Возрастная модуляция фенотипической пластичности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы при хроническом действии стрессоров

На правах рукописи

Хлебников Владимир Витальевич

Возрастная модуляция фенотипической пластичности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы при хроническом действии стрессоров

03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Волгоград, 2010

Работа выполнена в Волгоградском государственном медицинском университете.

Научные руководители:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Сергей Львович

доктор медицинских наук, профессор Рыбак Вера Александровна

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор Павлов Алексей Владимирович

- доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич

Ведущая организация – Саратовский государственный медицинский университет им. В.И.Разумовского

Защита состоится «______»______________2010г. в ______час. на заседании

Диссертационного совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131 Волгоград, пл.Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета (400131 Волгоград, пл.Павших борцов, 1).

Автореферат разослан «______»__________________2010г.

ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

доцент Григорьева Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Стресс – это адаптационный физиологический ответ живых систем на реальную или воображаемую угрозу жизни [B.K.Choudhury et al., 2009]. Он начинается с высвобождения кортикотропин-рилизинг-фактора (КРФ) в паравентрикулярном ядре (ПВЯ) гипоталамуса, который активирует гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальную нейроэндокринную ось (ГГАО) с последующим высвобождением группы гормонов и нейротрансмиттеров, как системно, так и селективно в тканях определенных органов [И.Г.Акмаев, 2003; К.В.Судаков, 2005, 2008; В.Г.Шаляпина и др., 2005, 2006; K.Tsukamoto et al., 2006; G. Boukouvalas et al., 2009]. Высвобождение нейротрансмиттеров вызывает почти немедленный ответ со стороны органа-мишени, в то время как более постепенное высвобождение гормонов эндокринными железами может усиливать и поддерживать стрессорный ответ достаточно продолжительное время [С.Л.Кузнецов и др., 2008, 2009; М.Ю.Капитонова и др., 2008; 2010; A.M. Bao et al., 2008; A.Armario et al., 2009]. Наряду с нейроэндокринной детерминантой у комплексного стрессорного ответа имеется вегетативная и поведенческая составляющая [В.И.Петров и др., 1998; В.Г.Шаляпина и др., 2005, 2006; R.Kvetnansky et al., 2009; P.H. Wirtz et al., 2009]. Известно, что дизрегуляция ГГАО при стрессе может приводить к развитию депрессии и тревожных состояний, а также провоцировать аддиктивное поведение. Психоневрологические последствия перенесенного стресса включают нарушения памяти, фобические реакции, гиперактивность, нарушения сна [В.А.Рыбак, 2000; М.Е.Стаценко и В.А.Рыбак, 2005; Е.В.Хоженко и др., 2008; G.Dagyte et al., 2008; P.Verma et al., 2009; P.Putman et al., 2010]. Поскольку развитие постстрессовой психопатологии является последствием активации ГГАО и связанного с ней повышения концентрации глюкокортикоидов в крови, и оно находится в критической зависимости от того, как долго высокая концентрация кортикостероидов сохраняется, особый интерес представляет выяснение нейробиологических механизмов, участвующих в поддержании постстрессовой активации ГГАО [E.R.de Kloet 2005; G.Kiosterakis et al., 2009; X.Belda et al., 2009; E.Kanitz et al., 2009; A.Papadimitriou et al., 2009], лучшее понимание которых приведет к развитию новых методов лечения и профилактики стресс-ассоциированного поведенческого дефицита.

Одним из механизмов постcтрессовых сдвигов в организме является модуляция нейроэндокринной пластичности ГГАО, которая определяет выраженность и стойкость стресс-индуцированных изменений в организме. Известно, что постстрессовое нарушение мозговой пластичности способно усиливать подверженность стресс-ассоциированной нeврологической патологии [J.Gronli et al., 2006; Y.Li et al., 2006, 2009; G.Dagyte et al., 2009]; однако сведения о стресс-индуцированном нарушении пластичности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) в ее морфологическом выражении единичны и в большинстве своем затрагивают лишь отдельные ее звенья, что является источником многочисленных противоречий в объяснении закономерностей дезадаптационных изменений в ГГАО при хроническом стрессе.

Исследований возрастных особенностей стресс-респонсивности и ее морфологического субстрата – ГГНС – проведено достаточно много, однако в большинстве из них идет противопоставление молодого возраста старому или препубертатного периода постпубертатному, в то время как развернутая возрастная характеристика стресс-ассоциированных изменений в различных звеньях ГГНС в литературе отсутствует, и ряд возрастных периодов, в частности период полового созревания или старения остается практически неизученным, [R.D.Romeo et al., 2007; O.Malkesman et al., 2009].

