Клинико-диагностические особенности цервикальных интраэпителиальных неоплазий, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
На правах рукописи
КАРАТЮК
Татьяна Ивановна
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
14.01.01 – акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Омск - 2011
Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Клинышкова Татьяна Владимировна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор,
ГОУ ВПО «Омская государственная
медицинская академия» Рудакова Елена Борисовна
доктор медицинских наук, профессор,
ГОУ ВПО Росздрава «Уральская государственная
медицинская академия» Обоскалова Татьяна Анатольевна
Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия»
Защита состоится «___»____________ 2011 г.в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.065.01 при ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» по адресу: 644043, г. Омск, ул. Ленина, 12.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государствен-
ной медицинской академии по адресу: 644043, г. Омск, ул. Ленина, 12.
Автореферат разослан «___» _____________________2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Федотов В.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Рак шейки матки, по данным ВОЗ, занимает второе место в структуре злокачественных опухолей репродуктивных органов у женщин без тенденции к снижению. Общепризнано, что ведущим фактором канцерогенеза является персистирующая папилломавирусная инфекция вследствие интеграции ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) в геном клетки и синтеза онкобелков Е7и Е6 [Киселев Ф.Л., 2000; Zur Hausen H., 1991; Dalstein V. et al., 2003]. В серии эпидемиологических исследований подтверждена причинная связь между папилломавирусной инфекцией и большинством случаев предрака шейки матки или цервикальной интраэпителиальной неоплазией (CIN) [Zuna R.E. et al., 2007; Jakobsson M. et al., 2010; Nielsen A. et al., 2010]. В связи с этим совершенствование диагностических технологий, направленных на детекцию ВПЧ высокого онкогенного риска, приобретает особую значимость у женщин с CIN. Наряду с ВПЧ-типированием при цервикальном предраке перспективна количественная оценка ВПЧ онкогенного риска ввиду возможной корреляции уровня вирусной нагрузки с наличием предрака или риском его развития [Куевда Д.А. и соавт., 2007; Carcopino X. et al., 2006; Botezatu A. et al., 2009]. Внедрение в клиническую практику терминологической системы Бетесда (2001), в том числе в России, позволяет на этапе цитологического исследования дифференцировать предрак на высокую степень плоскоклеточного поражения (HSIL) и низкую степень (LSIL). Сведения по характеру вирусной нагрузки при LSIL и НSIL нуждаются в уточнении с клинических позиций.
Наряду с прямыми методами, направленными на детекцию ВПЧ, определенную прогностическую ценность имеют косвенные методы, к которым относятся оценка экспрессии белка р16ink4, осуществляющего контроль клеточного цикла, и метаболитов эстрадиола, активирующих клеточную пролиферацию и синтез онкобелков ВПЧ в инфицированных клетках на фоне 16ОНЕ1[Аполихина И.А. и соавт., 2007; Манухин И.Б. и соавт., 2010; Sepkovic D.W. et al., 2009]. Мнение о р16ink4 как о маркере опухолевой и предопухолевой патологии шейки матки подтверждает взаимосвязь интенсивности его экспрессии с синтезом онкобелка Е7 ВПЧ. С другой стороны, лишь 22,7 – 60% образцов, позитивных к р16, содержат ВПЧ высокого онкогенного риска [Vasilev I. et al., 2006; Redman R. et al., 2008]. Подтверждение значимости этого маркера при CINI нуждается в детализации его использования при HSIL (CINII, CINIII) [Рудакова Е.Б. и соавт., 2010; Коган Е.А. и соавт., 2010; Negri G. et al., 2004]. Неоднозначно мнение относительно интерфероногенеза и необходимости использования иммуноактивных препаратов при цервикальной папилломавирусной инфекции ввиду доказанного супрессивного действия онкобелков Е6 и Е7 ВПЧ на продукцию интерферонов [Киселев В.И. и соавт., 2007]. Прикладное значение большинства из перечисленных методов, имеющих пока ограниченное применение в клинической практике, заключается в возможности выбора рациональной тактики ведения пациенток с CIN c позиции прогнозирования, с учетом существующей системы двойственного менеджмента при низкой степени эпителиального поражения [Минкина Г.Н., 2010]. Все вышеизложенное определило цель и задачи исследования.
Цель исследования. Улучшение результатов лечения пациенток с ВПЧ-ассоциированными цервикальными интраэпителиальными неоплазиями на основании совершенствования диагностического подхода и тактики ведения пациенток с этой патологией.
Задачи исследования.
1. Определить клинические и микробиологические особенности течения ВПЧ-ассоциированных цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN) c оценкой типирования и вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от степени поражения.
2. Оценить значение клинико-кольпоскопического индекса при высокой и низкой степени эпителиальных поражений в зависимости от наличия цервикальной папилломавирусной инфекции.
3. Изучить клиническое значение уровня экспрессии р16ink4 в эпителии экзоцервикса при высокой и низкой степени эпителиальных поражений на фоне папилломавирусной инфекции.
4. Провести сравнительный анализ уровня метаболитов эстрадиола (16-ОНЕ1 и 2-ОНЕ1) и интерферонового статуса в зависимости от наличия папилломавирусной инфекции у больных с CIN.
5. На основании результатов сравнительных исследований и прогнозирования усовершенствовать лечебно-диагностический алгоритм при ВПЧ-ассоциированных CIN, оценить эффективность лечения больных с CINI при использовании инозина пранобекса.
