Создание фитосбора нефролен с использованием рационального химико-фармакологического подхода (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ВИЧКУТКИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

СОЗДАНИЕ ФИТОСБОРА «НЕФРОЛЕН» С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

РАЦИОНАЛЬНОГО

ХИМИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА

(экспериментальное исследование)

15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Алтайской лаборатории ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Лампатов Вячеслав Витальевич

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Брюханов Валерий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Петриченко Василий Михайлович

доктор медицинских наук,

профессор Котегов Виктор Петрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «18» сентября 2007 г. в ___ час. на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46

Автореферат разослан «19» июня 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент Метелева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Лечение воспалительных заболеваний почек является актуальной проблемой современной терапии и требует поиска новых эффективных и безопасных лекарственных средств. Хорошо известно, что растительные средства, как правило, менее токсичны синтетических противовоспалительных препаратов и могут длительно применяться без каких-либо существенных побочных воздействий на организм [С.Я. Соколов, 2000]. В этом контексте перспективными для изучения и дальнейшего применения являются сборы, составленные из лекарственных растений, произрастающих на Алтае. Ранее было установлено, что водные извлечения из некоторых композиций лекарственных растений Алтая обладают противовоспалительным и противомикробным действием, а также влияют на процессы свободнорадикального окисления и функцию почек [О.Ш. Кривова, 2001; Е.М. Санаров с соавт., 2004; В.М. Брюханов с соавт., 1999; С.В. Замятина, 2006].

Изученные сборы были созданы путем сочетания лекарственного растительного сырья с учетом его фармакологических свойств [О.Ш. Кривова, 2001]. Однако такой подход далеко не всегда позволяет получить фитосборы с желаемым фармакотерапевтическим эффектом. Так, скрининговые фармакологические исследования шести сборов показали, что только один из них может быть рекомендован для углубленного изучения в качестве возможного фитосредства терапии почечной патологии [Е.М. Санаров с соавт., 2003]. В связи с этим актуальной задачей является установление зависимости фармакологического действия извлечений из сборов от их химического состава, что помогло бы в дальнейшем создавать новые эффективные растительные препараты, сочетающие в себе противовоспалительные, антиоксидантные, диуретические и противомикробные свойства, на основе рационального целенаправленного подхода. Предлагаемый подход к созданию комплексных фитопрепаратов, возможно, позволит избегать скрининговых фармакологических исследований, требующих больших затрат труда и времени. Поэтому было решено исследовать химический состав изученных ранее в нашей лаборатории сборов, проявивших фармакологическую активность, и, исходя из полученных результатов и химико-фармакологического анализа, составить новую активную фитокомпозицию, предназначенную для применения в комплексной терапии воспалительных заболеваний почек.

Важнейшее значение в химико-фармакологическом анализе извлечений из сборов отводилось биологически активным фенольным соединениям. Это связано с ведущей ролью фенольных соединений в противовоспалительном, антиоксидантном, противомикробном и диуретическом эффектах растений [В.А. Барабой, 1984; В.Д. Белоногова с соавт., 2003; Xiao Du et al., 2001].

Цель работы: Выявить закономерности между фармакологической активностью сборов и их химическим составом и на этой основе предложить сбор, обладающий терапевтической эффективностью при воспалительных заболеваниях почек.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Определить количественное содержание биологически активных соединений фенольной структуры в водных извлечениях из сборов лекарственных растений Алтайского края;
2. Выявить химико-фармакологические закономерности изученных сборов;
3. Разработать состав сбора из лекарственных растений Алтайского края, используя выявленные химико-фармакологические закономерности;
4. Определить количественное содержание фенольных соединений в водном извлечении из полученного сбора;
5. Провести стандартизацию предложенного сбора;
6. Изучить фармакологическую активность сбора и его влияние на функцию почек.

Научная новизна исследования: Впервые изучено количественное содержание фенольных соединений в водных извлечениях из сборов лекарственных растений Алтая методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). При этом установлено содержание простых фенолов (арбутина, гидрохинона), фенолкарбоновых кислот (салициловой и бензойной кислот), суммы оксикоричных кислот и их отдельных представителей (кофейной и феруловой кислот), суммы флавоноидов и их представителей (рутина, кверцетина), а также суммы всех фенольных соединений в пересчете на арбутин.

Выявлена зависимость фармакологического действия извлечений из сборов от содержания в них биологически активных соединений фенольной структуры. Установлено, что фармакологическое действие извлечений из сборов зависит от количественного содержания арбутина, салициловой кислоты, суммы флавоноидов, оксикоричных кислот и всех фенольных соединений.

В работе предлагается принципиально новый методологический подход к созданию комплексных фитопрепаратов для терапии почечной патологии, основанный на сочетании лекарственного растительного сырья с учетом содержания в нем арбутина, салициловой кислоты, суммы флавоноидов и оксикоричных кислот.

На основе предлагаемого подхода создан фитосбор, сочетающий в себе противовоспалительные, антиоксидантные, противомикробные и диуретические свойства; оформлена заявка на изобретение «Сбор лекарственных растений для профилактики и лечения воспалительных заболеваний мочевых путей» № 2006117461 (019008) от 22.05.2006 г. Сбору дано условное наименование «Нефролен».

Научно-практическая значимость: Получены новые сведения относительно химического состава некоторых лекарственных сборов, позволяющие существенно расширить их фармакогностическую характеристику.

