Экспериментально-морфологический анализ влияния уменьшения численности пометов и воспитания в искусственно сформированных пометах на показатели развития головного мозга, надпочечников и гонад у крыс

На правах рукописи

ЛИТВИНЦЕВА

Екатерина Марковна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ УМЕНЬШЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ ПОМЕТОВ

И ВОСПИТАНИЯ В ИСКУССТВЕННО СФОРМИРОВАННЫХ ПОМЕТАХ НА ПОКАЗАТЕЛИ РАЗВИТИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА,
НАДПОЧЕЧНИКОВ И ГОНАД У КРЫС

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток

2010

Работа выполнена на кафедре гистологии ГОУ ВПО «Дальневосточный

государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Рыжавский Борис Яковлевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Каредина Валентина Семеновна,

ГОУ ВПО «Владивостокский государственный

медицинский университет Росздрава»

кандидат медицинских наук

Бородай Светлана Витальевна,

ГУЗ «Краевой диагностический центр»,

г. Владивосток

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Амурская государственная

медицинская академия Росздрава»

Защита диссертации состоится «____» ______________ 2010 года

на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО

«Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава»

по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Владивостокского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «____» ________________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Г.В. Рева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Развитие мозга в постнатальном периоде онтогенеза находится под влиянием с одной стороны, генетически закрепленных программ, с другой стороны - внешней среды (P. Guesry, 1998; D.E. Dluzen, J.L. McDermot, 2000; W.J. Chen et al., 2003; T. Belovari et al., 2004; R.G. York et al., 2004; S.R. Kesler et al., 2008). Наиболее уязвимыми периодами для органогенеза мозга являются пренатальный и ранние этапы постнатального периода, когда действия различного рода факторов приводят к значительным последствиям. Такими факторами могут быть особенности гормонального статуса матери и плода (А.Г. Резников, 1982; Б.В. Розен, 1994), обеспеченность нутриентами (Н.И. Дмитриева, В.Г. Кассиль, 1982; О.К. Нетребенко, 2007), действие токсикантов (С.В. Шорманов и соавт., 2004; C.D. Maia et al., 2009), уровень стрессогенности среды и др. Степень стрессогенности среды – это один из факторов, оказывающих значительное влияние на органогенез головного мозга. Его эффект зависит от характера стрессогенности фактора, продолжительности его воздействия, интенсивности. Так, стресс на 19-й неделе беременности может вызвать в последующем изменение объема серого вещества различных областей коры, психические нарушения, ухудшение познавательных и интеллектуальных способностей (C. Buss et al., 2010). Хронический стресс обусловливает существенные изменения психоэмоционального статуса и поведения человека, которые могут завершиться постстрессорными депрессивными расстройствами и тревожными состояниями (Ю.В. Моисеева и соавт., 2009).

Экспериментальным путем показана возможность создания моделей с уменьшенной или увеличенной стрессогенностью среды, лучшими или худшими (по сравнению со среднестатистическими) условиями существования организма (Н.И. Дмитриева, В.Г. Кассиль, 1982; Ю.В. Наточин и соавт., 1995; Л.В. Серова и соавт., 1995; О.В. Перепелкина и соавт., 2006; D. Reiss et al., 2007; Б.Я. Рыжавский, 2000-2009; Ю.В. Моисеева и соавт., 2009). При этом было, в частности, показано, что содержание большого числа животных в тесной клетке приводит к снижению массы тела, увеличению массы надпочечников, концентрации кортикостероидов в плазме крови, выраженным изменениям поведения, в частности, повышенной тревожности (D.B. Vleck, V. Gente, 1968; Н.Л. Попова и соавт., 1970; А.Г. Старыгин, 1971; A. Gamallo et al., 1986; J. Baranyi et al., 2005; D. Reiss et al., 2007; Ю.В. Моисеева и соавт., 2009).

Пребывание животных в условиях «обогащенной среды», которая может выражаться меньшей скученностью, улучшением качества питания, большими по продолжительности контактами с матерью, приводит к увеличению темпов развития головного мозга, в частности к увеличению у них массы мозга, толщины коры, нейро-глиального индекса, количества белков (M.C. Diamond et al., 1964; E.L. Bennett et al., 1970).

Одним из факторов, значительно меняющих условия жизни в ранние её периоды, является воспитание в «чужой» среде, без участия биологической матери. Работы подобного плана показали, в частности, что воспитание крысят в «чужих» пометах отражается на функциональной активности их надпочечников, изменяет степень предрасположенности к генетически обусловленной гипертензии (M. Vallee, 1997; С.Я. Амстиславский и соавт., 1999; М.Д. Шмерлинг и соавт., 2005).

Уменьшение материнской заботы приводит к повышению уровня тревожности у взрослых особей, отражается на показателях их физического развития (S. Macr et al., 2004; I.C. Weaver et al., 2007). При периодическом отлучении от матери у крысят отмечаются дефицит массы тела, изменения в системе нейроэндокринной регуляции, низкая стресс-реактивность, повышенная исследовательская активность, низкая тревожность (P.M. Plotsky et al., 2005; Y. Matsumoto et al., 2006; А.А. Исенгулова и соавт., 2009).

В то же время, неизученными остаются многие моменты, такие как морфологические, морфометрические и гистохимические особенности разных зон неокортекса и гиппокампа животных, воспитанных в условиях лучше, чем среднестатистические, и, с другой стороны - крыс, выращенных «приемной» матерью, их возрастная динамика, а также взаимосвязи состояния эндокринных желез и показателей развития головного мозга таких животных, особенностей их высшей нервной деятельности (ВНД).

