Влияние возраста и пониженного содержания кислорода на функциональные свойства культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс

На правах рукописи

Валюшкина

Мария Петровна

Влияние возраста и пониженного содержания кислорода на функциональные свойства культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс

03.03.01 – Физиология

03.03.04 – Клеточная биология, цитология и гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор, член-корр. РАН Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Романов Юрий Аскольдович

доктор биологических наук, профессор Сонькин Валентин Дмитриевич

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки  Институт теоретической и

экспериментальной биофизики Российской Академии Наук

Защита состоится «13» февраля 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНЦ РФ – ИМБП РАН (123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а)

Автореферат разослан « 11 » января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Левинских М.А.

Общая характеристика работы

Актуальность. В настоящее время достигнут значительный прогресс в исследовании механизмов, определяющих такие свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) как высокий пролиферативный потенциал и способность к мультилинейной дифференцировке. Изучение этих аспектов физиологии ММСК имеет первостепенное значение как для понимания фундаментальных механизмов фунционирования этих клеток in vivo, так и в связи с перспективой их использования в области регенеративной медицины.

Исследования, направленные на выяснение того, как связанные с возрастом изменения на различных уровнях: организменном, тканевом, клеточном, влияют на реализацию основных свойств ММСК, являются единичными. Известно, что количество ММСК в костном мозге доноров и способность образовывать КОЕ-Ф линейно уменьшаются с возрастом (Caplan A.I. et al., 2009). При экспансии in vitro пролиферативная и колониеобразующая активность ММСК из костного мозга возрастных крыс уменьшается (Lepperdinger G, 2011), причем этот эффект характерен для ранних пассажей и не выявляется при длительном субкультивировании (Sethe S. et al., 2006; Schellenberg A. et al., 2011; Lepperdinger G., 2011). Остеогенный потенциал в таких клетках снижен, а адипогенный – повышен (Sethe S. et al., 2006). C другой стороны, группой Wagner W. (2009) не обнаружено отличий в пролиферативной и дифференцировочной активности между культивируемыми ММСК отдоноров в возрасте от 21 - 92 лет, а Григоряном А.С. и др. - у доноров от 18 до 70 лет (2009). Таким образом, попытки выявить возрастные особенности ММСК при их экспансии in vitro пока не позволили получить однозначные результаты, что может быть связано как с разнообразием используемых экспериментальных протоколов, так и с недооценкой роли физических факторов, таких как парциальное давление кислорода, для реализации свойств ММСК.

Во многих работах, в том числе и в нашей лаборатории (см. обзоры Буравкова Л.Б. и др., 2008; 2011), показано, что «физиологическая нормоксия» - близкое к тканевому содержание кислорода существенным образом меняет свойства ММСК. Использование in vitro низкого уровня О2, модулирующего «физиологическую нишу», может позволить получить принципиально новые данные относительно влияния возраста донора на свойства ММСК и их регенеративный потенциал. В частности, введение ММСК было успешно применено при дефектах хрящевой ткани, почечной недостаточности, повреждениях легких и других заболеваниях (Ponticiello M.S. et al., 2000; Rojas М. et al., 2005; Кухарчук А.Л. и др., 2004). При этом предварительное культированние клеток в гипоксической среде усиливало терапевтический эффект по сравнению с инфузией ММСК, культивируемых при 20% кислорода, что выражалось в увеличение ангиогенного потенциала клеток-предшественников (Im G.I. et al., 2001; Ефименко А.Ю. и др, 2010; Буравкова Л.Б.и др., 2012).

Исходя из вышеизложенного, целью данной работы являлось исследование влияния возраста крыс на морфофункциональные характеристики ММСК из костного мозга, культивируемых при различном содержании кислорода (5 и 20%), а также влияние на процесс репарации при введении этих клеток в зону экспериментального перелома трубчатой кости

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести анализ репликативных особенностей культивируемых ММСК из костного мозга крыс разного возраста при 5% и 20% О2.
2. Изучить изменения доли «стареющих» клеток в популяции ММСК костного мозга крыс в зависимости от возраста животного и концентрации кислорода.
3. Проанализировать иммунофенотип культивируемых ММСК костного мозга (кмММСК) разновозрастных крыс при 20% и при 5% кислорода в газовой среде.
4. Оценить изменения остео- и адипогенного потенциала при культивировании кмММСК разновозрастных крыс в стандартных условиях и при 5% кислорода в среде.
5. Исследовать влияние введения аллогенных кмММСК молодых и старых животных на репарацию трубчатой кости после предварительной экспансии клеток в газовой среде, содержащей 20% или 5% кислорода.