Разработан состав фитосбора «Нефролен», обладающего противовоспалительными, антиоксидантными, противомикробными и диуретическими свойствами. Сочетание перечисленных фармакологических свойств позволяет рекомендовать данный сбор в качестве перспективного лекарственного средства для дальнейших клинических фармакологических испытаний. По результатам исследования подготовлен к рассмотрению проект фармакопейной статьи на сбор «Нефролен».

Предлагается использование установленных химико-фармакологических закономерностей для целенаправленного создания новых сборов и фитопрепаратов, обладающих терапевтической активностью при воспалительных заболеваниях почек.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Водные извлечения из сборов лекарственных растений Алтая содержат арбутин, гидрохинон, салициловую и бензойную кислоты, флавоноиды и производные оксикоричной кислоты. Количественное содержание перечисленных фенольных соединений колеблется в широких пределах;
2. Фармакологическая активность извлечений из сборов зависит от количественного содержания в них арбутина, салициловой кислоты, флавоноидов и оксикоричных кислот;
3. Разработан состав растительного сбора «Нефролен» с учетом содержания в его компонентах арбутина, салициловой кислоты, флавоноидов и оксикоричных кислот;
4. Водное извлечение из полученного сбора обладает сравнительно высоким содержанием арбутина, салициловой кислоты, флавоноидов, оксикоричных кислот и суммы фенольных соединений;
5. Установлены морфолого-анатомические признаки и показатели доброкачественности сбора «Нефролен», которые включены в проект фармакопейной статьи;
6. Водное извлечение из сбора «Нефролен» обладает выраженными противовоспалительными, антиоксидантными, противомикробными и диуретическими свойствами.

Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научной конференции, посвященной 30-летию фармацевтического факультета АГМУ (г. Барнаул, 2005 г), на научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации», посвященной 70-летию Новосибирской государственной медицинской академии (г. Новосибирск, 2005 г), на международной научно-практической конференции «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы», посвященной 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию профессора Ш. М. Омарова (г. Махачкала, 2006 г), на второй Российско-Китайской международной научной конференции «Фундаментальная фармакология и фармация в клинической практике» (г. Пермь, 2006 г), на конференции «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования», посвященной 25-летию фармацевтического факультета Башкирского государственного медицинского университета (г. Уфа, 2006 г), на III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2007 г).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе одна – в журнале, рекомендованном ВАК; оформлена заявка на изобретение № 2006117461 (019008) от 22.05.2006 г.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 46 рисунками, 16 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы, включающего 202 источника, из них 78 иностранных авторов, и приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения фитохимического анализа из скрининговых сборов получали отвары в соотношении 1:10 в соответствии с требованиями ГФ XI издания.

Исследуемые фитосборы имели следующий состав: сбор 1 включал цветки ромашки аптечной (ГФ ХI, Изменения №№ 1-6) 1ч, листья бадана толстолистного (ТУ 9373-131-00482192-96) 2ч, листья ортилии однобокой (ТУ 9198-007-50655048-06) 2ч, плоды укропа пахучего (ГФ ХI) 1ч, плоды шиповника майского (ГФ ХI) 3ч, траву зверобоя продырявленного (ГФ ХI) 1ч, траву череды трехраздельной (ГФ ХI, Изменение №1) 2ч, корневища аира болотного (ГФ ХI) 1ч; сбор 2 – цветки ромашки аптечной (ГФ ХI, Изменения №№ 1-6) 1ч, цветки тысячелистника обыкновенного (ФС 42-44-72) 1ч, листья брусники обыкновенной (ГФ ХI) 2ч, листья подорожника большого (ГФ ХI) 1ч, плоды смородины черной (ГОСТ 21450-75) 2ч, плоды шиповника майского (ГФ ХI) 3ч, траву череды трехраздельной (ГФ ХI, Изменение №1) 1ч; сбор 3 – листья березы повислой (ВФС 42-2487-95) 2ч, плоды шиповника майского (ГФ ХI) 3ч, траву володушки многожильчатой (ВФС 42-580-76) 2ч, траву душицы обыкновенной (ГФ ХI, Изменение №1) 1ч, траву зверобоя продырявленного (ГФ ХI) 2ч, траву хвоща полевого (ГФ ХI, Изменения №1, №2) 1ч, корни солодки голой (ГФ Х) 1ч; сбор 4 – цветки ромашки аптечной (ГФ ХI, Изменения №№ 1-6) 1ч, цветки тысячелистника обыкновенного (ФС 42-44-72) 1ч, листья грушанки круглолистной (ТУ 9198-192-21428156-04) 2ч, листья подорожника большого (ГФ ХI) 1ч, плоды смородины черной (ГОСТ 21450-75) 2ч, плоды шиповника майского (ГФ ХI) 3ч, траву череды трехраздельной (ГФ ХI, Изменение №1) 1ч; сбор 5 – цветки ромашки аптечной (ГФ ХI, Изменения №№ 1-6) 1ч, цветки тысячелистника обыкновенного (ФС 42-44-72) 1ч, цветки календулы лекарственной (ГФ ХI, Изменение №2) 2ч, листья березы повислой (ВФС 42-2487-95) 2ч, листья зимолюбки зонтичной (ТУ 9198-193-21428156-04) 2ч, листья крапивы двудомной (ГФ ХI) 1ч, плоды аронии черноплодной (ФС 42-66-87) 3ч, плоды шиповника майского (ГФ ХI) 4ч, траву хвоща полевого (ГФ ХI, Изменения №1, №2) 1ч, семена льна посевного (ГФ ХI) 3ч; сбор 6 – плоды рябины обыкновенной (ГФ ХI, Изменения №1, №2) 3ч, плоды укропа пахучего (ГФ ХI) 2ч, почки березы повислой (ГФ ХI) 1ч, траву володушки многожильчатой (ВФС 42-580-76) 2ч, траву зверобоя продырявленного (ГФ ХI) 2ч, траву хвоща полевого (ГФ ХI, Изменения №1, №2) 1ч, корни солодки голой (ГФ Х) 1ч. Качество представленных сборов регламентировано ТУ 9198-024-485-405-79-02 и ТУ 9198-015-100-460-11-03.