Исследования последних лет позволили идентифицировать фолликулярнозвездчатые клетки аденогипофиза как возможные орган-специфические стволовые клетки, обеспечивающие железе высокую адаптационную пластичность [K.Inoue et al., 2002; C.Mogi et al., 2004; W.Allaerts et al., 2005; J.Marek, 2007; S.Devnath et al., 2008]. Однако исследования роли этих клеток при стресс-ассоциированной активации ГГНС, которые могли бы предоставить дополнительную информацию об их морфо-функциональной взаимосвязи с кортикотропоцитами, оркестрирующими постстрессовую модуляцию ГГАО, до сих пор не проводились.

В связи с выше изложенным, мы предприняли настоящее исследование, посвященное выявлению нейроэндокринных и поведенческих корреляций при хроническом действии различных по характеру стрессоров (гомо- и гетеротипических) в их возрастной опосредованности.

Целью настоящего исследования является выявление возрастных закономерностей изменения секреторной, митотической и апоптотической пластичности различных уровней гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы при хроническом действии гомотипических и гетеротипических стрессоров.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1.Исследовать влияние хронического действия гомотипического стрессора на морфо-функциональные особенности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и определить их поведенческие корреляции у препубертатных, молодых, зрелых и стареющих экспериментальных животных (крыс).

2.Изучить в сравнительном аспекте особенности хронического действия гетеротипического стрессора на гистофизиологические характеристики гипоталамуса, аденогипофиза и надпочечников в различные возрастные периоды.

3.Определить значение фолликулярнозвездчатых клеток аденогипофиза в формировании пластичности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в условиях хронического стресса на разных этапах постнатального онтогенеза.

Научная новизна работы.

В данном исследовании впервые с применением количественных иммуногистохимических методов, цифрового анализа изображения и методов оценки поведенческих реакций проведено изучение возрастных особенностей фенотипической пластичности ГГНС и ее звеньев при действии различных по природе стрессоров (гомотипических против гетеротипических) и ее корреляции со стресс-индуцированными поведенческими реакциями. Получены новые данные о возраст-зависимой сенситивности ГГАО, определены возрастные периоды наибольшей чувствительности к хроническому действию определенного типа стрессорных факторов как периоды риска по формированию дизрегуляторных модуляций ГГАО и соответствующих изменений поведения у экспериментальных животных, включающих развитие депрессии и тревожных состояний.

Теоретическое значение работы состоит в установлении возрастных закономерностей адаптации ГГАО при действии гомо- и гетеротипических стрессоров в их морфо-функциональном и поведенческом выражении и в установлении роли фолликулярнозвездчатых клеток в формировании секреторной пластичности аденогипофиза в условиях адаптации организма к разным типам стрессорного воздействия.

Практическая значимость работы заключается в получении новых сведений относительно амплитуды модуляций фенотипической пластичности ГГНС, приводящих к ее дизрегуляции при хроническом действии различных видов стрессоров, что может использоваться при планировании новых подходов к лечению и профилактике последствий перенесенного стресса в психоневрологической практике.

Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были доложены на 63-ой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, Волгоград, 26-29 апреля 2005 г.; на конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Волгоград, апрель 2006; на международной научной конференции «Современные наукоемкие технологии», Тенерифе, Испания, ноябрь 2008; на Всероссийской научной конференции "Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации", посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР проф. Ф.М. Лазаренко, Оренбург, 18-19 ноября 2008; на научной международной конференции "Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины", Паттайя,Тайланд, 20 декабря 2008 года; на VI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России, Саратов, 23-25 сентября 2009; на заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов в феврале 2010 года.

Результаты исследования отражены в 9 публикациях, 4 из которых - в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертаций.

Положения, выносимые на защиту:

1.Совместное действие стрессора определенного типа (гомотипического и гетеротипического) и возраста приводит к формированию определенного паттерну модуляции ГГНС, обнаруживающей выраженную онтогенетическую опосредованность.

2.Нарушение фенотипической пластичности звеньев ГГАС при хроническом стрессе является одной из причин функциональной дизрегуляции, имеющей отчетливое морфологическое выражение и проявляющейся в онтогенетически опосредованных поведенческих реакциях.

