Cравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro
На правах рукописи
ОГОРОДНИКОВА
Мария Владимировна
CРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА
ПРОИЗВОДНЫМИ ПЛАТИНЫ IN VITRO
14.00.14 – Онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (директор – академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников
доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, чл. – корр. РАМН, профессор А.В. Караулов
доктор биологических наук, профессор О.А. Бочарова
Ведущая организация:
ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт
им. П.А. Герцена Росмедтехнологий
Защита состоится «____» ________________2009 г. в____часов на заседании диссертационного совета Д.001.017.01 Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.
Автореферат разослан «____»_____________2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин
Введение
Актуальность проблемы. Установлено, что результатом действия большинства химиотерапевтических препаратов является индукция последовательных необратимых событий, приводящих опухолевую клетку к гибели путем апоптоза. Особое место в этом аспекте занимают препараты, относящиеся к группе комплексных соединений платины.
С момента открытия цисплатина Б. Розенбергом в 1960 году как соединения, обладающего противоопухолевой активностью, прошло около 45 лет, за это время интерес к поиску новых комплексных соединений платины возрос. В настоящее время, помимо цисплатина, широко используются такие препараты как карбоплатин, оксалиплатин, а также проходит испытания ряд новых комплексных соединений платины третьего поколения таких как сатраплатин, недаплатин, ZD0473 (JM 473), BBR3464.
Среди комплексных соединений двухвалентной платины большой интерес представляет отечественный препарат циклоплатам - S(-)-малатоамин (циклопентиламин) платино(II), который был синтезирован П.А. Чельцовым в лаборатории координационных соединений платиновых металлов Института общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН. Циклоплатам обладает хорошей растворимостью в воде, широким спектром и высокой противоопухолевой активностью, отсутствием нефротоксичности и перекрестной резистентности с известными платиновыми и некоторыми цитостатиками других групп. Лиофилизированная форма циклоплатама, разработанная в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, разрешена для медицинского применения при раке яичников, мезотелиоме плевры и множественной миеломе.
Молекулярные механизмы действия циклоплатама мало изучены. Как и у других препаратов комплексных соединений платины, мишенью цитотоксического действия циклоплатама является суперспиральная ДНК. При сравнительном изучении в опытах in vitro циклоплатам в терапевтической концентрации оказался более эффективным при действии на ДНК, чем цисплатин. При этом воздействие циклоплатама на ДНК клеток лейкоза in vivo может быть обнаружено уже через 24 часа. В механизмах действия циклоплатама показано, что он модулирует -адренорецепторную активность плазматической мембраны. Имеются данные об ингибирующем влиянии циклоплатама на протеинкиназу С.
Несмотря на такой большой интерес к препарату в клинике, in vitro циклоплатам изучен мало. Поэтому целью настоящего исследования является изучение действия циклоплатама на индукцию апоптоза опухолевых клеток различного морфологического происхождения.
Цель работы - изучить индукцию апоптоза отечественным противоопухолевым препаратом циклоплатамом в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином.
Задачи исследования. Оценить цитотоксическую активность противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина на клеточные линии с применением МТТ - теста.
- Сравнить цитотоксическую активность циклоплатама с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатином.
- Оптимизировать условия индукции и регистрации апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами in vitro.
- Оценить лекарственно-индуцированный апоптоз на клеточных линиях с применением современных методов регистрации апоптоза.
- Изучить влияние на апоптоз циклоплатама в сравнении с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатином.
Научная новизна исследования. Показана цитотоксическая активность циклоплатама в сравнении с цисплатином, карбоплатином, оксалиплатином на клеточных линиях лимфобластоидного, моноцитарного, меланоцитарного и эпидермального происхождения. Впервые показана способность отечественного противоопухолевого препарата платины второго поколения – циклоплатама – индуцировать апоптоз клеток линий Raji, U937, MelP, MCF-7, T47D, SKOV-3. Проведена оценка действия циклоплатама на апоптоз в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином. Применено три принципиально различных методических приема для определения популяционного анализа лекарственно–индуцированного апоптоза с использованием проточной цитофлуориметрии.