Научная новизна работы

Впервые при исследовании влияния содержания кислорода и возраста животного на морфофункциональные характеристики кмММСК в первичной культуре, показано снижение пролиферативной активности по сравнению со стандартными методами культивирования, независимо от возраста животного.

Впервые установлено, что постоянное культивирование кмММСК животных старше 6 месяцев в среде, содержащей 5% кислорода, увеличивало пролиферативную активность и число КОЕ-Ф, снижало адипогенный потенциал при одновременном увеличении остеогенного потенциала и снижении доли X-gal-положительных («стареющих») клеток в популяции.

Показано увеличение коэффициента утолщения костной мозоли и содержания в ней ретикулофиброзной костной ткани после введения кмММСК, культивируемых при 5% кислорода, а также увеличение доли хрящевой ткани после введения ММСК из костного мозга молодой крысы.

Основные положения, выносимые на защиту

В условиях стандартного культивирования кмММСК в среде, содержащей 20% кислорода, с увеличением возраста крыс снижается пролиферативная активность, количества КОЕ-Ф и ранняя стадия индуцированной остеогенной дифференцировки при увеличении доли X-gal-положительных клеток в популяции и интенсивности адипогенеза.

При постоянном культивировании в среде, содержащей 5% кислорода увеличивается пролиферативная активность и число КОЕ-Ф, снижается доля X-gal-положительных клеток, подавляется индуцированный адипогенез при активации ранних этапов остеогенеза кмММСК старых животных

Введение в зону перелома трубчатой кости крыс кмММСК способствовало увеличению коэффициента утолщения костной мозоли и доли хрящевой ткани. Кроме этого увеличивалась доля новообразованной костной ткани при введении ММСК, культивируемых при 5% кислорода, по сравнению с введением клеток, культивируемых при 20% кислорода.

Научно-практическая значимость работы

Проведенные исследования продемонстрировали возможность получения в короткие сроки большего числа кмММСК, благодаря постоянному культивированию при 5% кислорода, независимо от возраста донора.

Разработан способ стимуляции процесса репарации трубчатой кости у млекопитающих, включающий введение в область перелома ММСК предкультивированных в газовой среде, содержащей 5% О2, 5% СО2, 90% N2. (Патент № 2404242, от 20 ноября 2010 г.).

Разработан способ изменения функциональных характеристик клеток-предшественников, выделенных из костного мозга возрастных крыс, включающий постоянное культивирование при пониженном содержании кислорода, который позволяет получить к третьему пассажу клеточную популяцию, обладающую свойствами популяции клеток молодых животных (Заявка о выдаче патента, дата поступления 08.06.2012, регистрационный № 2012123714).

Апробация работы

Результаты работы обсуждены на VI, IIX, IX Конференциях молодых учёных, специалистов и студентов, посвящённой дню космонавтики (Москва, 2007, 2009, 2010), на IV Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2009), на Всероссийской научной школе-конференции для молодёжи "Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования" (Москва, 2009), на XXI Съезде физиологического общества им. Н.П. Павлова (Калуга, 2010), на IX Всероссийской научной школе-конференции: «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011), на VI Российской конференции с международным участием: «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», на II Всероссийской научной конференции молодых ученых “Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия” (Санкт-Петербург, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 7 тезисов и 1 глава в сборнике.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на _121_ страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 45 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, который включает 144 источника, в том числе 69 отечественных работ и 75 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследование проводилось на ММСК из костного мозга (км) крыс Wistar трех возрастных групп (по Pass D, 1993): молодых животных (возраст 1 месяц, 12 особей), взрослых половозрелых животных (6-8 месяцев, 6 особей) и зрелых или старых животных (>12месяцев, 6 особей). ММСК выделяли, как описано ранее (Буравкова и Анохина, 2007), а затем культивировали и субкультивировали в среде -МЕМ с антибиотиками-антимикотиками (1%) и 10% ФТС при 20% О2 (в стандартном СО2 инкубаторе Sanyo, Япония) и при 5% О2 (в мультигазовом инкубаторе Sanyo, Япония). Исследовали клетки 0 – 3 пассажей, включительно.