Цель исследования

Дать морфометрическую, гистохимическую характеристику неокортекса и гиппокампа, а также показателей высшей нервной деятельности крыс из экспериментально уменьшенных и искусственно сформированных («смешанных») пометов, сопоставить показатели развития головного мозга подопытных животных с некоторыми параметрами гистофизиологии их гонад и коркового вещества надпочечников.

Задачи исследования

1. Изучить морфологические, морфометрические, гистохимические показатели развития головного мозга 14-, 30-, 40-дневных крыс из пометов с экспериментально уменьшенной численностью.
2. Изучить влияние уменьшения численности пометов на показатели развития эндокринных желез (надпочечник, семенник, яичник) 14-, 30-, 40-дневных крыс.
3. Изучить морфологические, морфометрические, гистохимические показатели развития головного мозга 40-дневных крыс из искусственно сформированных («смешанных») пометов.
4. Изучить влияние воспитания крысят в искусственно сформированных («смешанных») пометах на показатели развития эндокринных желез (надпочечник, семенник, яичник) 40-дневных крыс.
5. Изучить особенности поведения в ПКЛ крыс из пометов с экспериментально уменьшенной численностью и искусственно сформированных («смешанных») пометов.

Научная новизна исследования

Работы состоит в том, что в ней впервые описано влияние экспериментального уменьшения численности пометов и воспитания крысят в искусственно сформированных пометах на показатели развития их головного мозга, надпочечников и гонад, показатели ВНД.

Установлены особенности морфометрических, гистохимических показателей развития некоторых отделов неокортекса и гиппокампа мозга крысят из экспериментально уменьшенных пометов разных возрастных групп. Впервые дана морфометрическая и гистохимическая характеристика гонад и коркового вещества надпочечников, уровня половых гормонов в крови этих животных.

Впервые показано, что крысята, воспитанные в искусственно сформированных пометах, отличаются от контрольных по целому ряду морфометрических и гистохимических показателей развития головного мозга.

Впервые проведен многосторонний анализ особенностей морфометрических и гистохимических показателей развития мозга, имеющего увеличенную массу, описана возрастная динамика этих особенностей.

Научная и практическая значимость работы

Проведенная работа относится к фундаментальным. Ее результаты расширяют представления о действии на развитие мозга факторов, которые могут влиять на данный процесс как у человека, так и у животных в реальных условиях. Научную значимость имеют новые данные о соотношениях макро- и микроскопических характеристик развивающегося мозга. Данные, приведенные в работе, могут использоваться в лабораториях, исследующих органогенез головного мозга, а также при чтении лекций по гистологии, физиологии, педиатрии в медицинских, биологических и педагогических вузах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Численность пометов крыс может рассматриваться как один из факторов, существенно влияющих на показатели развития, гистофизиологии головного мозга и ряда эндокринных желез крыс в молочном и препубертатном периодах онтогенеза. Уменьшение численности пометов сопровождается достоверными изменениями гравиметрических и морфометрических показателей развития головного мозга, ВНД, а также – показателей гистофизиологии гонад и надпочечников.

2. Мозг экспериментальных животных из пометов с уменьшенной численностью отличается большей массой, а также многими важными характеристиками, такими как толщина коры, плотность расположения нейронов, размеры нейронов, содержание в них НК и активности некоторых общеметаболитических ферментов.

3. Воспитание крысят в искусственно сформированных («смешанных») пометах отражается на ряде морфологических и гистохимических показателей развития головного мозга крысят, что проявляется меньшими толщиной коры СТД, размерами цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов слоя II и V ПТД, слоя II СТД, гиппокампа, цитоплазмы нейронов слоя V СТД, сниженной активностью NADH-d в цитоплазме нейронов слоя II, NADPH-d – в цитоплазме нейронов гиппокампа, более высокой, чем в контроле, концентрацией РНК в цитоплазме нейронов слоя II и V ПТД и СТД и гиппокампа. В этих условиях существенно меняются показатели соматического развития животных, гистофизиологии их гонад (меньшие абсолютная масса органов, диаметры наиболее крупных овариальных фолликулов и семенных канальцев, активность ГСДГ в клетках Лейдига, высокая активность ГСДГ в текоцитах фолликулов), надпочечников (сниженная абсолютная масса, толщина коркового вещества), ВНД.

Апробация диссертации

Материалы исследования представлены XII краевом конкурсе молодых ученых и аспирантов (январь 2010 г, г.Хабаровск), на заседании Хабаровского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (март 2010 г, г.Хабаровск), на 11-ой Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель 2010 г, г. Владивосток).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 5 в журналах, входящих в Перечень ведущих научных журналов и изданий ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста, включая 29 таблиц, 60 рисунков. Список литературы содержит 351 источник, в том числе 178 иностранных и 173 отечественных. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав собственных данных, заключения, выводов и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе были исследованы 181 беспородная белая крыса из 22 пометов, полученных от спаривания интактных 4,5 – 5,5 месячных самок и самцов.

В первом разделе работы изучалось влияние уменьшенной численности пометов на показатели развития мозга, гонад и надпочечников крыс.

