Морфологические особенности восстановления дефектов склеры при трансплантации клеток
На правах рукописи
БАРАНОВ Петр Юрьевич
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЕФЕКТОВ СКЛЕРЫ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2010 г
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Пылаев Александр Сергеевич
доктор медицинских наук, профессор Гурина Ольга Юрьевна
доктор медицинских наук, профессор Аветисов Сергей Эдуардович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Торбек Виктория Эдуардовна
доктор биологических наук, профессор Мустафин Александр Гасисович
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится «29» ноября 2010 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г.Москва, ул.Островитянова, д.1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г.Москва, ул.Островитянова, д.1
Автореферат диссертации разослан «27» октября 2010 г
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор Щеголев Александр Иванович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЛ – активированные лейкоциты
ИЛ – интерлейкин
КОЕ-Фб – колониебразующие фибробластоподобные клетки
КП – культуральный пластик
МНК – мононуклеарные клетки периферической крови
МСК – мезенхимальные стволовые клетки
ПолиА:У – эквимолярный раствор полиадениловой и полиурациловой кислот
с/т – соединительная ткань
СО – стандартное отклонение
СФБ – сбалансированный фосфатный буфер
СЭ – склерэктомия
ТК – трансплантация клеток
Фб – фибробласты
ХАМ – хорион-аллантоисная мембрана куриного эмбриона
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка
DAPI – 4,6-диамидино-2-фенилиндол
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Проблема дефектов соединительной ткани склеры глаза является одной из самых актуальных в современной экспериментальной морфологии и офтальмологии. Прогрессирующая миопия, механические травмы, химические и термические ожоги, атрофические состояния склеры, связанные с использованием цитостатиков и нарушением кровоснабжения и иннервации фиброзной оболочки глаза, сопровождаются структурными, биохимическими и биомеханическими нарушениями, чреватыми ослаблением и потерей склерой своих функций. Эти нарушения проявляются как на клеточном (снижение синтетической и митотической активности), так и на тканевом (уменьшение общего числа клеток, изменение состава и соотношения компонент межклеточного вещества) уровне.
До сегодняшнего дня единственным эффективным методом лечения подобных состояний остаются склероукрепляющие операции, суть которых состоит в хирургическом укреплении склеры различными материалами. Подобный подход чреват интра- и послеоперационными осложнениями, кроме того, лишь косвенно влияет на причину истончения склеры, что приводит к необходимости повторных вмешательств, затрудненных рубцовой тканью, формирующейся после первой операции. Консервативные методы лечения и физиотерапевтический подход не обладают достаточной эффективностью, что делает поиск новых методов восстановления дефектов склеры актуальным и перспективным. Одним из таких малоизученных направлений является клеточная терапия, использующая в качестве активного компонента аутологичные или аллогенные живые клетки. Подобный подход отвечает предъявляемым к потенциальному методу лечения требованиям: он безопасен при использовании аутологичного материала, и способен усилить репаративную регенерацию. В зависимости от типа клеток и их предварительной стимуляции/селекции эффект от трансплантации может существенно отличаться, а результат реализовываться по одному или нескольким из следующих механизмов: антиапоптотическое действие, противорубцовое действие, ангиогенный и митотический эффекты.
На модели асептических разрезов сухожилия и связок уже изучен эффект трансплантации фибробластов дермы и сухожилий, мезенхимальных стволовых клеток при восстановлении дефектов плотной оформленной соединительной ткани. Положительные результаты этих исследований легли в основу нашей работы.
Цель исследования
Оценить морфологические изменения в склере кролика при репаративной регенерации и после трансплантации клеток.
Задачи исследования
1. In vitro выбрать потенциально эффективный тип клеток для трансплантации;
2. Сформировать биологическую модель объемных дефектов склеры;
3. Изучить закрытие дефекта склеры кролика на предлагаемой модели;
4. Изучить закрытие дефекта склеры кролика при трансплантации клеток;
5.Сопоставить восстановление дефектов склеры при репаративной регенерации и после трансплантации клеток.
Научная новизна
1.Впервые проведено сравнение фибробластов склеры и дермы кролика и человека в культуре in vitro.
2.Продемонстрировано положительное влияние активированных лейкоцитов периферической крови на ангиогенез и пролиферацию фибробластов дермы и склеры.
3.Разработан метод и проведена оценка адгезии лейкоцитов и фибробластов к склере за счет окраски флуоресцентными красителями.
4.Разработана новая биологическая модель объемных дефектов склеры с описанием репаративной регенерации.
5.Впервые проведено исследование трансплантации аутологичных фибробластов дермы и лейкоцитов кролика в область дефекта склеры с использованием объективных морфометрических методов.
Практическая значимость
Предложена биологическая модель объемных дефектов склеры, позволяющая объективно оценивать эффективность новых методов лечения дефектов склеры.
Предложенный метод клеточной терапии дефектов склеры – субконъюнктивальная трансплантация аутологичных активированных лейкоцитов, может быть рекомендован для дальнейших клинических испытаний.
Основные положения, выносимые на защиту
1.Активированные лейкоциты периферической крови усиливают ангиогенез на модели хорион-аллантоисной мембраны куриного эмбриона.
2.Супернатант активированных лейкоцитов периферической крови усиливает пролиферацию фибробластов склеры и дермы в культуре in vitro.
3.Операция склерэктомии глубиной 75 мкм в верхне-внутреннем квадранте глаза кролика приводит к формированию объемного дефекта склеры, и может служить биологической моделью для изучения репаративной регенерации плотной соединительной ткани.
4.Субконъюнктивальная трансплантация аутологичных активированных лейкоцитов периферической крови приводит к достоверному усилению регенерации объемных дефектов склеры.
Реализация результатов работы
Материалы диссертации (биологическая модель объемных дефектов склеры, клеточная терапия дефектов склеры) внедрены в научно-исследовательскую практику НИИ ГБ РАМН, кафедры морфологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ им Н.И. Пирогова, педагогическую практику кафедры морфологии.