Научная новизна. Получены новые данные о высокой частоте ВПЧ 16 типа и уровне вирусной нагрузки ВПЧ онкогенного риска (16,18 типы) в зависимости от степени эпителиального поражения, коррелирующей с величиной клинико-кольпоскопического индекса. Усиление экспрессии р16ink4 в экзоцервиксе имеет однонаправленный характер относительно степени поражения CIN при папилломавирусной инфекции, что было установлено на основании бальной оценки разработанного иммуногистохимического индекса. В отличие от здоровых и неинфицированных женщин с CIN, ВПЧ-ассоциированные CIN сопровождаются повышением уровня метаболита эстрадиола 16-ОНЕ1, при отсутствии существенных его изменений в зависимости от степени поражения. ВПЧ-ассоциированные CIN независимо от степени поражения не сопровождаются активацией интерфероногенеза. Доказано, что для прогнозирования течения ВПЧ-ассоциированных CINI наряду с анамнестическими признаками имеют значение уровень вирусной нагрузки ВПЧ 16,18 типов, клинико-кольпоскопического и иммуногистохимического индекса р16.
Практическая значимость. Показана значимость как социальных факторов (возраст, особенности сексуального поведения, курение), так и клинико-кольпоскопического анализа (М. Shafi and S. Nazeer, 2006) при ВПЧ-ассоциированной форме CIN в зависимости от степени поражения. Определено клиническое значение иммуногистохимического маркера р16ink4 в экзоцервиксе. На основании детализации особенностей экспрессии р16 с учетом интенсивности реакции, протяженности экспрессии и наличия ядерной метки разработан иммуногистохимический индекс р16 (в баллах), что позволяет усовершенствовать использование данного маркера в качестве прогностического при CIN. Выявлен пороговый уровень индекса р16, что имеет значение при выборе врачебной тактики. Разработана шкала прогностических критериев течения ВПЧ-ассоциированных эпителиальных поражений шейки матки, позволяющая осуществлять дифференцированный вариант ведения пациенток с CINI. Установлено увеличение клинико-микробиологической эффективности на фоне повышения функциональных возможностей клеток к синтезу ИФН- при использовании инозина пранобекса в лечении больных с ВПЧ-ассоциированными CINI в сравнении с традиционным лечением.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Преобладание ВПЧ 16 типа, установленное при эпителиальных поражениях шейки матки, сопровождается повышением уровня вирусной нагрузки при высокой степени поражения (CINII, CINIII) в сравнении с низкой степенью поражения (CINI) и коррелирует с величиной клинико-кольпоскопического индекса.
2. ВПЧ-ассоциированные эпителиальные поражения шейки матки протекают на фоне снижения соотношения метаболитов эстрадиола (2-ОНЕ1/16-ОНЕ1) и характеризуются повышением экспрессии р16ink4 в экзоцервиксе в зависимости от степени поражения и уровня вирусной нагрузки ВПЧ.
3. Лечение больных с ВПЧ-ассоциированными CINI предусматривает дифференцированный подход (деструкция или консервативная тактика) с учетом комплекса прогностических факторов, что способствует повышению клинической эффективности (70,0%), элиминации ВПЧ (83,3%) на фоне активации интерферонового ответа.
Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты исследования используются в работе специализированного кабинета по патологии шейки матки женской консультации №1 г.Омска, в учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии ЦПК и ППС.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на межрегиональной научно-практической конференции «Проблемы здоровья женщин репродуктивного возраста» (Омск, 2009), межрегиональной научно-практической конференции «Инновационные технологии диагностики и лечения в здравоохранении» (Омск, 2009), III Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Саратов, 2009), Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты» (Москва, 2010), X и XI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009, 2010), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011), расширенном межкафедральном заседании кафедр акушерства и гинекологии ОмГМА (Омск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них две в научных изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.
Структура и объем диссертации.
Диссертация написана в традиционном стиле, изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Текст иллюстрирован 28 рисунками, содержит 34 таблицы. Библиографический указатель включает 103 отечественных и 174 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Материалы. Работа выполнена на базе женской консультации №1 г.Омска (главный врач – Л.И. Цыганкова), Академического центра лабораторной диагностики, ЦНИЛ ОмГМА (зав. - д.м.н., профессор Т.И. Долгих), кафедре патологической анатомии с курсом клинической патологии ОмГМА (зав. каф. – д.м.н., профессор А.В. Кононов) с 2008 по 2011 гг. Для решения поставленных задач обследовано 140 больных с CIN различной степени в возрасте от 19 до 45 лет в рамках открытого когортного проспективного контролируемого исследования (рис.1). Пациентки с ВПЧ-ассоциированными CIN составили две основные группы: 1-я группа - пациентки с CINI (n=73), 2-я группа – больные с CINII,CINIII (n=42); ВПЧ-негативные больные с CINI составили группу сравнения (n=25). Группа контроля включала 25 здоровых женщин репродуктивного возраста. В зависимости от характера лечения больных с CINI методом рандомизации выполнено разделение на две группы: 1А (n=30) – с использованием инозина пранобекса, 1Б группа (n=30) – по традиционной схеме.
Критериями включения в основные группы явилось: наличие гистологически подтвержденного диагноза CINI, CINII, CINIII, репродуктивный возраст женщин, положительные данные цервикального ВПЧ-теста, отсутствие антибактериальной терапии на протяжении последних 3 месяцев.