Клеточный прирост определяли, подсчитывая количество ММСК на микрофотографиях рандомически выбранных фиксированных полей зрения на разных сроках культивирования с помощью программы SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, USA). Число удвоений рассчитывали по формуле n = 3,32 lg (x/x0). Для определения числа КОЕ-Ф среди клеток, выделенных из костного мозга крыс разного возраста, в чашки Петри (35мм) помещали 0,5 мл суспензии. При субкультивировании ММСК рассевали в такие же чашки с плотностью 24 кл/см2. Через 14 дней культуры окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали КОЕ-Ф. «Стареющие» кмММСК выявляли по увеличению активности бета-галактозидазы, которая выявлялась гистохимически при деградации субстрата 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бета-D-галактопиранозида - X-gal (X-gal-положительные клетки). Иммунофенотипирование кмММСК проводили после 1-3 пассажа, используя антитела к следующим антигенам: CD90; CD54; CD44; CD11b; CD73; CD45 на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США), согласно инструкции производителя. Способность кмММСК к мультилинейной дифференцировке характеризовали после индукции соответствующими дифференцировочными средами (индуцированная дифференцировка) и без них (спонтанная дифференцировка). Начальные этапы (7 сут.) остеогенной дифференцировки (состав среды - -МЕМ, 200мМ глутамин, 100мМ пируват натрия, антибиотики/антимикоти (1%), 10% ФТС, 10-8М дексаметазона, 10мМ глицерол-2-фосфата и 0,2мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты) кмММСК оценивали гистохимически по наличию в клетках активности щелочной фосфатазы (характерного раннего маркера остеобластов) с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США). Адипогенную дифференцировку (состав среды - -МЕМ, 200мМ глутамин, 100 мМ пируват натрия, антибиотики/антимикоти (1%), 10% ФТС, 0,5мМ изобутилметилксантина, 1М дексаметазона, 10г/мл инсулина ) определяли после 14 сут. по появлению в культуре клеток, накапливающих в цитоплазме жировые капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red О (Sigma, США).

Исследование репаративного потенциала культивируемых кмММСК разновозрастных крыс было выполнено на 58 самцах линии Wistar (вес 200-300 г.). В 1 серии животным вводили кмММСК от 1,5 месячной крысы, а во 2 серии животным – кмММСК от 12-месячной крысы в область оперативного перелома малоберцовой кости (Разрешение биотической комиссии ГНЦ РФ - ИМБП РАН). Экспансия вводимых кмММСК была предварительно проведена ex vivo. В каждой серии животные были разделены на 4 группы. I – только оперативный перелом (П); II – перелом и введение в зону повреждении 0,25 мл МЕМ (П+ МЕМ); III - перелом и введение 0,25 мл МЕМ с 5·105 кмММСК после экспансии при 20% О2 (П+ МЕМ+ кмММСК/20%); IV - перелом и 0,25 мл МЕМ с 5·105 кмММСК после экспансии при 20% О2 (П+ МЕМ+ кмММСК/5%). Через 14 дней животных выводили из эксперимента и выделяли участки костей с костными мозолями, образовавшимися в местах переломов. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Г-Э) (общая морфология), толуидиновым синим (ТС) (кислые мукополисахариды), пикрофуксином (ПФ) (коллагеновые волокна) для определения состава тканей, образующих костную мозоль, и коэффициента ее утолщения (отношение диаметра костной мозоли к диаметру костных отломков).

Достоверность различий значений определялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с использованием программы Statistica 6. Расчет средних значений и стандартного отклонения проводилось с помощью программы Microsoft Excel.

Объем проведенных исследований

Морфофункциональная характеристика кмММСК разновозрастных крыс (пролиферация, КОЕ, дифференцировка, X-gal, иммунофенотип)
Группы животных	Кол-во животных			Кол-во исследованных популяций кмММСК
1 месяц	12	20%		12
		5%		12
6-8 месяцев	6	20%		6
		5%		6
>12 месяцев	6	20%		6
		5%		6
итого	24			48
Оценка репаративного потенциала
Группы животных	Кол-во животных		Кол-во гист. срезов
			Г - Э		ТС	ПФ
Контрольная (П)	14		14		20	18
Контроль со средой (П+ аМЕМ)	14		13		18	19
1,5 месяц (П+ МЕМ+ кмММСК)	20%	7	8		7	8
	5%	7	8		7	8
>12 месяцев (П+ МЕМ+ кмММСК)	20%	6	14		6	14
	5%	6	12		6	12
итого		60	53		80	89

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика кмММСК в первичной культуре. На третий день культивирования во всех группах клетки располагались одиночно и/или группами (рис. 1). Клетки имели вытянутую форму с несколькими длинными отростками, однако встречались и округлые клетки с неоднородной цитоплазмой. В первичных культурах сохранялись клетки, морфологически сходные с клетками крови, которые могли располагаться также на кмММСК. Через шесть дней культивирования количество клеток в фиксированных полях зрения значительно увеличивалось по сравнению с 3-м днем культивирования, при этом при 5% кислорода клетки были мельче и более вытянутыми по сравнению с культивированием при 20% кислорода, что было описано нами ранее (Буравкова Л.Б. и Анохина Е.Б., 2007). К девятому дню клетки преимущественно образовывали монослой, исключение составляли некоторые культуры ММСК от старых животных, которым для образования монослоя было необходимо более длительное культивирование.