Лекарственное сырье, вошедшее в состав сборов, было заготовлено в районах Алтайского края в соответствии с правилами сбора и сушки лекарственного растительного сырья [Сборник инструкций, 1985]. Сборы готовили согласно ГФ ХI издания.

Идентификацию и количественное определение биологически активных веществ (БАВ) в водных извлечениях из сборов осуществляли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Милихром А-02. Качественный и количественный анализ БАВ в водных извлечениях из сборов проводили с использованием стандартных образцов арбутина, гидрохинона, рутина, кверцетина, салициловой, бензойной, кофейной и феруловой кислот. Расчеты осуществлялись в программе «МультиХром». Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Стьюдента.

Результаты фитохимического анализа сопоставляли с результатами фармакологических исследований соответствующих сборов, полученными ранее в нашей лаборатории. Корреляционный анализ осуществляли в программе «BioStat».

На основании выявленных химико-фармакологических закономерностей выдвигали предположения об участии того или иного вещества или группы веществ в обеспечении фармакологического действия сборов. На основе этого разрабатывали состав нового сбора, предназначенного для профилактики и лечения воспалительных заболеваний почек. Отвар из полученного сбора подвергали фитохимическому анализу методом ВЭЖХ аналогично отварам из ранее изученных сборов.

Морфолого-анатомические признаки сбора изучали с помощью стереомикроскопа МБС – 9 (х28), микроскопов «Биолам» с увеличением малого объектива х135, большого х600 и «Микмед – 6» с увеличением малого объектива х100, большого х400.

Содержание БАВ в сборе определяли методом ВЭЖХ аналогично определению соответствующих соединений в отварах из сборов. Для установления содержания арбутина из сбора получали водное извлечение по методике, приведенной в ГФ ХI издания (статья 26 «Листья толокнянки») с незначительными изменениями (навеска сырья 1 г). Содержание общей суммы флавоноидов и оксикоричных кислот в пересчете на рутин изучали в спиртовом извлечении, полученном по методике, приведенной в ГФ ХI издания (статья 11 «Цветки пижмы») с небольшими модификациями (время экстракции 60 мин).

Определение влажности, содержания золы общей и золы нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте, примесей в сборе, а также степень его измельчения определяли по методикам ГФ ХI издания.

Микробиологическую чистоту сбора определяли по методикам, приведенным в ГФ ХI издания и Изменении №2 (раздел 2) ГФ ХI издания. Сбор отнесен к категории 4А лекарственных растительных средств, применяемых в виде настоев и отваров, приготовленных с использованием кипящей воды.

Исследование радиологической активности сбора и содержания в нем токсичных элементов проводили на базе Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае».

Радиологические свойства сбора оценивали по активности излучения, испускаемого стронцием – 90 и цезием – 137 с использованием программно-аппаратурного комплекса «ПРОГРЕСС 2000» согласно МУК 2.6.1191-03 «Радиационный контроль. Стронций – 90 и цезий – 137. Пищевые продукты. Отбор проб, анализ и гигиеническая оценка».

Содержание в сборе особо токсичных металлов (ртути, мышьяка, свинца, кадмия) устанавливали согласно ГOСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов».

Исследование фармакологической активности сбора «Нефролен» проводили на 86 белых беспородных крысах обоего пола, массой 150 – 250 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Контрольные и подопытные животные находились в аналогичных условиях и имели примерно одинаковую исходную среднюю массу. Эвтаназию производили согласно правилам, принятым Европейской Конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986).

Из сбора готовили отвар в соотношении 1:10 по методике, приведенной в ГФ ХI издания. Отвар применяли из расчета 500 мг/кг массы тела животного в сутки. Оценку качества отвара проводили по содержанию суммы фенольных соединений в пересчете на арбутин методом ВЭЖХ.

Противовоспалительную активность определяли на экспериментальных моделях острого и хронического воспаления. Моделью острого воспаления служил каррагениновый отек задних лап крыс [Методические указания…, 2000; Тринус Ф.П. с соавт., 1975]. В течение 14 дней крысам подопытной группы вводили отвар исследуемого сбора, контрольной группе – равнообъемное количество воды. После окончания длительного введения крысам, находящимся под легким эфирным наркозом, тонкой иглой под плантарный апоневроз правой задней конечности вводили 0,1 мл 1% раствора каррагенина. Объем лапы определяли онкометрически с помощью плетизмометра до- и через 60, 120 и 240 минут после введения флогистика.