Критерии включения в группу сравнения: наличие гистологически подтвержденного диагноза CINI, репродуктивный возраст женщин, отрицательные данные цервикального ВПЧ-теста, отсутствие антибактериальной терапии на протяжении последних 3 месяцев. Необходимым условием участия в исследовании было информированное согласие пациенток.
Критерии включения в группу контроля были: отсутствие соматических и гинекологических заболеваний, репродуктивный возраст, цитологическое заключение ASCUS, гистологическая норма биоптата шейки матки.
Критерии исключения из исследования: возраст больных менее 19 и более 45 лет, преинвазивный и инвазивный рак шейки матки, беременность и лактация, острый вагинит, наличие острых воспалительных заболеваний и обострения хронических заболеваний в течение предшествующих 6 месяцев, наличие гормонозависимых заболеваний гениталий.
Рис. 1. Дизайн исследования
Методы исследования.
Обследование больных проводилось по единой схеме, включающей оценку данных общего и акушерско-гинекологического анамнеза, общеклинического, гинекологического обследования и специальных методов исследования.
Для цитологического исследования цервикальных мазков, которое выполнялось всем больным, забор материала осуществлялся с использованием щеток cytobrash с последующей его фиксацией. Стекла окрашивали по Папаниколау. Оценка результатов проводилась в соответствии с терминологической системой Бетесда (2001г.), позволяющей установить степень SIL (LSIL, HSIL).
Расширенная кольпоскопия выполнялась всем пациенткам с целью визуального сканирования тканей шейки матки под микроскопом в ответ на обработку 3% раствором уксусной кислоты и 2% раствором Люголя. Использовали кольпоскоп «SOM 52» фирмы Karl Kaps GmbH & Co.KG (Германия). Применяли международную классификацию кольпоскопических терминов (2003г.). Для унификации полученных результатов использовали клинико-кольпоскопическую классификацию (М.Shafi and S.Nazeer, 2006) с подсчетом клинико-кольпоскопического индекса (в баллах). При обнаружении аномальных кольпоскопических картин выполняли прицельную биопсию экзоцервикса и/или соскобов эндоцервикса.
Морфологический раздел исследований включал наряду с цитологическим гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов, выполнен доцентом кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии ОмГМА, к.м.н. С.И. Мозговым (зав. каф. – д.м.н., профессор А.В. Кононов). Гистологическое исследование биоптатов шейки матки осуществляли после фиксации в 10% формалине (на фосфатном буфере при рН 7,2 - 7,4), подвергали обработке в гистологическом аппарате карусельного типа STP-120 (Microm, Германия). С парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 4 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое исследование для оценки экспрессии p16ink4 в эпителии экзоцервикса проведено на материале от 55 пациенток, 8 из которых составили группу контроля. Использовали моноклональные кроличьи антитела к p16ink4 (ингибитор циклинзависимых киназ 4 и 6, клон EP 435Y, разведение 1:200 «Epitomics», США). Применяли стрептавидин-биотиновую систему детекции КР-500 (Diagnostic BioSystems, США). Для демаскировки антигенов применяли процедуру кипячения на водяной бане в течение 1 часа при использовании цитратного буфера (рН=6,0). Степень распространения иммуногистохимической метки р16 оценивали с учетом интенсивности реакции в баллах (1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - высокая), индекса или протяженности экспрессии в баллах (0 - отсутствует, 1- менее 50%, 2 - более 50% клеток), наличия ядерной метки (в %) при подсчете не менее чем в 10 полях зрения на 1000 клеток в баллах (0 – негативная, 1 – единичная, 5 и менее клеток в поле зрения, 2 – множественная, более 5 клеток в поле зрения). Суммируя баллы, получали значение иммуногистохимического индекса (0-7 баллов). Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли с использованием микроскопа Axioskop 40, цифровой камеры AxioCam MRc5 c программой компьютерной обработки изображений AxioVision 4.6.3 (Carl Zeiss, Германия).
Оценку инфекционного статуса шейки матки осуществляли посредством молекулярно-биологического и микробиологического исследования в Академическом центре лабораторной диагностики (зав. центром - д.м.н., профессор Т.И. Долгих).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) цервикальных соскобов проводилась для детекции ВПЧ высокого (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67) и низкого (6,11) онкогенного риска («АмплиСенс», «Интерлабсервис», Москва). Количество ДНК ВПЧ 16 и 18 типов определяли методом ПЦР в режиме реального времени («АмплиСенс», «Интерлабсервис», Москва). Количество ДНК ВПЧ 16,18 типов рассчитывали на 100.000 клеток человека. Детекция Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, вируса простого герпеса I и II типа, цитомегаловируса проводилась методом ПЦР (АмплиСенс FL, ИнтерЛабСервис, Москва). Микробиологическое исследование цервикального и вагинального отделяемого выполнялось в микробиологической лаборатории ЦНИЛ (зав. лабораторией - Л.И. Лазарева). Всем пациенткам выполнялся количественный бактериологический посев на микрофлору (на дисбиоз) и чувствительность к антибиотикам с количественным определением условно-патогенной и нормальной микрофлоры влагалища.
Гормональное исследование включало количественное определение метаболитов эстрадиола (2-ОНЕ1 и 16-ОНЕ1), их соотношения в утренней порции мочи методом ИФА с помощью тест-системы Estramet (Мираксфарм, Москва) (зав. лабораторией - к.м.н. Т.В. Притыкина).
