Клинико-морфологическая и иммуногистохимическая характеристика и прогностические критерии плоскоклеточного рака гортани

На правах рукописи

Горбань

Нина Андреевна

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ

ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ГОРТАНИ

14.00.15 – патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва-2008

Работа выполнена в ГУ Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Александр Юрьевич Абросимов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ -

Милованов Андрей Петрович

доктор медицинских наук, профессор –

Мацко Дмитрий Евгеньевич

Ведущая организация - Российский университет дружбы народов

Защита состоится «____» ноября 2008 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН (117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН (117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3).

Автореферат разослан «___» сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.П.Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Рак гортани составляет 4-6% злокачественных опухолей человека и имеет тенденцию к росту, так как его развитие связано с загрязнением внешней среды промышленными канцерогенами (Вержбицкий Г.В, 1983). По частоте встречаемости в Российской Федерации рак гортани вышел на 5-е место (Ушаков В.С. и соавт., 2003). В 2004 г. радикальное лечение по поводу злокачественного новообразования гортани завершили 61% больных (в 2003 г. – 59,8%), от числа больных с I-III стадией заболевания - 74%. Из них получили только лучевое лечение – 38,4%, комбинированное – 39,4%, только хирургическое – 15,8% больных (Чиссов В.И. и соавт., 2005). В последние годы одним из наиболее признанных и эффективных методов лечения рака гортани является лучевая терапия, которая используется как самостоятельный метод, так и в комбинации с хирургическим и лекарственным лечением (Андреев В. Г. и соавт., 1998; Канаев С.В., 2003; Рожнов В.А., 2002). Лучевой метод лечения, особенно распространенного рака гортани, привлекает возможностью избежать калечащих операций (Андреев В. Г. и соавт., 1998; Бойков В. П., 1989; Рожнов В.А., 2002). Эффективность метода зависит от радиочувствительности рака гортани, определить степень которой очень трудно даже при комплексном обследовании больного. Нередко опухоль оказывается радиорезистентной, или развиваются рецидивы заболевания.

В настоящее время еще нет достоверного способа определения радиочувствительности рака гортани, не разработаны критерии учета индивидуальных особенностей опухолевого процесса при раке гортани, которые могут служить основой прогнозирования клинического течения заболевания и планирования лечения, проведения активных профилактических мероприятий в прогностически неблагоприятной группе больных (Бойков В. П., 1989).

В настоящее время активно изучают различные молекулярно-биологические тканевые маркеры, большинство из которых характеризует определенные биологические особенности опухоли, специфику ее «поведения» и регуляции (Пожарисский К. М. и соавт., 2000; Colombo M. и соавт., 2008). Количество изучаемых потенциальных молекулярных маркеров увеличивается лавинообразно. В их число входят онкогены, протоонкогены, онкобелки, различные факторы роста и их рецепторы, супрессорные гены и продукты их экспрессии, протеазы, участвующие в прогрессировании опухолевого процесса. Результаты исследований порой носят достаточно противоречивый характер. Представляется логичным, что комплексное использование клинических данных и молекулярно-биологических признаков с большей вероятностью будет способствовать определению индивидуального прогноза у онкологических больных вообще и при плоскоклеточном раке гортани в частности.

К числу малоизученных, но очень актуальных относится вопрос о характере изменений слизистой оболочки вне основного узла опухоли. Не исключено, что именно очаги дисплазии (предрака) и карциномы in situ могут быть источниками рецидива опухоли (Вержбицкий Г.В, 1983; Шарипова М.А., 1990).

Цель исследования – изучить клинико-морфологические и иммуногистохимические особенности плоскоклеточного рака гортани с позиции их прогностического значения.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Определить связь между иммуноморфологическими особенностями рака гортани до лечения и клинико-морфологическими параметрами, имеющими прогностическое значение. (Определить пролиферативную активность по экспрессии Ki-67 и циклина D1, мутацию гена р53 по экспрессии мутантного белка р53, экспрессию bcl-2).

2. Изучить возможную связь между иммуногистохимическими характеристиками опухоли до лечения и клиническими результатами терапии.

3. Оценить характер кровоснабжения опухоли по таким показателям как микрососудистая плотность, суммарный периметр сосудов и суммарная площадь сосудов. Определить взаимосвязь васкуляризации опухоли с клинико-морфологическими параметрами и ее влияние на прогноз заболевания.

4. Установить степень лечебного патоморфоза опухолей после проведенной терапии и проанализировать взаимосвязь ее с экспрессией биологических маркеров и клиническим течением болезни.

5. Исследовать иммуногистохимические особенности предраковых изменений слизистой оболочки гортани, установить их прогностическое значение.

Научная новизна исследования.

