Функциональное состояние клеток с цитотоксической активностью у женщин с наружным генитальным эндометриозом
На правах рукописи
АЛЕКСИНСКАЯ ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК
С ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ У ЖЕНЩИН
С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ
14.01.01 – акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Иваново 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Посисеева Любовь Валентиновна
доктор медицинских наук, профессор Назаров Сергей Борисович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Качалина Татьяна Симоновна,
ГБОУ ВПО «Нижегородская
государственная медицинская академия»
Минздрава России
доктор медицинских наук, профессор Попов Александр Анатольевич,
ГБУЗ МО «Московский областной
научно-исследовательский институт
акушерства и гинекологии»
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита диссертации состоится «_____» декабря 2013 года в «_______» часов на заседании диссертационного совета Д208.028.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 153045, Россия, г. Иваново, ул. Победы, 20.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Ив НИИ М и Д имени В.Н. Городкова» Минздрава России.
Автореферат разослан «______» ноября 2013 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук И. А. Панова
Актуальность исследования
В структуре гинекологической патологии эндометриоз занимает 3-е место после воспалительных заболеваний и миомы матки, однако до настоящего времени нет чёткого понимания этиологии и патофизиологии данного заболевания. Согласно последним данным, во всём мире эндометриозом страдает каждая десятая женщина репродуктивного возраста (Адамян Л.В., 2013; Линде В. А., 2012; Качалина Т.С., 2010; Giudice L.C., 2010).
Эндометриоз, характеризующийся эктопическим ростом эндометриальной ткани вне мест ее нормального расположения, часто сравнивают с доброкачественной опухолью (Bernadete Trov de Marqui A., 2012; Ярмолинская М. И., 2007). Определение роли иммунных нарушений в патогенетических механизмах развития эндометриоза приобретает особое значение, поскольку поддержание тканевого гомеостаза и противоопухолевая защита в организме реализуются через иммунную систему (Ярилин А. А., 2006). Существует мнение, что развитие эндометриоза непосредственно ассоциировано с угнетением активности реакций клеточной цитотоксичности (Анциферова Ю.С., 2007; Gazvani R., 2002). Особый интерес представляет уникальная популяция ЕК-Т клеток, экспрессирующих TCR рецептор. Изучение механизмов реализации цитотоксического ответа Т-лимфоцитами показало, что при активации TCR+ лимфоциты приобретают фенотип CD16+ и способность к быстрому высвобождению провоспалительных цитокинов, например TNF. Активированные TCR+ лимфоциты способны к эффективной деструкции клеток-мишеней, что определяет их важную роль в развитии противоопухолевого иммунного ответа (Нижегородова Д. Б., 2009; Rincon-Orozco В., 2005). Доказано, что в периферической крови женщин с эндометриозом увеличивается содержание этой популяции Т-лимфоцитов (Малышкина А.И., Шаалали Ю.С., 2010). Однако роль TCR+ лимфоцитов в патогенезе эндометриоза во многом не ясна. В литературе отсутствуют данные об уровне активации этой уникальной популяции Т-лимфоцитов при наружном эндометриозе.
Изучение патогенеза наружного эндометриоза у человека имеет ряд ограничений. Так, у женщины сложно проследить самые первые этапы образования эктопического эндометрия. К тому же, нежелательно проведение повторных лапароскопических исследований у пациентки для наблюдений за динамикой очагов эндометриоза в перитонеальной полости. Поэтому новые возможности изучения этого заболевания открываются при использовании моделей у животных (Шарабанова И.Ю., 2002).
За рубежом и в нашей стране хирургический метод лечения генитального эндометриоза был и остается единственным, позволяющим удалить морфологический субстрат эндометриоза (Попов А.А., 2011). Однако до настоящего времени ни одна из предложенных стратегий лечения эндометриоза не привела к полному его излечению и не позволила избежать рецидивов, что обусловлено множественными полисистемными нарушениями, лежащими в основе его этиопатогенеза (Л. В. Адамян, Е. Н. Андреева, 2013). Иммунная патофизиология эндометриоза предполагает эффективность иммунологического подхода к лечению этого заболевания (Ярмолинская М. И., 2007).
Таким образом, определение функционального состояния клеток с цитотоксической активностью у женщин с наружным эндометриозом является актуальной проблемой гинекологии.
Цель исследования:
Установить новые механизмы развития наружного эндометриоза на основании оценки функционального состояния клеток с цитотоксической активностью на системном и локальном уровнях для разработки новых критериев диагностики данного заболевания у женщин и обоснования использования иммуномодулирующей терапии.
Задачи исследования:
- Дать характеристику соматического и репродуктивного здоровья женщин с наружным эндометриозом.
- Установить особенности изменения содержания и функционального состояния клеток с цитотоксической активностью (CD16+, CD3+CD16+, TCR+ лимфоцитов) на системном и локальном уровнях у женщин с наружным эндометриозом.