Иммунологическое исследование включало оценку уровня сывороточного ИФН-, ИЛ-4, интерферонового статуса (ИФН-, ИФН- спонтанного, ИФН- стимулированного ФГА в культуре ткани) методом ИФА («Вектор-Бест», Новосибирск). Детекция проводилась на оптическом ридере Multiscan EX Lаbsystems, Финляндия (зав. лабораторией - д.м.н. Т.Ф. Соколова).
Статистические методы обработки результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Exсel и STATISTICA 6.0 (консультанты – д.м.н. С.С. Бунова, д.м.н. Д.В. Турчанинов). По каждому признаку в сравниваемых группах определяли среднюю арифметическую величину (М) и среднее квадратичное отклонение () для количественных данных, имеющих нормальное распределение. Для описания распределения, не являющегося нормальным, использовали медиану (Ме) и интерквартильный размах, указанный в виде 25% и 75% процентилей. Визуализацию распределения параметров в группах проводили с помощью соответствующих частотных гистограмм. Для качественных переменных рассчитывались абсолютные и относительные (%) величины. Минимальный размер выборки был рассчитан с помощью номограммы Альтмана [Петри А., 2003]. Для оценки достоверности различий в группах применяли непараметрические критерии: 2, точный критерий Фишера (), критерий Манна-Уитни (z), критерий Вилкоксона (Z). Причинно-следственные связи определялись в ходе корреляционного анализа Спирмена (rs). Статистически значимыми считали различия между сравниваемыми рядами с уровнем вероятности 95% (р<0,05). При составлении диагностической таблицы применялся последовательный анализ, разработанный А. Вальдом. Для расчета чувствительности, специфичности прогностических признаков, прогностической ценности положительного результата теста, отрицательного результата теста выстраивалась четырехпольная таблица с последующим определением показателей [Власов В., 2006].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При обследовании 140 женщин репродуктивного возраста с верифицированной CIN (средний возраст - 27,0±6,46 лет) выявлены клинические особенности заболевания в зависимости от степени поражения. Для больных 1-й группы была характерна более высокая распространенность заболевания в раннем репродуктивном возрасте, чем во 2-й группе и группе сравнения (z=-2,07, р=0,038, z=-3,57, р=0,0003 соответственно). Более высокая распространенность заболевания в позднем репродуктивном возрасте во 2-й группе сочеталась с более ранним началом половой жизни (17,4±1,2 против 18,7±2,3лет в 1-й группе, р=0,003), в том числе с сексуальным дебютом до 15 лет в 26,2% случаев против 4,1% в 1-й группе (р=0,001), без влияния промискуитета; коротким интервалом от менархе до начала половой жизни; а также высокой частотой курения (60%) (2Yаtеs=15,52, р=0,0001) (рис.2).
 |
Рис. 2. Характер распределения интервала между возрастом менархе
и возрастом начала половой жизни у больных с ВПЧ-ассоциированными CIN
Примечание: р1 -уровень различий при сравнении 1-й и 2-й групп, р2 –1-й и группы сравнения.
В структуре методов контрацепции наблюдалось преимущественное преобладание нерегулярной барьерной контрацепции в 1-й и 2-й группах (р=0,039, р=0,005) либо ее отсутствие. Неспецифический характер жалоб со стороны гениталий не имел статистический значимых различий у больных исследуемых групп. Представленные анамнестические данные подтверждают не только роль социальных факторов (особенности сексуального поведения, курение, характер контрацепции) в развитии CIN на фоне папилломавирусной инфекции (Г.Н. Минкина, И.Б. Манухин, 2001, S.I. Collins et al. 2005, B.I. Stefnescu et al. 2007), но и их влияние на тяжесть процесса.
Микробиологический раздел исследования позволил установить качественную и количественную составляющую ВПЧ-тестирования шейки матки. Как в 1-й, так и во 2-й группе установлено наличие ВПЧ высокого онкогенного риска с преобладанием ВПЧ 16 типа (48,0 и 69,0% соответственно, р=0,045) в варианте моноинфекции либо сочетанного варианта инфицирования с ВПЧ 18 типа (р>0,05) (рис. 3). Для больных 1-й группы характерным явилось наряду с доминированием ВПЧ 16 типа высокая частота других типов ВПЧ высокого риска в отличие от больных 2-й группы больных (р=0,023). Сочетанное инфицирование шейки матки ВПЧ высокого риска и ВПЧ 6 типа установлено у больных 1-й (8,2%) и 2-й (4,7%) групп (р=0,74).
 |
Рис. 3. Типы ВПЧ высокого онкогенного риска у больных с CIN, %
Примечание: * - р<0,05 при сравнении 1-й и 2-й групп.
Анализируя характер вирусной нагрузки ВПЧ 16,18 типа было установлено, что в 1-й группе преобладали больные со средней и низкой вирусной нагрузкой, во 2-й – больные с высокой вирусной нагрузкой (рис. 4). При этом уровень вирусной нагрузки ВПЧ 16 типа в 1-й группе больных составил 4,2 (2,4 - 5,1) lg на 105 клеток, во 2-й - 5,6 (5,1 - 6,7) lg на 105 клеток (z=4,41; р=0,000).
 |
Рис. 4. Уровень вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18 типа у больных с CIN
Примечание: * - р<0,05 при сравнении 1-й и 2-й группы.