Апробация результатов работы
Основные положения работы доложены на межкафедральной конференции ГОУ ВПО РГМУ им Н.И. Пирогова в г. Москва (сентябрь 2010), конференции молодых исследователей НИИ ГБ РАМН в г. Москва (апрель 2007), 14 международном студенческом медицинском конгрессе в г. Гронинген, Нидерланды (июнь 2007), 2 международной медицинской студенческой конференции в г.Нови Сад, Сербия (июль 2007), Всероссийской конференции «Современные методы диагностики лечения заболеваний роговицы и склеры» в г. Москва (сентябрь 2007), Всероссийском Иммунологическом Конгрессе в г. Санкт-Петербург (июль 2008), Всероссийской конференции «Глаукома: реальность и перспективы» (Москва, сентябрь 2008), Международном конгрессе медицинских студентов в г.Берлин, Германия (октябрь 2008), VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России в г.Саратов (октябрь 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и 3 – в иностранных журналах, в том числе в журналах, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки Российской Федерации – 6 публикаций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материал и методы исследования, главы собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций; библиография включает в себя 343 работы: 76 источников отечественной и 267 – иностранной литературы. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 33 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы и методы исследования
Проведенную экспериментальную работу можно условно разделить на 2 этапа: in vitro и in vivo. На первом этапе мы проводили поиск оптимального метода клеточной терапии для восстановления дефектов склеры (выделение и характеристика фибробластов склеры и дермы человека и кролика, выделение и активация лейкоцитов периферической крови, оценка адгезивных способностей фибробластов дермы и лейкоцитов, оценка эффекта активированных аутологичных лейкоцитов лейкоцитов на ангиогенез, оценка эффекта супернатанта активированных лейкоцитов и сыворотки на пролиферацию фибробластов дермы и склеры). Второй этап включал создание экспериментальной модели объемных дефектов склеры (операция склерэктомии), поиск оптимального метода мечения хирургического дефекта, качественную морфологическую и количественную морфометрическую оценку эффекта трансплантации предложенных типов клеток (введение суспензии фибробластов дермы или лейкоцитов) на восстановление дефекта.
Клеточные культуры фибробластов склеры и дермы кролика и человека выделяли методом экспланта (в случае склеры – с добавлением коллагеназы I), культивировали в полной питательной среде (ДМЕМ, 5% ЭТС), пассировали при достижении 70-80% конфлюэнтности. Кривую пролиферации строили исходя из усредненных данных, полученных при субкультивировании. Время удвоения популяции в культуре in vitro определяли по кривой роста.
Выделение и активацию лейкоцитов проводили по авторской методике. Цельную кровь из ушных вен кролика за 4 часа до введения в объеме 6-8 мл забирали вакуумной системой получения крови Vacutainer (BD Biosciences, США) в стеклянную пробирку без дополнительного покрытия и содержащую 1 мл раствора полиА:У (препарат Полудан, Верофарм, Россия). Для оценки содержания клеточных элементов в цельной периферической венозной крови изготовляли мазок крови с окраской азур-эозином по Романовскому. Закрытую пробирку с кровью и полиА:У инкубировали 3 часа при 37ОС, после чего центрифугировали при 300g и комнатной температуре в течение 10 минут. Шприцом собирали лейкоцитарную фракцию в объеме 1,5 мл. Подсчитывали жизнеспособность и количество клеток с помощью р-ра трипанового синего в камере Горяева, концентрацию клеток в сыворотке до 250 тысяч кл./мл. При таком подходе активация аутологичных лейкоцитов достигалась за счет процессов свертывания крови и интернализующихся при связывании с лигандом толл-подобных рецепторов 3 и 7 типов, связывающихся с полиадениловой и полиурациловой кислотами.
Для оценки эффекта супернатанта активированных лейкоцитов на пролиферацию фибробластов склеры и дермы кролика фибробласты высевали в лунки 24-луночного планшета (по 12 лунок, соответственно) в плотности 10 тыс клеток/см2 (20 тыс. клеток в каждую лунку) в 1 мл полной питательной среды (2% ЭТС, ДМЕМ, L-глютамин). Через 4 часа в 4 лунки добавляли по 0,5 мл супернатанта активированных лейкоцитов периферической крови кролика (неаутологичных), в 4 – по 0,5 мл сыворотки, выделенной из той же крови и ещё в 4 – предварительно подогретый до 37оС раствор Хэнкса. Через 24 часа клетки снимали с пластика раствором трипсин-Версена и подсчитывали общее количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева с окраской трипановым синим. Полученные данные оценивали на нормальность распределения критериями Колмогорова-Смирнова, Пирсона и Шапиро-Уилка. Сравнение групп проводили с помощью t-теста (p>0,05) с поправкой Бонферрони. Статистический анализ проводили с использованием программы GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., США).
Исследование адгезии фибробластов и мононуклеаров к склере проводили in vitro. Склеру кролика (интактную или с удаленной эписклерой) разрезали на квадраты 2*2 мм (по 8 для каждого из двух глаз) и помещали в лунки 96-луночного планшета (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Дания) и фиксировали в лунках планшета на парафин так, чтобы поверхность материала была параллельна основанию планшета и отстояла от верхней границы лунки не более чем 3 мм. Все материалы трижды промывали по 10 минут стерильным ФБС до полного смачивания поверхности, что необходимо для равномерного распределения суспензии клеток. В каждую лунку добавляли по 50 мкл (2,5 х 104 клеток/мл) суспензии окрашенных DAPI фибробластов в растворе Хэнкса на 3 пассаже или 50 мкл (2,5 х 104 клеток/мл) окрашенных DAPI МНК, выделенных на градиенте фиколл-верографина (Vacutainer, BD Biosciences, США). Инкубировали в течение 45 минут при 37°С, 5% CO2, 100% влажности в темноте, затем образцы промывали 2 раза 1 мл ФБС (t=4°C). Фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 5 минут, после чего промывали раствором Хэнкса (ПангЭко, Россия). В качестве контроля клетки инкубировали на поверхности культурального пластика (КП) и парафина (П) в котором фиксировали образцы. В дополнительных контрольных экспериментах инкубацию клеток на тех же материалах проводили в растворе Хэнкса, но без ионов Ca2+ и Mg2+, необходимых для адгезии клеток. После инкубации и промывания образцов делали по 3 микрофотографии каждой лунки планшета на микроскопе Leica350 D (объектив х10) в режиме эпифлуоресценции с селективным светофильтром для DAPI. Область выбирали случайным образом, после чего проводили фокусировку. Подсчитывали все светящиеся элементы. За счет эпифлуоресценции нам удалось оценить распределение клеток по поверхности материала, при этом не возникала необходимость в изготовлении тонких срезов. Попарное сравнение групп проводили с помощью t-теста и F-теста (p>0,05).