Практическая значимость исследования. Сочетание методов определения лекарственно - индуцированного апоптоза in vitro может найти применение для скрининга новых соединений и веществ с потенциальной противоопухолевой активностью.
Апробация работы. Апробация диссертационной работы прошла 25 сентября 2008 г. на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитокинетики, отдела экспериментальной химиотерапии, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории синтетических противоопухолевых веществ НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Материалы работы были представлены на III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, Белоруссия, 2004 г.), на 29-м ESMO конгрессе «Annals of Oncology» (Вена, Австрия, 2004 г.), на Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике» (Барнаул, 2005 г.), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005 г.), на V симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2006 г.), на V съезде онкологов и радиологов СНГ (Ташкент, Узбекистан, 2008 г.), на 20-м Международном противораковом конгрессе ICACT (Париж, Франция, 2009 г.). По теме диссертации опубликованы 11 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 145 источника. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 25 рисунков и 23 таблицы.
Материалы и методы исследования.
Препараты, используемые для индукции апоптоза. Для исследования использовали химиотерапевтические препараты: циклоплатам (лаборатория разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва), цисплатин (TEVA Ltd., Израиль), оксалиплатин (элоксатин, Sanofi Winthrop Industrie, Франция), карбоплатин (параплатин, Bristol-Myers Squibb, Италия).
Клеточные линии. В работе использовали клеточные линии: Jurkat (Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека), Raji (B-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека), U937 (моноцитарная лимфома человека), MelP (меланома человека), SKOV-3 (рак яичников), МСF-7 (рак молочной железы), T47-D (рак молочной железы), PC-3 (рак предстательной железы). Клеточные линии получены из банка клеточных культур РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Клеточные линии выращивали в полной питательной среде при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста.
Оценка цитотоксического действия химиопрепаратов МТТ - тестом. MTT - тест, предложенный Т. Мосманном, основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5- дифенилтетразолий бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках и может являться критерием степени их чувствительности к противоопухолевому воздействию химиопрепаратов. К суспензии клеток (5104 клеток/180 мкл среды) добавляли 20 мкл химиопрепарата в концентрациях 110-6М, 0,510-5М, 110-5М, 0,510-4М, 110-4М и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 24, 48, 72 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях. Через 96 часов в планшет с клетками добавляли по 20 мкл MTT в каждую лунку и инкубировали 5-6 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2. После образования формазана планшеты центрифугировали при 2000 оборотах/минуту 7-10 минут, надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 150-200 мкл диметисульфоксида (DMSO). Планшеты помещали на 5-7 минут в термостат при температуре 37°С. Затем планшеты встряхивали на шейкере, после этого интенсивность окрашивания среды измеряли на спектрофотометре "Multiscan" при =540-690nm, за blank принимали лунки, содержащие среду без клеток и препаратов. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток. Процент живых клеток вычисляли по формуле:
| N0= | N1 100% |
| N2 |
где N0 – процент живых клеток; N1 – средняя оптическая плотность лунок, содержащих клетки и препарат; N2 – средняя оптическая плотность контрольных лунок, содержащих только клетки. Для каждого препарата строили график зависимости «доза–эффект» и определяли ИК50 (ингибирующая концентрация - концентрация препарата, при которой гибнет 50% опухолевых клеток).
Проточно-цитофлуориметрический анализ. Проточно-цитофлуориметрический анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, CШA), укомплектованном аргоновым лазером (длина волны 488 нм), с использованием программного обеспечения CELLQuest. В каждой пробе анализировалось от 2000 до 5000 событий.
