Клинико – иммунологические критерии прогноза результативности программ экстракорпорального оплодотворения
На правах рукописи
МАРКИНА
Любовь Алексеевна
клинико–иммунологические критерии прогноза результативности программ экстракорпорального оплодотворения
14.00.01 – Акушерство и гинекология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2008
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Баженова Людмила Григорьевна
доктор биологических наук Зорина Раиса Михайловна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Краснопольская Ксения
Владиславовна
доктор медицинских наук,
профессор Козлов Иван Генрихович
Ведущее учреждение:
ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический
университет».
Защита состоится «____»_______________200_______ г. в _______ч. на заседании диссертационного совета Д. 208.048.01 при ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» (101000, г. Москва, ул. Покровка, д. 22а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии»
Автореферат разослан «____»_________________200 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук,
профессор Серова О.Ф.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Основной составляющей общего здоровья женщины и качества ее жизни является репродуктивное здоровье, а одним из важнейших его компонентов – способность к зачатию, вынашиванию и рождению детей. Утрата этой способности – трагедия семьи и общества, и с этих позиций бесплодие в браке – это современная медико-социальная проблема, требующая дальнейшего изучения. Современные подходы к диагностике и лечению бесплодных супружеских пар основаны на достижениях фундаментальных наук в области изучения молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе реализации процесса репродукции у человека (Сухих Г.Т., 2008). Метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в настоящее время – один из наиболее эффективных методов лечения как женского, так и мужского бесплодия. Потребность в этом методе высока в связи с тем, что в последние годы значительно расширился перечень показаний к применению ЭКО (Смольникова В.Ю., Леонов Б.В., 2002).
В последнее время все большее внимание уделяется изучению роли цитокинов и универсальных регуляторных субстанций в механизмах координации различных функций человеческого организма. К такому классу соединений относятся белки семейства макроглобулинов, играющие существенную роль на всех этапах реализации репродуктивной функции. Это позволяет рассматривать изучение их регуляторных свойств при ЭКО в качестве перспективного направления для решения задач по повышению результативности программ ЭКО, поскольку ряд авторов рассматривает их в качестве прогностических и диагностических критериев не осложненного течения беременности (Зорин Н.А., 2005; Maltseva N.V., Zorin N.A., 1997; Zorin N.A., 2005; Armstrong P.B., Quigley J.P., 1999; Birkenmeier G., 2001).
Цель настоящего исследования состояла в определении прогностических критериев результативности программ экстракорпорального оплодотворения на основе оценки клинических и иммунологических показателей при трубно-перитонеальном бесплодии воспалительного генеза.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
1. Оценить фолликулогенез у участниц программ ЭКО в ответ на стимуляцию суперовуляции в зависимости от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.
2. Изучить сывороточное содержание цитокинов (ИЛ-1,ИЛ-6, ФНО-, ИНФ-), белков острой фазы: альфа-2-макроглобулина (МГ), ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ), лактоферрина (ЛФ), антитрипсина (АТ), альбумина и специфических комплексов: МГ-IgG, ЛФ- IgG и Плазмин-МГ (ПЛ-МГ) у участниц программ ЭКО в зависимости от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.
3. Исследовать сывороточное содержание цитокинов, белков острой фазы и специфических комплексов в разные периоды проведения программы ЭКО (до программы, в день проведения TVP, на 15 день после эмбриотрансфера) у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза, с оценкой значимости исследуемых показателей в прогнозе результативности программ ЭКО.
4. Определить уровни цитокинов, белков острой фазы и специфических комплексов в составе фолликулярной жидкости и оценить их связь с результативностью программ ЭКО.
5. Провести сравнительную оценку изученных показателей при индуцированной и физиологической беременности.
Научная новизна.
Впервые определены уровни ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина и специфических комплексов (МГ–IgG, ЛФ– IgG и ПЛ-МГ) в составе фолликулярной жидкости, а также их прогностическая значимость.
Впервые установлено, что при индуцированной беременности на 15 день гестации снижение содержания трофобластического 1-глобулина сопровождается повышением уровня ассоциированного с беременностью -2-гликопроте-ина, в сравнении с физиологической беременностью. Выявленные закономерности в показателях двух основных белков беременности на ранних этапах гестации при индуцированной беременности обосновывают механизмы сохранения ее на этапе раннего эмбриогенеза в позитивных программах ЭКО: первичная несостоятельность фетоплацентарного комплекса компенсируется реакцией иммунной системы матери, обеспечивая сохранение беременности.