Эффект лейкоцитарной фракции периферической крови на ангиогенез оценивали на модели хорион-аллантоисной мембраны куриного эмбриона. Проводили сравнительный анализ влияния лейкоцитов периферической крови с предварительной активацией процессами свертывания и лигандом толл-подобных рецепторов полиА:У, и без последнего. Яйца инкубировали при 37оС двое суток, после чего производили вскрытие для доступа к хорион-аллантоисной мембране по методу «окошечка» и вводили 0,3 мл стимулятора. Для оценки каждого фактора в отдельности в эксперименте сравнивали четыре группы: лейкоциты, активированные процессом свертывания крови; лейкоциты, активированные процессом свертывания и лигандом толл-подобных рецепторов полиА:У (в обоих случаях вводили 120 тысяч клеток в сыворотке); раствор полиА:У; в качестве контрольного стимулятора вводили физиологический раствор. Затем яйца помещали в инкубатор ещё на сутки, после чего вскрывали, проводили фотосъемку и количественную оценку параметров ангиогенеза путем полуавтоматического морфометрического анализа с помощью специально разработанной авторской компьютерной программы SqVas 2.0 (Николаенко Д.С.). Для объективной количественной оценки интенсивности ангиогенеза использовали следующие критерии: общая площадь сосудистого русла; число дистальных сосудов, впадающих в кольцевой сосуд хорион-аллантоисной мембраны; количество бифуркаций сосудов. Сравнение групп проводили с помощью t-теста (p>0,05) с поправкой Бонферрони. Аддитивность действия факторов проверяли критерием Шеффе.
Для моделирования объемных дефектов склеры нами была предложена операция склерэктомии в области верхне-внутреннего квадранта глаза кролика, заключающаяся в удалении поверхностного лоскута склеры диаметром 5 мм с центром на расстоянии 7 мм от лимба. Эта область была выбрана после анализа литературных данных и предварительных микроанатомических и гистологических исследований (продольные срезы), показавших отсутствие в этой области крупных сосудов. За счет этого кровотечение и следующее за ним образование фибриновых сгустков и асептическое воспаление были минимизированы. Операцию выполняли под общей анестезией (Тилетамин и Золазепам – внутримышечное введение 20 мг/кг Zoletil 100 “Virbac Sante Animale”, Франция) и местной анестезией (инстилляции р-ра дикаина). Для доступа к склере разрез конъюнктивы выполняли по лимбу, за счет чего «закрытие» дефекта осуществлялось неповрежденной конъюнктивой, что минимизировало её участие в процессе регенерации. Область дефекта маркировали трепаном, создавая концентрический дефект глубиной 75 мкм. Расслаивающим ножом удаляли эписклеру и часть стромы склеры, конъюнктиву фиксировали к лимбу швом. В результате мы получали объемный дефект склеры, глубиной около 75 мкм, не заполненный кровью, с неизменной сосудистой оболочкой и сетчаткой и закрытый неповрежденной конъюнктивой. Созданный дефект предлагается использовать для оценки действия различных препаратов на регенерацию склеры.
К традиционным методам маркировки краев операционного дефекта можно отнести использование туши и шовного материала. Используемый материал должен отвечать требованиям инертности – не вызывать асептического воспаления или фиброза окружающей ткани, долгое время сохраняться в ткани, не мешать изготовлению препаратов и последующему анализу (морфологическому, гистологическому, биохимическому, функциональному). Тушь не сохраняется в тканях требуемое время (6 месяцев), кроме того не позволяет точно маркировать края дефекта. Мы провели предварительный сравнительный анализ шовного материала (полиамид, пролен, полипропилен) и волокон углерода Карботекстим-М (НИИ «Графит», Россия) в качестве гистологических маркеров. Нитью прошивали склеру между слоями, а волокна углерода вставляли в края дефекта по периметру раны. По результатам предварительного анализа на 4-х глазах кроликов породы Шиншилла (2 недели и 6 месяцев) мы остановились на волокнах углерода, которые и использовали в основном эксперименте.
Трансплантацию аутологичных активированных лейкоцитов или фибробластов дермы проводили через неделю после операции склерэктомии. Под местной анестезией (инстилляции р-ра дикаина) субконъюнктивально в область дефекта в аутологичной сыворотке крови вводили 0,4 мл суспензии, содержащей около 100 тысяч жизнеспособных клеток. Все процедуры с животными проводили согласно установленным этическим нормам, протокол исследования рассмотрен и утвержден на заседании локального этического комитета РГМУ 27 декабря 2007 года. Кроликов содержали в виварии в стандартных условиях. Животных выводили из эксперимента через 1, 3, 8, 10, 15, 20 и 40 суток, 2, 4 и 6 месяцев после операции/введения активированных лейкоцитов, 40 суток после введения фибробластов дермы (по 2 экспериментальных и 2 контрольных глаза на каждый срок). Энуклеированные глаза фиксировали в стандартном растворе (10% формальдегид водный) с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов, ксилоле-хлороформе и заливкой в парафиновые блоки. Изготовляли продольные гистологические срезы на микротоме (8 мкм). Полученные препараты окрашивали гематоксилин-эозином с заливкой в канадский бальзам. Фотосъемку проводили на микроскопе Nikon Eclipse 800.