- В экспериментальной модели эндометриоза на лабораторных животных определить содержание и функциональное состояние перитонеальных TCR+ лимфоцитов и оценить эффективность использования иммуномодулирующей терапии по показателям их репродуктивной функции.
- Разработать новые критерии диагностики наружного эндометриоза у женщин.
Научная новизна исследования
Впервые установлено, что развитие наружного генитального эндометриоза связано с усилением внутриклеточной продукции TNF+ в популяции CD16+ лимфоцитов, в общей популяции лимфоцитов в периферической крови и в перитонеальной жидкости, снижением перитонеальных CD3+ лимфоцитов, а в эутопическом и эктопическом эндометрии - CD16+ клеток и CD3+CD16+ лимфоцитов, увеличением в периферической крови, перитонеальной жидкости и эктопических очагах эндометриоза уровня TCR+ лимфоцитов и функционально активных TCR+TNF+ лимфоцитов, снижением в пуле TCR+ лимфоцитов на локальном уровне количества функционально активных TCR+CD16+ и дабл-позитивных TCR+CD16+TNF+ клеток, уменьшением уровня TCR+TNF+ лимфоцитов в эутопическом и эктопическом эндометрии.
Впервые установлено, что на ранних этапах роста эктопического очага экспериментального эндометриоза в перитонеальной полости крыс отмечается увеличение содержания TCR+ клеток, а также высоко активной популяции TCR+TNF+ лимфоцитов.
Практическая значимость исследования
Разработаны новые диагностические критерии наружного эндометриоза у женщин, связанные с определением в периферической крови - TNF CD16+, CD16+, TNF+ TCR+, TCR+, TNF+ лимфоцитов.
Положения, выносимые на защиту
Развитие наружного генитального эндометриоза у женщин связано с увеличением общего содержания и функциональной активности клеток, обладающих цитотоксическим потенциалом, в периферической крови и в перитонеальной жидкости, и снижением функциональной активности ЕК-Т клеток непосредственно в пуле TCR+ лимфоцитов в перитонеальной жидкости, в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин.
На ранних этапах роста эктопического очага экспериментального эндометриоза в перитонеальной полости крыс отмечается увеличение общего содержания и функциональной активности -Т лимфоцитов.
Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: итоговой конференции научного общества студентов и молодых ученых «Неделя науки – 2007», Иваново, 2007; конференции молодых ученых, посвященной 75-летию со дня рождения В.Н. Городкова, Иваново, 2007; научно-практической конференции «Неделя науки-2009», Иваново, 2009; научно-практической конференции «Неделя науки-2010», Иваново, 2010; 92-ой ежегодной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Неделя науки – 2012», посвященной 110-летию профессора С.Д. Носова (ИГМА), Иваново, 2012; V Всероссийской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты», Иваново, 2012; конференции молодых ученых, Иваново, 2012; конференции молодых ученых, Иваново, 2013; 93-ей ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки - 2013», Иваново, 2013; XIV Всероссийском научном форуме «Мать и дитя», Москва, 2013.
Внедрение результатов в практику
Разработанные дополнительные критерии диагностики наружного эндометриоза прошли предрегистрационное испытание в клинико-диагностической поликлинике Федерального государственного бюджетного учреждения “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения РФ.
Личное участие автора
Самостоятельно проводились отбор пациенток в группы, согласно критериям включения и исключения, обследование и лечение пациенток. Принимала участие в проведении иммунологических исследований и постановке эксперимента. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 4 – в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 207 источников, в том числе 78 отечественных и 129 иностранных источников. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 16 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Клиническая часть работы выполнена на базе Федерального бюджетного государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор д.м.н. А.И.Малышкина). Исследования проводились в гинекологической клинике (эндоскопическом отделении – зав. к.м.н. В.Н. Романов), в лаборатории клинической иммунологии (зав. д.м.н. проф. Н.Ю. Сотникова).
Всего было обследовано 87 женщин. Основную группу составили 55 женщин с наружным эндометриозом. Контрольную группу составили 32 женщины, у которых при лапароскопии не было выявлено наружного эндометриоза. Этим женщинам проводилась лапароскопия с целью хирургической стерилизации (n=28), по социальным показаниям согласно федеральному закону «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, № 323-ФЗ. Также в эту группу вошли пациентки с бесплодием в браке (n=4), которым при лапароскопии был исключен диагноз наружный эндометриоз и хронический сальпингит (мужской фактор бесплодия, послеоперационный спаечный процесс). На каждую пациентку заполнялась специально разработанная «индивидуальная карта обследования», в которую вносились данные анамнеза, результаты обследования из истории болезни. Обследование женщин проводилось однократно при поступлении в клинику.