Выявлена статистически значимая взаимосвязь результативности программ ЭКО с уровнями цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1) в составе фолликулярной жидкости, а также концентраций АБГ и цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1) в сыворотке крови, определяемых на 15 день после эмбриотрансфера.
Практическая значимость работы. Полученные результаты продемонстрировали значимость определяемых белков, цитокинов и специфических комплексов у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза для прогноза последующей беременности.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Количество полученных ооцитов, общее количество и качество эмбрионов, а также процент оплодотворения эмбрионов у женщин, принявших участие в программах ЭКО, зависят от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий в анамнезе и давности его последнего обострения.
2. Исходно низкий уровень лактоферрина (менее 1,5 мг/л), повышенное содержание в фолликулярной жидкости ИЛ-6 (32,8±9,9) и ИЛ-1 (3,3±1,1) и повышение в динамике в период раннего эмбриогенеза сывороточных концентраций белков беременности: АБГ (более 0,03 г/л), ТБГ (более 30 нг/мл), острофазового белка – лактоферрина (более 2,0 мг/л), иммуноглобулина G (более 10 г/л) является хорошим прогнозом для последующей реализации репродуктивной функции.
3. Индуцированная беременность у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза характеризуется низким содержанием трофобластического -1-глобулина (27,97±7,56 нг/мл) в период раннего эмбриогенеза, в сравнении с физиологически наступившей беременностью (133,0±24,61 нг/л). Это свидетельствует о первичной несостоятельности фетоплацентарного комплекса, которая компенсируется реакцией иммунной системы матери в форме повышения уровня ассоциированного с беременностью -2-гликопротеина (до 0,059±0,013 г/л), обеспечивая условия сохранения беременности.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на III Республиканской конференции «Актуальные проблемы эндокринологии» – Москва, 2003; 9-ом Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» – Москва, 2007; 2-ой Российской конференции «Иммунология репродукции» - Москва, 2007; 1-ой Всероссийской конференции «Проблемы женского здоровья и пути их решения» – Москва, 2007; первого регионального научного форума «Мать и дитя» – Казань, 2007, а также на межрегиональных, областных и городских конференциях.
Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения. Результаты исследования и основные рекомендации, вытекающие из них, используются в лечебной практике МЛПУ «Зональный перинатальный центр» города Новокузнецка и учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии ГОУ ДПО «НГИУВ Росздрава». Основные рекомендации включены в семинары и лекции для врачей-курсантов, врачей-интернов, клинических ординаторов и аспирантов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав, посвященных анализу данных, полученных в ходе работы, обсуждение результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами, 10 рисунками. Библиография включает 183 литературных источника, из них 48 отечественных и 135 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Дизайн исследования представлен на рис.1.
Рис.1. Дизайн исследования
Основную группу составили 45 участниц программ экстракорпорального оплодотворения с трубно-перитонеальным фактором бесплодия воспалительного генеза. Участницы программ включались в исследование по критериям включения и исключения и были подобраны для сопоставимости групп, в зависимости от результативности программ ЭКО: 22 (48,9%) пациентки имели результативные программы и 23 (51,1%) женщины входили в оппозитную по наступлению беременности группу. Средний возраст пациенток с трубно-перито-неальной формой бесплодия воспалительного генеза составил 30,6 ± 0,5 лет; 18 (40%) пациенток находились в раннем репродуктивном возрасте (от 25 до 29 лет), при этом одна (2,22%) женщина была моложе 25 лет. В позднем репродуктивном возрасте (от 30 до 34 лет) были 21(46,67%) пациентка, из них старше 35 лет – 4 (8,89%) и старше 40 – 1 (2,22%). Средний возраст менархе соответствовал 12,2±0,23 годам, при этом своевременное наступление менархе (от 11 до 14 лет) отмечено у 37 (82,2%) женщин, раннее (с 10 лет) – у 4 (8,88%) и позднее наступление менархе (с 16 лет) установлено у 3 (6,7%) пациенток. Данные анамнеза свидетельствовали о наличии нарушений менструального цикла по типу олигоменореи – у 8 (17,8%) пациенток, гиперполименореи – у 4 (8,9%) и альгоменореи – у 9 (20%). Продолжительность бесплодия: первичного – у 23 (51,1%) пациенток и вторичного – у 22 (48,9%), варьировала от 2 до 16 лет, составляя в среднем 7,0±0,5 лет. У 13 (28,9%) женщин в анамнезе были проведены реконструктивно-пластические операции (сальпингостоматопластика, сальпингоадгезиолизис, адгезиолизис), которые не завершились восстановлением естественной фертильности, при этом у 6 (46,1%) из них в последующем возникли внематочные беременности. У 7 (15,6%) пациенток данной группы в анамнезе были роды, двое (4,4%) из которых закончились оперативным родоразрешением, путем Кесарева сечения. Прерывание первой беременности медицинским абортом отмечено у 22 (48,9%) пациенток, при этом только у 6 (27,3%) из 22 женщин в послеабортном периоде проводилась реабилитационная терапия.