Для полуавтоматического морфометрического анализа в работе мы использовали коммерчески доступную программу МЕКОС – «Флюороденситоморфометрия» (Мекос, Москва), и свободно распространяемую ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, США). На полученных изображениях (опыт, контроль) количественно измеряли следующие параметры: толщина склеры; общая плотность клеток; плотность распределения клеток в поверхностном слое склеры; плотность распределения клеток во внутреннем слое склеры; рассчитывали отношение толщины склеры в опыте к толщине склеры контролатеральной стороны и относительную плотность клеток по слоям. В качестве контрольной группы использовали прооперированную склеру второго глаза, а также склеру контролатеральной стороны. Используемый подход позволил использовать метод «ослепления», повышающий надежность исследования: препараты кодировали, что позволяло провести объективную количественную оценку параметров склеры, не зная характер экспериментального воздействия. Количественные значения параметров на каждом сроке объединяли в группы по типу воздействия. Для сравнения групп применяли t-критерий Стьюдента (парный t-критерий) и непараметрический анализ ANOVA, p>0,05. Предварительно полученные данные проверяли на нормальность распределения критериями Шапиро-Уилка, Колмогорова-Смирнова и Пирсона.
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Культура фибробластов дермы и склеры in vitro
В независимых экспериментах нами было получено по 3 первичных культуры фибробластов дермы и склеры человека и кролика. В эксперименте было показано, что фибробласты склеры и дермы отличаются как морфологически, так и по своим свойствам in vitro. Фибробласты дермы кожи начинали раньше мигрировать на пластик, обладали менее вытянутой формой, быстрее достигали состояния конфлюэнтности (время удвоения популяции в культуре около 1,5 суток). Фибробласты дермы кролика и человека по морфологии существенно не отличались, однако клетки кролика удавалось пассировать 8-9 пассажей по сравнению с 5-6 для клеток человека. Фибробласты склеры по своим свойствам и морфологии были ближе к фибробластам сухожилий и роговицы. Клетки мигрировали менее чем из 50% эксплантов. В культуре клеток in vitro мы наблюдали образование контактов, подобных тем, что фиброциты склеры, роговицы и сухожилий образуют in vivo. Время удвоения популяции фибробластов склеры in vitro составило 3-5 суток. При увеличении концентрации ЭТС до 10%, фибробласты склеры приобретали черты фибробластов дермы: отростки уменьшались, характерные контакты между отростками исчезали. Фибробласты склеры кролика демонстрировали большую пролиферативную активность по сравнению с фибробластами склеры человека. Полученные данные подтверждают отличия фибробластов дермы и склеры, наблюдаемые особенности фибробластов склеры (меньше темпы пролиферации, быстрый выход на плато кривой роста) характерны для клеток и кролика и человека. Мы считаем, что низкая скорость деления in vitro делает невозможным использование фибробластов склеры в качестве агента для клеточной терапии.
Эффект супернатанта активированных лейкоцитов на пролиферацию фибробластов склеры и дермы в культуре in vitro.
В эксперименте in vitro нами было показано, что добавление к питательной среде сыворотки или супернатанта активированных лейкоцитов приводит к значимому усилению пролиферации фибробластов, причем супернатант активированных лейкоцитов обладает более выраженным эффектом по сравнению с сывороткой на пролиферацию фибробластов как склеры, так и дермы (Табл. 1). Во всех четырех опытных группах (при добавлении сыворотки или супернатанта) мы наблюдали характерные морфологические изменения клеток в культуре in vitro, заключающиеся в уменьшении отростков, увеличении ядерно-цитоплазматического отношения, просветления ядра и цитоплазмы, и появления «светящихся» делящихся клеток («свечение» в данном случае относится к светлому кольцу, наблюдаемому в фазово-контрастном освещении, и связанному с частичным отлипанием фибробласта от культурального пластика).
Таблица 1.
Увеличение популяции фибробластов дермы (ФбД) и склеры (ФбС) кролика в контроле (добавление р-ра Хэнкса) и в опытных группах (добавление сыворотки и супернатанта активированных лейкоцитов).
| Группа | Макс | Мин | Среднее | СО |
| ФбД + р-р Хэнкса | 2,2 | 1,2 | 1,61 | 0,29 |
| ФбД + сыворотка | 2,8 | 1,3 | 2,02 | 0,48 |
| ФбД + супернатант | 2,95 | 1,8 | 2,35 | 0,33 |
| ФбС + р-р Хэнкса | 1,55 | 0,9 | 1,23 | 0,17 |
| ФбС + сыворотка | 2,05 | 1,3 | 1,60 | 0,19 |
| ФбС + супернатант | 2,25 | 1,65 | 1,99 | 0,19 |
Наблюдаемые изменения согласуются с литературными данными, полученными для фибробластов in vitro и in vivo при добавлении к культуре мононуклеаров и связаны с высоким содержанием факторов роста (основной фактор роста фибробластов, макрофагальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста) в сыворотке. Дополнительный эффект супернатанта активированных лейкоцитов объясняется повышением концентрации основного фактора роста фибробластов и тромбоцитарного фактора роста при активации. Стоит учитывать, что описанный эффект объясняется факторами роста, уже имеющимися в исследуемом бесклеточном растворе, в то время как при введении суспензии in vivo лейкоциты продолжают синтезировать соответствующие цитокины, обеспечивая пролонгированный эффект, кроме того описано контактное стимулирующее действие мононуклеаров на фибробласты.
Исследование адгезии клеток к склере.