3.Фолликулярнозвездчатые клетки вносят свой вклад в формирование секреторной пластичности аденогипофиза, обеспечивая ему гибкость адаптационного ответа при действии различных видов стрессоров в определенные возрастные периоды.

Объем и структура диссертации.

Диссертации изложена на 142 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, главу 1 – обзор литературы, главу 2 - с описанием материала и методов исследования, главы 3 и 4, излагающие результаты исследования, их обсуждение и выводы. Диссертация содержит 5 таблиц и 52 рисунка, в том числе 34 микрофотографии. Библиографический указатель насчитывает 236 источников: 41 отечественный и 195 зарубежных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

В работе использованы 144 крысы-самца четырех возрастных групп: по 36 особей в каждой группе: неполовозрелых (25 дней от роду), молодого возраста (3 месяца), зрелого возраста (6 мес) и стареющих животных (12 мес) [A.Sahu et al., 1998; T.M.Segar et al., 2009]. Проведено две серии экспериментов в каждой из 4-х возрастных групп (по 12 животных в каждой экспериментальной подгруппе и подгруппах возрастного контроля), моделирующих хронический стресс. По 5 часов в день на протяжении 7 дней экспериментальные животные испытывали действие гомотипического стрессора (иммерсионно-иммобилизационный стресс, K.Takagi et al., 1964 – 1-я экспериментальная группа) или гетеротипического непредсказуемого стресса, (B.K.Choudhury et al., 2003, c некоторыми модификациями – 2-я экспериментальная группа) для оценки морфо-функциональной пластичности ГГНС на разных этапах постнатального онтогенеза. По окончании последней сессии стресса эксперимента проведена оценка поведенческих реакций в тесте открытого поля [K.Yu.Sarkisova et al., 2001], приподнятого крестообразного лабиринта [S.Pellow et al., 1986] и предпочтения раствора сахарозы [P.Willner et al., 1987]. Гипоталамус, гипофиз, надпочечники, а также тимус и желудок экспериментальных и контрольных животных оценивались макроскопически и микроскопически с применением гистологических и иммуногистохимических методов, а также имидж-анализа. Применялись иммуногистохимические реакции на КРФ (для гипоталамуса), АКТГ (для гипофиза), каспазы-3 (маркер апоптоза), РСNA (маркер пролиферации), белок S100 (маркер поддерживающих клеток надпочечников и фолликулярнозвездчатых клеток гипофиза), ED1 (маркер зрелых макрофагов). Статистический анализ проводился с применением коэффициента Стьюдента (статистика различий), коэффициента Пирсона (корреляционный анализ) и дисперсионного анализа.

Полученные результаты и их обсуждение

Хронический стресс снижал уровень предпочтения раствора сахарозы у экспериментальных животных, причем эта тенденция обнаруживается во всех возрастных группах (рис.1). Снижение предпочтения раствора сахарозы расценивается как ангедония - показатель депрессивного состояния экспериментальных животных [A.J.Grippo et al., 2002]. Уменьшение данного показателя при действии гомотипического стрессора достигает уровня значимости только у стареющих животных (p<0,01), в то время как гетеротипический стрессор достоверно снижает его не только у стареющих особей (p<0,001), но и у молодых и зрелых животных (р<0,05). Таким образом, у стареющих животных уровень предпочтения сахарозы высоко достоверно снижается при действии обоих видов стрессоров, что указывает на уменьшение пластичности поведенческих реакций в данной возрастной группе.