В 1-ой группе исследованы 14-дневные крысы из пометов с экспериментально уменьшенной численностью (2 помета, 11 крысят). Контролем к ним являлись 14-дневные животные из пометов средней численности (2 помета, 20 крысят). Во 2-ой группе исследовались 30-дневные животные, воспитанные в пометах уменьшенной численности (3 помета, 18 крысят). Контролем для них служили 30-дневные крысы из пометов средней величины (3 помета, 31 крысенок). 3-ю группу составили 40-дневные животные из пометов с уменьшенной численностью (6 пометов, 30 крысят). Контролем для них были 40-дневные крысы из пометов средней численности (2 помета, 24 крысенка). Уменьшение численности пометов достигалась путем удаления из пометов средней величины (число крысят – 9-10) по 4-5 крысят в однодневном возрасте.

Во втором разделе работы исследовались особенности развития мозга, надпочечников и гонад 40-дневных крыс, воспитанных в искусственно сформированных, «смешанных» пометах (4 помета, 47 крысят). Они были образованы из пометов средней величины (число крысят - 8-10), в которые были добавлены по 4-6 «приемных» крысенка и убрано по столько же «родных». Контролем для них служили 40-дневные крысята из «естественных» пометов средней численности (2 помета, 24 крысенка).

Все животные сравниваемых групп содержались одновременно в условиях одного вивария, корм и воду получали ad libitum. Для изучения ВНД животные в 30-дневном возрасте были подвергнуты исследованию в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ). Забой контрольных и подопытных животных проводили одновременно, декапитацией. Взвешиванием на электронных весах определяли массу тела, мозга, полушария, гонад и надпочечников. Левое полушарие фиксировали в течение 1 часа в жидкости Карнуа. Затем его разрезали в переднетеменной (ПТД) и собственно теменной долях (СТД) строго перпендикулярно длиннику и верхней поверхности левого полушария, пользуясь схемами В.М. Светухиной (1962), заливали в парафин. На микротоме фирмы Reichert готовили срезы, толщиной 7 мкм. Их окрашивали метиленовым синим, а также - галлоцианином на нуклеиновые кислоты (НК) по Эйнарсону (З. Лойда и соавт., 1982).

Проводилось обзорное изучение препаратов ПТД и СТД, их морфометрическое исследование, которое включало в себя:

1. Определение толщины коры головного мозга. Проводилось измерение в 3 участках ПТД и СТД при помощи окуляр-микрометра МОВ – 15, при увеличении объектива х8 (Г.Г. Автандилов, 1990). Аналогично проводилось измерение толщины слоя I коры головного мозга.

2. Определение плотности расположения нейронов производили при увеличении окуляра х10, объектива на х40 в слоях II и V ПТД и СТД, в 5 стандартных (S=10000 мкм2) полях зрения каждого слоя.

3. Измерение площади сечения цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов слоев II и V ПТД и СТД и поля САI гиппокампа осуществляли с помощью компьютерной морфометрии на аппарате «Мекос» (медицинские компьютерные системы). В каждой из этих зон измеряли по 25 клеток.

Гистохимические исследования включали:

1. Определение концентрации НК в цитоплазме, ядрах и ядрышках пирамидных нейронов слоя II и V ПТД и СТД, поля САI гиппокампа на препаратах, окрашенных галлоцианином по Эйнарсону, на аппарате «Мекос» по оптической плотности этих структур при =550 нм. В мозге каждого животного исследовали по 25 клеток каждой из указанных областей.

2. Определение активности NADH-d и NADPH-d проводили тетразолиевым методом по Loida (З. Лойда и соавт., 1982) в нейронах слоев II, V СТД и поля САI гиппокампа. Из СТД правого полушария готовили криостатные срезы толщиной 20 мкм, которые монтировались на покровные стекла. Инкубацию проводили в термостате при температуре 370С в течение 30 минут. Результат оценивали измерением оптической плотности продуктов реакции в цитоплазме на аппарате «Мекос» (=550 нм). Исследовали 25 нейронов каждой из указанных областей.

Из левых надпочечников, яичников и семенников готовили криостатные срезы толщиной 20 мкм, проходящие через центральную часть органа. Они монтировались на покровные стекла и на них проводили реакции на 3-гидроксистероиддегидрогеназу (ГСДГ). Активность ГСДГ исследовалась по методу З. Лойда (1982). Интенсивность реакции оценивалась цитофотометрически с использованием аппарата «Мекос» при =550 нм. В каждом случае проводили измерения в 25 адренокортикоцитах каждой из зон коры надпочечника, в 25 клетках внутренней теки полостных фолликулов и клетках Лейдига семенника. На этих же препаратах окуляр-микрометром МОВ-15 измеряли толщину коркового вещества надпочечника, диаметр наибольшего полостного фолликула и средний диаметр семенного канальца.

Показатели ВНД оценивались по параметрам регистрации поведенческих актов у 30-дневных крысят в ПКЛ. Во время опыта каждое животное помещалось в лабиринт, где в течение 3 минут регистрировали суммарное время и количество элементарных поведенческих актов: свешиваний, стоек, груминга, принюхиваний, движений, заходов в открытые и закрытые рукава. По перечисленным компонентам поведения определялись интегральные характеристики: исследовательская активность и уровень тревожности (Ю.А. Сапожников и соавт., 2002). Во время забоя животных осуществляли забор крови. В сыворотке определяли концентрации тестостерона и эстрадиола стандартными иммуноферментными методиками. Эти исследования проведены под руководством д.б.н., проф. Р.В. Учакиной.

Статистический анализ проведен с помощью пакета прикладных программ Statistiсa 6.0. Высчитывались среднее арифметическое значение (М), ошибка (±m), медиана. Различия считались достоверными при Р<0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

В первой части работы нами были изучены особенности некоторых показателей развития головного мозга, надпочечников и гонад 14-, 30- и 40-дневных крыс из пометов с экспериментально уменьшенной численностью.