Влияние сбора на развитие пролиферативного воспаления изучали на модели хлопчатобумажной гранулемы [Oronsky A.L. et al., 1967]. Крысам, находившимся под эфирным наркозом, имплантировали стерильные хлопчатобумажные шарики массой 20 мг. В течение 14 дней подопытной группе животных вводили отвар сбора, контрольной группе – равное по объему количество воды. Затем гранулемы извлекали и определяли их влажную и сухую массы. Величина прироста массы шариков служила показателем степени развития гранулематозной ткани. Разность между влажной и сухой массой оценивалась как экссудативный компонент воспалительной реакции.

Для определения антиоксидантной активности исследуемого сбора использовали классическую модель воспаления, вызванного введением формалина [Методические указания, 2000]. Данная модель применяется для активации свободнорадикального окисления при изучении антиоксидантной активности растительных средств [Арбузова Я.С., 2006; Замятина С.В., 2006]. Экспериментальным животным в течение 14 дней вводили отвар исследуемого сбора, контрольной группе – эквиобъемное количество воды. По окончанию введения крысам, находящимся под легким эфирным наркозом, под плантарный апоневроз обеих задних конечностей вводили по 0,2 мл 3% раствора формалина. На третьи сутки производили эвтаназию животных с забором крови. Плазму крови использовали для определения показателей оксидантного статуса. В гемолизате эритроцитов определяли показатели антиоксидантной активности.

Оксидантный статус крови крыс оценивали по уровню находящихся в плазме крови свободнорадикальных прооксидантов (общая прооксидантная активность, ОПА), индуцирующих окисление ТВИН-80, а также по содержанию тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП), представленных преимущественно малоновым диальдегидом.

О состоянии антиоксидантного статуса крови крыс судили по активности трех важнейших внутриэритроцитарных антиоксидантных энзимов: каталазы (КАТ), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО). Кроме этого, определяли суммарный показатель общей антиоксидантной активности (ОАА), отражающий активность не только внутриклеточных антиоксидантных энзимов, но и неферментных антиоксидантов организма.

При исследовании влияния сбора на функцию почек животные содержались в индивидуальных клетках, что позволяло определять суточный диурез. В собранной моче определяли содержание ионов Na+ и K+ методом пламенной фотометрии. Экскрецию креатинина как показателя, характеризующего скорость клубочковой фильтрации, определяли унифицированным методом Поппера по реакции Яффе [Меньшиков В.В. с соавт., 1987]. Отвар вводили в течение 14 дней. Полученные результаты сравнивали с исходными показателями, которые определяли до введения отвара.

Все результаты фармакологических исследований обрабатывали статистическим методом вариационных рядов с использованием критерия Стьюдента.

Изучение противомикробных свойств водного извлечения из сбора «Нефролен» проводили по методике, приведенной в Изменении № 2 ГФ ХI издания (раздел 3 «Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных средств», п. 3.3.1. «Модификация метода Госфармакопеи ХI»), в отношении стандартных тест-штаммов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli (коллекция патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

К наиболее активным фенольным соединениям, проявляющим противовоспалительное, антиоксидантное, противомикробное и диуретическое действие, как правило, относят флавоноиды, фенолокислоты, в том числе оксикоричные кислоты, а также некоторые простые фенолы [Браславский В.Д. с соавт., 1999; Товчига О.В., Штрыголь С.Ю., 2005; Шкарина Е.И. с соавт., 2001; Myagmar B.E. et al., 2004; Tulegenova A. et al., 1999]. Учитывая это, в водных извлечениях из сборов, обладающих фармакологической активностью, было изучено содержание флавоноидов, фенолкарбоновых и оксикоричных кислот, а также некоторых простых фенолов методом ВЭЖХ.

В качестве подвижной фазы использовали 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУК) – элюент А и смесь ацетонитрила с 0,1% ТФУК в соотношении 7:3 – элюент В. Объем анализируемой пробы составлял 2 мкл, скорость подачи элюента – 100 мкл/мин, температура колонки – 35С. Подробные условия хроматографирования фенольных соединений приведены в таблице 1.

Качественный анализ всех соединений осуществляли путем сопоставления параметров удерживания пиков, полученных на хроматограммах анализируемых проб с параметрами удерживания пиков, полученных при элюировании стандартных растворов анализируемых веществ. Для дополнительной идентификации в пробы добавляли стандартные образцы, наблюдая увеличение высот предполагаемых пиков определяемых веществ. Кроме этого, сравнивали спектры поглощения в УФ – области стандарта и обнаруженного вещества в анализируемой пробе, записанные при остановленном потоке элюента во время выхода вещества из колонки.

Таблица 1

Условия хроматографирования биологически активных соединений

БАВ	Анализируемая проба	Градиент элюентов	Объем элюирования (мкл)	(длина волны, нм)
Арбутин, гидрохинон	Отвар	5 – 15% элюэнта В	1500	280
Сумма фенольных соединений, бензойная и салициловая кислоты	Отвар	15 – 55% элюэнта В	2500	280
Сумма флавоноидов и оксикоричных кислот, кверцетин	Отвар*	15 – 55% элюэнта В	2500	360
Сумма оксикоричных кислот, кофейная и феруловая кислоты	Этилацетатное извлечение из отвара*	15 – 55% элюэнта В	2500	360
Рутин	Отвар* после экстракции этилацетатом	15 -55 % элюэнта В	2500	360

Примечание: * - после очистки хлороформом

Количественное определение проводили, используя метод градуировки по внешнему стандарту. Для этого готовили серии разведений стандартных образцов и строили градуировочные графики по результатам хроматографирования в соответствующих условиях (Таблица 1). Суммарное содержание фенольных соединений определяли, используя градуировочный график арбутина, сумму оксикоричных кислот вычисляли по градуировочному графику феруловой кислоты. Для определения суммы флавоноидов использовали разность между суммой площадей пиков хроматограммы отвара до экстракции этилацетатом и суммой площадей пиков хроматограммы этилацетатной фракции соответствующего отвара. Сумму флавоноидов рассчитывали по градуировочному графику рутина.