В каждом из случаев (фибробласты дермы и МНК), адгезия фибробластов и МНК к склере с удаленными поверхногстными слоями выше в сравнении с адгезией к интактной склере. Это связано с обнажением молекул коллагена и фибронектина при удалении эписклеры. В контрольных экспериментах (адгезия в растворе Хэнкса без ионов кальция и магния), количество светящихся объектов (неспецифически адгезировавших клеток) не превышало 1-2 в поле зрения.
Таблица 2.
Минимальное, максимальное, среднее количество клеток, адгезировавших к поверхности склеры в рамке подсчета и стандартное отклонение.
| Материал | Макс | Мин | Среднее | СО |
| Интактная склера + Фб | 22 | 3 | 14,3 | 6,6 |
| Прооперированная склера + Фб | 26 | 1 | 16,5 | 8,9 |
| Культуральный пластик + Фб | 67 | 13 | 44,3 | 19,7 |
| Парафин + Фб | 9 | 1 | 4,3 | 2,7 |
| Интактная склера + МНК | 8 | 1 | 3,8 | 2,7 |
| Прооперированная склера + МНК | 9 | 1 | 5,0 | 3,0 |
| Культуральный пластик + МНК | 8 | 1 | 3,8 | 2,6 |
| Парафин + МНК | 2 | 0 | 0,5 | 0,8 |
Полученные данные убедительно свидетельствуют об интенсивной адгезии клеток к прооперированной склере. Адгезировавшие фибробласты способны к пролиферации, в то время как среди прилипающих мононуклеаров описаны КОЕ-Фб, дающие начало фибробластам соединительной ткани. Это свидетельствует о возможном тканезаместительном эффекте при трансплантации.
Эффект лейкоцитов на ангиогенез
Морфометрическая оценка параметров ангиогенеза подтвердила положительное влияние всех экспериментальных стимуляторов на ангиогенез хорион-аллантоисной мембраны куриного эмбриона (ХАМ), заключающееся в увеличении площади сосудистого русла и количества дистальных сосудов, впадающих в кольцевой сосуд ХАМ.
Таблица 3.
Эффект полиА:У, лейкоцитов, и лейкоцитов, активированных полиА:У на основные параметры ангиогенеза на модели хорион-аллантоисной мембраны эмбриона кур.
| Группа | Площадь сосудистого русла, мм2 | Число дистальных сосудов, шт. | Количество бифуркаций сосудов, шт. |
| Физиологический р-р | 13,1 | 53,5 | 16,8 |
| ПолиА:У | 19,2 | 69,9 | 20,4 |
| Лейкоциты | 28,9 | 102,7 | 19,№ |
| Лейкоциты+ полиА:У | 42,1 | 121,8 | 29,8 |
Число бифуркаций сосудов ХАМ не зависит от влияния комплекса полиА:У и лейкоцитов периферической крови человека, что свидетельствует о том, что комплекс полиА:У и неактивированные лейкоциты оказывают стимулирующее влияние только на самые тонкие, онтогенетически более поздние сосуды и не влияют на более ранние сосуды (правая и левая дорсальные артерии, артерии второго порядка), что подтверждает действие этих стимуляторов именно на ангиогенез, а не на эмбриональный артериогенез. Это позволяет экстраполировать полученные результаты на животных в постэмбриональном периоде, когда артериогенез завершен и неоваскуляризация идет за счет ангиогенеза. При статистическом анализе предложенных параметров (Табл. 3) показано, что добавление полиА:У на поверхность ХАМ вызывает достоверное увеличение площади сосудистого русла на 50%, числа дистальных сосудов на 30% по сравнению с контролем и не влияет на количество бифуркаций. Добавление суспензии лейкоцитов на поверхность ХАМ вызывает достоверное увеличение площади сосудистого русла на 120%, числа дистальных сосудов на 90% по сравнению с контролем и не влияет на количество бифуркаций. Добавление суспензии лейкоцитов, активированных процессами свертывания и полиА:У, на поверхность ХАМ вызывает достоверное увеличение площади сосудистого русла на 220%, числа дистальных сосудов на 130%, количества бифуркаций на 80% по сравнению с контролем.
Увеличение площади сосудистого русла и количества бифуркаций под влиянием лейкоцитов периферической крови, активированных полиА:У и процессами свертывания не является аддитивным эффектом действия лейкоцитов и полиА:У. Наиболее чувствительным морфометрическим признаком для характеристики интенсивности ангиогенеза является площадь сосудистого русла. Безусловно, данные, полученные in vitro, не могут считаться достаточными для суждения об эффекте данного препарата in vivo, однако убедительно свидетельствуют в пользу лейкоцитов, стимулированных процессами свертывания и лигандом толл-подобных рецепторов поли А:У как наиболее перспективного экспериментального препарата для усиления ангиогенеза при восстановлении дефектов склеры по сравнении с другими исследованными субстанциями.
Регенерация склеры после склерэктомии
Регенеративные процессы в склере после операции слабо выражены. Мы наблюдали слабую инфильтрацию в конъюнктиве и в поверхностном слое склеры. В течение первых двух недель слабая воспалительная инфильтрация сменялась пролиферацией резидентных фибробластов склеры в поверхностном, но не во внутреннем слое. К концу первого месяца нормальная плотность клеток восстанавливалась, но толщина склеры на препаратах 1, 3 и 6 месяцев оставалась меньшей по сравнению с контрольной. В конъюнктиве мы наблюдали интенсивную инфильтрацию в месте разреза, разрешающуюся к концу первой недели. На препаратах первых двух недель мы наблюдали новообразованные сосуды, которые исчезали после первого месяца. В двух случаях на сроках 3 и 6 месяцев мы отмечали «жировую дистрофию» -- формирование жировой ткани в сформированном операционном дефекте, что может быть связано с большей скоростью пролиферации адипоцитов по сравнению с фибробластами склеры. На этих препаратах мы также наблюдали большую плотность фибробластов склеры в нижележащих слоях, что, возможно, связано с прорастанием сосудов в жировую ткань. В отличие от классической схемы регенерации, на нашей модели мы не наблюдали обширного кровотечения, тромбообразования, а следовательно и отложения фибрина. Это, в свою очередь, приводит к снижению миграции нейтрофилов и асептического воспаления, сказываясь и на последующих этапах (активация резидентных фибробластов, ангиогенез, ремоделирование ткани). Наши и литературные данные показывают, что воспалительная инфильтрация конъюнктивы разрешается к концу первой недели, чем и обуславливается выбор срока для введения клеток в область дефекта. Ни в одном из случаев нами не было описано случаев формирования стафиломы или фистулы склеры. Неполное восстановление и отсутствие спаек и рубцов в области дефекта делают описанную биологическую модель воспроизводимой и эффективной для оценки различных методов воздействия на регенерацию склеры.