Возраст животных	День культивирования
	Концентрация кислорода	3	6	9
1 мес.	20%
	5%
6-8 ме.с	20%
	5%
>12 мес.	20%
	5%

Рис.1. Первичная культура кмММСК крыс разного возраста. Фазовый контраст. Бар 100 мкм. Представлены микрофотографии в фиксированном поле зрения.

Рис.2. Число удвоений популяции ММСК в первичной культуре разновозрастных крыс, культивируемых при различном содержании кислорода.

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 5 % кислорода (р<0,05)

Оценка числа удвоений популяции с 3 по 6 сутки культивирования в первичной культуре, выявила снижение пролиферативной активности с возрастом. При сравнении пролиферативной активности клеток одной возрастной группы при 20% и 5% кислорода показано снижение числа удвоений в первичной культуре при пониженном содержании кислорода, причем этот эффект был более выражен с увеличением возраста (рис. 2).

Пролиферативная активность культивируемых кмММСК. В условиях стандартного культивирования при 20% кислорода к третьему пассажу число удвоений в популяции кмММСК старых животных было достоверно ниже, чем у молодых крыс. Понижение концентрации кислорода в среде культивирования стимулировало пролиферативную активность во всех возрастных группах, в результате чего число удвоений на третьем пассаже приближалось к числу удвоений клеток молодых крыс (табл. 1).

Таблица 1. Число удвоений популяции кмММСК

Возраст	1 мес.		6-8 мес.		>12 мес.
Концентрация О2	20%	5%	20%	5%	20%	5%
Пассаж 1	3,5±0,2	4,1±0,1*	3,7±0,2	3,5±0,2	3,05±0,2*	3,8±0,2#
Пассаж 2	3,0±0,2	3,9±0,2*	2,8±0,2	3,8±0,2	2,5±0,3	3,2±0,2**#
Пассаж 3	3,9±0,2	4,4±0,1	3,6±0,2	4,0±0,2	2,1±0,45*	4,0±0,2#
Всего удвоений	10,4	12,4	10,1	11,3	7,6	11

* достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

** достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 5 % кислорода (р<0,05)

# достоверное отличие от кмММСК старых животных при 5 % кислорода (р<0,05)

достоверное отличие от кмММСК старых животных при 20% кислорода (р<0,05)

Интересный результат был получен при расчете общего числа удвоений кмММСК за все время культивирования. Оказалось, что у молодых животных число удвоений при 5% О2 было больше на 20% по сравнению со стандартными условиями культивирования, у взрослых – только на 10%, а у старых – на 40%. Таким образом, культивирование при 5% О2 приводило к сглаживанию различий в пролиферативной активности между кмММСК животных разного возраста, наблюдаемые при 20% О2, причем особенно выраженным этот эффект был в группе старых крыс.

Колониеобразование. Одним из определяющих свойств ММСК костного мозга является их способность к формированию колоний, состоящих из потомков исходной клетки (КОЕ-Ф). Было показано, что в первичной культуре ММСК образовывали много плотных и крупных колоний. КмММСК старых животных при 5% кислорода также успешно образовывали клеточные колонии, однако они имели меньший размер и плотность (табл. 2) и сохраняли морфологические отличия, выявленные в первичной культуре. При дальнейшем субкультивировании в среде, содержащей 20% О2, среди клеток обеих групп КОЕ-Ф практически не выявлялись.

Таблица 2. Количество КОЕ-Ф среди кмММСК, полученных от молодых и старых крыс и культивируемых при различном содержании кислорода.

Концентрация О2	20% кислорода		5% кислорода
Группы Пассаж	1 месяц	>12 месяцев	1 месяц	>12 месяцев
0 пассаж
3 пассаж

Выявление «стареющих» кмММСК по активности бета-галактозидазы. Гистохимическое выявление бета-галактозидазы в кмММСК крыс разного возраста на следующий день после пассирования показало, что доля «стареющих» клеток (X-gal – положительных) у молодых животных была почти в 3 раза меньше, чем у взрослых и старых крыс. При 5% О2 процент X-gal – положительных кмММСК у взрослых крыс был существенно ниже, чем при 20% О2 и примерно таким же как у молодых. Эффект пониженного О2 на кмММСК у старых крыс был менее выраженным. При последующей экспансии при 20% О2 к 3 дню, когда клетки начинали пролиферировать, доля «стареющих» клеток в популяции от молодых животных продолжала оставаться невысокой, а среди клеток возрастных крыс существенно снижалась. При 5% О2 этот эффект был еще более заметен. В этом случае практически вдвое уменьшалась доля X-gal – положительных клеток и среди кмММСК от молодых крыс (рис. 3).