Уровень пролиферации, экспрессия мутантного белка р53 и ингибитора апоптоза bcl-2, а также характер васкуляризации опухоли являются значимыми прогностическими факторами при плоскоклеточном раке гортани. Выделена группа пациентов с гиперэкспрессией р53, уровнем Ki-67 более 55% и низким уровнем васкуляризации (микрососудистая плотность менее 17 и суммарный периметр сосудистой стенки менее 799µм), которые имеют потенциально неблагоприятный прогноз заболевания, связанный с высоким риском развития рецидивов и низкой специфической и безрецидивной выживаемостью, а также наличием метастазов в регионарных лимфатическим узлах.

Степень лечебного патоморфоза плоскоклеточного рака гортани не зависит от иммуногистохимического фенотипа опухоли. Низкая степень терапевтического патоморфоза является фактором риска развития рецидива заболевания.

Наличие экспрессии р53 и/или распространение Ki-67-позитивных клеток до уровня 2/3 толщины эпителиального пласта и выше характерны для тяжелых необратимых предраковых изменений (тяжелая дисплазия, карцинома in situ) покровного эпителия гортани, и могут быть использованы для разграничения предраковых и доброкачественных гиперпластических процессов.

Научно-практическая значимость работы состоит в том, что для установления потенциала злокачественности плоскоклеточного рака гортани предлагается использовать комплекс молекулярных маркеров. В работе показано, что высокий уровень пролиферативной активности опухоли, выявляемый с помощью экспрессии Ki-67 и циклина D1, связан с наличием метастазов в лимфатических узлах и развитием в последующем рецидива заболевания. Обнаружена связь пролиферативной активности со специфической выживаемостью, что может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе для пациентов с высокой пролиферативной активностью опухоли.

Выявление экспрессии р53 статистически достоверно связано с развитием рецидива болезни и коротким безрецидивным периодом, что также указывает на неблагоприятный прогноз у данных пациентов. Напротив, выявление экспрессии bcl-2 в опухоли может служить благоприятным прогностическим признаком.

Характер развития кровеносного русла опухоли и степень ее васкуляризации влияют на возможность возникновения рецидива заболевания, на показатели специфической и безрецидивной выживаемости. Высокая степень васкуляризации опухоли служит благоприятным прогностическим признаком по сравнению с низкой, при которой высока вероятность развития рецидива и установлен более низкий уровень пятилетней выживаемости.

Наличие экспрессии р53 клетками пласта покровного многослойного плоского эпителия, высокий уровень Ki-67 свидетельствуют о необратимых предраковых изменениях эпителия, характерных для тяжелой дисплазии и карциномы in situ.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007 г.).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции клинического радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН (сентябрь 2008 г., протокол №8), на межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (октябрь, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику клинико-морфологического отделения ГУ-МРНЦ РАМН (заведующий – доктор медицинских наук, профессор Е.Ф.Лушников) и отделения лучевого и хирургического лечения заболеваний верхних дыхательных путей ГУ-МРНЦ РАМН (заведующий – доктор медицинских наук, профессор В.Г.Андреев).

Личный вклад автора. Автором диссертации обоснована актуальность темы, сформулированы цель, задачи исследования и выводы. Диссертант лично систематизировала и провела микроскопический анализ архивного гистологического материала, накопленного в лаборатории патологической анатомии ГУ-МРНЦ РАМН за период с 1998 по 2005 гг. Автор самостоятельно выполнила все иммуногистохимические исследования с маркерами, провела статистический анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 114 страницах и состоят из введения, обзора данных литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований (4 глав), обсуждения, выводов и указателя литературы, который содержит 38 отечественных и 115 зарубежных источника. Диссертация содержит 17 таблиц и 46 рисунков.

Связь темы диссертации с планом научных работ ГУ-МРНЦ РАМН. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой НИР ГУ-МРНЦ РАМН на тему «Разработка технологии комбинированного лечения больных злокачественными опухолями и предраковыми заболеваниями верхних дыхательных путей» (№ государственной регистрации 01.2.007 02199).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика материала и методов его исследования

В качестве материала использованы гистологические препараты и парафиновые блоки биоптатов гортани 64 пациентов (62 мужчины и 2 женщины) в возрасте от 34 до 77 лет (средний возраст 56±1,2). Изучен гистологический материал (парафиновые блоки и срезы тканей) хирургически удаленной гортани 36 пациентов с инвазивным плоскоклеточным раком. Все пациенты находились на комбинированном лечении в клинике ГУ-МРНЦ РАМН с 1998 по 2005 гг. Сроки наблюдения за пациентами после хирургических вмешательств составили от 2 до 9 лет. В 44 наблюдениях кроме кусочков с инвазивным плоскоклеточным раком были изучены фрагменты нормальной слизистой оболочки гортани, а также с различными морфологическими изменениями покровного эпителия: от простой плоскоклеточной гиперплазии до тяжелой дисплазии и карциномы «in situ». Проанализированы клинические данные, представленные в медицинских картах всех пациентов, включенных в исследование.