Изучение поведенческих реакций в тестах открытого поля и приподнятого крестообразного лабиринта позволяет оценивать уровень тревожности, исследовательскую и двигательную активность [М.Г.Семенова и др., 2005; L.I.Ying et al., 2009]. В открытом поле у экспериментальных неполовозрелых, молодых и зрелых животных уменьшалось число вертикальных стоек и увеличивалась продолжительность груминга, причем с большим уровнем значимости при гетеротипическом стрессе по сравнению с гомотипическим, в то время как у стареющих животных эти показатели показывали значительную индивидуальную вариабельность и изменялись недостоверно. Известно, что общее число пересечений характеризует двигательную активность, а доля пересечений периферических квадратов по отношению к общему числу пересечений определяется как индекс тревожности [A.Avital et al., 2006]. Он имел тенденцию снижаться с возрастом, незначительно повышался при действии гомотипического стрессора и значимо увеличивался во всех возрастных группах, кроме стареющих животных, при действии гетеротипического стрессора (p<0,05) (рис.2). Продолжительность замирания в приподнятом крестообразном лабиринте неуклонно увеличивалась у контрольных крыс с возрастом; в эксперименте она достоверно увеличивалась лишь у стареющих животных при обоих видах стресса и у зрелых – при действии гетеротипического стрессора (p<0,05). Сокращение пребывания в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта является одним из самых достоверных критериев тревожного состояния [X.Belda et al., 2008] (рис.3). У стареющих животных этот показатель был исходно более низким по сравнению с другими возрастными группами, и уменьшение его при стрессе было минимальным среди возрастных групп. Наибольшее снижение данного показателя отмечено у 3-х и 6-месячных животных, что говорит о высоком уровне тревожности у них при хроническом стрессе. В раннем, молодом и зрелом возрасте различия в поведении при разных видах стресса говорят о пластичности поведенческих реакций при действии различных по характеру стрессоров. Эти же тенденции сохраняются при оценке количества выходов в открытые рукава, которые также позволяют охарактеризовать анксиогенный эффект стресса. Доля выходов в открытые рукава достоверно снижалась в препубертатном, молодом и зрелом возрасте при гомо- (p<0,05) и гетеротипическом стрессе (p<0,01), в то время как у стареющих животных она имела тенденцию к снижению, но достоверно не изменялась. Таким образом, обобщая данные поведенческих тестов, следует отметить, что у животных разных возрастных групп имели место различные проявления поведенческого дефицита в различных экспериментальных парадигмах. В целом у животных раннего, молодого и зрелого возраста отмечались изменения поведения, свидетельствующие о повышении уровня тревожности, в то время как у стареющих животных преобладали изменения поведения, соответствующие депрессивно-подобному состоянию. Наибольшие различия в поведении животных двух экспериментальных подгрупп отмечены в молодом возрасте, в меньшей степени – в зрелом. В раннем возрасте и у стареющих животных эти различия были не значительными, что характеризует возрастную динамику пластичности поведенческих реакций.

У экспериментальных животных обеих экспериментальных подгрупп всех возрастных групп обнаружены признаки стресса: акцидентальная инволюция тимуса (в младших группах), гипертрофия надпочечников и кровоизлияния/изъязвления на слизистой оболочке желудка, а также уменьшение массы тела по сравнению с контрольными животными (p<0,05 при действии гетеротипического стрессора). Динамика относительной массы гипофиза показала достоверное ее снижение с возрастом и повышение при обоих видах стресса у подавляющего большинства возрастных групп (рис.4). При этом у стареющих животных уровень повышения при действии гомо- и гетеротипических стрессоров различался меньше, чем в младших возрастных группах. Относительная масса надпочечников снижалась у контрольных животных с возрастом и достоверно повышалась у крыс всех возрастных групп обеих экспериментальных подгрупп с наибольшей амплитудой повышения у стареющих животных (рис.5).

Возрастная динамика морфологии надпочечников крыс достаточно подробно описана в литературе [L.K.Malendowicz, 1987; P.Rebuffat et al., 1992]. При хроническом стрессе у животных отмечается выраженная гипертрофия коркового вещества надпочечников, главным образом за счет гипертрофии и гиперплазии губчатых кортикостероцитов, особенно граничащих с сетчатой зоной, что свидетельствует о повышении функциональной активности коры надпочечников, в частности клеток пучковой зоны [T.Milovanovic et al., 2003]. Корково-мозговое соотношение – адекватный показатель степени гипертрофии коры надпочечника – флуктуировал у контрольных крыс с возрастом и значимо увеличивался в группе стареющих животных (p<0,05), у которых он больше всего возрастал и при обоих видах стресса (p<0,01). Увеличение данного показателя было достоверно у неполовозрелых животных с разным уровнем значимости при действии гомо- и гетеротипического стрессора (p<0,05 и p<0,01 соответственно) и с одинаковым уровнем значимости при действии разных видов стресса у молодых и зрелых особей (p<0,05) (рис.6). Иммуногистохимическое окрашивание на белок S100 выявляет популяцию поддерживающих клеток мозгового вещества, количество которых считается косвенным показателем симпато-адреналовой системы [S.S.Sternberg, 1996; S.Diaz-Flores et al., 2008]. Иммунореактивные клетки в мозговом веществе надпочечников контрольных животных выявлялись в виде тонких отростчатых образований, нередко переплетающихся своими отростками, количество которых имело тенденцию увеличиваться с возрастом, достигая значимости различий у 6-месячных (p<0,05) и 12-месячных (p<0,01) крыс. Перенесенный стресс практически не влиял на относительную численность данной клеточной популяции в старшей возрастной группе и незначительно изменял ее долю в раннем возрасте, однако у молодых и зрелых животных отмечено достоверное снижение данного показателя (p<0,05) при действии гетеротипического стрессора, что позволяет косвенно судить о степени стресс-ассоциированной активации симпато-адреналовой системы в определенные возрастные периоды.