Рис. 3. Доля кмММСК крыс с выявленной активностью бета-галактозидазы.

Иммунофенотип культивируемых кмММСК. Для клеток-предшественников всех экспериментальных групп независимо от условий культивирования, была характерна экспрессия антигенов: CD90, CD54, CD44, CD73. КмММСК были отрицательны по CD45 и CD11b (табл. 3).

Таблица 3. Иммуннофенотип ММСК костного мозга разновозрастных животных

Возрастные группы	1 месяц		6-8 месяцев		>12 месяцев
О2 Антиген	20% О2	5% О2	20% О2	5% О2	20% О2	5% О2
CD90	99,9±0,1	99,8±0,1	99,9±0,1	99,9±0,1	99,0±0,9	99,8±0,2
CD54	99,1±0,1	98,4±0,7	99,0±0,3	99,7±0,1	96,7±2,3	96,1±3,4
CD44	97,3±1,0	97,4±1,0	97,3±1,8	97,4±1,0	97,3±1,8	97,3±0,7
CD73	97,3±1,0	97,7±1,0	97,1±1,6	98,7±0,7	97,3±1,8	97,3±0,3
CD11b	3,7±0,5	2,3±0,1	97,1±1,6	4,2±0,1	2,2±0,8	2,7±1,1
CD45	1,5±0,5	0,3±0,1	4,7±1,7	2,7±1,4	0,6±0,4	0,8±0,4

Потенциал дифференцировки. При 20% О2 доля кмММСК со спонтанной активностью щелочной фосфатазы (начальные этапы остеогенной дифференцировки) была существенно ниже для взрослых и старых животных, индукция остеодифференцировки несколько стимулировала увеличение доли таких клеток у молодых и взрослых крыс, но не влияла на кмММСК старых животных (Рис.4). При 5% О2 доля спонтанно дифференцированных клеток среди кмММСК молодых крыс была ниже, чем при 20% О2, а у взрослых и старых животных, наоборот, выше, чем при 20% О2. Индукция дифференцировки при 5% О2 привела к увеличению доли кмММСК с активностью щелочной фосфатазы практически до уровня молодых животных.

Рис.4. Процент клеток, содержащих щелочную фосфатазу

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

В кмММСК всех исследуемых групп не было обнаружено спонтанно образованных липидных капель (адиподифференцировка). После индукции в клетках молодых крыс, культивируемых при 20% кислорода, доля кмММСК, содержащих липидные включения, была минимальна. При 5% кислорода значительно снижалось число таких клеток в группах взрослых и старых животных, причём максимальное снижение наблюдалось в группе старых животных. Вместе с тем, при пониженном содержании кислорода было выявлено увеличение процента клеток с липидными включениями у кмММСК молодых животных (рис. 5).

Рис.5. Процент кмММСК, содержащих липидные капли в цитоплазме

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

достоверное отличие от кмММСК 6-8 месячных крыс при 20% кислорода (р<0,05)

достоверное отличие от кмММСК старых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

Репаративный потенциал кмММСК крыс разного возраста. Важным показателем функциональной активности ММСК является их влияние на процессы регенерации. Для того, чтобы сравнить репаративный потенциал кмММСК от молодых и старых животных, была проведена оценка эффективности формирования костной мозоли на месте экспериментального перелома малоберцовой кости крыс после введения культивируемых при 20% О2 кмММСК от крыс разного возраста (рис. 6).

	1,5 мес	12 мес
контроль
Перелом + аМЕМ
Перелом + аМЕМ+кмММСК 20%О2
Перелом + аМЕМ+кмММСК 5%О2

Рис. 6. Костная мозоль на 14 сутки после экспериментального перелома малоберцовой кости крыс. Окраска гематоксилином и эозином. Бар 200 мкм.