Регенерация склеры после склерэктомии с введением аутологичных фибробластов дермы
Фибробласты дермы после субконъюнктивальной трансплантации как адгезируют к склере, так и образуют независимые очаги рубцевания, сохраняющиеся на протяжении 1,5 месяцев. Фибробласты продолжают пролиферировать после трансплантации, быстро восстанавливая операционный дефект. Однако интенсивная пролиферация приводит к образованию нароста на склере в месте дефекта с хаотичным ходом соединительнотканных волокон.. Интенсивная пролиферация фибробластов объясняется аутокринным действием клеток, подтверждаемым в экспериментах in vitro – высеянные в относительно высокой плотности на культуральный пластик фибробласты дермы способны к делению и без добавления факторов роста (сыворотки). Полученные данные свидетельствуют против использования фибробластов дермы в качестве объекта для клеточной терапии дефектов склеры – резкое утолщение (более 500%) фиброзной оболочки чревато нарушением подвижности глаза и изменениями в сосудистой оболочке и сетчатке. Мы считаем, что без дополнительной стабилизации процессов деления фибробластов дермы, их трансплантация небезопасна.
Регенерация склеры после склерэктомии с введением активированных аутологичных лейкоцитов периферической крови
Мы наблюдали слабую инфильтрацию в конъюнктиве и поверхностных слоях склеры в течение 2-х суток после инъекции. Через неделю после инъекции (2 недели после операции) инфильтрат рассасывался, увеличенная плотность клеток наблюдалась только в склере. Ни на одном из описанных препаратов (с 1 суток до 6 месяцев после операции-инъекции) мы не наблюдали ни рубцевания в склере, ни упомянутой выше жировой дистрофии. В одном случае (2 суток после инъекции) было отмечено формирование рубца в конъюнктиве на месте разреза. Спаек между конъюнктивой и склерой не наблюдали ни на одном из препаратов. В конъюнктиве и поверхностных слоях склеры мы наблюдали образование небольших сосудов, сохранявшихся вплоть до 6 месяца. На всех препаратах отмечается повышенная периваскулярная плотность фибробластов. Таким образом, введение активированных аутологичных лейкоцитов периферической крови приводит к восстановлению операционного дефекта уже через 2 недели после трансплантации (3 недели после операции). На препаратах 2-х суток и 1 недели отмечается резко повышенная плотность фибробластов в поверхностных слоях склеры, которая уменьшалась к 1 месяцу после введения, но оставалась выше таковой по сравнению с контролем. К преимуществам данного метода воздействия как способа восстановления дефектов склеры стоит отнести долговременность эффекта – клинические данные свидетельствуют о том, что при использовании биологических или других материалов трансплантат рассасывается на дальних сроках наблюдения. Мы считаем, что наблюдаемый эффект достигается за счет трех основных групп факторов: ангиогенное действие, подтвержденное in vitro, обеспечивается активацией макрофагов, гранулоцитов, тромбоцитов, и небольшим количеством клеток-предшественников эндотелия в периферической крови. В условиях очага повреждения это способствует образованию новых сосудов. Митотическое действие, подтвержденное in vitro на культурах фибробластов склеры и дермы. Обеспечивается как контактным действием лейкоцитов, так и продукцией факторов роста и цитокинов при активации. Нами продемонстрировано повышение уровня основного фактора роста фибробластов и тромбоцитарного фактора роста в сыворотке при активации процессами свертывания и полиА:У. Сохранение клеток в зоне введения, подтвержденное в экспериментах с адгезией, обеспечивает пролонгированный эффект. Тканезаместительное действие, связанное с адгезией и превращением субпопуляций лейкоцитов в клетки соединительной ткани. Впрочем, расчеты, основанные на количестве вводимых клеток, циркулирующих фиброцитов и КОЕ-Фб в крови, показывают, что вклад данного механизма в общий эффект должен быть незначителен. Описанный метод восстановления дефектов склеры обладает существенным преимуществом перед используемыми сегодня в клинической практике. Несмотря на более низкую эффективность по сравнению с «однофакторными» методами – генной терапией с использованием факторов роста, или введением рекомбинантных факторов роста фибробластов или сосудов, предлагаемая методика обладает более пролонгированным действием, и меньшей себестоимостью. Кроме того, потенциальные риски генной терапии и введения рекомбинантных факторов в высокой концентрации превосходят возможный положительный эффект. Безусловно, предложенный нами метод не в состоянии заменить хирургический подход, используемый в случае сквозных травм и дефектов фиброзной оболочки глаза, особенно в связи с возможным образованием шварт в стекловидном теле, но мы считаем возможным сочетание трансплантации клеток с хирургической процедурой (установка трансплантата) в случае прогрессирующей миопии. Проведенные исследования показывают, что аутологичные клетки будут способствовать образованию соединительной ткани, необходимой для более плотного контакта материала со склерой. При атрофических состояниях склеры и образовании фильтрационных кист трансплантация активированных аутологичных лейкоцитов может избавить от необходимости проведения хирургического вмешательства. Малая инвазивность процедуры (забор венозной крови и субконъюнктивальная инъекция) и высокая эффективность делает этот метод перспективным в лечении упомянутых состояний.