Определение апоптоза методом двойного окрашивания. К суспензии клеток (5104 клеток/180 мкл среды) добавляли 20 мкл химиопрепарата в концентрациях 0,510-5М, 110-5М, 110-4М, и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 24, 48 и 72 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях. После окончания инкубации клетки собирали в пробирки, осаждали на центрифуге при 1000 оборотах/минуту в течение 10 минут. Клетки дважды отмывали в солевом фосфатном буфере (PBS) без азида, добавляли 100 мкл связывающего буфера, 5 мкл Аннексина V/FITC, 10 мкл пропидиум йодида (PI) (5 мкг/мл). Образцы встряхивали на вортексе и инкубировали в темноте 15 минут при комнатной температуре. Затем к пробам добавляли 400 мкл связывающего буфера и производили анализ на цитофлуориметре с возбуждением флуоресценции аргоновым лазером (488 нм) и регистрацией эмиссии зеленого диапазона по каналу FL1 (525 нм), а красного диапазона – по каналу FL2 (585 нм). Прямое и боковое светорассеивание регистрировали по каналам FSC и SSC.
Оценку результатов проводили по следующим параметрам: интактные (живые) клетки не связывают ни Аннексин V/FITC, ни PI (АnV- PI-), ранние апоптотические клетки окрашиваются только Аннексином V/FITC (АnV+ PI-), а поздние апоптотические или некротические клетки – и Аннексином V/FITC, и PI (АnV+ PI+) (рисунок 1).
Рисунок 1. Распределение опухолевых клеток, окрашенных Аннексином V/FITC/PI по флуоресценции после инкубации без химиопрепарата (а) и с препаратом (б).
Определение активной каспазы-3. К суспензии клеток (5104 клеток в 180 мкл среды) добавляли 20 мкл цитостатика в концентрациях 0,510-5М, 110-5М и 110-4М и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 24 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях. Клетки собирали в пробирки для подсчета клеток на проточном цитофлуориметре, осаждали при 1000 оборотах/минуту в течение 10 минут, затем дважды отмывали в холодном PBS. К пробам добавляли раствор Cytofix/Cytoperm из расчета 0,5 мл раствора на 1106 клеток и инкубировали 20 минут при +4оС. Пробы осаждали 7 минут при 1200 оборотах/минуту, дважды отмывали Perm/Wash буфером (0,5 мл на 1 пробу). К каждой пробе добавляли по 100 мкл раствора, содержащего 20 мкл антител к каспазе-3/FITC (BD) и 80 мкл Perm/Wash буфера, инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем пробы промывали Perm/Wash буфером (мл на 1 пробу), ресуспендировали в 0,5 мл Perm/Wash буфера и анализировали на проточном цитофлуориметре (рисунок 2).
Рисунок 2. Гистограмма распределения клеток Jurkat по флуоресценции после окрашивания моноклональными антителами к активной каспазе-3/FITC, после 72 - часовой инкубации клеток с циклоплатамом.
Исследование апоптоза методом TUNEL c использованием набора APO-DIRECT Kit (BD)
К суспензии клеток (5104 клеток в180 мкл среды) добавляли 20 мкл цитостатика в концентрациях 0,510-5М, 110-5М и 110-4М и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 72 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2. Контролем служили интактные клетки. После окончания инкубации клетки собирали в пробирки, осаждали на центрифуге при 1000 оборотах/минуту в течение 10 минут и дважды отмывали в холодном PBS. Этот метод включает в себя две стадии: первая - фиксация исследуемого образца, вторая – окрашивание и анализ образца на проточном цитофлуориметре. Фиксация образца. К пробе добавляли раствор 1%-го парафoрмальдегида в РBS (рН-7,4) из расчета 1-2106 клеток на 1 мл. Пробы помещали на лед и инкубировали 30 - 60 минут. Затем образцы центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту, удаляли из каждой пробы супернатант. К осадку добавляли 5 мл РBS, ресуспендировали и центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту. Повторяли процедуру еще раз. Клеточный осадок ресуспендировали в остаточном РBS, добавляли 70%-ный ледяной этанол в концентрации 1-2106 клеток/мл. Затем пробы помещали на лед и инкубировали в течение 30 минут при -20°С. Окрашивание образцов. В набор входят так же позитивные и негативные контрольные образцы, которые хранятся при -20°С в 70%-ном этаноле. Контрольные образцы в количестве 1мл помещали в пробирки для проточного цитофлуориметра. Контрольные и опытные образцы центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту, затем удаляли надосадок. К образцам добавляли 1 мл Wash Buffer и встряхивали пробирки на вортексе, затем центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту и удаляли надосадок. Повторяли процедуру еще раз. К пробам добавляли 50 мкл Staining Solution, ресуспендировали осадок и инкубировали 60 минут при 37°С. После окончания инкубации к пробам добавляли 1 мл Rinse Buffer, центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту и удаляли надосадок. Повторяли процедуру еще раз. К образцам добавляли 0,5 мл PI/RNase Staining Buffer и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Анализировали образцы на проточном цитофлуориметре.