Согласно данным анамнеза, у 18 (40%) женщин было установлено наличие экстрагенитальной патологии: тонзиллит – у 3(6,7%), анемия – у 4(8,9%), хронический гастрит – у 3 (6,7%), хронический холецистит – у 1 (2,2%). Патология щитовидной железы наблюдалась у 7(15,6%) женщин, из них диффузный зоб – у 4 (8,8%), гипотиреоз – у 3 (6,7%). Состояние функций щитовидной железы было компенсировано к моменту начала программ экстракорпорального оплодотворения.
В структуре гинекологической заболеваемости у пациенток, включенных в данную группу, были: сальпингоофорит – у 27 (60,0%), хронический эндометрит – у 10 (22,2%), перенесенный в анамнезе пельвиоперитонит – у 5 (11,1%) и тубо-овариальный абсцесс – у 3 (6,6%).
Гормональный фон в этой группе женщин до начала проведения программ представлен следующими значениями: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) – 8,65±0,69 мМЕ/л; лютеинизирующий гормон (ЛГ) – 7,0±0,69 мМЕ/л; эстрадиол (Е2) – 39,54±3,27 пг/мл; прогестерон – 40,16±3,83 Нм/л; уровень пролактина – 383,42±25,24 мМЕ/л. Наряду с этим, было отмечено значимое повышение уровня прогестерона у пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия, имевших давность обострения воспалительного процесса от 3-х до 5 лет (53,75±8,26 Нм/л), в сравнении с теми, кто перенес последнее обострение давностью до 3-х лет (30,12±5,2 Нм/л р=0,0361).
Группа сравнения представлена 15 беременными женщинами репродуктивного периода (25±2,08 лет), не принимавших с контрацептивной целью гормональные препараты в анамнезе. У пациенток данной группы беременность наступила в естественных циклах, срок гестационного периода соответствовал 3–4 неделям беременности.
Контрольная группа была представлена 28 практически здоровыми женщинами репродуктивного возраста (средний возраст 24±1,2 лет), обследованных во II фазу менструального цикла, которые не принимали эстроген-гестагенные препараты с контрацептивной или регуляторной целями.
Все клинико-лабораторные исследования выполнялись после получения информированного согласия обследуемых женщин и включали:
1. Клиническое обследование пациенток, трансвагинальное сканирование органов малого таза, определение уровня ФСГ, ЛГ, пролактина, ХГЧ, эстрадиола и прогестерона методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов «Human» (Германия) и «Alcor bio» (Санкт Петербург).
2. Иммунохимическое исследование:
– определение уровней белков семейства макроглобулинов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости методом низковольтного ракетного иммуноэлектрофореза; а содержание АБГ в фолликулярной жидкости – методом ИФА с использованием авторской тест системы (Зорин Н.А. и соавт.,1992);
– исследование уровня IgG в сыворотке крови и фолликулярной жидкости – методом Mancini (1965);
– определение уровня иммунных комплексов МГ-IgG в сыворотке крови и фолликулярной жидкости ИФА-методом;
– концентрации интерлейкинов, ТБГ и ЛФ – ИФА-методом, с использованием тест систем «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).
Процедуры статистического анализа выполнялись с помощью статистических пакетов SAS 9, SPSS-16 и InStat 2.0 (Sigma, США). Проверка нормальности распределения признаков в группах сравнения проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова и Шапиро Уилка. Парное межгрупповое сравнение показателей производилось по критерию параметрического дисперсионного анализа, а в случае отсутствия нормальности распределения признаков, использовались непараметрические критерии Краскела-Валлиса и Ван дер Вардена. Для оценки взаимосвязи между результирующей качественной переменной и набором качественных и количественных предикторов, использовался метод логистической регрессии. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты проведенного исследования установили зависимость фолликулогенеза в ответ на стимуляцию суперовуляции у участниц программ с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза от давности последнего обострения воспалительного процесса. При более длительной ремиссии (более 5 лет) количество преовуляторных фолликулов было максимальным: 19,06±0,49, что значимо (р=0,032) больше, чем в подгруппе пациенток с последним обострением воспалительного процесса до 3-х лет (17,23±0,92). Аналогичная тенденция выявлена и при определении количества полученных ооцитов, но при отсутствии статистически значимой разницы между группами. В подгруппе с последним обострением более 5 лет (16,18±0,58) их было больше на 14%, чем в подгруппе с обострением воспалительного процесса менее 3-х лет (13,94±1,11). Процент оплодотворения полученных ооцитов не зависел от давности последнего обострения воспалительного заболевания матки и придатков.