В аденогипофизе при хроническом стрессе у животных обеих экспериментальных подгрупп всех четырех возрастных групп отмечались микроциркуляторные нарушения в виде полнокровия капилляров и венул, гипертрофия эндокриноцитов, увеличение числа и доли базофильных клеток (более характерное для животных первых трех возрастных групп), усиление фолликуло- и кистообразования, особенно характерное для животных двух старших возрастных групп. С возрастом доля кортикотропоцитов в дистальной части аденогипофиза возрастает (начиная с 6-месячного возраста – высоко достоверно, p<0,01) (рис.7). Увеличение удельной площади кортикотропоцитов достоверно при действии гомотипического стрессора (p<0,05) и высоко достоверно при действии гетеротипического стрессора (p<0,01 для неполовозрелых и молодых экспериментальных животных; p<0,001 для животных зрелого возраста), у 12-месячных крыс данный показатель увеличивается незначительно.

Митотическая пластичность аденогипофиза оценивалась при окрашивании PCNA. Отмечено, что доля иммунореактивных клеток в целом невелика, они достаточно равномерно распределены по территории аденогипофиза, однако в латеральных крыльях их плотность несколько выше, чем в базофильном клине [S.S.Sternberg, 1996]. Количество иммунореактивных клеток с возрастом имеет тенденцию к уменьшению. У экспериментальных животных этот показатель незначительно увеличивался во всех возрастных группах при обоих видах стресса, однако достоверным увеличение было только при действии гомотипического стрессора у животных неполовозрелого и молодого возраста (p<0,05 и p<0,01 соответственно) (рис.8).

Окрашивание на каспазу-3 показало, что количество иммунореактивных клеток в целом сопоставимо с количеством PCNA-позитивных клеток. Данный показатель был подвержен значительным индивидуальным колебаниям. С возрастом число иммунореактивных клеток несколько увеличивается, достигая уровня значимости в группе стареющих крыс (p<0,05). Хроническое действие гетеротипического стрессора высоко достоверно (p<0,01) у неполовозрелых животных и достоверно (p<0,05) у крыс остальных возрастных групп вызывает увеличение данного показателя. При гомотипическом стрессе изменение доли иммунореактивных клеток не было достоверным у молодых и зрелых животных, для неполовозрелых и стареющих особей вероятность увеличения составила >99,95% (рис.9).

Окрашивание на ED1 выявило неожиданно много иммунореактивных клеток в аденогипофизе. Эти клетки были крупными по размеру, значительно большим, чем у фолликулярнозвездчатых клеток. У контрольных крыс в неполовозрелом возрасте доля ED1+клеток была достоверно ниже, чем у молодых (p<0,05), зрелых (p<0,01) и стареющих (p<0,001) животных. При хроническом действии гомотипического стрессора она достоверно повышалась у стареющих животных (p<0,01), а гетеротипического – еще и у неполовозрелых c одинаковым уровнем значимости (p<0,05) и 6-месячных (p<0,01) (рис.10).

Окрашивание на белок S100, специфически выявляющее в аденогипофизе фолликулярнозвездчатые клетки, показало, что в неполовозрелом возрасте эти клетки немногочисленны, как правило, они не имеют формы звездчатых; чаще всего это мелкие округлые клетки, равномерно распределенные по паренхиме железы, расположенные поодиночке вне связи с фолликулами, которые в данной возрастной группы встречаются не часто. С возрастом их число неуклонно возрастает (p<0,05; p<0,01 и p<0,001 при сравнении неполовозрелых контрольных животных с молодыми, зрелыми и стареющими соответственно) (рис.11), и они начинают приобретать угольчатую форму. В стареющем организме они становятся отчетливо звездчатыми, образуют скопления, как в связи с фолликулами, так и за их пределами. При действии гомотипического стресса у неполовозрелых и молодых животных данный показатель достоверно уменьшается (p<0,05), у зрелых животных он снижается незначительно, в то время как у стареющих он повышается, причем в обеих экспериментальных подгруппах. При действии гетеротипического стрессора данный показатель значимо уменьшается в неполовозрелом периоде (p<0,001), молодом (p<0,01) и зрелом возрасте (p<0,05). Обнаружение столь разнообразной и разнонаправленной динамики данной клеточной популяции в разных возрастных группах дает нам основание оценить вклад фоллликулярнозвездчатых клеток в определении секреторной пластичности аденогипофиза и адаптации центрального звена ГГАО к хроническому стрессу.