Статистическая обработка результатов Статистический анализ проводили с использованием программ «BIOSTAT» (Version 3.2), Microsoft Excel, Statistica v.5.0. Различия считали статистически достоверными при p<0,05, использовали t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна - Уитни.
Результаты исследования
Оценка цитотоксической активности препаратов группы платина с использованием МТТ – теста.
С применением МТТ-теста проведено исследование цитотоксичности противоопухолевых препаратов, относящихся к комплексным соединениям платины. В исследовании были использованы опухолевые клеточные линии из коллекции банка клеточных культур РОНЦ.
По кривым «доза – эффект», полученным после инкубации клеток с химиопрепаратами, определены значения ИК50, т.е. дозы препаратов, при которых, по данным МТТ - теста, погибало 50% опухолевых клеток.
Установлено, что циклоплатам обладает цитотоксической активностью в отношении всех клеточных линий. При увеличении концентрации циклоплатама уменьшается количество выживших клеток. В отношении клеточных линий лимфобластоидного (Jurkat, Raji) и моноцитарного (U937) происхождения, значения ИК50 были меньше либо равны теоретической терапевтической концентрации циклоплатама (110-5М). При сравнении циклоплатама с оксалиплатином в концентрации 110-6М на клеточной линии Jurkat достоверных различий между действием этих препаратов на выживаемость клеток не выявлено (p>0,05). Выживаемость клеток под действием циклоплатама, в сравнении с цисплатином и карбоплатином, оказалась ниже; так, при использовании концентрации 0,510-5М процент живых клеток для циклоплатама был равен 46%, тогда как для цисплатина и карбоплатина 38% и 100% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью по сравнению с цисплатином и карбоплатином. Циклоплатам имеет схожий эффект с оксалиплатином, о чем свидетельствуют значения ИК50 (0,410-5М и 0,610-5М соответственно).
На клеточной линии Raji статистически достоверных различий при сравнении циклоплатама с цисплатином в концентрациях 0,510-5М, 110-4М, а также циклоплатама с оксалиплатином в концентрации 1х10-5М не выявлено. При сравнении циклоплатама с оксалиплатином обнаружилось, что последний обладает большей цитотоксической активностью в концентрациях 110-6М и 0,510-5М. Так, при использовании концентрации 110-6М процент выживших клеток для циклоплатама составил 61%, а для оксалиплатина - 53%, при концентрации 0,510-5М – 55% и 36% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток линии Raji в сравнении с цисплатином и карбоплатином. На основании полученных данных были определены значения ИК50 для циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина: 0,5510-5М, 0,7310-5М, 0,1510-5М соответственно.
При действии циклоплатама, цисплатина и оксалиплатина в концентрациях 0,510-4М, 110-4М на клетки линии U937 достоверных различий выявлено не было. При изучении действия циклоплатама в дозе, близкой к терапевтической in vivo – 110-5М, процент выживших клеток составил всего 9%. Для цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина были построены кривые «доза–эффект» и определены значения ИК50, которые составили соответственно 0,3310-5М, 0,4410-5М и 6,610-5М.
Таким образом, нами показано, что циклоплатам обладает цитотоксической активностью в отношении клеточных линий лимфобластоидного (Jurkat, Raji) и моноцитарного (U937) происхождения. При увеличении концентрации циклоплатама уменьшается количество выживших клеток. Для клеточных линий Raji и U937 значение ИК50 цисплатина меньше либо равно теоретической терапевтической концентрации, тогда как для Jurkat значение ИК50 превышает теоретическую терапевтическую концентрацию в 3,7 раза. Значение ИК50 карбоплатина для клеточной линии U937 превышает теоретическую терапевтическую концентрацию в три раза.