Наряду с этим, нами был установлен значимо низкий уровень прогестерона (30,12±5,2 Нм/л) во II фазу предшествовавшего программе цикла и ХГЧ на 15-й день после эмбриотрансфера (72,71±34,43 МЕ/л) у пациенток, имевших последнее обострение воспалительного заболевания до 3-х лет перед вступлением в программу ЭКО. Кроме того, установлена зависимость уровня белка -ХГЧ от давности перенесенного обострения воспалительного процесса. При давности последнего обострения до 3-х лет уровень -ХГЧ был значимо ниже (72,71± 34,43 МЕ/л;), по сравнению с более отдаленными сроками перенесенного воспалительного процесса – свыше 5-ти лет (244,63±45,93 МЕ/л; р=0,0231).
Корреляционный анализ показал, что количество, а главное – качество эмбрионов, напрямую зависело от уровня альфа-1-антитипсина (АТ) и альфа-2-макроглобулина (МГ) в сыворотке крови пациенток, определяемого до начала проведения программ ЭКО (r=0,673; р<0,001 и r=0,484; р<0,014, соответственно), а также от концентрации альбумина в фолликулярной жидкости (r=0,348; р<0,02). Чем выше были концентрации АТ и МГ и комплексов МГ– IgG в сыворотке крови, определяемых до программ ЭКО, тем больше эмбрионов хорошего качества мы получали. В то же время, высокая концентрация ФНО-, IgG и в сыворотке крови женщин до вступления в программу коррелировала с меньшим количеством полученных эмбрионов и более низкими их качественными характеристиками (r=-0,416, р<0,04; r=-0,416, р<0,04 соответственно).
Проведенное исследование позволило выявить, что значимым в определении позитивного исхода программ является не только характеристики фолликулогенеза в ответ на стимуляцию суперовуляции, но и характер перенесенного воспалительного заболевания в анамнезе у пациенток с трубно-перитонеаль-ным бесплодием воспалительного генеза, а также давность перенесенного обострения. Чем ранее отзвучало обострение (более 5 лет), тем позитивнее мы получили ответ на проведенную стимуляцию суперовуляции (большее количество преовуляторных фолликулов и полученных ооцитов). Общее количество эмбрионов было так же больше и лучше были качественные показатели.
Полученные нами данные наглядно демонстрируют, что результативность программ определена метаболическими изменениями, происходящими в организме женщины как до вступления программу, так и после переноса эмбриона.
Белки, цитокины и специфические комплексы в сыворотке крови
и фолликулярной жидкости участниц программ ЭКО
Установлено, что у женщин до вступления в программу ЭКО сывороточные уровни общего белка и альбумина, АТ, ЛФ, -ИФН, ФНО- и специфических комплексов (МГ-IgG, ЛФ-IgG, ПЛ-МГ) были статистически значимо выше, чем в группе здоровых небеременных женщин (табл. 1).
Выявлена зависимость некоторых из вышеперечисленных показателей (общий белок, ЛФ, иммунокомплексы МГ-IgG) от давности последнего обострения воспалительного процесса гениталий. Так при давности обострения воспаления гениталий до 3-х лет содержание общего белка было максимальным в сравнении с женщинами, давность обострения у которых была более 5 лет (82,58±2,22 г/л и 75,94±2,63г/л, р<0,0001). Содержание иммунокомплексов МГ–IgG в группе с обострением воспалительного процесса гениталий давностью более 5 лет назад также снижалось до 0,66±0,15 г/л в сравнении с показателями при обострении воспалительного процесса гениталий менее 3-х лет (1,01±0,095; р=0,05)и было сопоставимо с показателями здоровых небеременных женщин (р=0,003).
Таблица 1.