Среди ассоциантов ВПЧ в цервико-вагинальном биотопе были выявлены ВПГ, C. trachomatis, Candida spp., Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, G. vaginalis как в клинически значимом титре, так и в титре менее 104 КОЕ/мл при отсутствии статистически значимых различий между основными группами. Случаи отсутствия ИППП и дисбиоза, отмеченные в группе сравнения, наблюдались значительно чаще (44%), чем в 1-й группе (68%) и во 2-й (7,1%, р=0,000) группе.
При сравнительном анализе данных кольпоскопии у больных с CIN установлена частая регистрация аномальных кольпоскопических признаков, доминирующих в различных сочетаниях во 2-й группе (р=0,03), с высокой частотой симптома неравномерного йод-позитивного эпителия в 1-й и 2-й группе (р>0,05) в отличие от группы сравнения (2Yates=17,44, р=0,000). Признаки воспаления наблюдались в каждом 3 случае и не имели статистически значимых различий в зависимости от наличия ВПЧ. Для объективизации полученных данных проведен клинико-кольпоскопический анализ с учетом возраста больных, курения, данных цитологии, степени побеления эпителия после уксусной кислоты, площади поверхности поражения, с оценкой межкапиллярной дистанции, очаговости поражения и характера поверхности (M.Shafi, S.Nazeer, 2006).
Проведя бальную оценку клинико-кольпоскопического индекса, нами установлено повышение его величины по 2-й группе относительно 1-й группы и группы сравнения (р=0,000) (рис. 5). У больных с CINI в 1-й группе и группе сравнения не установлено зависимости его значений от наличии ВПЧ (р>0,05). Уровень клинико-кольпоскопического индекса коррелировал с уровнем вирусной нагрузки ВПЧ 16 типа (rs=0,4, р=0,01).
 |
Рис. 5. Уровень клинико-кольпоскопического индекса у больных с ВПЧ-ассоциированными CIN
Примечание: р1 -уровень различий при сравнении 1-й и 2-й групп, р2 –1-й и группы сравнения.
Морфологический раздел исследования включал цитологическое исследование цервикальных мазков, гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов шейки матки. Оценка цитологических результатов свидетельствовала о статистически значимом преобладании в 1-й группе ASCUS, LSIL, признаков воспаления, во 2-й группе – HSIL; признаки койлоцитоза и воспаления у больных с CINI доминировали на фоне ПВИ в сравнении с неинфицированными пациентками, которым в связи с обнаружением койлоцитов проводилось ретестирование на ВПЧ (р<0,05).
Верификация CIN осуществлялась в соответствии с данными гистологического исследования. Пациентки с CINI (n=98) составили 1-ю основную группу и группу сравнения в зависимости от наличия ВПЧ, с CINII (n=25) и CIN III (n=17) - 2-ю основную группу, объединенных в одну по высокой степени поражения и общности лечебных подходов (деструкция). Независимо от степени поражения наблюдалось преобладание CIN на фоне плоскоклеточной метаплазии в отличие от изолированного варианта CIN. Частота койлоцитоза в 1-й (74%) и во 2-й (64,2%) группе не имела статистически значимых различий. Случаи койлоцитоза у пациенток без ВПЧ могут быть, по мнению ряда авторов, следствием инфицирования другими вирусами [Daxnerova Z. et al., 2003; Qian Y.S. et al., 2005].
Иммуногистохимическое исследование проведено на материале от 47 пациенток с CIN. На основании подсчета иммуногистохимического индекса р16 было установлено увеличение его экспрессии в эпителии во 2-й группе в сравнении с 1-й (р=0,000) (рис. 6). В группе контроля (n=7) при получении биопсии у больных ASCUS, наблюдалось отсутствие ядерной метки, окрашивание слабой интенсивности либо его отсутствие. Анализируя составляющие иммуногистохимического индекса, нами установлено, что при проведении частотного анализа (кросстабуляции) наблюдалась прямая статистически значимая взаимосвязь (-статистика=0,75) между степенью CIN и толщиной окрашивания эпителиального пласта (Pearson 4,6, p=0,03; M-L 2 6,2, p=0,01) и наличием множественной ядерной метки (Pearson 7,5, p=0,006; M-L 2 8,9, p=0,002). Прямая взаимосвязь наблюдалась между наличием ВПЧ и присутствием множественной ядерной метки (Pearson 4,9, p=0,02; M-L 2 5,6, p=0,01), между наличием ВПЧ и присутствием индекса экспрессии более 50% (Pearson 5,08, p=0,02; M-L 2 5,06, p=0,02). Корреляционный анализ Спирмена позволил установить сильную связь между уровнем вирусной нагрузки ВПЧ 16 типа и величиной иммуногистохимического индекса в 1-й и во 2-й группах (rs=0,89, rs=0,91 соответственно, р<0,001). Полученные данные подтверждают исследования ряда авторов, установивших корреляцию степени CIN и вирусной нагрузки с экспрессией р16 [Eleutero J.Jr. et al., 2007; Yi W.et al., 2008; Mulvany N.J. et al., 2008].
 |
Рис. 6. Уровень иммуногистохимического индекса р16 в эпителии шейки матки больных с ВПЧ-ассоциированными CIN, баллы
Примечание: р1 -уровень различий при сравнении 1-й и 2-й групп, р2 –1-й и группы сравнения.