Материалом для исследования служили: периферическая венозная кровь, перитонеальная жидкость, эутопический эндометрий и эктопические очаги эндометриоза. Периферическая венозная кровь объёмом 5 мл забиралась в день операции, непосредственно перед проведением оперативного вмешательства. Перитонеальная жидкость для исследования аспирировалась в момент лапароскопии. В это же время производилась биопсия эндометрия и очагов эндометриоза. Образцы исследуемого материала помещались в стерильные пробирки с физиологическим раствором. Исследованию подвергались нативные образцы перитонеальной жидкости, биоптаты эутопического и эктопического эндометрия в физиологическом растворе и «гепаринизированные» образцы венозной крови. Взятие материала осуществлялось в I фазу менструального цикла.
Клинические методы
Сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотр, общеклиническое обследование, необходимое для выполнения оперативного вмешательства.
Иммунологические методы
Процедура выделения популяции мононуклеарных клеток (МНК) крови, перитонеальной жидкости и эндометрия
Фракцию мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови женщин и перитонеальной жидкости женщин и крыс получали стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078). Для выделения фракции эндометриальных МНК фрагменты эндометриальной ткани механически измельчали, фильтровали через стальное сито и отмывали в среде RPMI 1640 для удаления клеточного дебриса. Полученную взвесь клеток центрифугировали в градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,060, d=1,078) и отбирали для исследования кольцо клеток в интерфазе фиколл-урографин (d=1,078) – RPMI 1640.
Оценка функционального состояния лимфоцитов методом проточной цитометрии
Определение экспрессии мембранных рецепторов лимфоцитами крови, перитонеальной жидкости и эндометрия проводили с помощью моноклональных антител методом трехцветной проточной цитометрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC), фикоэритрин (РЕ) или РЕCy 5. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цитометрии клетки использовали в конечной концентрации 1х106.
К 50 мкл суспензии клеток в концентрации 1х106 клеток/мл добавляли 5 мкл мАТ, меченных FITC, PE и PE-Cy5, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем клетки отмывали в 1 мл фосфатного буфера (PBS), содержащего 0,1% азид натрия, и фиксировали в соответствии со стандартной процедурой.
Внутриклеточную процедуру окрашивания проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя, используя коммерческий набор Intra Prep TM (Becman Coulter, France) для пермеабилизации клеточной мембраны. При поведении процедуры окрашивания клетки сначала фиксировали в течение 15 мин в 100 мл реагента 1 из набора Intra Prep TM. Потом клетки инкубировали со 100 мл реагента 2 и с антителами к цитокину TNF для внутриклеточного окрашивания. При окрашивании лимфоцитов крыс проводили дополнительную процедуру инкубации клеток с FITC-коньюгированными вторичными антителами (Anti-Armenian and Syrian hamster IgG). Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgG1-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", USA). Анализ клеток проводили в лимфоцитарном гейте и в гейте TCR /+ лимфоцитов. 10000 клеток анализировалось в каждом образце. Анализ результатов проводили в программе "CellQuest Pro" (Becton Dickinson, USA).
Экспериментальные методы
Эксперименты выполнены на 115 половозрелых белых крысах-самках линии Wistar массой 200-250 г. Животные содержались в условиях вивария ИГМА на стандартном рационе питания, имели свободный доступ к воде.
Экспериментальная модель наружного эндометриоза воспроизведена у 100 крыс путем подшивания фрагментов маточного рога к внутренней поверхности брюшной стенки (Vernon M. W., 1985). Эта модель ранее была достаточно хорошо охарактеризована и подтверждена морфологическими исследованиями (Шарабанова И.Ю., 2002). При хирургическом вмешательстве использовались викриловые нити.
Для иммунологического исследования у 25 крыс проводился забор перитонеальной жидкости во время операции, а также через 7, 14 и 21 день после оперативного вмешательства.
Для сравнительной оценки эффективности разных методов лечения при экспериментальном эндометриозе использованы 90 крыс, которые были разделены на 6 групп: 1-я группа контрольная (n = 15) – ложнооперированные крысы, которым проводилось удаление левого маточного рога; 2-я группа (n = 15) - крысы с экспериментальным эндометриозом без лечения; 3-я группа (n = 15) - крысы с экспериментальным эндометриозом и коагуляцией эндометриоидного очага; 4-я группа (n = 15) - крысы с экспериментальным эндометриозом, которым после операции ежедневно в течение 7 дней подкожно вводили иммуномодулятор Вилон в дозе 10 мкг/кг в 1 мл физиологического раствора; 5-я группа (n = 15) - животные с коагуляцией гетеротопий и внутрибрюшинным однократным введением Вилона в дозе 10 мкг/кг в 1 мл физиологического раствора (n = 15); 6-я группа - крысы, с коагуляцией эндометриоидного очага и подкожным введением Вилона в течение 7 дней в вышеуказанной дозе.
Диатермокоагуляцию эндометриоидных очагов проводили в пределах видимой здоровой ткани с помощью электроприбора ЭБД – 25/220 “ Контур “ при мощности 25 Вт., температуре насадки 190°С в течение 5-10 секунд.