Морфометрические характеристики склеры при регенерации и введении клеток
«Ослепленный» морфометрический подход позволил провести количественную оценку следующих абсолютных параметров: толщина склеры, плотность клеток в поверхностном и внутреннем слое, общая плотность склеры. Однако, ввиду высокой индивидуальной вариабельности этих признаков, группировка данных по типу воздействия не дает нормально распределенной выборки и не позволяет выявить отличия t-тестом. Мы предложили использовать для этой цели расчетные морфометрические признаки: относительную толщину склеры и относительные плотности клеток в поверхностном и внутреннем слое, вычисляемые как отношение измеренных параметров на опытной стороне к параметрам контролатеральной. Известно, что склера в верхне-внутреннем квадранте на 10-15% толще, чем в нижне-наружном, поэтому критерием восстановления дефекта было увеличение толщины в 1,1 раза.
Таблица 4.
Расчётные морфометрические характеристики склеры кролика после операции, операции и введения клеток.
| Тип воздействия | Относительная толщина, М±СО | Отн. плотность клеток в поверхностном слое, М±СО |
| СЭ – 2 недели | 0,90±0,11 | 1,96±0,23 |
| СЭ + ТК – 2 недели | 0,98±0,22 | 1,90±0,»4 |
| СЭ – 1 месяц | 0,85±0,14 | 1,03±0,23 |
| СЭ + ТК – 1 месяц | 1,2±0,16 | 1,12±0,15 |
| СЭ – 2 месяца | 0,89±0,09 | 1,12±0,11 |
| СЭ+ТК – 2 месяца | 1,11±0,10 | 1,36±0,20 |
| СЭ -- 4 месяца | 0,80±0,12 | 1,11±0,14 |
| СЭ+ТК – 4 месяца | 1,29±0,13 | 1,45±0,25 |
| СЭ – 6 месяцев | 0,86±0,11 | 0,90±0,10 |
| СЭ+ТК – 6 месяцев | 1,18±0,10 | 1,05±0,16 |
Попарное сравнение на каждом из сроков показало, что если через 2 недели после операции склерэктомии толщина склеры меньше нормальной и не отличается между группами СЭ и СЭ+ТК (0,90±0,11 и 0,98±0,22, соответственно), то уже начиная с 1 месяца отличие становится значимым. В случае репаративной регенерации склеры без введения клеток дефект полностью не восстанавливается и к 6 месяцу, что подтверждается относительной толщиной, на всех сроках не превышающей 1,10.
Рисунок 2.
Расчетные относительные морфометрические характеристики склеры после склерэктомии (СЭ) и склерэктомии с трансплантацией клеток (СЭ+ТК) на разных сроках. Данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения.
При трансплантации аутологичных активированных лейкоцитов дефект восстанавливается уже через месяц (1,20±0,17), достигнутый эффект сохраняется на всех сроках наблюдения. Для относительной плотности клеток в поверхностном слое склеры прослеживается та же тенденция: если через 2 недели после операции плотность клеток между группами СЭ и СЭ+ТК не отличалась (1,96±0,23 и 1,90±0,24), то к 1 месяцу отличия появлялись (1,01±0,23 и 1,18±0,15) и сохранялись на всех сроках наблюдения. Тот факт, что плотность клеток через 2 недели после операции существенно выше таковой на последующих сроках, подчеркивает послеоперационный характер наблюдаемой клеточной инфильтрации, в то время как на более поздних сроках повышенная плотность фибробластов склеры свидетельствует о выраженном трофическом эффекте (только в случае введения аутологичных лейкоцитов – достигающемся за счет новообразованных сосудов). Плотность фибробластов во внутреннем слое после операции склерэктомии не изменялась на протяжении всего срока наблюдения. В случае склерэктомии с введением клеток она возрастала через месяц после трансплантации, нормализуясь на второй. Это подчеркивает, что восстановление стромы склеры идет не только за счет клеток поверхностных, но и внутренних слоев. Таким образом, количественный объективный морфометрический анализ показал, что восстановление дефекта склеры после введения лейкоцитов завершается к концу 1 месяца и идет за счет активации как поверхностных, так и внутренних слоев, в то время как без трансплантации дефект частично восстанавливается за счет пролиферации поверхностно расположенных фибробластов. К дополнительным результатам исследования можно отнести используемые расчетные критерии (относительные толщина склеры и плотность клеток в различных слоях), которые мы рекомендуем использовать для анализа процессов регенерации склеры как более чувствительные. Включение в расчет параметров контролатеральной стороны позволяет компенсировать внутривидовые отличия.
ВЫВОДЫ
- В культуре in vitro был показан положительный эффект супернатанта лейкоцитов периферической крови кролика, активированных процессами свертывания и комплексом полиА:У, на пролиферацию фибробластов склеры и дермы кролика.
- На модели хорион-аллантоисной мембраны куриного эмбриона доказан стимулирующий эффект активированных свертыванием и полиА:У лейкоцитов на ангиогенез, достоверно превышающий эффекты от каждого из компонентов в отдельности.
- Операция склерэктомии с удалением поверхностного слоя склеры в верхне-внутреннем квадранте глаза кролика является стандартизуемой и воспроизводимой биологической моделью для изучения репаративной регенрации плотной соединительной ткани. В отсутствие дополнительного воздействия репаративная регенерация дефекта склеры идет за счет миграции и пролиферации фибробластов поверхностных слоев склеры вокруг зоны операции. Дефект полностью не восстанавливается и через 6 месяцев, активные процессы пролиферации и ангиогенеза завершаются через месяц после операции.
- При трансплантации аутологичных фибробластов дермы кролика в область дефекта наблюдается интенсивная интеграция и пролиферация клеток, сопровождающаяся чрезмерным утолщением склеры, новообразованием соединительной ткани склеры с неупорядоченным ходом волокон и новообразованными «очагами» в конъюнктиве, это свидетельствует против данного метода как способа восстановления объемных дефектов склеры.