Ввиду установленной возможности экспрессии р16 у неинфицированных больных с CINI было решено определить пороговое значение р16. Для индивидуальной категориальной оценки результатов индекса р16 был использован метод процентилей, согласно которому нормальное значение показателя находится в пределах «статистической нормы» от 16 до 84 процентиля [Ширинский В.А. и соавт., 1985]. В нашем случае 84% верхним процентилем явилось значение 4,72, в соответствии с чем значение 4 балла и менее находятся в пределах нормы.
Интерес к метаболитам эстрадиола при CIN продиктован взаимосвязью «агрессивного» по причине индукции клеточной пролиферации метаболита 16-ОНЕ1 и экспрессией онкобелков Е6 и Е7 ВПЧ [Киселев В.И. и соавт.2006; Zheng J. et al., 1998].
Установлено, что у больных с ВПЧ-ассоциированными CINI наблюдалось преобладание уровня 16-ОНЕ1 (z=2,23; р=0,025), снижение соотношения уровня 2-OHE1/16OHE1 относительно группы контроля (z=0,98; р=0,04). Аналогичные данные получены у больных с CINII,III по уровню 16-ОНЕ1 (z=2,51; р=0,01) и соотношению метаболитов (z=-2,39; р=0,01). В зависимости от степени поражения шейки матки на фоне папилломавирусной инфекции существенных изменений метаболитов у больных 1-й и 2-й группы не установлено (р>0,05). Полученные данные подтверждают участие метаболита 16-ОНЕ1 в ВПЧ-зависимом канцерогенезе [Асадчикова О.Н. и соавт., 2009; Мальцева Л.И. и соавт., 2009]. У неинфицированных больных с CINI анализируемые показатели не имели статистически значимых различий с группой контроля.
Иммунологическое направление исследований при ПВИ лежит в основе разработки патогенетически ориентированной терапии, поскольку ее разрешение происходит при участии клеточного иммунного ответа. С этой целью проведено изучение наиболее информативных цитокинов (ИФН-, ИЛ-4), характеризующих вариант иммунного ответа, и особенностей интерфероногенеза при ВПЧ-ассоциированных CIN.
При оценке уровня сывороточного ИФН- установлено статистически значимое его преобладание во 2-й группе относительно 1-й (U=8,00; р=0,025). При проведении корреляционного анализа получена связь средней силы между степенью CIN и уровнем ИФН- (rs=0,45; р=0,04) при отсутствии значимых изменений со стороны ИЛ-4.
Несмотря на однонаправленный характер уровня ИФН- от степени поражения, функциональный резерв к синтезу ИФН- был ограничен, как при LSIL, так и при HSIL. В частности, нами не выявлено активации интерфероногенеза in vitro в зависимости от степени поражении (р>0,05), что позволяет расценить подобные изменения как способствующие персистенции ВПЧ.
Для оценки прогноза развития CINI на фоне папилломавирусной инфекции были выявлены прогностические критерии течения заболевания. На основании комплексной оценки полученных данных была разработана диагностическая таблица, позволяющая определить прогноз течения CINI (табл.1).
При выборе критериев учитывались достоверно значимые различия между двумя основными группами, к которым относились данные анамнеза (возраст пациенток, возраст начала половой жизни, а также интервал между возрастом менархе и началом половой жизни) и лабораторных методов обследования (вирусная нагрузка ВПЧ 16,18 типов, уровень клинико-кольпоскопического и иммуногистохимического индексов).
Таблица 1
Прогностические критерии течения ВПЧ-ассоциированных CIN
| Критерии | ДК |
| Данные обследования | |
| +3,2 -4,1 -11,1 |
| -10,5 -1,7 +6,4 +16,4 +11,2 |
| -10,4 +8.4 |
| Данные анамнеза | |
| -3,0 +0,3 +4,2 |
| +8,0 +2,2 -2,5 -7,1 |
| +4,1 -0,5 -4,5 |
Примечание: ДК – диагностический коэффициент в битах.
Рассчитаны диагностические коэффициенты (ДК) для каждого из признаков в результате последовательного анализа Вальда. При сумме ДК выше «+13» битов вероятность перехода CINI в HSIL составляет 95%, если сумма ДК превышает «+19», то вероятность прогрессии CINI составляет 99%, при сумме битов менее «-13», вероятность благополучного исхода составляет 95%.
Чувствительность разработанной диагностической таблицы (87,5%), специфичность (90,9%), прогностическая ценность положительного результата теста (89,2%) и отрицательного результата теста (95,2%) позволяет с высокой долей вероятности определить риск развития HSIL у пациенток с CINI и обосновать целесообразность дифференцированного подхода (деструктивного варианта лечения либо консервативного ведения пациенток), что отражено в усовершенствованном лечебно-диагностическом алгоритме (рис.7).
Рис. 7. Алгоритм ведения больных с ВПЧ-ассоциированными CINI
При низкой вероятности развития HSIL (ДК менее «-13» битов) больным с CIN рекомендуется наблюдательная тактика или медикаментозное лечение с использованием противовирусного препарата инозин пранобекс при условии отсутствия данных неудовлетворительной кольпоскопии и согласия пациентки с тактикой ведения. При высокой вероятности перехода CINI в HSIL (ДК более «+13» битов) наблюдательная тактика является нецелесообразной, рекомендуется деструкция шейки матки.
Разработанный алгоритм был использован у 30 пациенток с CINI. Было проведено изучение эффективности лечения пациенток с ВПЧ-ассоциированными CINI с использованием противовирусного препарата инозин пранобекс (n=30) в сравнении с традиционной схемой (n=30) посредством рандомизации. В каждой из групп деструкцию шейки матки проводили при наличии показаний: неудовлетворительная кольпоскопия; отказ больных от тактики наблюдения; сумме ДК более «+13» битов по диагностической таблице.