Подопытные крысы всех возрастных групп имели большую, чем в контроле, массу тела, головного мозга и полушария. Различия массы тела и мозга между подопытной группой и контрольной были наибольшими в 14- и 30-дневном возрасте, наименьшие – в 40-дневном.

Морфометрическое изучение головного мозга выявило у 14- и 30-дневных крыс несколько большую, чем в контроле, толщину коры ПТД (Р>0,05), у 30-дневных – достоверное увеличение толщины коры СТД (1291±19 мкм против 1213±18 мкм в группе контроля). В противоположность этому, у подопытных 40-дневных крысят толщина СТД была меньше таковой у контрольных животных (1279±17 мкм против 1367±15 мкм, Р<0,05). В то же время, толщина коры ПТД у крыс сравниваемых групп не имела статистически значимых различий. Плотность расположения нейронов у подопытных крыс была снижена в 14- и 30-дневном возрасте в слое II СТД, у 30- и 40-дневных – в слое II ПТД (табл. 1, Р<0,05). У 14-дневных подопытных крысят отмечалось достоверное увеличение размеров ядер и ядрышек нейронов слоя II СТД, цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов гиппокампа. Подопытные 30-дневные крысята отличались от контрольных животных увеличенными размерами цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов слоя II ПТД и СТД, слоя V ПТД, гиппокампа, у нейронов слоя V СТД были увеличены лишь размеры ядрышек (Р<0,05). Характер отклонений от контроля менялся у 40-дневных крыс. Экспериментальные крысята в этом возрасте отличались меньшими размерами цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов слоя II и V ПТД, слоя II СТД, меньшими размерами ядрышек и цитоплазмы нейронов слоя V, ядрышек нейронов гиппокампа.

Концентрация РНК в цитоплазме нейронов слоев II и V ПТД подопытных 14-дневных крысят была ниже, чем в контроле. В 30-дневном возрасте межгрупповых различий по этим показателям не выявлено. В противоположность этому, у 40-дневных крыс концентрация РНК в цитоплазме нейронов слоев II и V ПТД и СТД, гиппокампе мозга подопытных крыс была более высокой, чем в контроле.

Изучение активности NADH- и NADРH-d показало, что у подопытных 14-дневных крысят активность этих ферментов в цитоплазме нейронов слоев II, V СТД и гиппокампа была больше, чем в контроле. Подопытные 30-дневные крысы обладали большей активностью NADH-d во всех изученных нами локализациях, тогда как активность NADРH-d – увеличена в цитоплазме нейронов слоя II и V по сравнению с группой контроля. В противоположность этому, у 40-дневных крыс активность NADH-d в цитоплазме нейронов слоя II СТД, активность NADРH-d – слоя II СТД и гиппокампа были существенно ниже, чем в контроле (табл. 1, Р<0,05).

Таким образом, нами впервые установлено, что экспериментальное уменьшение численности пометов отразилось как на «макропоказателях» развития головного мозга (величина массы мозга и полушария), так и на «микропоказателях», отражающих характер постнатального развития нейронов неокортекса и гиппокампа; при этом были выявлены морфометрические особенности мозга с экспериментально увеличенной массой. По нашему мнению, заслуживает особого внимания тот факт, что отличия мозга подопытных животных от контроля в разные периоды онтогенеза имеют разную выраженность и направленность.

Экспериментальное уменьшение численности пометов привело к изменениям показателей развития исследованных нами стероидсекретирующих органов – надпочечников и гонад. Они проявлялись увеличением массы надпочечника, толщины его коркового вещества во всех изученных возрастных группах. В возрасте от 30 до 40 дней изменялся характер отличий активности ГСДГ, ключевого фермента стероидогенеза, в цитоплазме адренокортикоцитов сетчатой зоны коры надпочечника. Так у подопытных 30-дневных крысят активность этого фермента была ниже, чем у контрольных животных (0,630±0,024 усл. ед. против 0,776±0,048 усл. ед. соответственно), тогда как у 40-дневных крыс наблюдается превышение этого показателя над контролем (0,583±0,015 усл. ед. против 0,518±0,028 усл. ед., Р<0,05).

Для 14- и 30-дневных самок из экспериментально уменьшенных пометов были характерны достоверно большие масса яичников, диаметр наибольших овариальных фолликулов, у 14-дневных - увеличение активности ГСДГ в текоцитах фолликулов (0,543±0,03 усл. ед. против 0,409±0,024 усл. ед.). У 14- и 30-дневных подопытных самцов была достоверно увеличена масса семенников. Диаметр семенных канальцев у подопытных 30-дневных крыс был достоверно большим, чем в контроле (180±7 мкм против 146±7 мкм). Активность ГСДГ в клетках Лейдига семенника у 14- и 30-дневных крысят имела тенденцию к увеличению (Р>0,05), тогда как у 40-дневных была ниже, чем в контроле (0,512±0,024 усл. ед. против 0,603±0,027 усл. ед., Р<0,05).

Таким образом, развитие органов эндокринной системы, продуцирующих стероидные гормоны, обладающие мощным влиянием на состояние головного мозга, у животных из уменьшенных пометов существенно отличалось от такового в контроле.