Также исследована цитотоксическая активность препаратов в отношении клеточных линий эпидермального (Т47D, PC-3, MCF-7) и меланоцитарного (MelP) происхождения. С увеличением концентрации циклоплатама и цисплатина уменьшается процент выживших клеток. В отношении оксалиплатина и карбоплатина такой тенденции не наблюдается. Были определены значения ИК50, которые составили для циклоплатама 0,4610-5М, для цисплатина 0,910-5М. Эффективными препаратами в отношении клеточной линии Т47D рака молочной железы являются циклоплатам и цисплатин.
При сравнении циклоплатама с цисплатином на клеточной линии MelP достоверных различий в диапазоне выбранных концентраций не выявлено. Определены значения ИК50 для циклоплатама, цисплатина и карбоплатина, которые составляют 0,9310-5М, 2,6810-5М и 6,210-5М соответственно. Эффективным препаратом в отношении клеточной линии меланомы человека является циклоплатам, так как только его значение меньше теоретической терапевтической концентрации.
При действии препаратов на клетки линии PC-3 самый низкий процент выживших клеток (33%) получен после действия циклоплатама в дозе 110-4М. Значение ИК50 для циклоплатама составляет 4,4710-5М.
При действии препаратов на клетки линии MCF-7 значения ИК50 для циклоплатама, цисплатина и карбоплатина составляют 5,110-5М, 4,510-5М и 8,110-5М соответственно.
Исследование лекарственно-индуцированного апоптоза методами проточной цитофлуориметрии.
В настоящей работе было применено три принципиально различных методических приема для определения популяционного анализа лекарственно–индуцированного апоптоза с использованием проточной цитофлуориметрии.
Метод двойного прижизненного окрашивания с использованием Аннексина V/FITC в комбинации с PI, основанный на способности Аннексина V, меченного FITC, связываться с фосфатидилсерином, позволяет зафиксировать апоптотические клетки. В связи с тем, что транслокация фосфатидилсерина происходит и в некротических клетках Аннексин V используют в сочетании с витальным красителем PI. Апоптотические клетки начинают взаимодействовать с Аннексином V после того, как произошла конденсация хроматина, но до утраты плазматической и ядерной мембранами, которые ограничивают проникновение PI. В результате живые клетки не связывают ни Аннексин V, ни PI. Апоптотические клетки с неповрежденной мембраной окрашиваются только Аннексином V, а поздние апоптотические или некротические клетки – и Аннексином V, и PI.
Так под действием циклоплатама на клетки линии Jurkat в течение 72 часов при использовании терапевтической концентрации 110-5М, число ранних апоптотических клеток (АnV+PI-) для циклоплатама составило 62%, для цисплатина 29% для оксалиплатина 25% и для карбоплатина 14%.
Таким образом, циклоплатам индуцирует апоптоз лучше, чем все остальные препараты. Это касается и применения максимальной дозы 110-4М (рисунок 3).
Рисунок 3. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии Jurkat после 72–часовой инкубации с химиопрепаратами, n=5 (*p>0,05, в остальных случаях p<0,05 в сравнении с интактным контролем, p>0,05, в остальных случаях p< 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии Jurkat с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов (рисунок 4). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510-5 количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 76%, для цисплатина 45,8%, для оксалиплатина и карбоплатина получены недостоверные данные относительно интактного контроля, которые составили 8,2 и 9,1% соответственно. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток положительных по каспазе-3 увеличивается и составляет для циклоплатама 83,2%, для цисплатина 58,9%, для оксалиплатина 28%, для карбоплатина 23,7%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 90,1%, для цисплатина 71,4%, для оксалиплатина и карбоплатина 36 и 55,5% соответственно. Таким образом, наиболее эффективными препаратами, вызывающими высокую экспрессию активной каспазы-3 при использовании терапевтической дозы in vitro, являются циклоплатам и цисплатин (рисунок 4).
Рисунок 4. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии Jurkat с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов, n=3 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем).