Через 6 месяцев после лечения оценивали контроль эффективности (по результатам повторной кольпоскопии, цитологического исследования, ВПЧ-тестирования), через 3 мес - интерфероногенез. При сравнительной оценке интерферонового статуса до и после лечения (связанные группы - критерий Вилкоксона) в 1А группе установлено повышение уровня ИФН– спонтанного (Z=1,95, р=0,05), ИФН– стимулированного (Z=2,07, р=0,04) при отсутствии статистически значимых различий в 1Б группе (р>0,05).
В результате установлено, что при использовании инозина пранобекса в режиме монотерапии и комбинированного с деструкцией метода лечения у пациенток с ВПЧ-ассоцироваными поражениями низкой степени (CINI) получена высокая частота регресса CINI (70%), элиминации ВПЧ (83,3%) и снижения вирусной нагрузки (отсутствие высокой и средней вирусной нагрузки) на фоне активации интерфероногенеза (р<0,05). При традиционном ведении больных с CINI (наблюдение, деструкция) этиологическое и клиническое выздоровление наблюдалось в 2 раза реже (в 40 и 36,6% соответственно) при низких темпах снижения вирусной нагрузки ВПЧ.
ВЫВОДЫ
1. Для больных с ВПЧ-ассоциированными цервикальными интраэпителиальными неоплазиями характерно преобладание ВПЧ 16 типа: 69,0% при высокой степени поражения (CINII-CINIII), 48,0% при низкой степени поражения (CINI) (р<0,05). Уровень вирусной нагрузки ВПЧ онкогенного риска (16,18 типы) влияет на степень поражения: высокая нагрузка доминирует при CINII-CINIII (81,2%), повышение частоты средней (48,3%) и низкой (12,9%) нагрузки является статистически значимым при CINI.
2. Клинико-социальными особенностями ВПЧ-ассоциированных цервикальных интраэпителиальных неоплазий в зависимости от степени поражения являются: при CINI - более высокая распространенность в раннем репродуктивном возрасте; при CINII-III - более юный возраст начала сексуальных отношений с дебютом до 15 лет (26,2%), более короткий интервал от менархе до начала половой жизни, высокая частота курения (60%) и нерегулярная барьерная контрацепция либо ее отсутствие на фоне неспецифичности жалоб, общей для больных с CIN.
3. ВПЧ-ассоциированные цервикальные поражения характеризуются более высоким клинико-кольпоскопическим индексом при CINII-III - 6,0 (4,0; 6,0) баллов относительно CINI - 1,0 (0; 2,0) баллов, (р<0,05); при CINI факт ВПЧ не влияет на величину кольпоскопического индекса; среди инфицированных женщин уровень вирусной нагрузки ВПЧ 16 типа коррелирует с клинико-кольпоскопическим индексом (rs=0,4, р=0,01).
4. У пациенток с ВПЧ-ассоциированными поражениями высокой степени (CINII-CINIII) наблюдается 3-кратное повышение величины иммуногистохимического индекса р16ink4а в эпителии экзоцервикса - 6,0 (5,0; 7,0) (по интенсивности реакции, протяженности экспрессии и наличию ядерной метки) в сравнении с поражениями низкой степени (CINI) - 2,0 (1,0; 4,0), что коррелирует с уровнем вирусной нагрузки ВПЧ 16 типа (rs=0,91; р<0,001).
5. У больных с ВПЧ-ассоциированными цервикальными интраэпителиальными неоплазиями независимо от степени поражения наблюдается снижение соотношения метаболитов эстрадиола 2-OHE1/16OHE1 в сравнении с контрольной группой вследствие преобладания уровня «агрессивного» метаболита16-ОНЕ1 в отличие от ВПЧ-негативных больных с CINI (p<0,05), что подтверждает участие последнего в ВПЧ-зависимом канцерогенезе.
6. При наличии корреляции степени поражения цервикальных интраэпителиальных неоплазий с уровнем сывороточного ИФН- (в отличие от ИЛ-4) (rs=0,45; р=0,04), не наблюдается активации интерфероногенеза в зависимости от степени поражения, что способно поддерживать персистенцию папилломавирусной инфекции.
7. Дифференцированное лечение больных с ВПЧ-ассоциированными эпителиальными поражениями в соответствии с усовершенствованным алгоритмом, предусматривающим оценку вирусной нагрузки ВПЧ, клинико-кольпоскопический, иммуногистохимический индексы, сопровождается статистически значимым увеличением регресса CINI (70,0%), элиминации ВПЧ (83,3%), активацией интерферонового ответа при использовании инозина пранобекса в сравнении с традиционным ведением больных (36,6% и 40% соответственно).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. К анамнестическим факторам, влияющим на выбор врачебной тактики при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях, относятся: возраст больных, возраст начала половой жизни, интервал от менархе до сексуального дебюта; к клинико-лабораторным факторам - уровень вирусной нагрузки ВПЧ 16,18 типа (высокая - более 5 lg на 105 клеток, средняя - 3-5 lg на 105 клеток, низкая - менее 3 lg на 105 клеток), величина иммуногистохимического (0-7 баллов), клинико-кольпоскопического (0-10 баллов) индексов.