Материал обрабатывали с применением гистологических и иммуногистохимических методов. Для гистологического исследования кусочки ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина (рН 7,0). Гистологические срезы опухолевой и прилежащей к ней ткани толщиной 3–4 микрона были окрашены гематоксилином и эозином. На светооптическом уровне оценивали степень дифференцировки опухоли, характер изменений покровного эпителия и стадию опухолевого процесса согласно рекомендациям ВОЗ (2005 г.).

Иммуногистохимическое исследование во всех случаях проводили на парафиновых срезах толщиной 3-4 микрона с моноклональными антителами фирмы DAKO в разведении 1:50 для Ki-67, циклина Д1 и Bcl-2, 1:100 для р53 и 1:25 для FVIII по стандартному протоколу непрямого трехступенчатого иммуноферментного метода.

Положительным результатом иммуногистохимической реакции считали наличие специфического окрашивания в коричневый цвет ядер при выявлении антигена Ki-67. При реакции с антителами к р53 опухоли с наличием специфически окрашенных ядер более чем в 25% опухолевых клеток относили к р53-позитивным.

Положительной реакцией считали наличие специфического ядерного окрашивания при реакции с антителами к циклину D1 и цитоплазматического при реакции с антителами к bcl-2 более чем в 30% опухолевых клеток. При реакции с антителами к фактору VIII положительной считали цитоплазматическое окрашивание эндотелиальных клеток.

Для морфометрических исследований опухоли использовали компьютерный анализатор изображения (система анализа изображений Leica Qwin Pro, цифровой фотоаппарат Leica, микроскоп Leica, системный блок на базе процессора Intel Pentium III, с оперативной памятью 512 MB).

Подсчет индекса Ki-67 и р53 проводили на компьютерном анализаторе изображения «Leica QWin» при анализе более 1000 клеток. Индекс Ki-67 и р53 вычисляли как соотношение площади специфически окрашенных ядер к площади всех ядер, выраженное в процентах.

Микрососудистое русло в раках гортани оценивали по методике, которую предложил в 1994 году N. Weidner. Плотность микрососудистого русла, суммарную длину периметра сосудов и суммарную площадь сечения сосудов определяли в срезах, окрашенных с использованием первичных антител к фактору Виллебрандта (FVIII). Подсчет проводили в 5-10 полях зрения при увеличении х400 и поле зрения микроскопа (0,054мм2).

Степень лечебного патоморфоза определяли, пользуясь классификацией Г. А. Лавниковой (1974).

Статистическую обработку полученных параметров проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 для операционной среды Windows (Боровиков В.П., 1998). Значимость различий между средними величинами и независимыми переменными оценивали с помощью t-Test, дисперсионного анализа, таблиц сопряженности 2х2 (, точный критерий Фишера). Анализ специфической и безрецидивной выживаемости производили с помощью метода Каплана-Мейера (1958), достоверность различий между кривыми выживаемости подтверждали Cox`F-Test. Статистически значимыми признавали различия между сравниваемыми величинами при уровне р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При морфологическом исследовании у всех пациентов морфологически был верифицирован плоскоклеточный рак гортани (в 11 случаях высокодифференцированный, в 26 – умеренно дифференцированный и в 27 – низкодифференцированный). В прилежащих участках нормальный эпителий определялся в 19 наблюдениях, простая гиперплазия – в 22, слабая дисплазия – в 2, умеренная дисплазия – в 1, тяжелая дисплазия – в 5 и карцинома in situ – в 16 случаях.

К моменту установления диагноза у больных выявлена различная степень распространенности заболевания: Т2 – у 5 пациентов (7,8%), Т3 – у 37 (57,8%), Т4 – у 22 (34,4%). Метастазы в регионарных лимфатических узлах выявлены в 19 (29,7%) наблюдениях. Отдаленных метастазов не выявлено ни в одном случае. Рецидив заболевания развился у 17 (26,6%) пациентов в сроки от 1 до 4 лет, 12 из них умерли от прогрессирования заболевания.

Анализ экспрессии маркеров пролиферации

Наиболее популярным при изучении пролиферативной активности в качестве маркера является антиген Ki-67 (Pinto A. P. и соавт., 2008). Присутствие его во всех фазах митотического цикла позволяет использовать данный белок в качестве универсального маркера пролиферации при оценке активности роста злокачественных новообразований (Шацева Т.А. и соавт., 2004).

Экспрессия Ki-67 обнаружена во всех случаях. При количественном анализе минимальное количество Ki-67 позитивных клеток составило 7%, максимальное – 100%, медиана – 54,5%, среднее арифметическое – 54,9±3,0%, распределение близко к нормальному. Положительное специфическое окрашивание при реакции с антителами к циклину D1 наблюдалось в 18 случаях (28,1%).