- При трансплантации активированных лейкоцитов в область дефекта достоверно увеличивается плотность клеток склеры, возрастает количество новообразованных сосудов. Удаленный объем склеры полностью восстанавливается через 1 месяц после трансплантации. Новообразованная соединительная ткань и сосуды сохраняются вплоть до 6 месяца. Упорядоченный ход соединительнотканных волокон склеры и отсутствие реактивных изменений в конъюнктиве и сосудистой оболочке, делают этот метод перспективным в восстановлении объемных дефектов склеры.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Для изучения атрофических состояний склеры и новых методов лечения предложена биологическая модель объемных дефектов плотной соединительной ткани.
- Углеродный материал «Карботекстим-М» хорошо подходит для маркировки зоны операции на склере, хорошо сохраняется и не вызывает изменений в окружающих тканях.
- Мы не рекомендуем использовать фибробласты дермы для восстановления дефектов склеры из-за их высокой пролиферативной активности, сохраняющейся и после трансплантации.
- Лейкоциты периферической крови, стимулированные процессами свертывания и комплексом полиА:У обладают выраженной стимулирующей активностью на пролиферацию фибробластов и ангиогенез, что подтверждает перспективность использования этого препарата в терапии атрофических состояний соединительной ткани.
- Продемонстрирована безопасность и эффективность предложенного метода восстановления дефектов склеры за счет трансплантации активированных лейкоцитов, мы рекомендуем его для ограниченных клинических испытаний в терапии дистрофических состояний склеры.
- При морфометрическом анализе параметров регенерации склеры мы рекомендуем использовать расчетные показатели относительной толщины и относительной плотности клеток, как обладающие наибольшей чувствительностью.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Баранов П.Ю. Оценка эффективности использования клеточных технологий для увеличения толщины склеры // Материалы конференции молодых исследователей «Клиническая и экспериментальная офтальмология» М., 2007, с.10-12.
2. Baranov P., Nikolaenko D., Popkova A., Trufanov S. Autologus Mononuclear Cells Are Effective in Improvement of Sclera Regeneration // Proceedings of 14th International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, 2007, p.267.
3. Baranov P., Trufanov S., Avetisov S., Pavliuk S. Cell Therapy for Recovery of Scleral Defects // Proceedings of 2nd International Medical Student Congress Novi Sad, Novi Sad, 2007, p.23
4. Аветисов С.Э., Каспаров А.А., Каспарова Евг.А., Павлюк А.С.,Фадеева Л.Л.., Каспарова Е.А., Попкова А.М., Баранов П.Ю., Николаенко Д.С. Лечение вирусных и невирусных заболеваний переднего отрезка глаза методом локальной экспресс-аутоцитокинотерапии с использованием комплексных клеточных препаратов аутологичных клеток периферической крови, активированных полиА:полиУ // Сборник научных статей «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры» М. 2007, т.2, с.174-183
5. Аветисов С.Э., Павлюк А.С., Федоров А.А., Труфанов С.В., Баранов П.Ю., Николаенко Д.С., Попкова А.М. Экспериментальные доказательства эффективности клеточной терапии для восстановления дефектов склеры // Сборник научных статей «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры» М. 2007, т.2, с.183-187
6. Павлюк А.С., Николаенко Д.С., Каспаров А.А., Каспарова Евг.А., Попкова А.М., Баранов П.Ю. Стимуляция экспериментального ангиогенеза клеточными препаратами мононуклеарных клеток периферической крови человека, активированными полиА:полиУ // Сборник научных статей «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры» М. 2007, т.2, с.209-213
7. Avetisov SE, Pylaev AS, Pavliuk AS, Trufanov SV, Baranov P Autologous mononuclear cells are effective in improvement sclera regeneration // European Journal of Medical Research, Volume 12/supplement IV, p.160 2007
8. Павлюк А.С., Аветисов С.Э., Баранов П.Ю., Федоров А.А., Труфанов С.В., Суббот А.М, Николаенко Д.С. Клеточная терапия с использованием МНК активированных лигандом TLR-3 полиА:полиУ, приводит к регенерации экспериментальных хирургических дефектов склеры // Российский Иммунологический Журнал, том 2 (11), №2-3, 2008, с.114-115
9. Павлюк А.С., Каспаров А.А., Каспарова Евг.А., Суббот А.М., Баранов П.Ю., Николаенко Д.С. Мононуклеарные клетки периферической крови, активированные лигандом TLR-3 полиА:полиУ, стимулируют ангиогенез // Российский Иммунологический Журнал, том 2 (11), №2-3, 2008, с.115
10. Павлюк А.С., Каспаров А.А., Каспарова Евг.А. Суббот А.М., Баранов П.Ю. Репрограммирование иммуноцитокиновой доминанты Th1/Th2 с использованием лиганда TLR-3 полиА:полиУ // Российский Иммунологический Журнал, том 2 (11), №2-3, 2008, с.123-124
11. Аветисов С.Э., Павлюк А.С., Стенина М.А., Федоров А.А., Кривов Л.П., Николаенко Д.С., Баранов П.Ю., Суббот А.М., Тухватулин А.И. Экстраокулярные мышцы mdx-мышей как мишень для клеточной терапии: морфогистологическая характеристика с использованием компьютерного морфометрического анализа // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, Том 3, №3, 2008, с.47-51
12. Аветисов С.Э., Павлюк А.С., Федоров А.А., Гурина О.Ю., Труфанов С.В., Баранов П.Ю., Николаенко Д.С., Суббот А.М. Возможности применения клеточной терапии для восстановления дефектов склеры (экспериментальное исследование) // Сборник научных статей «Глаукома: реальность и перспективы», М., 2008, с.135-140
14. Груша Я.О., Федоров А.А., Павлюк А.С., Баранов П.Ю., Бакаева Т.В. Сравнительное исследование пространственной структуры современных орбитальных пористых имплантационных материалов и адгезии клеток к ним // Вестник Офтальмологии, №4, 2010, с. 45-50