Содержание белков, ФНО-, специфических комплексов в сыворотке крови участниц ЭКО до вступления в программу в сравнении с показателями
у здоровых небеременных женщин
| Изучаемые показатели | Группы обследованных женщин | ||
| здоровые небеременные (n=43) | пациентки до программы ЭКО (n=25) | достоверность различий (р) | |
| Общий белок, г/л | 70,12±1,25 | 79,26±1,49 | p<0,0001 |
| Альбумин, г/л | 46,38±0,4 | 50,00±0,32 | р< 0,0001 |
| -1-антитрипсин, г/л | 2,23±0,06 | 2,52±0,12 | p=0,02 |
| Лактоферрин, мг/л | 1,02±0,12 (0,71-1,32) | 1,53±0,2 | p=0,023 |
| ФНО-, пкг/мл | 0,76±0,11 | 1,5±0,3 | р=0,01 |
| -ИФН, пкг/мл | 10,4±1,7 | 29,5±7,5 | р=0,007 |
| МГ-IgG, мг/л | 0,71±0,04 | 1,18±0,27 | р=0,02 |
| ПЛ-МГ, мг/л | 0,87±0,05 | 1,5±0,26 | р=0,003 |
| ЛФ- IgG, мг/л | 0,94±0,1 | 1,46±0,11 | р=0,001 |
Примечание: р - статистически значимые различия показателей в исследуемых группах; в скобках указаны стандартные отклонения значений для лактоферрина.
При обострении воспалительного процесса, отзвучавшего менее 3-х лет до начала программ, сывороточные показатели ЛФ у женщин имели максимальные значения, в сравнении с давностью обострения гениталий более 5-ти лет (1,83±0,22мг/л и 1,21±0,36, р=0,023). Сывороточные концентрации ингибиторов протеиназ – АТ и МГ не зависели от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.
Полученные данные позволяют предположить, что на момент вступления в программы ЭКО женщины с трубно-перитонеальным бесплодием, в большей или меньшей степени, имели остаточные явления воспаления (особенно, если оно было отзвучало менее 3 лет назад) и характеризовались определенным дисбалансом цитокинового и белкового профиля. Применение стимуляции суперовуляции приводит к ряду метаболических изменений, приводящих к нормализации некоторых показателей и, таким образом, косвенно способствующих наступлению беременности.
Нами установлено, что проведенная стимуляция суперовуляции не влияла на показатели цитокинов, а также специфических комплексов (МГ–IgG, ЛФ–IgG и ПЛ-МГ), содержание IgG, АТ, а также ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина и средний уровень лактоферрина. Концентрации вышеперечисленных белков не зависели и от характера перенесенного воспалительного процесса. Вместе с тем, гормональная подготовка способствовала снижению в сыворотке крови содержания общего белка (с 79,26±1,49г/л до 70,09± 1,1г/л), альбумина (с 50,00±0,32г/л до 46,75±0,28г/л) и повышала уровень ингибитора протеиназ – -2-макроглобулина (с 2,18±0,11г/л до 2,76±0,12г/л). При этом снижение уровней общего белка и альбумина не зависело от давности последнего обострения воспалительного процесса. В то время, максимальное повышение МГ и снижение ЛФ в сыворотке крови участниц программ ЭКО отмечалось при давности обострения воспалительного процесса гениталий до 3-х лет (МГ– от 2,18±0,16г/л до 2,87±0,2г/л; р=0,025 и ЛФ от 1,82±0,22г/л до 1,16±0,12г/л, р=0,008).
Отмеченное нами повышение уровня МГ нельзя объяснить влиянием повышенного уровня половых стероидов при стимуляции суперовуляции, поскольку мы не установили одновременного повышения уровня АБГ, который также является эстрогензависимым белком. Возможно, в данном случае повышение содержания МГ связано не столько с гормональным фоном, сколько с метаболическими реакциями, характерными для недавно перенесенного воспалительного процесса.
Оценивая выявленные изменения ряда сывороточных показателей через 15 дней после эмбриотрансфера, мы проанализировали их в зависимости от результативности программы и сравнили с показателями при физиологической беременности. Оказалось, что концентрации общего белка и острофазовых белков: альбумина, МГ и АТ не зависели от результативности программы ЭКО и не отличались от показателей, характерных для физиологической беременности в одинаковых сроках гестации. Подобные результаты, в определенной степени, предсказуемы – все три острофазовых белка являются белками-транспорте-рами, активно выводящими целый ряд метаболитов из циркуляции, и их уровни зависят от слишком многих факторов. Совершенно иные закономерности были выявлены для показателей основного белка беременности – АБГ, являющегося резервным ингибитором протеиназ. Нами установлено, что уровни АБГ, определяемые на 15 день после эмбриотрансфера, в результативных программах были значимо выше, чем в программах, оппозитных по наступлению беременности, при этом концентрация АБГ в группе при индуцированной беременности была в 3 раза выше, чем при физиологической беременности и не зависела от количества плодов (рис. 2).