Фитохимический анализ показал, что отвары из всех сборов содержат арбутин, гидрохинон, рутин, феруловую, бензойную и салициловую кислоты (Таблица 2). При этом их количество колеблется от 0,00008% до 0,046%. Кверцетин обнаружен лишь в трех сборах в количестве не более 0,00004%. По-видимому, это связано с низкой растворимостью флавоноида в воде при нагревании. Кофейная кислота в отварах из сборов не обнаружена. Это может быть связано с ее отсутствием или неустойчивостью к окислительным процессам.

Сумма флавоноидов в отварах из сборов составила от 0,004% (сбор 1) до 0,036% (сбор 3). Различным оказалось и содержание производных коричной кислоты. Наибольшее количество оксикоричных кислот найдено в отваре из сбора 6 (0,034%), наименьшее – в отваре из сбора 2 (0,014%). Сумма всех фенольных соединений в отварах из сборов не превысила 0,8%, при этом максимальное их количество зафиксировано в отваре из сбора 6.

Результаты фитохимического анализа использовали для поиска зависимости фармакологической активности лекарственных сборов от их химического состава. В результате проведенного химико-фармакологического анализа выяснилось, что сборы с высоким содержанием арбутина, флавоноидов и салициловой кислоты обладают более выраженными противовоспалительными свойствами. Сборы с высоким содержанием флавоноидов и оксикоричных кислот проявили лучшие антиоксидантные свойства. Наиболее выраженные противомикробные свойства проявили сборы с высоким содержанием суммы всех фенольных соединений.

Зависимость диуретической активности извлечений из сборов от содержания в них фенольных соединений не обнаружена. Очевидно, это связано с комплексным действием ряда биологически активных соединений, содержащихся в извлечениях из сборов, в том числе соединений, содержание которых нами изучено не было. Так, известно диуретическое действие терпеноидов, карденолидов и некоторых других биологически активных растительных соединений [Б.Н. Головкин с соавт., 2001].

Далее, выявленные химико-фармакологические закономерности использовали при создании нового фитосбора, для которого предполагалось наличие противовоспалительных, антиоксидантных, противомикробных и диуретических свойств. При этом растения подбирались таким образом, чтобы создать в водном извлечении из сбора высокие концентрации арбутина, флавоноидов, салициловой и оксикоричных кислот, которые, как показал химико-фармакологический анализ ранее изученных боров, определяют их фармакологическое действие.

Таблица 2

Содержание биологически активных веществ в отварах из сборов, %

Биологически активные фенольные соединения	Сбор 1	Сбор 2	Сбор 3	Сбор 4	Сбор 5	Сбор 6
Арбутин	0,00164 ±0,000056	0,04569 ±1,000020	0,00025 ±0,000008	0,00034 ±0,000008	0,00119 ±0,000027	0,00008 ±0,000003
Гидрохинон	0,00501 ±0,000160	0,00013 ±0,000003	0,00075 ±0,000026	0,00080 ±0,000029	0,00116 ±0,000047	0,00258 ±0,000097
Рутин	0,00151 ±0,000044	0,00314 ±0,000111	0,01455 ±0,00033	0,00457 ±0,000202	0,00313 ±0,000136	0,00679 ±0,000246
Кверцетин			0,00002 ±0,000001	0,00004 ±0,000001	0,00004 ±0,000001
Феруловая кислота	0,00312 ±0,000134	0,00080 ±0,000028	0,00286 ±0,000097	0,00067 ±0,000015	0,00111 ±0,000049	0,00297 ±0,000093
Бензойная кислота	0,00059 ±0,000020	0,00136 ±0,000053	0,01195 ±0,000033	0,00295 ±0,000144	0,00219 ±0,000072	0,00066 ±0,000026
Салициловая кислота	0,00335 ±0,000069	0,00401 ±0,000160	0,01524 ±0,000299	0,00676 ±0,000178	0,00508 ±0,000151	0,00847 ±0,000270
Сумма флавоноидов в пересчете на рутин	0,004±0,0002	0,015±0,0006	0,036±0,0011	0,019±0,0006	0,028±0,0008	0,022±0,0009
Сумма оксикоричных кислот в пересчете на феруловую кислоту	0,022±0,0010	0,014±0,0005	0,027±0,0010	0,022±0,0010	0,024±0,0010	0,034±0,0005
Сумма фенольных соединений в пересчете на арбутин	0,271±0,0100	0,304±0,0129	0,540±0,0224	0,323±0,0054	0,452±0,0116	0,796±0,0314

В результате был получен фитосбор с условным названием «Нефролен», в состав которого вошли: трава володушки многожильчатой 1ч, трава мелиссы лекарственной 1ч, трава тысячелистника обыкновенного 1ч, плоды малины обыкновенной 1ч, листья грушанки круглолистной 3ч. Отвар из полученного сбора подвергали фитохимическому анализу методом ВЭЖХ аналогично отварам из ранее изученных сборов.

