., Бажанов Н.А.
12. Патент №2268062 от 20 января 2006 г. «Биотрансплантат, способ его получения (варианты) и способ лечения дилатационной кардиомиопатии», авторы: Гольдштейн Д.В.,Ржанинова А.А., Горячев В.В., Репин В.С., Шаменков Д.А., Фатхудинов Т.Х., Сабурина И.Н., Макаров А.В., Горностаева С.Н.
13. Патент №2268061 от 20 января 2006 г. «Биотрансплантат, способ его получения (варианты) и способ лечения ишемической болезни сердца», авторы: Гольдштейн Д.В., Ржанинова А.А., Горячев В.В., Репин В.С., Шаменков Д.А., Фатхудинов Т.Х., Сабурина И.Н., Макаров А.В., Горностаева С.Н.
14. Кириллов А.М., Коротеев А.В., Фатхудинов Т.Х., Гольдштейн Д.В., Ржанинова А.А., Долотов В.К., Белянко И.Э., Сандриков В.А. Возможности клеточной терапии в лечении сердечной недостаточности при дилатационной кардиомиопатии // в сб.: Материалы II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". – Москва. –2005. – с.153-154.
15. Бокерия Л.А., Фатхудинов Т.Х., Голухова Е.З., Гольдштейн Д.В., Какучая Т.Т. и др. Перспективы применения новых клеточных технологий в сердечно-сосудистой хирургии // В сб.: Сборник научных трудов межрегиональной научно-практической конференции с международным участием "Реабилитационные технологии XXI века". – Саратов. – 2006. – с.18.
16. Константинов Б.А., Гавриленко А.В., Воронов Д.А., Фатхудинов Т.Х., Бочков Н.П. Результаты применения клеточных и генно-инженерных технологий в лечении хронической ишемии нижних конечностей // В сб.: Материалы Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении". – Москва. – 2006. – с.89-90.
17. Фатхудинов Т.Х., Дьячков А.В., Кириллов А.М., Гольдштейн Д.В. Трансплантация аллогенных мультипотентных стромальных клеток в лечении ХСН у пациентов с ДКМП // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева " Сердечно-сосудистые заболевания". – XI ежегодная сессия научного центра. – Москва. – 2007. – т.8. – №3. – с. 99.
18. Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., Гольдштейн Д.В. Модели изучения ангиогенеза при трансплантации клеток // В сб.: Материалы Ежегодной всероссийской международной научной конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении». – Москва. – 2008. - с. 103-104.
19. Fatkhudinov T., Bolshakova G., Slascheva G., Baykova J., Murashev A., Goldshtein D. Homing of bone marrow derived mononuclears after intracoronary transventricular transplantation // Stem Cells Europe and World Biobanking Summit and Exhibition. – September 2009. – Edinburgh, UK. – collected abstracts on CD.
20. Fatkhudinov T., Bolshakova G., Slascheva G., Baykova J., Murashev A., Goldshtein D. Multipotent stromal cell transplantation in 30 days after acute myocardial infarction // Stem Cells World Congress. – January 2010. – San Francisco, USA. – collected abstracts on CD.
21. Фатхудинов Т.Х., Байкова Ю.П., Макаров А.В., Большакова Г.Б., Гольдштейн Д.В. Роль клеток красного костного мозга в репарации миокарда // В сб.: Сборник научных трудов всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина». – Москва. – 2011, - с. 157.
22. Fatkhudinov T., Bolshakova G., Slascheva G., Baykova J., Murashev A., Goldshtein D. Bone Marrow Derived Multipotent Stromal Cells Promote Myocardial Fibrosis // Abstracts of the World Conference on Regenerative Medicine. – November 2011. – Leipzig, Germany. – collected abstracts on CD.

*Курсивом выделены работы, опубликованные в журналах, входящих в список ВАК РФ

Соискатель: Т.Х. Фатхудинов