Наряду с этим, нами установлено повышение в 29 раз концентрации ТБГ через 15 дней после эмбриотрансфера в результативных программах, по сравнению с уровнями на день TVP (в результативных программах: 0,94±0,51 нг/мл – 27,97±7,56 нг/мл; р=0,005; в программах оппозитных по наступлению беременности: 0,67±0,29 нг/мл – 0 нг/мл). Кроме того при индуцированной беременности концентрация ТБГ была в 4,7 раза ниже его содержания при физиологически наступившей беременности (133,37±24,61 нг/мл; р=0,0001). Вместе с тем, зависимости концентрации ТБГ от исхода беременности и количества плодов нами не выявлено. Установленные закономерности указывают на то, что формирующаяся фетоплацентарная система плода при индуцированной беременности, в целом, не состоятельна, и повышение уровней АБГ, способного стимулировать пролиферацию, является компенсаторной реакцией организма матери, позволяющей сохранить плод.
Рис.2. Сравнительный уровень АБГ (г/л) в сыворотке крови
при физиологической беременности и на разных этапах проведения программ ЭКО, в зависимости от ее результативности.
При изучении динамики сывороточных уровней цитокинов нами установлено, что при индуцированной беременности уровни цитокинов на 15 день после эмбриотрансфера были сопоставимы с показателями, полученными в день проведения TVP (табл.2). В то же время, при нерезультативных программах отмечено статистически значимое снижение концентраций ИЛ-6 и ФНО-.
Таким образом, выявленные закономерности свидетельствуют о том, что при результативных программах запускаются компенсаторные механизмы, способствующие имплантации: повышенные уровни ИЛ-1 противодействуют инфекции и тем самым предотвращают ранние репродуктивные потери, сниженные уровни ИФН- косвенно улучшают доступность рецепторов, что компенсирует фетоплацентарную недостаточность, равно как и повышенные концентрации ИЛ-6.
Таблица 2.
Динамика сывороточных уровней цитокинов у женщин до программы,
в день TVP, на 15 день после эмбриотрансфера в зависимости
от результативности ЭКО и при физиологической беременности
| Показатели | Динамика концентраций цитокинов | |||||
| до программы, n=45 | TVP | на 15 день эмбриотрансфера | физиологи-ческая беременность n=15 | |||
| ЭКО «+» n=22 | ЭКО «-» n=23 | ЭКО «+» n=22 | ЭКО «-» n=23 | |||
| ИЛ-6 | 53,5±34,1 | 27,8±29,9 | 16,9±10,3 | 46,3±18,5 | 6,1±2,6* | 5,9±3,2** |
| ИЛ-1 | 8,9±1,4 | 9,5±2,5 | 6,2±0,9 | 9,1±1,5 | 8,7±0,5 | 4,5±0,4** |
| ФНО- | 1,5±0,3 | 1,2±0,3 | 1,5±0,3 | 1,9±0,5 | 0,7±0,5* | 1,2±0,4** |
| -ИФН | 29,5±7,5 | 17,01±5,88 | 20,99±4,06 | 17,45±4,40 | 22,5±7,08 | 31,1±13,6** |
Примечание: *– достоверность различий между группами ЭКО «+» и ЭКО «-»;
**– достоверность различий между индуцированной и физиологической беременностью.
Сывороточные концентрации специфических комплексов, определяемых на 15 день после эмбриотрансфера в результативных программах оставались практически неизменными, а в нерезультативных – значимо снижались, по сравнению с их уровнем в день проведения TVP (рис.3).
Рис. 3. Динамика содержания специфических комплексов в сыворотке крови женщин в день проведения TVP и на 15 день после эмбриотрансфера,
в нерезультативных программах ЭКО.
Рис. 4. Динамика содержания специфических комплексов в сыворотке крови женщин в день проведения TVP и на 15 день после эмбриотрансфера,
в результативных программах ЭКО.
Принимая во внимание транспортную роль комплекса ПЛ-МГ, способного активно переносить вещества в ткани эмбриона и стимулировать его рост и развитие, можно предположить, что выявленные нами высокие базовые уровни изученных комплексов при результативных программах ЭКО являются компенсаторным механизмом, позволяющим сохранить плод. А их низкие уровни в период раннего эмбриогенеза (особенно ЛФ–IgG) в нерезультативных программах ассоциируются с невынашиванием беременности.