Также в нашем исследовании использован метод лекарственно-индуцированного апоптоза, основанный на определении фрагментированной ДНК в популяции опухолевых клеток линии Jurkat после действия циклоплатама, оксалиплатина, цисплатина, карбоплатина. Исследованные препараты индуцировали фрагментацию ДНК в процессе апоптоза клеток Jurkat через 72 часа инкубации (рисунок 5). При действии циклоплатама в концентрации 0,5х10-5М количество апоптотических клеток составило 51,8%, для цисплатина 13,9%, для оксалиплатина 0,6% (*p > 0,05), для карбоплатина 2,3% (*p > 0,05).
Рисунок 5. Индукция внутринитевых разрывов ДНК клеток линии Jurkat после инкубации с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов, n=4 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
При увеличении концентрации препаратов до 110-5М количество апоптотических клеток для циклоплатама увеличилось и составило 83,5%, для цисплатина 74,7%, для оксалиплатина-16%, для карбоплатина-10,1%; при использовании максимальной дозы препаратов 110-4М количество апоптотических клеток значительно увеличилось и составило для циклоплатама 96,1%, для цисплатина-96% (p > 0,05), для оксалиплатина 70,8%, для карбоплатина-41,2%. Таким образом, циклоплатам в сравнении с осалиплатином и карбоплатином эффективнее индуцирует гибель клеток линии Jurkat по типу апоптоза.
При исследовании лекарственно-индуцированного апоптоза на клеточной линии Raji (инкубация 72 часа) под действием циклоплатама в концентрации 110-5М количество клеток в раннем апоптозе (АnV+ PI-) составило 4,7% (*p>0,05), для цисплатина 19,0%, для оксалиплатина-13,9%, для карбоплатина-13,7% (рисунок 6). Популяция клеток, положительных по АnV+ и PI+, для циклоплатама составила 65,1%, для цисплатина– 25,6%, для оксалиплатина – 45,7, для карбоплатина – 5,9% (*p>0,05).
Рисунок 6. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии Raji после 72–часовой инкубации с химиопрепаратами, n=3 (*p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии Raji с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов (рисунок 7). Количество апоптотических клеток после инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510-5М для циклоплатама составило 32%, для цисплатина 20,5%, для оксалиплатина-34,5% и карбоплатина-10,2%. Статистически достоверной разницы между действием циклоплатама и оксалиплатина при данной концентрации не получено. С увеличением концентрации химиопрепаратов до 110-5М популяция клеток положительных по каспазе-3 увеличивается и составляет для циклоплатама 65%, для цисплатина 39%, для оксалиплатина-50,1%, для карбоплатина-16%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 79%, для цисплатина 68,3%, для оксалиплатина и карбоплатина-70,1% и 23,2% соответственно. Таким образом, препаратами, вызывающими высокую экспрессию активной каспазы-3 при использовании теоретической терапевтической дозы 110-5М, являются циклоплатам, оксалиплатин.
Рисунок 7. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии Raji с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов, n=5 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Определение внутринитевых разрывов ДНК в клетках линии Raji проводили после инкубации с циклоплатамом, оксалиплатином через 72 часа (рисунок 8). Количество апоптотических клеток после инкубации с циклоплатамом в концентрации 0,510-5М составило 74%, с цисплатином 31,5%, с оксалиплатином-7,2%, с карбоплатином - 5,1%. При увеличении концентрации препаратов до 110-5М процент апоптотических клеток увеличился и составил для циклоплатама 90,2%, для цисплатина 68,8%, для оксалиплатина-7,7%, для карбоплатина-9%. При использовании максимальной дозы препаратов 110-4М доля клеток в состоянии специфического апоптоза увеличилась и составила для циклоплатама 96,3%, для цисплатина 84,2%, для оксалиплатина-53,0%, для карбоплатина-16,3%.