Результаты фитохимического анализа показали, что отвар из сбора «Нефролен» не уступает по содержанию флавоноидов отварам из сборов, ранее изученных в нашей лаборатории, и превосходит их по содержанию арбутина, салициловой и оксикоричных кислот, а также суммы всех фенольных соединений (Таблица 3).

Таблица 3

Содержание фенольных соединений в водном извлечении

из сбора «Нефролен», %

Биологически активные фенольные соединения	Среднее содержание в отваре
Арбутин	0,05232 ± 0,002402
Гидрохинон	0,00657 ± 0,000313
Рутин	0,00536 ± 0,000222
Кверцетин	0,00024 ± 0,000008
Кофейная кислота	0,00006 ± 0,000000
Феруловая кислота	0,00655 ± 0,000228
Бензойная кислота	0,00701 ± 0,000271
Салициловая кислота	0,08122 ± 0,003346
Сумма флавоноидов в пересчете на рутин	0,033 ± 0,0015
Сумма оксикоричных кислот в пересчете на феруловую кислоту	0,039 ± 0,0018
Сумма фенольных соединений в пересчете на арбутин	2,924 ± 0,0570

Для внедрения полученного сбора в медицинскую практику была проведена его стандартизация. Согласно ГФ ХI издания и ОСТ 91500.05.001.00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения», установлены морфолого-анатомические диагностические признаки сбора; числовые показатели его доброкачественности: содержание действующих веществ, влажность, содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте, органические и минеральные примеси, степень измельчения; микробиологическая чистота (Таблица 4). Показано, что сбор «Нефролен» соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» по радиационной активности и содержанию особо токсичных элементов (ртути, мышьяка, свинца, кадмия).

Таблица 4

Показатели доброкачественности сбора «Нефролен»

Показатели	Методы определения	Нормы качества
Подлинность: арбутин, флавоноиды, салициловая и оксикоричные кислоты	ВЭЖХ	Наличие пиков с характерными спектральными характеристиками
Количественное содержание: - арбутин - флавоноиды и оксикоричные кислоты	ВЭЖХ ВЭЖХ	не < 0,6% не < 1,5%
Влажность	по ГФ ХI	не > 9%
Зола общая / нерастворимая в 10% HСI	по ГФ ХI	не > 9% / не > 1%
Органические / минеральные примеси	по ГФ ХI	не > 1,5% / не > 1%
Частиц размером > 5 мм / < 0,18 мм	по ГФ ХI	не > 13% / не > 6%
Микробиологическая чистота	ГФ ХI, Изменения №2, №3 ГФ ХI	категория 4А

Исследование противовоспалительных свойств фитосбора «Нефролен», проведенное на модели каррагенинового отека, позволило сделать вывод, что сбор обладает антиэкссудативным действием. Так, в результате его длительного предварительного введения, к 60 минуте развитие отека ослаблялось в среднем на 17,3%, а к 240 минуте – на 21,7% (Р < 0,01). При этом, как показано на рисунке 1, предварительное введение сбора животным повлияло как на интенсивность воспалительного отека, так и на динамику его развития.

Изучение влияния на течение хронического воспалительного процесса показало, что исследованный сбор обладает антипролиферативным действием. В результате профилактического введения сбора животным подопытной группы выявилось существенное уменьшение влажной массы воспалительной гранулемы, которая составила в среднем 70,5 мг, что на 16,7% ниже контрольного показателя и является достоверным различием (Р < 0,001). Достоверным оказалось и снижение массы сухой гранулемы, которое составило 19% (Р < 0,001). Разность между влажной и сухой массами составила 58,6 мг и оказалась на 16,2% ниже соответствующего показателя экссудации контрольной группы животных.

Рис. 1. Влияние отвара из сбора «Нефролен» на развитие каррагенинового отека

Примечание: сплошная линия соответствует контрольной группе животных, пунктирная – опытной; по оси абсцисс – время наблюдения, по оси ординат – прирост объема лап крыс (см); здесь и далее звездочками отмечено достоверное различие с контролем.

При изучении антиоксидантного действия сбора «Нефролен» in vivo в подопытной группе животных выявлено достоверное уменьшение показателей антиоксидантной системы крови крыс по отношению к контролю. Активность каталазы уменьшилась на 10,7%, супероксиддисмутазы – на 17,7%, глутатионпероксидазы – на 12,7%. При этом наибольшие изменения произошли с интегративным показателем ОАА, значение которого оказалось на 49,7% меньше соответствующего показателя в контроле и на 40% ниже показателя интактной группы животных (Таблица 5).

Снижение указанных показателей антиоксидантного статуса могло произойти в ответ на уменьшение продукции свободных радикалов под влиянием биологически активных веществ сбора, что следует рассматривать как антиоксидантное действие. Кроме этого, снижение показателя ОАА при применении отвара из сбора может быть связано с уменьшением количества неферментных факторов антиоксидантной защиты организма животных вследствие их более активного вовлечения в борьбу со свободнорадикальными реакциями, вышедшими из-под контроля. Показатели оксидантного статуса подопытной группы животных при этом несколько превысили контрольные значения, что, вероятно, явилось следствием упомянутого выше снижения активности антиоксидантных ферментов. Возможно и прооксидантное действие растительного средства, что при профилактическом применении повышает защитные свойства организма. С этой позиции становится понятным повышение показателей оксидантного статуса исследованным сбором с одной стороны, и его противовоспалительное действие с другой. Таким образом, под влиянием сбора «Нефролен» произошли существенные изменения в балансе между оксидантной и антиоксидантной системами организма животных. Возможно, это имеет отношение к механизмам противовоспалительного действия исследованного сбора.