Препарат Вилон является иммуномодулятором, разработанным в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН. Синтетический тимомиметик дипептид (Lys-Glu) Вилон получен путем направленного химического синтеза на основании аминокислотного анализа комплексного препарата тимуса - тималина, иммунобиологических и физико-химических свойств аминокислот. Препарат рекомендован Фармакологическим государственным комитетом Минздрава РФ для клинических испытаний (разрешение на проведение клинических испытаний Минздрава РФ от 19.02.02) (Князькин И. В., 2002; Назарова А.О., 2006).
Для оценки репродуктивной функции у крыс исследовали длительность эстрального цикла и его фаз. С этой целью у крыс в утренние часы при помощи пипетки и физиологического раствора получали влагалищные мазки, которые исследовали после окраски по Романовскому. О фазе цикла судили по соотношению различных типов клеток в мазке.
Для сравнительной оценки эффективности методов лечения при экспериментальном эндометриозе через 6 недель после начала эксперимента мы изучали: продолжительность эстрального цикла, частоту наступления беременности, продолжительность беременности, количество крысят в помёте и массу помёта. Для получения животных с датированным сроком беременности использовался метод вагинальных мазков (Дыбан А. П., 1975). Самок в фазу проэструс или ранний эструс помещали в одну клетку с самцами (4 самки и 1 самец). Каждое утро производился анализ микроскопического содержимого вагинальных мазков на наличие сперматозоидов. Сперматозоиды выявляли в неокрашенных препаратах с помощью светового микроскопа под малым увеличением. День обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке считался как первый день беременности. При рождении потомства производился подсчёт количества крысят в помёте и их взвешивание.
Статистическая обработка данных
Статистическая обработка результатов исследования проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения. В зависимости от типа распределения данных оценивали достоверность различий между показателями независимых выборок по непараметрическому критерию U Манна-Уитни или по t-критерию Стьюдента (М±m). Для оценки факторов риска рассчитывался относительный риск (RR) с 95% доверительным интервалом (ДИ - 95%). Статистический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ «Statistica 6.0», «Microsoft Office 2007», «GenStat» и «Open Epi». Для оценки диагностической значимости новых иммунологических показателей применялись интерактивные диаграммы и ROC-анализ с использованием программы «MedCalk».
Результаты исследования и их обсуждение
Для изучения клинических особенностей течения заболевания проведёно обследование 87 женщин в возрасте от 18 до 44 лет. Средний возраст женщин контрольной группы составил 33,19±1,15 года, и был выше, чем средний возраст женщин основной группы - 30,76±0,64 года (р=0,039). В контрольной группе наиболее часто встречались женщины в возрасте старше 35 лет – 40,6%, в то время как в основной группе чаще наблюдались пациентки в возрасте от 26 до 30 лет – 36,4%. По характеру менструальной функции пациентки с наружным эндометриозом в 80,0% случаев отмечали дисменорею, что достоверно больше (р<0,001), чем женщины контрольной группы – 15,6%. Установлено, что при наличии у женщины дисменореи частота выявления наружного эндометриоза повышается в 21,6 раза. Согласно результатам исследований в разных странах, распространённость дисменореи варьируется от 16,8 до 81% (Адамян Л. В., 2013). Достоверные различия групп были получены при изучении репродуктивной функции обследованных женщин. Пациентки основной группы реже имели в анамнезе роды по сравнению с женщинами контрольной группы (контрольная группа - 56,3%, основная группа -10,9%, р<0,001). В основной группе первичное бесплодие отмечалось у 49,1% пациенток основной группы, а вторичное бесплодие у 29,1%, пациенток (р=0,0001 и р=0,013 соответственно). Согласно нашим данным, при наличии у женщины бесплодия частота выявления наружного эндометриоза увеличивается в 3,1 раза. Полученные нами данные подтверждают мнение большинства отечественных и зарубежных авторов о взаимосвязи наружного эндометриоза с бесплодием (Адамян Л.В., 2013; Марченко Л. А., 2007; Hansen K. A., 2006; Кузьмичёв Л. Н., 2001).
При анализе применяемых методов контрацепции в обеих исследуемых группах было обнаружено, что женщины основной группы значительно реже использовали внутриматочную (р=0,023) и барьерную контрацепцию (р=0,011) по сравнению с женщинами группы контроля.
При изучении гинекологических заболеваний в анамнезе пациенток достоверных различий основной группы от контрольной выявлено не было. Однако 18% женщин основной группы в анамнезе уже перенесли оперативное вмешательство по поводу наружного эндометриоза, что подтверждает литературные данные о частоте рецидивов эндометриоза после хирургического лечения (Fanta M., 2012; Angioni S., 2010). По частоте перенесённых соматических заболеваний разных нозологических форм достоверных отличий между контрольной и основной группами выявлено не было. Однако отсутствие какой-либо экстрагенитальной патологии достоверно чаще наблюдалось у женщин контрольной группы - 21,8%, в основной группе - 7,3% (р=0,049). Пациентки с наружным эндометриозом чаще болели простудными заболеваниями - 40%, женщины контрольной группы - 12,5% (р=0,008). Установлено, что высокая частота простудных заболеваний ассоциирована с увеличением в 4,7 раза риска развития наружного эндометриоза.