Тестирование подопытных крысят в ПКЛ выявило у них увеличение времени и числа свешиваний, принюхиваний, выходов и нахождений в открытых рукавах лабиринта, большее количество заходов в закрытые рукава, меньшее время нахождения в закрытых рукавах, бездействия. Уровень тревожности у крысят из уменьшенных пометов (148,3±18,1) был меньше соответствующего показателя у контрольных животных (211,4±17, Р<0,05), а медиана исследовательской активности у подопытных животных была существенно большей, чем в контроле.

Таким образом, воспитание животных в экспериментально уменьшенных пометах привело к увеличению массы их головного мозга, отличиям его по ряду важных показателей: толщине коры, плотности расположения нейронов и их размеров, содержанию в них НК и активности некоторых общеметаболитических ферментов, показателям активности клеток стероидсекретирующих эндокринных желез и ВНД.

Во второй части работы нами было исследовано влияние условий воспитания крысят в искусственно сформированных («смешанных») пометах. Подопытные животные отличались сниженной массой тела (63±4 г против 81±2 г), головного мозга (1434±14 мг против 1481±11 мг). Морфометрическое изучение коры выявило, что толщина СТД подопытных крыс (1209±12 мкм) была меньше, чем у контрольных животных (1367±15 мкм, Р<0,05, табл. 2). Численная плотность нейронов слоя II ПТД у подопытных самцов была достоверно ниже, чем в контроле (18,6±0,3 против 21,3±1).

Размеры цитоплазмы и ядер нейронов в исследованных зонах неокортекса и гиппокампа у подопытных животных были меньше, тогда как концентрация НК в этих клетках была существенно более высокой, по сравнению с контролем. У животных из опытных пометов, по сравнению с контрольной группой, выявлялось снижение активности NADH-d в нейронах слоя II СТД (0,404±0,011 усл. ед. против 0,445±0,013 усл. ед.) и NADPH-d – в нейронах гиппокампа (0,388±0,01 усл. ед. против 0,437±0,018 усл. ед.).

Параллельно с этим в опытной группе наблюдалось достоверное уменьшение абсолютной массы надпочечников (9±0,4 мг против 10,4±0,4 мг), яичников (15±0,8 мг против 19±1,5 мг), семенников (282±31 мг против 463±13 мг), диаметров наибольших полостных овариальных фолликулов (404±12 мкм против 456±20 мкм), семенных канальцев (207±9 мкм против 246±9 мкм), толщины коркового вещества надпочечников (725±12 мкм против 793±11 мкм). При этом в опытной группе активность ГСДГ в текоцитах овариальных фолликулов была достоверно более высокой (0,622±0,025 усл. ед. против 0,559±0,01 усл. ед.), а в клетках Лейдига семенников – более низкой (0,491±0,018 усл. ед. против 0,603±0,027 усл. ед.), чем у животных контрольной группы.

У подопытных самок отмечалось повышение концентрации эстрадиола в крови (57,4±5,3 пг/мл против 34,4±4,5 пг/мл, Р<0,05), тогда как у подопытных самцов – тенденция к снижению концентрации тестостерона (2,15±0,3 нмоль/л против 3,17±0,57 нмоль/л), что коррелирует с повышенной активностью ГСДГ в теке овариальных фолликулов и более низкой, чем в контроле, в клетках Лейдига семенника.

Таблица 1

Влияние уменьшения численности пометов на гравиметрические, морфометрические
и цитохимические показатели развития головного мозга 14-, 30- и 40-дневных крыс

Группа Показатели	14-дневные крысы (1)		30-дневные крысы (2)		40-дневные крысы (3)
	опыт	контроль	опыт	контроль	опыт	контроль
Масса мозга, абс., мг	1180±13*	984±18	1489±21*	1285±18	1579±18*	1481±11
Масса полушария, мг	450±10*	375±8	545±9*	476±7	574±10*	547±9
ПТД, Толщина коры, мкм	1527±32	1494±21	1591±14	1553±17	1570±11	1573±12
Толщина слоя I, мкм	142±5	140±3	148±3	142±3	152±3	147±3
Число нейронов в поле зрения, слой II	20±1,6	23,2±0,4	17±0,3*	19±0,3	18±0,2*	20±0,68
слой V	9±0,3	8,4±0,1	6,5±0,4	7,2±0,1	7±0,12	6,8±0,16
Площадь сечения, мкм2
ядрышек нейронов слоя II	1,6±0,08	1,63±0,03	1,95±0,06*	1,6±0,04	2,03±0,05*	2,47±0,1
ядер нейронов слоя II	55,4±1,5	54,03±1,09	56,3±0,7*	50,9±0,9	56±0,6*	61,4±1,3
цитоплазмы нейронов слоя II	37,8±1,2	36,8±0,7	45,5±0,7*	37,9±0,7	39±1,4*	45,8±1,2
ядрышек нейронов слоя V	4,18±0,18	4,22±0,08	5±0,07*	4,08±0,08	4,1±0,13*	4,77±0,11
ядер нейронов слоя V	121,3±3	115,1±2,4	109,5±0,9*	96,2±3,9	95,3±2,3*	105±2
цитоплазмы нейронов слоя V	96,5±4,4	100,6±2,7	109,4±1,4*	91,7±2,4	78,4±1,7*	88,7±2,4
СТД, Толщина коры, мкм	1218±21	1183±24	1291±19*	1213±18	1279±17*	1367±15
Толщина слоя I, мкм	109±4	105±3	125±3	123±2	136±2	142±4
Число нейронов в поле зрения, слой II	22,7±0,5*	25,3±0,4	18,1±0,4*	20±0,4	20±0,3	20,8±0,53
слой V	9,2±0,3	9±0,2	6,9±0,2	7,2±0,1	7±0,12	7,1±0,23
Площадь сечения, мкм2
ядрышек нейронов слоя II	1,7±0,05*	1,53±0,03	1,92±0,06*	1,6±0,04	2,06±0,04*	2,56±0,17
ядер нейронов слоя II	56,6±0,9*	52,9±0,8	54,2±1,02*	49,9±0,9	55,5±1,5*	60±1,5