Рисунок 8. Индукция внутринитевых разрывов ДНК клеток линии Raji после инкубации с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов, n=5 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Изучение действия циклоплатама на индукцию апоптоза клеток линии U937 проводили в сравнении с оксалиплатином. При определении апоптотических клеток методом двойного окрашивания (инкубации 72 часа) количество ранних апоптотических клеток при использовании концентрации 0,510-5М для циклоплатама составило 60%, для оксалиплатина-17%. При использовании дозы 110-5М количество поздних апоптотических или некротических клеток для циклоплатама и оксалиплатина уменьшилось и составило 24% и 7% соответственно. При увеличении дозы (110-4М) популяция клеток, положительных по АnV+ и отрицательных по PI –, увеличилась как для циклоплатама, так и для оксалиплатина и составила 77% и 39% соответственно. Количество клеток, положительных по АnV+ и PI+, наоборот, уменьшилось и составило для циклоплатама 15%, для оксалиплатина 14%.
Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии U937 с циклоплатамом, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 9). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510-5 количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 84,5%, для оксалиплатина 24,5%. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток положительных по каспазе-3 увеличилась и составила для циклоплатама 90,5%, для оксалиплатина 50,1%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 99,5%, для оксалиплатина 65%.
Рисунок 9. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии U937 с циклоплатамом, оксалиплатином, в течение 72 часов, n=3 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Определение внутринитевых разрывов ДНК в клетках линии U937 проводили после инкубации с циклоплатамом, оксалиплатином через 72 часа (рисунок 10). При концентрации 0,510-5 М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 27,4%, для оксалиплатина 1,9% (*p > 0,05). При увеличении концентрации препаратов до 110-5М количество апоптотических клеток увеличилось и составило для циклоплатама 48,3%, для оксалиплатина 31%, при использовании максимальной дозы препаратов 110-4М для циклоплатама количество положительных клеток по маркеру составило 86,4%, для оксалиплатина 56,8%.
Рисунок 10. Индукция нитевых разрывов ДНК клеток линии U937 после инкубации с циклоплатамом, оксалиплатином в течение 72 часов, n=3 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Определение апоптоза методом двойного окрашивания проводили после инкубации клеток линии MelP с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 11). При концентрации 110-4М общее количество клеток, положительных по АnV+PI+ и АnV+PI-, для циклоплатама составило 53,8%, для цисплатина 44,4%, для оксалиплатина 11,2 %, что меньше на 42,6% в сравнении с циклоплатамом. Популяция клеток, положительных по каспазе-3, составила для циклоплатама 65%, для цисплатина 29,3%, для оксалиплатина 32,6%. Таким образом, циклоплатам оказывает больший эффект на опухолевые клетки меланомы кожи MelP, чем оксалиплатин и цисплатин.
Рисунок 11. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии MelP после 72–часовой инкубации с химиопрепаратами, n=4 (*p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии MelP с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов (рисунок 12). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510-5М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 49%, для цисплатина 24,1%, для оксалиплатина 23,5%. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, увеличилась и составила для циклоплатама 65%, для цисплатина 29,3%, для оксалиплатина-32,6%. Статистически достоверной разницы между действием цисплатина и оксалиплатина не получено. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 77,6%, для цисплатина 33%, для оксалиплатина-50,8%.
Рисунок 12. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии MelP с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов, n=3 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Циклоплатам оказывает больший эффект на опухолевые клетки линии рака яичников SKOV-3, чем цисплатин и оксалиплатин (рисунок 13). Так, при 72 – часовой инкубации количество ранних и поздних апоптотических клеток после действия циклоплатама (110-5М) составило 34,2%, для цисплатина 18,1%, для оксалиплатина 18,7%. При увеличении концентрации до 110-4М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 66,4%, для цисплатина 32%, для оксалиплатина 9,1%.
Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии SKOV-3 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 14). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510-5М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 35,4%, для цисплатина 16,1%, для оксалиплатина- 17,8%. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, в отношении циклоплатама увеличилась и составила 53,3%, для цисплатина и оксалиплатина – незначительно увеличилась и составила 21% и 26,5% соответственно. С увеличением дозы препаратов количество апоптотических клеток увеличилось и составило для циклоплатама 80%, для цисплатина 55%, для оксалиплатина- 35,4%.