Изучение морфологических и иммуногистохимических особенностей ПВЯ гипоталамуса производилось на гистологических срезах, произведенных в соответствии с рекомендациями G.Paxinos и С.Watson (2007) для головного мозга крыс разных возрастных групп. В исследуемых препаратах отмечено, что хронический стресс вызывает изменения в нейронах мелкоклеточной фракции ПВЯ гипоталамуса, которые заключаются в их гипертрофии, гипертрофии их ядер, повышении доли деконденсированного хроматина и увеличении размера и количества ядрышек. Имидж-анализ показал, что удельная площадь КРФ-иммунореактивных клеток в ПВЯ имеет возрастную тенденцию к увеличению и максимальных значений она достигает у стареющих крыс (p<0,001); однако при хроническом стрессе амплитуда увеличения данного показателя в обеих экспериментальных группах этого возраста – минимальная среди возрастных подгрупп, хотя и достигает уровня значимости (p<0,05). У неполовозрелых животных отмечен более высокий уровень различий с контролем при действии гетеротипического стрессора по сравнению с гомотипическим (соответственно p<0,01 и p<0,05). В молодом и зрелом возрасте данный показатель достоверно увеличивался при действии гетеротипического стрессора, однако гомотипический стрессор вызывал лишь незначительное его повышение (рис.12). Данный показатель является чрезвычайно важным для оценки функционального состояния ГГАО, так как дает возможность судить и о респонсивности, и о фасилитации/габитуации, и об эффективности отрицательной обратной связи, однако для этого необходимо сопоставление данного показателя с индексами активации других звеньев ГГАО.

Корреляционный анализ продемонстрировал наличие средней по силе достоверной обратной корреляционной связи между корково-мозговым соотношением в надпочечнике и экспрессией КРФ в гипоталамусе у животных молодого и зрелого возраста соответственно при действии гомотипического стрессора (r=-0,68, p<0,05 и r=-0,63, p<0,05), в то время как в других возрастных группах при гомотипическом стрессе и во всех возрастных группах при гетеротипическом стрессе она была слабой или недостоверной. Таким образом, эффективность отрицательной обратной связи ГГАО и определяющая ее секреторная пластичность гипоталамуса имеет возрастную детерминанту и зависит от типа действующего хронически стрессора.

Корреляционный анализ использовался нами и при определении связи между динамикой клеточных популяций кортикотропоцитов и фолликулярнозвездчатых клеток в аденогипофизе. Оказалось, что сильная обратная корреляционная связь отмечалась между удельной площадь АКТГ- и белок S100-иммунореактивных клеток при действии гомотипического стрессора в молодом возрасте, средняя по силе достоверная связь между этими показателями у неполовозрелых особей и животных зрелого возраста (r=-0,72, p<0,05 и r=-0,64, p<0,05). В остальных группах связь была слабой и недостоверной. Таким образом, продемонстрировано, что численность клеточной популяции фолликулярнозвездчатых клеток и кортикотропоцитов

взаимообусловлены, что свидетельствует о возможном участии фолликулярнозвездчатых клеток в дифференцировке кортикотропоцитов и, таким образом, при определенных уровнях стресс-ассоциированной активации, их способности онтогенетически опосредованно обеспечить адаптационный уровень пластичности центрального звена ГГАО.