С понижением степени дифференцировки опухоли пролиферативная активность, определяемая уровнем Ki-67, увеличивается (р<0,01). Средний уровень Ki-67 при увеличении Т стадии также увеличивается, однако статистически значимые различия получены только между группами Т2 и Т4 (р=0,05). Средний уровень Ki-67 в группе с выявленными метастазами выше, чем в группе без выявленных метастазов, (р=0,05). %. D. Mielcarek-Kuchta и соавт. (2003) также указывают на четкую корреляцию между Ki-67 и степенью дифференцировки опухоли.

При использовании полуколичественного метода - сравнения групп пациентов, в опухолях которых уровень Ki-67 более медианы (55%) и менее – статистическая достоверность связи между высоким уровнем Ki-67 и наличием метастазов в лимфатических узлах увеличивается (р=0,03), а также выявляется связь с наличием рецидива заболевания (р=0,04). Наши данные согласуются с результатами исследования M. F. Acicalin и соавт. (2004), которые обнаружили значительную корреляцию уровня Ki-67 с N-статусом и развитием рецидива. Sittel и соавт. (2000), показали, что при раке гортани высокий уровень Ki-67 коррелирует с коротким безрецидивным периодом.

Таблица 1. Специфическая выживаемость в зависимости от экспрессии иммуногистохимических маркеров при плоскоклеточном раке гортани

Факторы	Количество пациентов	5-летняя выживаемость(%)	Р (CoxF-Test)
Уровень пролиферации Ki-6755% Ki-67<55%	34 34	66 91	0,008
Экспрессия циклина Д1 циклинД1+ циклин Д1-	18 46	55,3 84,2	0,045
Экспрессия белка р53 Р53+ Р53-	36 28	69 85	0,18
Экспрессия протеина bcl-2 Bcl-2+ Bcl-2-	19 45	92,6 70,2	0,01
Коэкспрессия р53 и Ki-67 Р53+/ Ki-6755% Р53- или Ki-67<55%	22 42	57,8 86,2	0,02
Степень васкуляризации опухоли МСП17 МСП<17 СПСС799 СПСС<799 СПС1775 СПС<1775 МСП17/CПСС1775 МСП<17 или СПСС<1775	24 37 29 32 29 32 32 48	86,9 63,5 84,3 67,2 78,1 73,5 91,7 66,2	0,01 0,02 0,29 0,002

Здесь и далее в табл.2:

МСП – микрососудистая плотность

СПС – суммарная площадь сосудов

СПСС – суммарный периметр сосудистой стенки

Одним из регуляторов клеточного цикла, влияющим на агрессивность рака гортани, является циклин D1 (Копнин Б.П., 2000; Nix P. и соавт., 2005; Colombo M. и соавт., 2008). В нашей работе корреляции между наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы и экспрессией циклина D1 не обнаружено (р=0,66), а связь с развитием рецидива на уровне тенденции (р=0,08).

Таблица 2. Безрецидивная выживаемость в зависимости от экспрессии иммуногистохимических маркеров при плоскоклеточном раке гортани

Факторы	Количество пациентов	5-летняя выживаемость(%)	Р (CoxF-Test)
Уровень пролиферации Ki-6755% Ki-67<55%	34 34	57 81	0,01
Экспрессия циклина Д1 циклинД1+ циклин Д1-	18 46	48,2 77,1	0,049
Экспрессия белка р53 Р53+ Р53-	36 28	54 85	0,03
Экспрессия протеина bcl-2 Bcl-2+ Bcl-2-	19 45	81,2 64	0,08
Коэкспрессия р53 и Ki-67 Р53+/ Ki-6755% Р53- или Ki-67<55%	22 42	43,4 81,5	0,003
Степень васкуляризации опухоли МСП17 МСП<17 СПСС799 СПСС<799 СПС1775 СПС<1775 МСП17/CПСС1775 МСП<17 или СПСС<1775	24 37 29 32 29 32 32 48	84,3 49,4 83,4 52,9 71,4 63,3 93,3 52,4	0,001 0,004 0,22 0,00006

Сопоставление уровня Ki-67 и экспрессии циклина D1 со специфической и безрецидивной выживаемостью больных представлено в таблицах 1 и 2. Наши данные согласуются с данными T. Arisi и соавт. (2004), O. Ataman и соавт. (2004), которые показали, что экспрессия циклина D1 опухолевыми клетками свидетельствует о низкой общей и безрецидивной выживаемостью.

Анализ экспрессии белков р53 и bcl-2

Инактивация функции белка р53, который является центральным компонентом системы, которая обеспечивает экстренное удаление поврежденных и потенциально опасных для организма клеток (Тюляндин С.А., 2000), является наиболее универсальным молекулярным изменением в различных опухолях человека (Петровичев Н.Н., 2001; Petry B-J, 2008).