Нами установлено, что определяемая на 15 день после эмбриотрансфера сывороточная концентрация ЛФ у пациенток с индуцированной беременностью значимо повышалась (р<0,0001), по сравнению с его уровнем в день TVP и была статистически значимо выше сывороточного уровня ЛФ при физиологически наступившей беременности такого же гестационного периода физиологической беременности – 1,54±0,15 мг/л. В нерезультативных программах ЭКО сывороточное содержание ЛФ оставалось неизменным в течение всего периода исследования (рис. 5).
Рис. 5. Динамика сывороточной концентрации лактоферрина (мг/л)
на разных этапах проведения программ ЭКО, в зависимости
от результативности и в сравнении с физиологической беременностью.
Повышение уровней ЛФ может объясняться тем, что данный белок является не только острофазовым реактантом, но и обладает мощными противовоспалительными и антимикробными свойствами, а также является активным транспортером кислорода в ткани.
Это особенно важно для женщин с бесплодием трубно-перитонеальной формой бесплодия воспалительного генеза, страдающих, как показывают наши исследования, от остаточных явлений перенесенного ранее воспаления и характеризующихся целым рядом отклонений в микроокружении имплантирующегося эмбриона и формирующегося фето-плацентарного комплекса. Мы считаем, что продолженное повышение содержания ЛФ у женщин с индуцированной беременностью является компенсаторным механизмом, а не показателем острофазовой реакции.
Нами установлено, что по белковому составу и показателям биологически активных веществ фолликулярная жидкость во многом была идентична сыворотке крови. При этом концентрации макроглобулина (0,182±0,13 г/л) и антитрипсина (0,233±0,01 г/л) были ниже сывороточных в 15 и 12 раз соответственно, а содержание лактоферрина (0,470±0,05 г/л) в 3 раза меньше его значений в сыворотке крови. Зависимости концентраций изученных нами показателей в фолликулярной жидкости от характера перенесенного воспалительного заболевания в анамнезе и срока давности его обострения мы не выявили.
Анализ полученных данных установил, что средние концентрации всех изучаемых белков и специфических комплексов в составе фолликулярной жидкости не зависели от исхода проведенных программ ЭКО.
При этом средние уровни цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1) в фолликулярной жидкости у пациенток результативных программ были значимо выше в сравнении с теми, у кого беременность не наступила, ИЛ-6 в результативных программах – 32,8±9,9 пкг/мл, а в нерезультативных – 10,5±2,5 пкг/мл (р=0,038); ИЛ-1 в позитивных программах – 3,3±1,1 пкг/мл, а в оппозитных по наступлению беременности – 0,7±0,4 пкг/мл (р=0,044). Показатели ФНО- и -ИФН в составе фолликулярной жидкости не зависели от результативности программы.
Данные результаты подтверждают высказанные ранее предположения о стимулирующей роли ИЛ-6 и защитной ИЛ-1 для развития плода. Вероятно, данные цитокины не только способствуют успешной имплантации, но и оказывают благотворное влияние на развитие самого ооцита. Учитывая их высокие исходные уровни при успешных программах ЭКО, можно предположить их влияние на формирование более полноценных ооцитов с более высоким репродуктивным потенциалом и, вполне возможно, с гораздо меньшим количеством хромосомных аномалий, которые являются одной из основных причин ранних выкидышей. Косвенным подтверждением тому могут служить выявленные в работе высокие концентрации иммунокомплексов в фолликулярной жидкости при негативном исходе программ ЭКО. Кроме того, это может свидетельствовать о накоплении большого количества поврежденных белков-транспортеров (МГ и ЛФ) в процессе избыточного окисления в зоне воспаления, которые не способны выполнять свои функции и, в силу этого, распознаются иммунной системой как частично чужеродные, что и приводит к образованию комплексов.
ВЫВОДЫ
1. Количество полученных преовуляторных фолликулов и ооцитов, количество и качество эмбрионов, а также процент оплодотворения у женщин, принявших участие в программе ЭКО, зависят от давности обострения воспалительного заболевания гениталий в анамнезе.
2. Содержание общего белка, альбумина, антитрипсина, специфических комплексов (МГ-IgG, ЛФ-IgG, ПЛ-МГ) и цитокинов (-ИФН и ФНО-) в крови пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза, до вступления в программы ЭКО, статистически значимо повышено в сравнении со здоровыми небеременными женщинами.