Продолжение таблицы 1

	(1)		(2)		(3)
цитоплазмы нейронов слоя II	37,6±0,8	35,8±0,75	41,9±1,27*	36,5±0,7	38,5±1,2*	45,3±1,3
ядрышек нейронов слоя V	3,93±0,08	3,9±0,07	4,5±0,1*	3,8±0,08	4±0,1*	4,35±0,08
ядер нейронов слоя V	117,3±2,5	106,5±5,6	100,9±1,8	99,8±2,2	92,7±2,1	95±2,4
цитоплазмы нейронов слоя V	95,9±4	95,6±2,1	93,6±1,9	89,6±2,04	75,6±2,6*	82±1,9
ядрышек нейронов гиппокампа	1,95±0,04*	1,82±0,03	2,2±0,06*	1,98±0,04	2,5±0,07*	2,94±0,2
ядер нейронов гиппокампа	79,6±2*	75±1,16	72,8±0,9*	70,2±0,9	70,6±1,4	73,8±1,9
цитоплазмы нейронов гиппокампа	43,5±0,9*	40,3±0,9	46,1±0,8*	44,08±0,7	46,8±2,2	50,5±2,06
Активность NADH–d в нейронах, усл. ед.:
- слоя II СТД	0,431±0,034*	0,338±0,014	0,528±0,026*	0,411±0,021	0,386±0,017*	0,445±0,013
- слоя V СТД	0,473±0,039*	0,332±0,019	0,637±0,04*	0,441±0,031	0,377±0,02	0,390±0,012
-гиппокампа	0,609±0,058*	0,345±0,018	0,576±0,032*	0,449±0,026	0,428±0,012	0,422±0,016
Активность NADH–d в нейронах, усл. ед.:
- слоя II СТД	0,343±0,009*	0,289±0,009	0,396±0,018*	0,334±0,011	0,363±0,017*	0,417±0,015
- слоя V СТД	0,393±0,032*	0,305±0,01	0,448±0,023*	0,381±0,023	0,376±0,021	0,396±0,01
-гиппокампа	0,445±0,025*	0,337±0,016	0,482±0,023	0,437±0,021	0,384±0,018*	0,437±0,018
Концентрация РНК в цито-плазме нейронов, усл. ед.:
слоя II ПТД	0,311±0,023*	0,394±0,018	0,389±0,021	0,402±0,02	0,299±0,014*	0,259±0,013
слоя V ПТД	0,394±0,019*	0,457±0,02	0,466±0,028	0,497±0,016	0,359±0,014*	0,312±0,017
слоя II СТД	0,314±0,034	0,379±0,02	0,409±0,032	0,416±0,015	0,300±0,019*	0,243±0,015
слоя V СТД	0,420±0,021	0,452±0,016	0,490±0,028	0,459±0,017	0,369±0,019*	0,307±0,017
гиппокампа	0,429±0,034	0,423±0,02	0,498±0,029	0,498±0,017	0,346±0,017*	0,255±0,019

* - различия между экспериментальной и контрольной группами статистически достоверны

Таблица 2

Влияние содержания крысят
в искусственно сформированных пометах
на гравиметрические, морфометрические
и цитохимические показатели развития их головного мозга

Группа Показатели	Опытная группа (1)	Контрольная группа (2)	«Свои» (3)	«Приемные» (4)
Масса мозга, абс., мг	1434±14*	1481±11	1418±20	1459±19
Масса полушария, мг	523±9	547±9	513±12	540±11
ПТД, Толщина коры, мкм	1574±15	1573±12	1530±16	1646±20*
Толщина слоя I, мкм	158±2*	147±3	155±3	164±4
Число нейронов в поле зрения, слой II	18,8±0,23	20±0,68	19±0,3	18,4±0,3
слой V	6,8±0,1	6,8±0,16	6,8±0,1	6,9±0,1
Площадь сечения, мкм2
ядрышек нейронов слоя II	1,99±0,03*	2,47±0,1	2,03±0,04	1,92±0,03*
ядер нейронов слоя II	52,28±0,66*	61,4±1,3	52,32±0,95	52,22±0,87
цитоплазмы нейронов слоя II	38,33±0,94*	45,8±1,2	37,9±1,3	39±1,26
ядрышек нейронов слоя V	4,5±0,1	4,77±0,11	4,57±0,09	4,37±0,22
ядер нейронов слоя V	96,53±1,23*	105±2	96,55±1,64	96,5±1,8
цитоплазмы нейронов слоя V	80,5±2,5*	88,7±2,4	78,44±3,34	83,8±3,6
СТД, Толщина коры, мкм	1209±12*	1367±15	1167±16	1176±21
Толщина слоя I, мкм	136±3	142±4	141±3	129±4*
Число нейронов в поле зрения, слой II	19,8±0,2	20,8±0,53	20,3±0,3	19±0,3*
слой V	6,9±0,1	7,1±0,23	6,9±0,1	6,9±0,1
Площадь сечения, мкм2
ядрышек нейронов слоя II	1,96±0,03*	2,56±0,17	1,97±0,03	1,96±0,07
ядер нейронов слоя II	50,02±0,63*	60±1,5	48,88±0,86	51,86±0,73*
цитоплазмы нейронов слоя II	37,17±0,95*	45,3±1,3	35,6±1	39,62±1,79*
ядрышек нейронов слоя V	4,48±0,08	4,35±0,08	4,38±0,06	4,65±0,19
ядер нейронов слоя V	91,5±1,04	95±2,4	89,51±1,18	94,75±1,72*
цитоплазмы нейронов слоя V	75,3±2,8	82±1,9	73,24±1,62	78,7±6,8
ядрышек нейронов гиппокампа	2,26±0,04*	2,94±0,2	2,26±0,03	2,25±0,09