По степени распространения эндометриоидного процесса основная группа разделилась следующим образом: I стадия отмечена у 7% женщин, II стадия у 35%, III стадия у 11% и IV стадия у 47% пациенток.
Пациентки основной группы в 65% случаев отмечали болевой синдром, в 13% случаев диспареунию. Установлено, что при наличии у женщины нециклических тазовых болей частота выявления наружного эндометриоза повышается в 2,6 раза. Во время лапароскопии у 40% женщин основной группы обнаружены эндометриомы. Ретроцервикальный эндометриоз наблюдался в 22% случаев, экстрагенитальный – в 25% случаев. При лапароскопии в основной группе спаечный процесс органов малого таза был обнаружен у 22% пациенток. Установлено, что при наружном эндометриозе в 8,7 раза повышается риск формирования спаечного процесса в малом тазу.
Существует мнение, что развитие эндометриоза непосредственно ассоциировано с угнетением активности реакций клеточной цитотоксичности (Gazvani R., 2002). Было установлено, что общее содержание CD16+ лимфоцитов в периферической крови при наружном эндометриозе было повышено (25,54±1,51%) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группой (14,21±0,96%, р=0,005), а также выявлено усиление внутриклеточной продукции TNF+ CD16+ лимфоцитами (3,17±0,23%) по сравнению группой контроля (1,78±0,30; р=0,002) и усиление внутриклеточной продукции TNF+ в общей популяции периферических лимфоцитов (13,24±0,73%) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (8,31±0,60%; р=0,0002).
Несмотря на несомненную важность оценки системных факторов иммунитета, наибольший интерес представляет изучение процессов, происходящих местно, в брюшной полости (Посисеева Л.В. 2009). Существует гипотеза о том, что в норме эндометриоидные клетки должны распознаваться перитонеальными ЕК, но нарушение элиминации эктопического эндометрия за счёт изменения активности ЕК приводит к развитию эндометриоза (Gazvani R., 2002). Оценка характера иммунного ответа на локальном уровне выявила другие закономерности изменения содержания и функционального состояния различных популяций цитотоксических лимфоцитов. Нами было установлено, что в перитонеальной жидкости женщин с наружным эндометриозом содержание CD3+лимфоцитов было значительно ниже (61,43±1,91%) такового в контрольной группе (71,55±4,00%, р=0,034). Но при этом в основной группе отмечалось повышение уровня перитонеальных лимфоцитов с фенотипом CD16+TNF (2,80±0,19%) относительно показателя контрольной группы (1,53±0,21, р=0,002), а также усиление внутриклеточной продукции TNF+ в общей популяции перитонеальных лимфоцитов (15,67±0,66%) по сравнению с группой контроля (9,93±0,76%; р=0,00003).
Существует гипотеза о том, что наружный эндометриоз является заболеванием преимущественно эндометрия. При этом, в эктопическом эндометрии женщин с наружным эндометриозом секретируется ряд растворимых факторов, оказывающих ингибирующее действие на функциональную активность ЕК (Vinatier D., 2000). В эутопическом и эктопическом эндометрии при наружном эндометриозе имело место снижение количества CD16+ лимфоцитов (13,33±0,80%; 12,09±0,74% соответственно) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (18,50±2,20%; р=0,01; р=0,004 соответственно), а также отмечалось снижение количества CD3+CD16+ лимфоцитов (3,65±0,41%; 4,48±0,42%) относительно данного показателя в эндометрии женщин группы контроля (11,56±2,17%; р=0,001; р=0,003 соответственно).
Ранее проведенные исследования показали, что при эндометриозе в периферической крови повышено общее содержания -Т клеток (Шишков Д.Н., 2006). Однако особенности активации и функциональной активности TCR+ лимфоцитов при наружном эндометриозе до настоящего времени остаются практически не изученными. Анализ данных о характере функционирования лимфоцитов с фенотипом ЕК-Т, экспрессирующих TCR рецептор, показал, что общее содержание TCR+ лимфоцитов в периферической крови женщин с наружным эндометриозом повышено (7,36±0,86%) по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе (3,50±0,27%; p=0,0002). У женщин с эндометриозом также достоверно повышалось содержание периферических TCR+TNF+ лимфоцитов (1,29±0,14%) по сравнению с показателем контрольной группы (0,55±0,09%; p=0,0002).
Большой интерес представляют перитонеальные TCR+ лимфоциты, поскольку именно этот пул клеток обладает специфической цитотоксичностью в отношении аутологичных эндометриальных клеток, попадающих в перитонеальную полость при менструации (Gazvani R., 2002). В перитонеальной жидкости общее содержание TCR+ лимфоцитов в основной группе было повышено (8,32±0,51%) по сравнению с группой контроля (5,28±0,55%; р=0,005), а также отмечалось увеличение количества TCR+TNF+ лимфоцитов (1,97±0,18%) относительно аналогичного показателя контрольной группы (1,22±0,22%; р=0,018).