1 – костные отломки; 2 – ретикулофиброзная костная ткань; 3 – хрящевая ткань; 4 - неоформленная соединительная ткань

Гистологическое исследование области перелома во всех группах не выявило нарушений процесса заживления кости. Костная мозоль состояла из эндостальной костной мозоли и периостальной костной мозоли, которую покрывала толстая, богатая фибробластами надкостница. Эндостальная костная мозоль состояла из рыхлой неоформленной соединительной ткани, а периостальная костная мозоль включала хрящевую ткань, ретикулофиброзную костную ткань и рыхлую неоформленную соединительную ткань. Во всех исследуемых группах в эндостальной костной мозоли обнаруживались дистальные и/или проксимальные отломки малой берцовой кости, представляющей собой участки пластинчатой костной ткани. Отломки были покрыты остеокластами и окружены новообразованными тканями. Большинство отломков были смещены друг относительно друга. Новообразованная ретикулофиброзная кость располагалась проксимально и дистально относительно хряща. Поверхность трабекул покрывали активные остеобласты.

В результате эксперимента обнаружено увеличение коэффициента утолщения костной мозоли при введении кмММСК, выделенных из костного мозга молодых животных (рис. 7). Причём данное увеличение было отмечено как в группе животных, которым вводили кмММСК молодой крысы, культивированные при 5% кислорода, так и в группе, где были использованы клетки, предварительное культивирование которых осуществлялось в стандартных условиях. Достоверного увеличения коэффициента утолщения при введении клеток, полученных из костного мозга старых животных, выявлено не было.

Рис.7. Коэффициент утолщения костных мозолей.

р<0,05 по сравнению с контрольными группами

При анализе тканевого состава костных мозолей было показано значительное увеличение количества хрящевой ткани после введения кмММСК молодых животных независимо от условий культивирования (табл. 4 и 5). Площадь, занимаемая ретикулофиброзной костной тканью, после введения клеток, культивируемых при 5% кислорода, превышала таковую после введения кмММСК, экспансия которых проходила при 20% кислорода независимо от возраста животного.

Таблица 4. Содержание хрящевой ткани в костной мозоли через 14 суток после экспериментального перелома малой берцовой кости крыс

Группы животных	После введения клеток молодой крысы (1,5 мес)		После введения клеток старой крысы (12 мес)
	% от площади мозоли	Площадь ткани в мм2	% от площади мозоли	Площадь ткани в мм2
контроль	10,1±2,7	2,1±1,1	7,1±0,1	0,5±0,1
Перелом + МЕМ	17,2±2,7	2,1±0,3	5,5±0,7	0,4±0,1
Перелом + МЕМ+кмММСК 20%О2	24,2±3,0*	2,6±0,3	8,4±1,1**	0,8±0,1
Перелом + МЕМ+кмММСК 5%О2	16,4±1,9	1,9±0,2	8,6±0,9**	0,8±0,1

* при р<0,05 по сравнению с контрольными группами

** при р<0,05 по сравнению с введением клеток молодой крысы

Таблица 5. Содержание ретикулофиброзной костной ткани в костной мозоли через 14 суток после экспериментального перелома малой берцовой кости крыс

Группы животных	После введения клеток молодой крысы		После введения клеток старой крысы
	% от площади мозоли	Площадь ткани в мм2	% от площади мозоли	Площадь ткани в мм2
контроль	51,2±4,9	5,7±0,8	64,5±3,0	3,9±0,3
Перелом + МЕМ	48,3±5,4	6,0±0,8	58,4±2,1	4,2±0,3
Перелом + МЕМ+кмММСК 20%О2	48,4±2,6	5,4±0,7	51,8±2,8	3,8±1,2
Перелом + МЕМ+кмММСК 5%О2	61,9±2,6	7,4±0,6	66,9±2,9	6,1±0,3

Ранее было показано, в том числе и в нашей лаборатории, что культивирование при пониженном содержании кислорода стимулирует пролиферативную активность ММСК первого и последующих пассажей при 5% кислорода (Grayson W.L., et al., 2006; Анохина Е.Б. и др., 2007; Буравкова Л.Б. и др., 2009; Ren H. et al., 2006; Dexheimer V. et al., 2011). Проведенное исследование показало снижение пролиферативной активности в первичной культуре при 5% кислорода во всех возрастных группах, с сохранением тенденции к снижению пролиферативной активности с возрастом. При дальнейшем субкультивировании при 5% кислорода происходило увеличение пролиферативной активности во всех группах, что соответствует ранее полученным результатам (Буравкова и др. 2007). Оценка количества КОЕ-Ф показала, что при постоянном культивировании в условиях 5% кислорода в среде в первичной культуре происходило образование достоверно большего числа колоний по сравнению с 20% кислорода, хотя оценка прироста клеток в фиксированных точках продемонстрировала снижение пролиферативной активности, что связано с разной схемой проведения экспериментов по оценки прироста и выявлению КОЕ-Ф. Оценивая влияние возраста, можно отметить, что независимо от условий культивирования, число КОЕ-Ф кмММСК старых животных значительно ниже, чем среди клеток молодых животных. Tsai C.C. и др. показали, что гипоксия понижает экспрессию E2A-p21 через HIF-1. Это позволяет сохранять в условиях гипоксии активность теломеразы и длину теломеров ММСК, при этом у клеток был нормальный кариотип и неповрежденный генетический аппарат (Tsai C.C. et al., 2011). Кроме этого, было показано, что высокое содержание HIF-1 может коррелировать со сверхэкспрессией белков-маркеров пролиферации фаз S-G2 клеточного цикла, таких как циклин А и Ki-67, и с активацией клеточной пролиферации (Анохина Е.Б. и др. 2010; Bos R at al., 2004; Gardner L.B. et al., 2003).