Таблица 5

Влияние сбора «Нефролен» на антиоксидантную и прооксидантную

активность крови крыс на фоне формалинового воспаления

Группа животных	ТБРП (мкМ)	ОПА (%)	Каталаза (%)	СОД (%)	ГПО (ЕД/мг Hb)	ОАА (%)
Интактные крысы	2,5±0,18	45,1±1,06	12,2±1,27	16,9±0,81	233,2±7,25	73,7±0,51
Формалиновое воспаление	3,4±0,17	48,9±1,18	22,4±1,02	28,3±1,05	242,8±11,2	87,8±0,86
Формалиновое воспаление на фоне примене-ния сбора	7,3±0,77*	60,4±0,8*	20,0±0,5*	22,3±0,5*	212,0±5,74*	44,2±0,7*

Примечание: подчеркнуты достоверные различия с интактной группой животных

Результаты исследования влияния сбора «Нефролен» на функцию почек в условиях длительного введения показали, что сбор обладает выраженными диуретическими свойствами (Рисунок 2). Так, к 5 дню наблюдения увеличение диуреза составило 40,3%, а к 12 дню – диурез превысил исходный уровень более чем в 2 раза. В первые пять дней увеличение диуреза у крыс происходило синхронно с ростом экскреции креатинина. Последняя, достоверно превысив исходное значение на пятый день, оставалась на достигнутом уровне в течение всех последующих дней наблюдения. Диурез же сохранял динамику роста вплоть до 12-го дня наблюдения, превысив к этому времени исходный уровень на 106%. По-видимому, это связано с уменьшением реабсорбции натрия, увеличение экскреции которого наблюдалось с 8-го дня и достигало достоверности к 12-му дню эксперимента, превысив исходный уровень на 29,2%.

Рис. 2. Влияние длительного введения отвара из сбора на функцию почек у крыс

Примечание: И – исходный уровень; цифры соответствуют дням наблюдения; сплошная линия – диурез, пунктирная – экскреция натрия, точечная – экскреция креатинина; звездочками отмечены достоверные изменения по отношению к исходному уровню.

Полученные результаты указывают на наличие двух возможных причин мочегонного действия сбора. С одной стороны – это усиление скорости клубочковой фильтрации, что, очевидно, обеспечивало постепенное увеличение диуреза, начиная с первых дней наблюдения, с другой – некоторое снижение канальцевой реабсорбции, что, в свою очередь, обусловливало развитие натрийуреза и дальнейшее увеличение экскреции воды.

Что касается экскреции ионов калия, то ее увеличение при введении сбора наблюдалось лишь в виде тенденции, так и не достигнув достоверных значений. Учитывая, что потеря ионов калия нежелательна для организма, отсутствие выраженного калийуреза следует рассматривать как несомненное преимущество растительного сбора перед большинством синтетических мочегонных средств.

В микробиологических исследованиях показано, что отвар из сбора «Нефролен» полностью подавляет рост золотистого стафилококка в нативном виде (соответствует 10%-му концентрированному отвару), а также при разведении в 2 и 4 раза (соответственно 5% и 2,5%-ные концентрированные отвары).

Таблица 6

Противомикробная активность водного извлечения из сбора

Тест-микроорганизмы	Количество концентрированного отвара в питательной среде, %
	10	5	2,5	1
Staphylococcus aureus				+
Pseudomonas aeruginosa		+	+	+
Escherichia coli	+	+	+	+

Примечание: «» - отсутствие роста, «+» - наличие роста

Кроме этого, выявлена чувствительность к исследуемому отвару синегнойной палочки, подавление роста которой отмечалось при использовании 10%-го концентрированного отвара, что соответствует концентрации биологически активных веществ в нативном отваре. Чувствительность кишечной палочки в данном исследовании не выявлена.

Таким образом, в результате исследований показано, что фитосбор «Нефролен», созданный с использованием предлагаемого методологического подхода, при длительном применении эффективно подавляет развитие острого и хронического воспалительного процесса, влияя при этом, как на экссудативный, так и на пролиферативный его компоненты. Одним из возможных механизмов противовоспалительного действия отвара из сбора является выраженное влияние на процессы свободнорадикального окисления, наличие которого установлено в опытах in vivo. Кроме этого, важным представляется наличие противомикробных свойств отвара из сбора в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, что было показано в микробиологических исследованиях. Перечисленные свойства, как и установленное диуретическое действие изученного сбора, необходимы для этиопатогенитической коррекции хронических воспалительных заболеваний мочевыводящей системы. При этом важно отметить, что сбор «Нефролен» отличается от ранее созданных в нашей лаборатории сборов именно сочетанием выраженных противовоспалительных, антиоксидантных, противомикробных и диуретических свойств. Так, среди ранее созданных были выявлены сборы с интенсивным диуретическим действием, однако их противовоспалительные свойства выражены незначительно. Другие сборы, обладали хорошим противовоспалительным действием, но их диуретическое действие было весьма слабым [О.Ш. Кривова, 2001; Е.М. Санаров с соавт., 2004]. С помощью предлагаемого подхода нам удалось создать фитокомпозицию, обладающую комплексным действием. Это оказалось возможным благодаря сочетанию биологически активных соединений, обеспечивающих фармакологическую активность фитосбора.