Позитивная реакция ядер опухолевых клеток с антителами к р53 обнаружена в 36 случаях, (56,3%). Распределение уровня р53 в выборке непараметрическое. Не установлено корреляции между уровнем р53 и степенью дифференцировки опухоли (р=0,23), а также Т стадией. Вероятность наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах у пациентов с р53-позитивными опухолями оказалась выше, чем у больных с р53-негативными, однако статистическая значимость связи только на уровне тенденции (р=0,08).

При р53-позитивных опухолях вероятность развития рецидива выше, чем при р53-негативных (р=0,01), средняя продолжительность безрецидивного периода составила 3,1±2,1 года, а при р53-негативных – 4,0±1,8 года, различие между группами на уровне тенденции (t-Test, р=0,09). Пятилетняя специфическая и безрецидивная выживаемость представлена в таблицах 1 и 2. По нашим данным р53 является прогностическим маркером рецидива рака гортани, что согласуется с выводами других авторов (H. Izawa и соавт.,1999; B. Khademi и соавт., 2002; R. Vielba и соавт.,2003).

Белок bcl-2 в настоящее время считают одним из основных ингибиторов апоптоза который может способствовать прогрессированию опухоли (Лушников Е.Ф и соавт., 2001). Экспрессия bcl-2 обнаружена в 19 случаях (29,7%). Значимой связи между наличием экспрессии bcl-2 и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы, развитием рецидива болезни не выявлено, р=0,25 и р=0,17 соответственно.

Экспрессия bcl-2 несколько чаще наблюдалась при Т3 стадии, чем при Т2 и Т4, а также в умеренно дифференцированных раках (G2), однако значимой связи между экспрессией bcl-2 и Т стадией, а также со степенью дифференцировки опухоли не выявлено. Пятилетняя специфическая и безрецидивная выживаемость представлена в таблицах 1 и 2.

Анализ коэкспрессии маркеров

У 22 пациентов (34,4%) наблюдалась коэкспрессия белка р53 и высокого уровня Ki-67. У 10 из них развился рецидив заболевания, 7 – умерли от прогрессирования болезни, судьба 3 пациентов не известна. У 6 пациентов с возникшим рецидивом наблюдалась либо экспрессия р53, либо высокий уровень Ki-67. Только у одного из пациентов с рецидивом рака отсутствовала экспрессия белка р53, и был низкий уровень пролиферации опухолевых клеток (индекс Ki-67 равен 29%) в первичной опухоли. В дальнейшем больной умер от прогрессирования опухолевого процесса. Связь коэкспрессии р53 и высокого уровня Ki-67 с развитием рецидива имеет высокую статистическую значимость р=0,016.

У 10 из 19 пациентов с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах наблюдалась коэкспрессия р53 и высокого уровня Ki-67. У остальных 9 пациентов с наличием метастазов был или высокий уровень Ki-67, или позитивная реакция с р53. В группе пациентов с низкой пролиферативной активностью опухолевых клеток и отсутствием экспрессии

белка р53 в опухоли метастазов в регионарных лимфатических узлах не было выявлено. Связь коэкспрессии р53 и высокого уровня Ki-67 с наличием метастазов статистически значима (р=0,04). Анализ специфической выживаемости показал, что коэкспрессия р53 и высокого уровня Ki-67 является фактором неблагоприятного прогноза для жизни пациентов с плоскоклеточным раком гортани. Пятилетняя специфическая и безрецидивная выживаемость представлена в таблицах 1 и 2.

Коэкспрессия bcl-2 и р53 выявлена в 14 случаях, а экспрессия bcl-2 и отсутствие экспрессии р53 - в 5, связь между экспрессией маркеров bcl-2 и р53 не достигала уровня статистической значимости (р=0,06). Во всех случаях с экспрессией bcl-2 и отсутствием экспрессии р53 клиническое течение болезни было безрецидивное, а у 3 из 14 пациентов, опухоли которых экспрессировали оба маркера, развился рецидив заболевания, и один из этих больных умер от прогрессирования опухолевого процесса. Однако статистически значение коэкспрессии bcl-2 и р53 для развития рецидива не достоверно (р=0,16).

В группе пациентов с коэкспрессией bcl-2 и р53 метастазы в лимфатических узлах обнаружены у только у 3 пациентов. Статистически влияние bcl-2 на прогноз при коэкспрессии с р53 не подтверждается (р=0,11 и 0,16).

Связь между уровнем Ki-67 и экспрессией bcl-2 не обнаружена. Средний уровень Ki-67 в группе bcl-2-позитивных опухолей составил 56,3±17,7%, а в группе bcl-2-негативных – 54,4±26,2% (р=0,78).