Выявление активности бета-галактозидазы в кмММСК всех возрастных групп свидетельствует об увеличении числа «стареющих» клеток с возрастом. Экспансия при 5% кислорода способствовала уменьшению числа X-gal-положительных клеток во всех возрастных группах.

Важной функциональной характеристикой ММСК является их способность к дифференцировке. На разных видах животных было показано подавление остеогенной дифференцировки с увеличением возраста (Zhou S. et al., 2008; Шахпазян Н.К. и др., 2012) и стимулирование остеогенеза стромальных клеток-предшественников взрослого организма при пониженном содержании кислорода (Lennon D.P. et al., 2001; Шахпазян Н.К. и др., 2012). Продемонстрированные в нашей работе достоверные увеличения доли клеток, вставших на путь остеогенеза после индуцированной дифференцировки при пониженном содержании кислорода для групп взрослых и старых животных, свидетельствует о важной роли этого фактора в процессах коммитирования. Однако тенденция к снижению остеогенного потенциала с возрастом сохранялась и при культивировании в условиях пониженного до 5% содержания кислорода. Проведенные ранее исследования адипогенеза показали, что культивирование при пониженном содержании кислорода приводит к его подавлению (Zhou S. et al., 2005), при этом с увеличением возраста животного повышалась способность к адипогенной дифференцировке при стандартных условиях культивирования (Sethe S. et al., 2006). В представленной работе показано увеличение числа адипоцитов с возрастом после индукции дифференцировки кмММСК. Возможным механизмом активации адипогенеза «старых» клеток при 20% кислорода является увеличение синтеза IL-6 при старении (Sethe S. et al., 2006). Вероятным механизмом торможения адипогенеза при 5% содержании кислорода является ингибирование дифференцировки через HIF-1-зависимую индукцию p27 Kip1 , а также ингибирование GSK3 и C/EBP сигналов (Park Y.K.et al., 2010).

Исходя из ранее проведенных исследований репаративного потенциала, была выбрана модель экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс (Дурнова и др., 2002), при которой непосредственно в область перелома сразу после хирургического вмешательства вводили суспензию ММСК в малом объеме культуральной среды (Буравкова Л.Б. и др. 2011). Показано, что после введения клеток-предшественников, полученных от 1,5-месячной крысы репарация была эффективнее по сравнению с клетками старой крысы, что выражалось в увеличении размеров костной мозоли. Кроме этого, установлено значительное увеличение количества хрящевой ткани после введения кмММСК молодых животных независимо от условий культивирования, а введение клеток, культивируемых при 5% кислорода, увеличивало долю ретикулофиброзной костной ткани. Одним из механизмов положительного эффекта введения клеток после культивирования при пониженном содержании кислорода может быть ангиогенный эффект этих клеток (Im G.I. et al., 2001.).

Выводы

1. Установлены различия в морфофункциональных характеристиках культивируемых ММСК костного мозга крыс: снижение репликативной активности, количества КОЕ-Ф и остеогенного потенциала, при увеличении индуцированной адипогенной дифференцировки и доли «стареющих» клеток в популяции с увеличением возраста животного (1-19 мес.)

2. В первичных культурах в условиях пониженного содержания кислорода (5%) выявлено снижение пролиферативной активности кмММСК во всех возрастных группах. Субкультивирование при 5% кислорода приводило к усилению пролиферативной активности кмММСК всех возрастных групп и сглаживанию возрастных различий к третьему пассажу.

3. Постоянное культивирование кмММСК при 5% кислорода стимулировало образование КОЕ-Ф во всех возрастных группах, особенно выраженное у молодых животных. При этом доля клеток, содержащих бета-галактозидазу (маркер «старения»), снижалась более существенно в возрастной группе 6-8 месяцев.