2. Уровень иммуногистохимического индекса р16ink4 в цервикобиоптатах больных с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями определяют на основании комплексной оценки трех признаков: интенсивность реакции (0-3 баллов), индекс экспрессии (0-2 балла), наличие ядерной метки (0-2 балла).
3. Выбор рациональной тактики ведения пациенток с ВПЧ-ассоциированными цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I степени основан на использовании прогностической шкалы (при величине диагностического коэффициента «+13» вероятность возникновения эпителиального поражения высокой степени (HSIL) составляет 95%, при «+19» – 99%). При высокой вероятности развития HSIL (CINII-CINIII) показано проведение деструкции, в остальных случаях возможна консервативная тактика ведения больных при отсутствии дополнительных показаний к деструкции (неудовлетворительная кольпоскопия, отказ больных от тактики наблюдения).
4. Дифференцированное назначение инозина пранобекса у больных с ВПЧ-ассоциированными цервикальными интраэпителиальными неоплазиями проводится в режиме монотерапии или комбинированной терапии при наличии показаний к деструкции при CINI, при CINII-CINIII – только в режиме комбинированной терапии.
5. При отсутствии данных комплексной оценки прогностических факторов возможно изолированное использование одного или нескольких маркеров. При уровне иммуногистохимического индекса р16ink4 более порогового значения (4,72 балла) и/или высокой вирусной нагрузки ВПЧ 16,18 типа (более 5 lg на 105 клеток) у больных с CINI наблюдательная тактика не рекомендуется ввиду риска прогрессии заболевания.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Клинышкова Т.В. ВПЧ-ассоциированные плоскоклеточные интраэпителиальные поражения шейки матки / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, И.Б. Самосудова // Материалы III Регионального научного форума « Мать и дитя». – М., 2009. – С. 125-126.
- Клинышкова Т.В. Особенности ВПЧ-ассоциированных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки высокой и низкой степени / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, И.Б. Самосудова // Вестник перинатологии, акушерства и гинекологии (Красноярск). – 2009. - № 16. – С. 175 – 179.
- Клинышкова Т.В. Иммуногистохимическое исследование р16ink4а при ВПЧ-ассоциированных плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях шейки матки / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, С.И. Мозговой // Омский научный вестник. – 2009. – № 1 (84). – С. 77–80.
- Клинышкова Т.В. Оценка вирусной нагрузки ВПЧ при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях шейки матки / Т.В. Клинышкова Т.И. Каратюк, Т.В. Притыкина // Проблемы здоровья женщин репродуктивного возраста : материалы межрегиональной научно-практической конференции. – Омск, 2009. - С. 32 – 34.
- Клинышкова Т.В. Оценка экспрессии р16ink4а при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях шейки матки / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, С.И. Мозговой // Материалы X юбилейного Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М., 2009. – С. 322 – 323.
- Каратюк Т.И. Особенности интерфероновой системы при ВПЧ-ассоциированных плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях шейки матки / Т.И. Каратюк, Т.Ф. Соколова, Т.И. Долгих, Н.Е. Турок // Вестник Уральской Медицинской Академической науки (Екатеринбург). – 2010. - №2/1 (29). - С. 145–146.
- Клинышкова Т.В. Клиническое значение уровня метаболитов эстрадиола при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях шейки матки / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, Т.В. Притыкина // Материалы Всероссийского конгресса «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты». – М., 2010. – С. 139 – 141.
- Клинышкова Т.В. Клинико-иммунологические особенности ВПЧ-ассоциированных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, Т.Ф. Соколова // Омский научный вестник. – 2010. - № 1 (94). - С.63 - 67.
- Клинышкова Т.В. Состояние экспрессии р16ink4 при плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях шейки матки в зависимости от наличия ВПЧ / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, Ю.В. Машнин // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М., 2010. – С. 398 - 399.
- Клинышкова Т.В. Совершенствование диагностических технологий при плоскоклеточных поражениях шейки матки / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, И.Г. Утянская // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М., 2010. - С 397- 398.
- Клинышкова Т.В. Результаты лечения ВПЧ-ассоциированных плоскоклетоных интраэпителиальных поражений шейки матки низкой степени / Т.В. Клинышкова, Т.И. Каратюк, И.Б. Самосудова // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы». – М., 2011. – С. 216 – 217.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВПЧ – вирус папилломы человека
ВПГ – вирус простого герпеса
ДК – диагностический коэффициент
ИП – инозин пранобекс
ИППП – инфекции, передаваемые половым путем
ИФА – иммуноферментный анализ
ИФН- – интерферон альфа
ИФН- – интерферон гамма
ПВИ – папилломавирусная инфекция
ASCUS - атипичные клетки плоского эпителия неясного значения
CIN I, II, III - цервикальная интраэпителиальная неоплазия I, II, III степени
HSIL - высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения
LSIL - низкая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения
SIL - плоскоклеточное интраэпителиальное поражение
16-ОНЕ1 - 16-гидроксиэстрон
2-ОНЕ1- 2-гидроксиэстрон
р16 - р16ink4
На правах рукописи
КАРАТЮК
Татьяна Ивановна
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
14.01.01 – акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Омск – 2011
____________________________________________
Подписано в печать 12.04.2011
Формат 60x84/16
Бумага офсетная
П.л. – 1,0
Способ печати - оперативный
Издательско-оперативный центр ОмГМА
644050, г.Омск, пр. Мира, 30, тел: 69-32-72