Результаты анализа факторов ангиогенеза

Факторы ангиогенеза исследованы в 61 случае рака гортани. Рассматривали три параметра – микрососудистую плотность, площадь сечения сосудов и суммарный периметр стенки сосудов в поле зрения микроскопа площадью 0,054 мм.

Средняя микрососудистая плотность составила 19,4±11,2 на поле зрения микроскопа площадью 0,054 мм, медиана – 17, минимум – 6, максимум – 69. Средний суммарный периметр интратуморальных кровеносных сосудов составил 799,1±341,8 µм/0,054 мм2, медиана – 776 µм/0,054 мм2, минимум – 249 µм/0,054 мм2, максимум – 1810 µм/0,054 мм2. Средняя суммарная площадь сосудов составила 1834,9±132,6 м2 /0,054 мм2 (ст. отклонение 1035,8 м2/0,054 мм2 ), медиана - 1775 м2 /0,054 мм2на поле зрения 0,0549 мм2/0,054 мм2, минимальное значение - 397 м2 /0,054 мм2, максимальное - 4796 м2 /0,054 мм2.

Сопоставление характера ангиоархитектоники с клиническими данными выявило значимую связь этого показателя с развитием рецидива. В группе пациентов, у которых в последующем развился рецидив заболевания, средняя микрососудистая плотность и суммарный периметр сосудистой стенки были статистически значимо ниже, чем в группе пациентов без рецидива (р=0,006 и 0,02 соответственно). Так в группе пациентов с рецидивом заболевания средние микрососудистая плотность и суммарный периметр сосудистой стенки составили 13,4±1,1 и 640,7±237,8 µм/0,054 мм2, а в группе без рецидива – 22,5±2,1 и 860,3±358,1 µм/0,054 мм2 соответственно. Рецидив заболевания развился только у одного пациента с высокими показателями микрососудистой плотности и суммарного периметра сосудистой стенки, у остальных 16 пациентов с рецидивом рака эти показатели были низкими. Уровень васкуляризации является значимым признаком развития рецидива (р=0,001).

Значение микрососудистой плотности в опухолях пациентов с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы было меньше, чем без выявленных метастазов, однако разница статистически не достоверна (р=0,41). Отмечается также некоторое повышенное значение суммарного периметра сосудистой стенки в опухолях без выявленных метастазов, чем с наличием метастазов (790,1±331,1 µм/0,054 мм2 и 818,9±372,9 µм/0,054 мм2 соответственно), но без статистической значимости (р=0,76).

Анализ микрососудистой плотности в группах пациентов с различными Т стадиями показал, что с увеличением Т стадии (от Т2 до Т4) увеличивается и значение микрососудистой плотности, однако статистически достоверной зависимости выявить не удалось (р=0,39, 0,28 и 0,18 соответственно). При увеличении Т стадии увеличивается суммарный периметр микрососудов, однако уровень статистической значимости различий между группами с различной Т стадией низкий, только различия между группами Т3 и Т4 имеют статистическую значимость на уровне тенденции (р=0,07).

Микрососудистая плотность в опухолях различной степени дифференцировки также отличалась. Самыми низко васкуляризируемыми опухолями оказались высокодифференцированные раки, а самыми высоко васкуляризированными - умеренно дифференцированные. Однако статистически значимой связи микрососудистой плотности со степенью дифференцировки опухоли не выявлено (р=0,09, 0,14 и 0,26 соответственно). Значимых различий в среднем суммарном периметре сосудистой стенки в опухолях различной степени дифференцировки вывить не удалось. Отмечается только различие между опухолями высокой степени дифференцировки и умеренно дифференцированными на уровне тенденции (р=0,07).

Сравнение средних величин суммарной площади сечения микрососудов не выявила значимых различий в группах с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах и без выявленных метастазов, с развитием рецидива заболевания и без рецидива, а также в группах с различной Т стадией и степенью дифференцировки опухоли. Пятилетняя специфическая и безрецидивная выживаемость см. табл. 1 и 2.

Наши данные согласуются с результатами других авторов, которые показали, что опухоли с высокой микрососудистой плотностью более радиочувствительны, чем с низкой (T. Kanijo и соавт. 2000; O. Ataman и соавт., 2004).

Клиническое значение лечебного патоморфоза опухолей

Сравнительное изучение биоптатов, взятых до лучевой терапии, и операционного материала облученных раковых опухолей гортани выявило снижение пролиферативной активности и нарастание полиморфизма опухолевых клеток, их дистрофию и некроз, продуктивно-склеротические изменения в строме. Глубина описанных изменений была различной и соответствовала степеням лечебного патоморфоза, описанным Г. А. Лавниковой (1974).