4. Не выявлено зависимости экспрессии CD90, CD73, CD54, CD44, CD45 и CD11b от возраста животных и содержания кислорода в среде культивирования.

5. При пониженном содержании кислорода (5%) показано достоверное увеличение индуцированного адипогенеза кмММСК одномесячных животных и незначительное снижение у взрослых (6-8 мес.) крыс, а также усиление начальной стадии индуцированной остеогенной дифференцировки в возрастных группах.

6. Продемонстрировано увеличение коэффициента утолщения костной мозоли через 14 дней после экспериментального перелома малоберцовой кости и введения суспензии аллогенных кмММСК, которое было более выраженным при введении клеток молодых животных

7. После введения кмММСК молодых крыс увеличивалась доля хрящевой ткани по сравнению с клетками старого животного. После предкультивирования клеток в среде, содержащей 5% кислорода, доля новообразованной костной ткани было больше по сравнению с контрольными группами.

Практические рекомендации

Для увеличения пролиферативной активности, потенциала остеогенной дифференцировки и снижения процента «стареющих» клеток в популяции ММСК от возрастных животных рекомендуется проводить экспансию клеток в условиях 5% кислорода.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Буравкова Л.Б., Андреева Е.Р., Валюшкина М.П., Дурнова Г.Н., Логинов В.И., Анохина Е.Б. Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных при различном содержании кислорода// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2009. – Т. 4, №3. – С. 52-57.
2. Буравкова Л.Б., Валюшкина М.П., Андреева Е.Р., Логинов В.И. Репаративный остеогенез при трансплантации мультипотентных стромальных клеток костного мозга, культивируемых при различном содержании кислорода // Морфология. – 2011. – Т. 139, №1. – С. 81-85.
3. Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б.. Возрастные различия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2013. - №1. – С.

Статьи в журналах

Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б. Влияние содержания О2 в среде на мультипотентные мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга разновозрастных крыс// Мед. академ. журнал. – 2012.- Т.12. - №3. – с.57-59.

Статьи в сборниках

Андреева Е.Р., Капланский А.С., Валюшкина М.П., Логинов В.И., Анохина Е.Б., Буравкова Л.Б. Использование культивируемых при различном содержании О2 мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга крыс для регенерации костной ткани // В кн. «Аутологические стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения». Под. ред. В.А. Ткачука. - М.: Литтера, 2009.- С.91-109.

Патент

1. Буравкова Л.Б., Капланский А.С., Андреева Е.Р., Валюшкина М.П., Григорьев А.И. Способ ускоренного формирования костной мозоли у млекопитающих. – Патент РФ № 2404242 от 20.11.2010.
2. Заявка на патент: Ex vivo способ повышения качества клеток-предшественников от возрастных доноров (Дата поступления 08.06.2012, Регистрационный № 2012123714).

Тезисы

1. Козионова (Валюшкина) М.П., Буравкова Л.Б. Сравнение пролиферативной активности мезенхимльных стволовых клеток (МСК) разновозрастных крыс in vitro //Материалы VI Конференции молодых учёных, специалистов и студентов, посвящённая дню космонавтики. – Москва, 2007. – С.29-30.
2. Буравкова Л.Б., Валюшкина М.П. Сравнение мезенхимальных стромальных клеток-предшественников разновозрастных крыс, культивируемых при различном содержании О2 // Материалы IV международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». – Москва, 2009. – С.68-39.
3. Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б. Сравнение пролиферации и фенотипа мезенхимальных стволовых клеток (МСК) разновозрастных крыс, культивируемых при различном содержании О2 // Материалы VIII Конференции молодых учёных, специалистов и студентов, посвящённая дню космонавтики. – Москва, 2009. – С.11-12.
4. Буравкова Л.Б., Капланский А.С., Андреева Е.Р., Валюшкина М.П., Дурнова Г.Н., Логинов В.И., Анохина Е.Б. Регенерация трубчатой кости при введении ММСК // Материалы Всероссийской научной школы-конференция для молодёжи "Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования". – Москва. 2009. – С. 14-15.
5. Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б. Характеристика культивируемых МСК, выделенных из костного мозга разновозрастных крыс // Материалы IX Конференции молодых учёных, специалистов и студентов, посвящённый дню космонавтики. - Москва. 2010. – C. 24-25.
6. Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б. Возрастные особенности культивирования МСК выделенных из костного мозга крыс // Материалы XXI Съезда физиологического общества им. Павлова. – Калуга, 2010. – С. 102-103.
7. Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б. Влияние содержания О2 в среде на ММСК костного мозга разновозрастных крыс // Материалы VI Российской конференции с международным участием: «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». – Москва, 2011. – С. 22-23.