Продолжение таблицы 2

	(1)	(2)	(3)	(4)
ядер нейронов гиппокампа	63,7±1,4*	73,8±1,9	62,77±2,09	65,36±1,47
цитоплазмы нейронов гиппокампа	39,7±0,7*	50,5±2,06	38,97±0,73	40,95±1,32
Активность NADH–d в нейронах, усл. ед.:
- слоя II СТД	0,404±0,011*	0,445±0,013	0,365±0,013	0,457±0,01*
- слоя V СТД	0,409±0,019	0,390±0,012	0,353±0,016	0,479±0,031*
-гиппокампа	0,405±0,018	0,422±0,016	0,343±0,011	0,474±0,028*
Активность NADPH–d в нейронах, усл. ед.:
- слоя II СТД	0,393±0,016	0,417±0,015	0,330±0,013	0,483±0,016*
- слоя V СТД	0,387±0,017	0,396±0,01	0,323±0,013	0,479±0,02*
-гиппокампа	0,388±0,01*	0,437±0,018	0,356±0,012	0,434±0,011*
Концентрация РНК в цитоплазме нейронов, усл. ед.:
слоя II ПТД	0,349±0,018*	0,259±0,013	0,344±0,024	0,358±0,027
слоя V ПТД	0,400±0,018*	0,312±0,017	0,405±0,027	0,392±0,024
слоя II СТД	0,338±0,015*	0,243±0,015	0,331±0,021	0,348±0,022
слоя V СТД	0,386±0,018*	0,307±0,017	0,381±0,023	0,393±0,032
гиппокампа	0,373±0,02*	0,255±0,019	0,380±0,024	0,361±0,037

*- различия между группами 1 и 2, 3 и 4 статистически достоверны

Тестирование в ПКЛ крысят из искусственно созданных пометов выявило у них увеличение на 14% времени принюхиваний (154,31±2,87 сек против 135,6±4,8 сек), сниженное время бездействия на 69% (9,2±1,8 сек против 29,8±4,3 сек, Р<0,05).

Изучение крысят внутри искусственно сформированных пометов, показало что «приемные» животные, воспитанные неродной матерью, отличаются по ряду признаков. Эти отличия включали в себя большую толщину коры в ПТД (1646±20 мкм против 1530±16 мкм), меньшую плотность расположения нейронов в слое II СТД у «приемных» крысят, чем у «своих» (19±0,3 против 20,3±0,3, Р<0,05). Нейроны слоя II ПТД у них отличались меньшими размерами ядрышек (1,92±0,03 мкм2 против 2,03±0,04 мкм2), в слое II СТД - увеличенными размерами ядер (51,86±0,73 мкм2 против 48,88±0,86 мкм2) и цитоплазмы (39,62±1,79 мкм2 против 35,6±1 мкм2), в слое V СТД - ядер (94,75±1,72 мкм2 против 89,51±1,18 мкм2, Р<0,05). Активность NADH- и NADPH-d в нейронах всех изученных локализаций у «приемных» крысят значительно превышала таковую у «своих», что свидетельствует о более интенсивно идущих в нейронах у «приемных» крысят процессов внутри- и внемитохондриального окисления (табл. 2). В то же время, «приемные» и «родные» крысята не различались по морфометрическим характеристикам надпочечников и гонад, концентрации в крови эстрадиола и тестостерона, за исключением относительной массы яичника, которая была меньшей у «приемных» самок. Тестирование «приемных» и «родных» крысят в ПКЛ выявило у первых увеличение на 7% времени принюхиваний (160,78±2,64 сек против 150,3±4,2 сек), снижение медианы исследовательской активности на 42%, а уровня тревожности – на 35% (91,7 против 141).

Таким образом, в целом, результаты изучения крыс, воспитанных в смешанных пометах, свидетельствуют, что как «свои», так и «приемные» отличаются по многим показателям развития мозга, надпочечников, гонад, поведению в ПКЛ от животных контрольной группы.

Суммируя все изложенные результаты работы, можно полагать, что они дополнили новыми существенными морфометрическими и гистохимическими данными информацию о влиянии условий воспитания, в период от неонатального до препубертатного, на развивающийся мозг, его неокортекс и гиппокамп, а также – на надпочечники и гонады, гормоны которых влияют на пре- и постнатальный органогенез мозга.

ВЫВОДЫ

1. Изменения условий воспитания крыс, при выращивании их в пометах уменьшенной численности, а также – в искусственно сформированных («смешанных») пометах, обусловливает развитие у них многочисленных морфометрических и гистохимических особенностей головного мозга, гонад и надпочечников.