В эктопических очагах выявлено значительное повышение общего содержания TCR+ лимфоцитов (8,45±0,77%) по сравнению с эутопическим эндометрием женщин с эндометриозом (6,22±0,60%; р=0,021), а также по сравнению с эндометрием женщин контрольной группы (4,88±0,45%; р=0,007). При наружном эндометриозе отмечено более высокое содержание TCR+TNF+ клеток в ткани очага эндометриоза (4,20±0,97%) по сравнению с эутопическим эндометрием женщин основной группы (2,04±0,25%; р=0,02 ).
Для уточнения характера активации TCR+ лимфоцитов мы провели анализ экспрессии CD16 молекул и внутриклеточной продукции TNF непосредственно в пуле TCR+ клеток. В перитонеальной жидкости женщин с наружным эндометриозом наблюдалось достоверное снижение функционально активных CD16+ лимфоцитов (23,96±2,11%) и даблпозитивных CD16+TNF+ лимфоцитов (10,85±1,44%) по сравнению с группой контроля (42,51±7%, р=0,009 и 26,53±5,82%, р=0,003 соответственно).
В ткани эутопического и эктопического эндометрия пациенток с наружным эндометриозом выявлено снижение содержания CD16+ клеток в пуле TCR+ лимфоцитов (37,91±3,12%; 33,12±2,70%, соответственно) по сравнению с аналогичным показателем эндометрия женщин контрольной группы (62,37±4,05%; p=0,036; р=0,007, соответственно). Кроме того, в пуле TCR+ лимфоцитов было снижено количество функционально активных лимфоцитов, продуцирующих внутриклеточно TNF, (33,77±2,82%; 38,70±3,10, соответственно) по сравнению с группой контроля (55,17±4,58%; р=0,02; р=0,049, соответственно). Уровень дабл-позитивных CD16+TNF+лимфоцитов в популяции TCR+ клеток в эктопическом и эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом был также значительно снижен (17,81±2,26%; 23,68±2,19%, соответственно) по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе (40,20±0,69%; р=0,01; р=0,009, соответственно).
По результатам ROC – анализа иммунологических показателей периферической крови женщин с наружным эндометриозом были выбраны 5 из них, которые могут использоваться в качестве дополнительных критериев диагностики данного заболевания (табл.1).
Таблица 1
Результаты ROC – анализа иммунологических показателей периферической крови
| Показатели (лимфоциты) | Диагностический показатель в периф. крови (%) | Точность метода (%) | Чувстви-тельность | Специ- фичность | Площадь под ROC кривой |
| CD16+ | >19,1 | 76 | 69,2 | 94,7 | 0,870 |
| TCR+ | >4,4 | 76 | 72,0 | 88,9 | 0,803 |
| TCR+TNF+ | >0,6 | 74 | 72,3 | 77,8 | 0,799 |
| TNF+CD16+ | >1,4 | 85 | 94,0 | 63,2 | 0,798 |
| TNF+ | >10,1 | 72 | 70,0 | 78,9 | 0,792 |
О наличии у женщины наружного эндометриоза может свидетельствовать: выявление в периферической крови TNF+CD16+ лимфоцитов более 1,4 %; CD16+ лимфоцитов более 19,1%; TCR+ более 4,4%; TCR+TNF+ более 0,6% и TNF+ более 10,1%.
Для уточнения роли цитотоксических TCR+ лимфоцитов в механизмах развития эндометриоидного очага, мы оценили динамику изменения содержания функционально активной популяции ЕК-Т лимфоцитов с фенотипом TCR+TNF+ в перитонеальной полости у крыс на различных этапах формирования очага экспериментального эндометриоза: до индукции эндометриоза (0 день), на 7, 14 и 21 день после проведения операции. Анализ данных показал, что на самых ранних этапах развития эндометриоидного очага в перитонеальной полости у крыс (на 7 день) происходит резкое увеличение общего содержании TCR+ лимфоцитов (9,05±0,82%) и пула функционально активных TCR+TNF+ лимфоцитов (3,76±0,48%), по сравнению с аналогичными показателями у крыс до операции (4,67±0,20%; р=0,0008; 2,01±0,17%; р=0,007). На 14 день после моделирования экспериментального эндометриоза достоверно возрастает продукция TNF в общей популяции перитонеальных лимфоцитов (28,64±4,21%) по сравнению с аналогичными показателями у крыс до операции (18,56±1,7%; р=0,047). Следует отметить, что полученные результаты у крыс с экспериментальным эндометриозом хорошо согласуются с изменениями этих же показателей в перитонеальной жидкости женщин с наружным эндометриозом.