ВЫВОДЫ

1. Водные извлечения из сборов лекарственных растений, произрастающих на Алтае, содержат: от 0,0001% до 0,0457% арбутина, от 0,0001% до 0,0005% гидрохинона, от 0,0015% до 0,0146% рутина, менее 0,00005% кверцетина, от 0,0007% до 0,0031% феруловой кислоты, от 0,0006% до 0,0120% и от 0,0034% до 0,0152% бензойной и салициловой кислот соответственно. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин составило от 0,004% до 0,036%, суммы оксикоричных кислот в пересчете на феруловую кислоту – от 0,014% до 0,034%, суммы всех фенольных соединений в пересчете на арбутин – от 0,271% до 0,786%.
2. Фармакологическая активность извлечений из сборов зависит от количественного содержания арбутина, салициловой кислоты, суммы флавоноидов и оксикоричных кислот.
3. В состав фитосбора «Нефролен» вошли: трава володушки многожильчатой, трава мелиссы лекарственной, трава тысячелистника обыкновенного, плоды малины обыкновенной, листья грушанки круглолистной. Выбор компонентов сбора определялся содержанием в них арбутина, салициловой кислоты, флавоноидов и оксикоричных кислот.
4. Водное извлечение из сбора «Нефролен» содержит: 0,052% арбутина, 0,007% гидрохинона, 0,005% рутина, 0,0002% кверцетина, 0,00006% кофейной кислоты, 0,007% феруловой кислоты, 0,007% и 0,081% бензойной и салициловой кислот соответственно. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин составило 0,033%, суммы осикоричных кислот в пересчете на феруловую кислоту – 0,039%, суммы всех фенольных соединений в пересчете на арбутин – 2,924%.
5. Установлены морфолого-анатомические признаки и числовые показатели доброкачественности сбора «Нефролен»: содержание арбутина не менее 0,6%; общей суммы флавоноидов и оксикоричных кислот – не менее 1,5%; влаги – не более 9%; золы общей – не более 9%; золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте, не более 1%; органической примеси – не более 1,5%; минеральной примеси – не более 1%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм, – не более 13%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,18 мм, – не более 6%. Подтверждена безопасность сбора по показателям микробиологической чистоты, радиоактивности и содержанию особо токсичных элементов.
6. В опытах на животных сбор «Нефролен» проявил противовоспалительное, антиоксидантное, противомикробное и диуретическое действие, что позволяет рекомендовать его для дальнейших клинических испытаний.
7. Результаты исследований положены в основу проекта фармакопейной статьи на сбор «Нефролен».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Определение количественного содержания арбутина в водных извлечениях из сборов лекарственных растений Алтая методом ВЭЖХ / Е.А. Вичкуткина, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Современные проблемы фармакологии и фармации: Всероссийская научно-практическая конференция. – Новосибирск, 2005. – С. 2-5.
2. Антиоксидантная активность как атрибут противовоспалительного действия некоторых сборов лекарственных растений (поиск зависимости от химического состава) / Е.А. Вичкуткина, С.В. Замятина, В.М. Брюханов и др. // Юбилейный сборник научных статей. – Барнаул, 2005. – С. 41-54.
3. Фитохимический анализ сборов, разработанных для лечения почечной патологии, методом ВЭЖХ / С.И. Большакова, Е.М. Санаров, Я.Ф. Зверев и др. // Актуальные проблемы фармации. Вып. III. – Барнаул, 2006. – С. 39-50.
4. Противовоспалительные свойства оригинального сбора из лекарственных растений флоры Алтая / Е.А. Вичкуткина, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Актуальные проблемы фармации. Вып. III. – Барнаул, 2006. – С. 51-56.
5. Влияние оригинального сбора из лекарственных растений Алтая на функцию почек у крыс / Е.А. Вичкуткина, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. // Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы: Международная научно-практическая конференция, посвященная 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию профессора Ш.М. Омарова. – Махачкала, 2006. – С. 183-185.
6. Фармакологическая активность почечного фитосбора, созданного с помощью оригинального методологического подхода / Е.А. Вичкуткина, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Нефрология. – 2006. – Том 10, №3. – С. 68-73.
7. Pharmacological activity of the new renal due created on the basis of the original methodological approach / E.A. Vichkutkina, V.M. Bryukhanov, Ya.F. Zverev et al. // Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice: 2-nd Russian-Chinese international scientific conference on pharmacology. – Perm, 2006. – P. 27-28.
8. Определение фенольного состава водного извлечения из оригинального сбора / Е.А. Вичкуткина, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования: сборник научных трудов конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Башкирского государственного медицинского университета. – Уфа, 2006. – С. 127-130.
9. Содержание действующих веществ в новом растительном сборе «Нефролен» / Е.А. Вичкуткина, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы III Всероссийской научной конференции: в 3 кн. – Барнаул: Изд-во Алтайского университета, 2007. – Кн. 2. – С. 373-377.
10. Стандартизация нового растительного сбора «Нефролен» / Е.А. Вичкуткина, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Актуальные проблемы фармации. Вып. IV. – Барнаул, 2007. – С. 33-44.