Лечебный патоморфоз оценен в 36 случаях. Из них в 8 случаях выявлен патоморфоз II степени, в 19 – III степени, и в 9 – IV степени. Пациенты были разделены на две группы: первая группа с лечебным патоморфозом II степени (22% пациентов) и вторая группа – с патоморфозом III-IV степени (78%). Анализ Ki-67 в этих группах не выявил различий между средними величинами (р=0,84), в группе с лечебным патоморфозом II степени средний уровень Ki-67 был 56,4±22,4%, а в группе с патоморфозом III-IV степени – 58,4±24,5%. Также не выявлено статистически значимой связи степени лечебного патоморфоза с экспрессией циклина D1 (р=0,17). Р53 также не влияет на степень лечебного патоморфоза (р=0,49).

В первой группе, с лечебным патоморфозом низкой степени bcl-2 позитивных опухолей не было, все bcl-2 позитивные опухоли оказались во второй группе, с выраженным лечебным патоморфозом. Различие между группами на уровне тенденции (р=0,07). При статистическом анализе и сравнении этих двух групп различия по показателям микрососудистой плотности, суммарного периметра и суммарной площади сосудов не обнаружено достоверных различий (р=0,14, 0,13 и 0,64 соответственно).

Пятилетняя безрецидивная выживаемость в группе с патоморфозом высокой степенью 84,6%, а в группе с низкой степенью – 48,6% (р=0,05). Средняя безрецидивная продолжительность жизни в первой группе 4,0±0,3 года, а во второй – 2,5±0,6 года (р=0,02).

Особенности прилежащего к опухолям покровного эпителия

В неизмененной слизистой оболочке и в участках с простой плоскоклеточной гиперплазией (без цитологических признаков дисплазии) Ki-67 положительные клетки локализовались исключительно в базальном слое эпителиального пласта, а экспрессия р53 не выявляется, либо наблюдается слабая экспрессия в некоторых клетках базального слоя. При тяжелой дисплазии и карциноме in situ уровень пролиферации клеток резко повышался, и Ki-67 положительные клетки локализовались в эпителиальном пласте от базального слоя до 2/3 толщины при тяжелой дисплазии или занимали эпителиальный пласт целиком при карциноме in situ. В тех случаях, когда инвазивный рак был р53 негативным, экспрессия р53 в участках слизистой оболочки с признаками тяжелой дисплазии или карциномы in situ также отсутствовала. При р53-позитивном инвазивном раке в очагах тяжелой дисплазии и карциномы in situ обнаружена положительная экспрессия р53 в клетках эпителиального пласта, причем в большинстве наблюдений на всей толще эпителиального пласта и в части случаев (преимущественно с картиной тяжелой дисплазии) – на протяжении 2/3 пласта.

Экспрессия bcl-2 в покровном эпителии выявлена только в 5 случаях. Специфическое окрашивание наблюдалось преимущественно в базальном и парабазальном слоях эпителиального пласта. В 4 случаях изменения покровного эпителия соответствовали карциноме in situ, в одном – гиперплазии, а инвазивный рак во всех случаях экспрессировал bcl-2.

Экспрессия циклина D1 выявлялась в 14 случаях с различными изменениями покровного эпителия – от простой гиперплазии до карциномы in situ, в виде ядер единичных эпителиальных клеток. В 2 случаях, с морфологической картиной карциномы in situ, экспрессия циклина D1 была выраженной – 1/3 эпителиального пласта и 2/3 пласта. В обоих случаях клетки инвазивного рака экспрессировали циклин D1, и опухоль клинически проявила агрессивное течение, рецидивировала, и оба пациента погибли от прогрессирования заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, плоскоклеточный рак гортани представляет собой разнородную группу опухолей с разным биологическим и клиническим поведением. Высокая пролиферативная активность опухолевых клеток является показателем биологической агрессивности плоскоклеточного рака гортани – в нашем исследовании уровень экспрессии Ki-67 более 55% и наличие экспрессии циклина D1 коррелировали с низкой специфической и безрецидивной выживаемостью, развитием рецидива заболевания и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах.

Одним из важных морфологических признаков, свидетельствующих об агрессивности рака гортани, является экспрессия р53. В нашей работе позитивная реакция с р53 выявлялась в 56,3% опухолей. Наличие экспрессии р53 в ядрах опухолевых клеток плоскоклеточного рака гортани свидетельствовала о высоком риске развития рецидива заболевания, коротком безрецидивном периоде и низкой безрецидивной пятилетней выживаемостью.

Особенности ангиоархитектоники в опухоли влияли на клиническое поведение рака гортани. Высоко васкуляризированные опухоли с высокими значениями микрососудистой плотности и суммарного периметра сосудистой стенки в нашем исследовании продемонстрировали более спокойное клиническое поведение, чем опухоли с низкой микрососудистой плотностью и небольшим суммарным периметром сосудистой стенки. Так в группе пациентов с микрососудистой плотностью более 17 и суммарным периметром сосудистой стенки более 799 рецидив возник только у одного пациента.