Исследование экспериментальных моделей наружного эндометриоза открывает широкие возможности в изучении не только патогенеза, но и является весьма перспективным в плане разработки новых методов лечения данного заболевания (Шарабанова И.Ю., 2002; Посисеева Л.В. 2001). Согласно литературным данным (Назаров С.Б., 2004) и полученным результатам, экспериментальный эндометриоз приводит к снижению фертильности крыс. Установлено, что при моделировании экспериментального эндометриоза и отсутствии лечения, происходит нарушение репродуктивной функции крыс в связи: с удлинением фазы диэструса и эстрального цикла в целом, снижением частоты наступления беременности в первый эстральный цикл, увеличением количества дней и эстральных циклов до наступления беременности, уменьшением среднего количества крысят в помёте и общей массы помёта.
При сравнении разных способов лечения обнаружено, что все они приводили к восстановлению нарушенной фертильности крыс, однако при хирургическом лечении в сочетании с внутрибрюшинным введением вилона восстановление репродуктивной функции крыс-самок происходило наиболее эффективно. Так, длительность диэструса и эстрального цикла в целом при данном способе лечения были достоверно меньше (2,67±0,24 дня; 5,77±0,26 дня, соответственно), чем в группе крыс без лечения (4,03±0,36 дня, р=0,004; 7,25±0,37 дня, р=0,003, соответственно). Количество дней и эстральных циклов до наступления беременности при комбинированном лечении с внутрибрюшинным введением вилона максимально приближается к показателям контрольной группы по сравнению с другими методами лечения.
При изучении среднего количества крысят в помёте установлено, что в группе крыс с комбинированным лечением с внутрибрюшинным введением вилона в помёте в среднем было больше крысят (5,60±0,52 крысят), чем при изолированном оперативном лечении крыс (4,07±0,46 крысят; р=0,037), а также при лечении только иммуномодулятором (4±0,00 крысят; р<0,01).
Общая масса помёта крыс во всех группах с лечением экспериментального эндометриоза была значительно больше, чем в группе крыс с эндометриозом без лечения, однако в группе крыс с комбинированным лечением с внутрибрюшинным введением Вилона общая масса помёта была больше (36,81±3,33г), чем аналогичный показатель крыс с лечением только иммуномодулятором (25,4±0,00г; р<0,01).
Вероятно, эффективность данного способа лечения связана с тем, что наиболее значимые изменения при наружном эндометриозе происходят местно, в перитонеальной полости. Именно на поверхности брюшины разыгрываются наиболее важные события, от которых зависит прогрессирование заболевания или регресс эндометриоидных гетеротопий (Ярмолинская М.И., 2007).
Таким образом, в периферической крови у женщин отмечается увеличение общего содержания и уровня активации клеток с цитотоксической активностью, что, по-видимому, свидетельствует о высоком уровне напряженности системных цитотоксических реакций. Однако на локальном уровне, где происходит формирование и рост очагов эндометриоза, содержание активированных TCR+клеток, обладающих высоким цитотоксическим потенциалом, напротив, снижается. Эти изменения позволяют говорить об угнетении противоопухолевого иммунного ответа, обусловленного активированными Т-клетками, на локальном уровне, что может способствовать выживанию клеток эндометрия при их попадании в перитонеальную полость в результате менструального рефлюкса, определяя возможность развития и роста очагов эндометриоза в перитонеальной полости.
ВЫВОДЫ
1. Наружный генитальный эндометриоз у женщин сопровождается дисменореей (ОР-21,6), спаечным процессом органов малого таза (ОР-8,7), частыми ОРВИ (ОР-4,7), бесплодием (ОР-3,1), нециклическими тазовыми болями (ОР-2,6).
2. У женщин с наружным эндометриозом в периферической крови отмечается увеличение содержания CD16+ лимфоцитов и усиление продукции TNF в популяции CD16+ лимфоцитов и общей популяции лимфоцитов, в перитонеальной жидкости - снижение CD3+ лимфоцитов при одновременном увеличении продукции TNF в популяции CD16+ лимфоцитов и общей популяции лимфоцитов, в эутопическом и эктопическом эндометрии - снижение CD16+ и CD3+CD16+ лимфоцитов.
3. У женщин с наружным эндометриозом в периферической крови, перитонеальной жидкости и эктопическом эндометрии имеет место повышение содержания TCR+ лимфоцитов и функционально активных TCR+TNF+ лимфоцитов, в пуле перитонеальных TCR+лимфоцитов - снижение уровня функционально активных TCR+CD16+ лимфоцитов и даблпозитивных TCR+CD16+TNF+ лимфоцитов, в эутопическом и эктопическом эндометрии - снижение уровня функционально активных TCR+TNF+ лимфоцитов.
4. Развитие экспериментального эндометриоза у крыс сопровождается на раннем этапе - увеличением в перитонеальной полости содержания TCR+ клеток и высоко активной популяции TCR+TNF+лимфоцитов с последующим их снижением, на позднем этапе - усилением продукции TNF в общей популяции перитонеальных лимфоцитов.