3. У пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием при давности перенесенного обострения воспалительного процесса до 3-х лет перед вступлением в программы ЭКО, имеются исходно высокие сывороточные значения общего белка и лактоферрина, а в ответ на стимуляцию суперовуляции отмечается значимое повышение уровня альфа-2-макроглобулина и снижение лактоферрина в сыворотке крови.
4. У женщин с наступившей беременностью в результате применения программы ЭКО наблюдается исходно нормальный уровень сывороточного лактоферрина (менее 1,5 мг/л); повышенное содержание некоторых цитокинов в фолликулярной жидкости (ИЛ-6 > 22 пкг/мл, ИЛ-1 > 2,0 пкг/мл) и увеличение концентраций белков беременности (АБГ > 0,03 г/л и ТБГ > 30 нг/л), а также лактоферрина > 2,0 мг/л и IgG > 10 г/л в сыворотке крови на 15-й день после эмбриотрансфера.
5. При индуцированной беременности на 15 день после эмбриотрансфера сывороточные концентрации АБГ и ЛФ выше (в 4 и 1,9 раза соответственно), а ТБГ в 4,7 раза ниже, в сравнении с таковыми при физиологической беременности сроком 3-4 недели гестации.
Практические рекомендации
1. При определении до начала программы сывороточных уровней ФНО- – более 1,0 пкг/мл., концентрации лактоферрина – более 1,3 мг/л., общего белка – более 73 г/л., альбумина – более 47 г/л и антитрипсина – более 2,4 г/л необходимо рекомендовать дополнительное обследование и проведение курса противовоспалительной и реабилитационной терапии.
2. Уровни цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1) в составе фолликулярной жидкости могут использоваться в качестве дополнительного прогностического критерия результативности программ ЭКО. Показатели ИЛ-6, превышающие 22 пкг/мл, а ИЛ-1 – 2,0 пкг/мл, определяют высокую вероятность позитивного исхода. Низкие уровни данных цитокинов (ИЛ-6 < 13 пкг/мл и ИЛ-1 < 1,0 пкг/мл) свидетельствуют о нерезультативности программ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Маркина Л.А., Зорина В.Н., Зорина Р.М. Альфа-2-макроглобулин и его комплексы с IgG в сыворотке крови у женщин при экстракорпоральном оплодотворении// Материалы 1-й Всероссийской конференции «Проблемы женского здоровья и пути их решения». – М., 2007. – С.35.
2. Мальцева Н.В., Маркина Л.А., Баженова Л.Г., Чирикова Т.С., Белогорлова Т.И. Сравнительный анализ содержания -2-макроглобулина и ассоциированного с беременностью -2-гликопротеина в сыворотке крови женщин при экстракорпоральном оплодотворении.// Сибирский медицинский журнал – 2007. –Т.22. - №4. – С.60–65.
3. Зорина В.Н., Маркина Л.А., Архипова С.В., Зорина Р.М., Зорин Н.А., Рябичева Т.Г. Уровни цитокинов, альфа-2-макроглобулина и его активной транспортной формы у женщин с бесплодием трубного генеза при экстракорпоральном оплодотворении.// Медицинская иммунология. – 2007. – Т.9. – №4-5. – С.389–397
4. Маркина Л.А., Баженова Л.Г., Зорина Р.М., Рыжикова С.Л. Белки и провоспалительные цитокины фолликулярной жидкости у женщин с бесплодием в программах ЭКО и ПЭ// Материалы 2 Российской конференции «Иммунология репродукции». – Сочи, 2007. – Р.1.–С.16.
5. Маркина Л.А., Мальцева Н.В., Баженова Л.Г., Зорина Р.М., Юркина Э.А. Ассоциированный с беременностью альфа-2-гикопротеин и трофобластический -глобулин при экстракорпоральном оплодотворении// Материалы 9 Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М., 2007. – С.158–159.
6. Маркина Л.А., Зорина В.Н., Шрамко С.В., Зорина Р.М., Архипова С.В., Баженова Л.Г. Содержание реактантов воспаления в сыворотке крови женщин при воспалительных заболеваниях придатков матки и участвующих в программе экстракорпорального оплодотворения.// Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. – №2. – С.15–17.
7. Л.А. Маркина, Р.М. Зорина, В.Н. Зорина, Л.Г. Баженова, С.В. Архипова, Т.Г. Рябичева, А.Н. Полукаров «Белки, цитокины и антигенспецифические иммунокомплексы фолликулярной жидкости и сыворотки крови у женщин при экстракорпоральном оплодотворении».// Вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии.–2008.– Т.7 - №6.– С.23–25.