Степень лечебного патоморфоза влияет на безрецидивную выживаемость и среднюю продолжительность жизни до возникновения рецидива. У пациентов с высокой степенью лечебного патоморфоза эти показатели больше, чем у больных с низкой степенью.

Экспрессия р53 и высокий уровень Ki-67 являются маркерами необратимой опухолевой трансформации эпителиальных клеток многослойного плоского эпителия гортани.

ВЫВОДЫ

1. Высокий уровень пролиферации опухолевых клеток является фактором высокого риска наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах и развития рецидива заболевания после комбинированного лечения плоскоклеточного рака гортани. Уровень экспрессии Ki-67 в ядрах более 55% опухолевых клеток связан с низкой специфической и безрецидивной выживаемостью, риском развития рецидива заболевания и наличием пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов. Экспрессия циклина D1 наблюдается в 28,1% случаев и связана с низкой специфической выживаемостью.
2. Экспрессия белка р53 наблюдается в 56,3% случаев рака гортани. Наличие экспрессии р53 опухолевыми клетками является неблагоприятным прогностическим признаком, свидетельствующим о высокой вероятности развития рецидива заболевания и коротком безрецидивном периоде.
3. Коэкспрессия р53 и уровня Ki-67 более 55% наблюдается в 34,4% случаев и является фактором неблагоприятного прогноза, связанного наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, развитием рецидива заболевания, низкой специфической и безрецидивной выживаемостью.
4. Экспрессия раковыми клетками bcl-2 обнаружена в 29,7% случаев, и является фактором благоприятного прогноза, связанным с высокой специфической выживаемостью.
5. Степень васкуляризации и особенности строения кровеносного русла влияют на вероятность развития рецидива заболевания после терапии, на специфическую и безрецидивную выживаемость. Высокий уровень васкуляризации опухоли и разветвленный тип строения кровеносных сосудов являются благоприятными прогностическими признаками. Показатель микрососудистой плотности (менее 17) и суммарного периметра сосудистой стенки (менее 779 µм) связаны с высоким риском развития рецидива заболевания, а также низкой специфической и безрецидивной выживаемостью. Клиническое поведение и прогноз рака гортани не зависит от суммарной площади сосудов.
6. Степень лечебного патоморфоза не зависит от уровня пролиферации опухолевых клеток до терапии, экспрессии р53 и особенностей васкуляризации опухоли. Низкая степень лечебного патоморфоза является прогностическим фактором рецидива и короткого безрецидивного периода при раке гортани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для прогностических целей при плоскоклеточном раке гортани рекомендуется использовать иммуногистохимические маркеры Ki-67 и р53, а также учитывать особенности ангиоархитектоники опухоли. Плоскоклеточные раки с высоким пролиферативным уровнем (Ki-67 более 55%) и наличием экспрессии белка р53 составляют прогностически неблагоприятную группу опухолей с высоким риском рецидива заболевания и низкими показателями выживаемости пациентов.
2. Для оценки характера микроциркуляторного кровеносного русла целесообразно учитывать такие показатели как микрососудистая плотность (МСП) и суммарный периметр сосудистой стенки (СПСС). Опухоли с МСП менее 17 и СПСС менее 779 являются прогностически неблагоприятными и имеют высокий риск развития рецидива, низкую выживаемость.
3. Экспрессия Ki-67 в ядрах эпителиальных клеток, расположенных на уровне 2/3 эпителиального пласта и выше, наличие экспрессии р53 отражают развитие тяжелой дисплазии и карциномы in situ покровного эпителия гортани и могут быть использованы для дифференциальной диагностики предраковых и доброкачественных гиперпластических процессов.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Горбань Н. А., Тен В. П., Панкратов В. А. «Экспрессия антигена Ki-67 и белка р53 как показателей агрессивности течения плоскоклеточного рака гортани». Вопросы онкологии. – 2007. –Т.53. - №6. – С.668-73.

2. Горбань Н. А., Тен В. П., Панкратов В. А. « Прогностическое значение иммуноэкспрессии Ki-67, Р53, BCL-2 и циклина D1в плоскоклеточном раке гортани». Материалы XI Российского Онкологического Конгресса. Москва, 2007г. – С.178.

3. Горбань Н. А., Тен В. П., Панкратов В. А «Ангиогенез в плоскоклеточном раке гортани и его прогностическое значение» - Вопросы онкологии. – 2008. –Т.54. - №6. – С. 732-36.

4. Горбань Н. А., Тен В. П., Панкратов В. А «Прогностическое значение маркеров пролиферативной активности и регуляции апоптоза в плоскоклеточном раке гортани» Российский онкологический журнал. – 2009. - №3. – С.13-17.