Таким образом, предпринятое исследование, проведенное с применением разнообразных тестов активации ГГНС при хроническом стрессе: поведенческих, морфологических, иммуногистохимических позволило выявить закономерности адаптационных изменений на разных уровнях ГГАО в возрастном аспекте в различных форматах хронического стрессорного воздействия. В большинство используемых в настоящее время моделей хронического стресса применены гомотипические стрессоры, вызывающие габитуацию стрессорного ответа [A.Armario et al., 2008]. Вместе с тем организм современного человека в большей степени подвержен действию постоянно меняющихся гетеротипических стрессоров, которые характеризуются иными закономерностями активации ГГНС, значительно отличающимися от привычных гомотипических моделей стресса с их фасилитацией респонсивности ГГАО [I.Z.Mathews et al., 2008; N.Grissom et al., 2009; T.M.Segar et al., 2009; J.H.Winston et al., 2010]. Сравнительное изучение адаптации разных звеньев ГГНС при действии гомо- и гетеротипических стрессоров позволило нам продемонстрировать возрастную динамику пластичности ГГАО с ее снижением в период старения организма, однако адаптационный потенциал в этот возрастной период, несмотря на нарушение отрицательной обратной связи, все еще достаточно адекватен даже при действии жестких стрессоров; и изменений, соответствующих посттравматическому синдрому с гипокортицизмом и атрофией коры надпочечников, отмеченных другими исследователями при хроническом стрессе у старых животных [В.Г.Шаляпина и др., 2005; T.M.Segar et al., 2009], в данной возрастной группе не наблюдается; при этом особенности поведенческого дефицита у животных данного возраста показывают, что нарушение пластичности ГГНС увеличивает подверженность стресс-ассоциированной неврологической патологии [G.Dagyte et al., 2009].

Предпринятое исследование выявило определенные закономерности динамики клеточных популяций аденогипофиза: кортикотропоцитов, вспомогательных клеток (макрофагальных и фолликулярнозвездчатых), а также показало диапазон митотической и апоптотической пластичности эндокриноцитов передней доли гипофиза при хроническом стрессе в разных возрастных группах. При этом распределение белок S100-позитивных клеток в дистальной части представляется чрезвычайно важным для нашего исследования. Ряд исследователей считают, что они выполняют лишь функцию скевенджеров [C.Luziga et al., 2006]. Если принять эту точку зрения, то становится трудно объяснить обнаруженное нами наличие столь многочисленной популяции зрелых макрофагов, которые практически дублируют функции скевенджерных фолликулярнозвездчатых клеток. Наше исследование поддерживает точку зрения тех исследователей [E.Horvath et al., 2002], которые считают, что фолликулярнозвездчатые клетки являются орган-специфическими стволовыми клетками, и выявленная нами их возрастная и стресс-ассоциированная динамика позволяет сделать заключение о роли этих клеток в пластичности аденогипофиза как центрального звена ГГНС при хроническом стрессе.

ВЫВОДЫ.

1. Хронический стресс индуцирует изменение диапазона фенотипически определенных адаптационных сдвигов в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, определяемое типом примененного стрессора (гомотипического или гетеротипического) и исходным возрастом экспериментальных животных и отражающееся в модификации поведенческой активности с формированием поведенческого дефицита в виде тревожных состояний у животных раннего, молодого и зрелого возраста и депрессивно-подобного поведения в стареющем организме.

2. Уровень экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора в паравентрикулярном ядре гипоталамуса и ее связь с респонсивностью периферического звена гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси характеризуют пластичность центрального звена гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, которая определяется возрастом экспериментальных животных, модулируется типом примененного стрессора и влияет на поведенческую активность. В молодом и зрелом возрасте она обеспечивает дифференцированный ответ при действии хронического стресса с применением разного типа стрессоров (гомо- или гетеротипических).

3. В стареющем организме пластичность гипоталамического звена гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы значительно снижается, что подтверждается высоким уровнем экспрессии КРФ при действии обоих видов стрессоров, не зависимым от уровня активности коры надпочечников и свидетельствующим о предотвращении адаптивной десенситизации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси, характерной для хронического действия гомотипического стрессора.

4. Хроническое действие различных стрессоров (гомо- и гетеротипических) выявляет диапазон секреторной пластичности аденогипофиза экспериментальных животных, модулируемой его митотической и апоптотической пластичностью, которая неуклонно увеличивается с возрастом до периода зрелости и снижается у стареющих животных, обнаруживая при этом диссоциацию гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси в ее центральном звене.

5. Свой вклад в модуляцию фенотипической пластичности различных звеньев ГГАО вносят вспомогательные белок S100-позитивные клеточные популяции в аденогипофизе и надпочечнике. В аденогипофизе фолликулярнозвездчатые клетки демонстрируют отчетливую тенденцию к увеличению своей доли с возрастом, обнаруживая при этом отрицательную корреляцию с числом АКТГ-позитивных клеток, что свидетельствует об их связи с опосредованным возрастом уровнем дифференцировки кортикотропоцитов.