2. Имеющий большую, чем в контроле, массу, головной мозг 14, 30- и 40-дневных крыс, выращенных в уменьшенных пометах, отличается от контрольного объемом неокортекса ПТД и СТД, размерами ядер и цитоплазмы, активностью NADH- и NADРH-d, концентрацией РНК в цитоплазме нейронов неокортекса и гиппокампа.

3. Характер отличий мозга крыс, выращенных в искусственно уменьшенных пометах, различен в 14-, 30- и 40-дневном возрасте. Эти обусловленные возрастом отличия проявляются в степени и направленности различий массы мозга, морфометрических характеристик коры, размеров различных структур нейронов, их гистохимических характеристик, что свидетельствует об отличиях динамики показателей развития мозга у животных из уменьшенных пометов от таковых в контроле.

4. Животные, выращенные в уменьшенных пометах, в 14-, 30- и 40-дневном возрасте имеют достоверно увеличенную массу надпочечников и гонад. 14- и 30-дневные самки отличаются увеличенными размерами наиболее крупных овариальных фолликулов, 30-дневные самцы – увеличенными диаметрами семенных канальцев. Активность ГСДГ в сетчатой зоне коры надпочечников у 30-дневных крыс обоего пола ниже, а у 40-дневных – выше, чем в контроле. У 14-дневных самок активность ГСДГ в клубочковой зоне коры надпочечников и в текоцитах фолликулов увеличена. У самцов в возрасте 14 дней активность ГСДГ увеличена в пучковой зоне коры надпочечников, у 40-дневных самцов имеется ее снижение в клетках Лейдига семенников.

5. Воспитание крысят в искусственно сформированных («смешанных») пометах обусловливает изменения морфометрических показателей развития головного мозга, включающие в себя уменьшение толщины СТД, численной плотности нейронов слоя II ПТД у подопытных животных. Размеры нейронов, их цитоплазмы и ядер в ПТД, СТД и гиппокампе у экспериментальных животных меньше, а концентрация РНК в цитоплазме клеток существенно выше, чем в контроле. Активность NADH-d в нейронах слоя II СТД и NADPH-d – в нейронах гиппокампа у подопытных крыс – ниже, чем в контроле.

6. Воспитание в искусственно сформированных («смешанных») пометах ведет к уменьшению у подопытных крысят обоего пола массы тела, абсолютной массы надпочечников и гонад, а также диаметров наиболее крупных полостных овариальных фолликулов, семенных канальцев, толщины коркового вещества надпочечников. У самок отмечается повышение концентрации в крови эстрадиола, активности ГСДГ в текоцитах овариальных фолликулов. У самцов в клетках Лейдига семенников отмечается снижение активности ГСДГ, по сравнению с контролем.

7. Воспитание крысят как в экспериментально уменьшенных, так и в искусственно сформированных пометах приводит к отклонениям их поведения в 30-дневном возрасте.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Литвинцева Е.М., Рыжавский Б.Я., Учакина Р.В. Влияние численности пометов крыс на показатели развития мозга, гонад и надпочечников // Дальневосточный медицинский журнал. – 2009. – №1. – С. 85 – 87.

2. Литвинцева, Е.М., Рыжавский Б.Я. Влияние содержания крысят в «чужих» пометах на некоторые показатели развития их головного мозга // Дальневосточный медицинский журнал. – 2009. - №2. – С. 101 – 104.

3. Литвинцева Е.М., Рыжавский Б.Я., Учакина Р.В. Сопоставление величины массы мозга с морфометрическими и гистохимическими характеристиками нейронов коры, показателями высшей нервной деятельности у крыс в препубертатном периоде онтогенеза // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 8. – С. 236 – 240.

4. Литвинцева Е.М. Влияние средовых факторов на морфологическую характеристику неокортекса и гиппокампа, показатели ВНД крыс в препубертатном периоде // Наука – Хабаровскому краю. Материалы XII краевого конкурса молодых ученых. – Хабаровск: Изд-во ТОГУ. – 2010. – С. 113 – 124.

5. Литвинцева Е.М., Рыжавский Б.Я., Матвеева Е.П. Морфологические особенности неокортекса и гиппокампа при экспериментальном увеличении массы мозга у крыс (онтогенетический анализ) // Дальневосточный медицинский журнал. – 2010. - №1. – С. 90 – 94.

6. Литвинцева Е.М. Особенности неокортекса и гиппокампа, ВНД при экспериментальном уменьшении численности пометов // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Материалы 11-ой Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. – 2009. – С. 18-19.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Абс. – абсолютная;

ВНД – высшая нервная деятельность;

ГСДГ – 3-гидроксистероиддегидрогеназа;

НК – нуклеиновые кислоты;

ПКЛ – приподнятый крестообразный лабиринт;

ПТД – переднетеменная доля;

СТД – собственно теменная доля;

NADH-d – NADH-дегидрогеназа;

NADPH-d – NADPH-дегидрогеназа;

ЦНС – центральная нервная система.

Литвинцева Екатерина Марковна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ

УМЕНЬШЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ ПОМЕТОВ И ВОСПИТАНИЯ
В ИСКУССТВЕННО СФОРМИРОВАННЫХ ПОМЕТАХ
НА ПОКАЗАТЕЛИ РАЗВИТИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА,
НАДПОЧЕЧНИКОВ И ГОНАД У КРЫС

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Подписано в печать 20.05.2010

Формат 6090 1/16. Усл. п.л. 1,0.

Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 12

Отпечатано на участке оперативной полиграфии

редакционно-издательского отдела ГОУ ВПО ВГМУ

690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 4