5. Наиболее эффективным методом лечения наружного эндометриоза в условиях экспериментальной модели на крысах является комбинация хирургического лечения и внутрибрюшинного введения иммуномодулирующего препарата дипептида Lys-Glu.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Для диагностики наружного эндометриоза рекомендуется использовать дополнительные иммунологические показатели периферической крови.
О наличии у женщины наружного эндометриоза может свидетельствовать: выявление в периферической крови увеличения продукции TNF CD16+ лимфоцитами более 1,4 % (точность метода - 85%), увеличение общего содержания в периферической крови CD16+ лимфоцитов более 19,1% (точность метода - 76%), увеличение общего содержания TCR+ лимфоцитов более 4,4% (точность метода - 76%), увеличение продукции TNF+ TCR+ лимфоцитами более 0,6% (точность метода - 74%), а также увеличение продукции TNF+ в общей популяции лимфоцитов более 10,1% (точность метода - 72%).
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Публикации в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:
- Алексинская Е.С., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Назаров С.Б., Анциферова Ю.С. Особенности функционального состояния TCR + лимфоцитов периферической крови и перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Аллергология и иммунология. - 2009.- Т.10, №2.- С.253.
- Анциферова Ю.С., Назаров С.Б., Козырина А.А., Алексинская Е.С., Назарова А.О. Изменение активности -Т лимфоцитов в перитонеальной жидкости и в эндометрии у крыс на разных стадиях развития очага экспериментального эндометриоза // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010.- №2/1(29).- С.89.
- Алексинская Е.С., Посисеева Л.В., Назаров С.Б. Особенности функционального состояния TCR+ лимфоцитов при наружном эндометриозе у женщин // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т.6 (14), №2 (1). - С.20-21.
- Алексинская Е.С., Назаров С.Б., Посисеева Л.В., Анциферова Ю.С. Изменение активности TCR+ лимфоцитов в периферической крови и перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом // Проблемы репродукции. – Москва. - 2012. - С.148.
Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:
- Алексинская Е.С., Посисеева Л.В., Назаров С.Б., Назарова А.О. Влияние нового иммуномодулирующего препарата «Вилон» на репродуктивную функцию крыс с экспериментальным эндометриозом // Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии: сборник научных работ и материалов научно-практической конференции молодых ученых, посвященный 75-летию со дня рождения В.Н.Городкова / Под редакцией Л.В.Посисеевой, С.Б.Назарова.- Иваново: Издательство МИК, 2007. – С.96-98.
- Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Посисеева Л.В., Назаров С.Б., Алексинская Е.С. Изменение продукции IL-6 клеток и TNF- различными популяциями клеток врожденного иммунитета в динамике развития очага экспериментального эндометриоза // Омский научный вестник. -№1 (84).- 2009. - С.85-87.
- Анциферова Ю.С., Назаров С.Б., Козырина А.А., Алексинская Е.С., Назарова А.О. Особенности спонтанной и стимулированной продукции цитокинов лимфоцитами и макрофагами перитонеальной жидкости у крыс с экспериментальным эндометриозом // Журнал теоретической и клинической медицины – 2010.- №5.- С.39-41.
- Алексинская Е.С. Изменение активности TCR+ лимфоцитов в эктопических очагах женщин с наружным генитальным эндометриозом // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А.Алмазова.- СПБ., 2012.- С.78.
- Алексинская Е.С. Изменение активности TCR+ лимфоцитов на системном и локальном уровнях при наружном генитальном эндометриозе. // Неделя науки – 2012: материалы 92-й ежегодной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 110-летию профессора С.Д. Носова (ИГМА) – Иваново. - 2012. - С. 24.
- Алексинская Е.С. Особенности функционального состояния TCR+ лимфоцитов у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Актуальные проблемы, медицинские и организационные технологии охраны репродуктивного здоровья семьи: сборник научных работ. – Иваново: Издательство МИК, 2012.- С.180-181.
- Алексинская Е.С. Нарушение функционирования TCR+ лимфоцитов в перитонеальной жидкости пациенток с наружным генитальным эндометриозом // Вестник РГМУ.- 2013. - №2. – С.169.
- Алексинская Е.С. Клинико-экспериментальное сравнение активности TCR+ лимфоцитов при наружном генитальном эндометриозе // Неделя науки- 2013: материалы 93-й ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием – Иваново, 2013.- С.148.
- Алексинская Е.С. Изменения функционального состояния TCR+ лимфоцитов при наружном генитальном эндометриозе. // Мать и дитя: материалы XIV Всероссийского научного форума - М., 2013.- С.246-247.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЕК - естественные киллеры
ЕК-Т – естественные киллерные Т-лимфоциты
CD – молекулы дифференцировки лимфоидных клеток
TCR – Т-клеточный рецептор
TNF - фактор некроза опухоли.