6. В раннем и молодом возрасте удельная площадь белок S-100 иммунореактивных клеток в передней доле гипофиза уменьшается при хроническом стрессе с разным уровнем различий при действии гомо- и гетеротипического стрессора и обратно коррелирует с числом кортикотропоцитов, в то время как в зрелом возрасте она уменьшается незначительно, а в стареющем организме имеет тенденцию к увеличению, что свидетельствует о способности фолликулярнозвездчатых клеток диверсифицировано участвовать в модуляции пластичности ГГАО в различных возрастных группах и при хроническом действии разных по типу стрессоров.

Практические рекомендации

1.Наряду с иммуногистохимическими показателями активации ГГНС при стрессе, характеризующими ее секреторную, митотическую и апоптотическую пластичность, для характеристики ее состояния целесообразно проводить оценку вспомогательных клеточных популяций (поддерживающих клеток мозгового вещества надпочечников, фолликулярнозвездчатых клеток, зрелых макрофагов), являющихся косвенными показателями активности гипофизарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем.

2.Выявленный уровень нарушения поведенческих реакций, сопровождающийся дизрегуляцией ГГАО вследствие нарушения ее фенотипической пластичности в стареющем организме, позволяет выделить возрастной период, соответствущий старению, как период повышенной чувствительности к действию не только гетеро-, но и гомотипических стрессоров, что необходимо учитывать при разработке мер по лечению и профилактике постстрессовой неврологической патологии для данной возрастной группы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хлебников, В.В. Особенности реакции иммунной и эндокринной систем растущего организма на воздействие хронического стресса / О.В.Федорова, О.Е. Верстакова, М.Аснизам Асари, Т.А. Худа Салех, В.Л.Загребин,  В.В.Хлебников, Д.А. Чернов // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины. Мат-лы 63-ой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, 26-29 апреля 2005 г., Волгоград, 2005.- C.122-124.

2. Хлебников, В.В. Возрастные особенности фенотипической пластичности гипоталамуса при хроническом стрессе / В.А.Рыбак, А.И.Краюшкин, В.В.Хлебников, Ю.В.Дегтярь // Успехи современного естествознания.- 2008.- 
N12.- C.56-57. 

3. Хлебников, В.В. Иммуногистохимическая характеристика гипофиза в норме и при хроническом стрессе / М.Ю.Капитонова, С.Л.Кузнецов, В.В.Хлебников, В.Л.Загребин, З.Ч.Морозова, Ю.В.Дегтярь // Морфология.- 2008.- Т.134.- N6.- C.32-37.

4. Хлебников, В.В. Особенности активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы при хроническом стрессе в период перехода на самостоятельное питание / М.Ю.Капитонова, Ю.В.Дегтярь, А.И.Краюшкин, В.В.Хлебников, В.Л.Загребин // Морфология.- 2008.-  Т.134.- N5.- C.73.

5. V.V.Khlebnikov Age-related changes in the structure of adenohypophysis during early postnatal ontogenesis / Yu.V.Degtyar, M.Yu.Kapitonova,  E.Pratama, V.V.Khlebnikov // European Journal of Natural History.- 2008.- N4.- P.41-42.

6. Хлебников, В.В. Экспрессия кортикотропин-рилизинг фактора в гипоталамусе крыс при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе / М.Ю.Капитонова, Ю.В.Дегтярь, А.И.Краюшкин, В.В.Хлебников, В.Л.Загребин // Современные наукоемкие технологии.-  2008.-    10.- С.56-57.

7. Хлебников, В.В. Респонсивность гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси при действии различных видов стрессоров / М.Ю.Капитонова, Ю.В.Дегтярь, З.Ч.Морозова, В.В.Хлебников, В.Л.Загребин // Вестник ВолГМУ. - 2008. - N1(25).- C.58-60.

8. Хлебников, В.В. Взаимодействие гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и тиреоидной осей при хроническом стрессе / С.Л.Кузнецов, М.Ю.Капитонова, В.В.Хлебников, Ю.В.Дегтярь, З.Ч.Морозова, В.Л.Загребин, Н.И.Кокин, О.В.Федорова // Морфология, 2009, Т.136, N4, C.85.

9. V.V.Khlebnikov Immunohistochemical Characteristics of the Hypophysis in  Normal Conditions and Chronic Stress / M.Y.Kapitonova, S.L.Kuznetsov, V.V.Khlebnikov, V.L. Zagrebin, Z.Ch.Morozova, Yu.V.Degtyar // Neurosci. Behav. Physiol.- 2010.- Vol.40.- N1.- P.97-102.