Рисунок 13. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии SKOV-3 после 72–часовой инкубации с химиопрепаратами, n=4 (*p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Рисунок 14. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии SKOV-3 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов, n=3 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Циклоплатам оказывает больший эффект на опухолевые клетки линии рака яичников МСF-7, чем цисплатин (рисунок 15). При инкубации 110-5М общее количество окрашенных клеток для циклоплатама составило 58,9%, для цисплатина 39,9%, для оксалиплатина 36,9%.
Рисунок 15. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии MCF-7 после 72–часовой инкубации с химиопрепаратами, n=4 (*p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии MCF-7 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 16). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510-5 количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 25,9%, для цисплатина - 15,8% (*p > 0,05), для оксалиплатина - 23,2% (p > 0,05). С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, незначительно увеличилась и составила для циклоплатама 35,6%, для цисплатина 16,3% (*p > 0,05), для оксалиплатина-19,3%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 64,9%, для цисплатина 25,1%, для оксалиплатина - 20,6% (p > 0,05). Таким образом, из полученных данных мы можем сделать вывод о том, что наиболее эффективным препаратом, вызывающими высокую экспрессию активной каспазы-3, является циклоплатам.
Рисунок 16. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии MCF-7 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов, n=3 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Эффективным препаратом в отношении клеточной линии Т47-D является циклоплатам (рисунок 17). При концентрации 110-5М общее количество окрашенных клеток для циклоплатама составило 32%, для цисплатина 30,5%, для оксалиплатина 21,5%.
Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии T47-D с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 18). При описании полученных результатов использовали данные за вычетом интактного контроля. После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510-5 количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 35,9%, для цисплатина 15,9%, для оксалиплатина 4,2%, что не является статистически достоверным значением в сравнении с интактным контролем. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, увеличилась и составила для циклоплатама 50,5%, для цисплатина 27,3%, для оксалиплатина-11,4%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 49,2%, для цисплатина 50,1%, для оксалиплатина-29%.
Рисунок 17. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии T47-D после 72–часовой инкубации с химиопрепаратами, n=3 (*p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05, в остальных случаях p < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Рисунок 18. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии T47-D с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов, n=3 (*p > 0,05 в сравнении с интактным контролем, p > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).
Выводы
- Циклоплатам и оксалиплатин в сравнении с цисплатином и карбоплатином обладают более выраженной цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеточным линиям лимфобластоидного (Jurkat, Raji) и моноцитарного происхождения (U937).
- Установлено, что цитотоксические эффекты циклоплатама и цисплатина по отношению к опухолевым клеткам эпителиального (T47-D) и меланоцитарного происхождения (MelP) выше, чем цитотоксические эффекты карбоплатина и оксалиплатина.
- Препараты группы комплексных соединений платины - циклоплатам, цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин - индуцируют гибель опухолевых клеток линий Jurkat, Raji и U937 по механизму апоптоза.
- Уровень индуцированного апоптоза возрастает с увеличением концентрации и/или длительности инкубации опухолевых клеток с химиопрепаратами.
- Препараты группы комплексных соединений платины - циклоплатам, цисплатин, оксалиплатин - индуцируют апоптоз популяций клеток линий как меланоцитарного (MelP), так и эпителиального происхождения (SKOV-3, T47-D, PC-3). При действии циклоплатама уровень апоптоза выше, чем при действии цисплатина и оксалиплатина.
- Противоопухолевые препараты группы платины значительно сильнее индуцируют апоптоз и оказывают более выраженное цитотоксическое действие в отношении клеток лимфобластоидного и моноцитарного происхождения по сравнению с клетками эпителиального и меланоцитарного происхождения.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Молекулярные механизмы действия препаратов платины. // Российский биотерапевтический журнал. №1, т.3, 2004, C.14-19. (Авторы: Вартанян А.А., Огородникова М.В.).
- Индукция апоптоза препаратами группы платины. // Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ. Минск, 2004, C.344. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю.).
- The investigation of platinum drugs reactivity in patients with CLL in vitro. // 29th ESMO Congress Annals of Oncology. Vienna, Austria, 2004, v15, P.iii159. (Shishkin Yu.V., Ogorodnikova M.V., Baryshnikov A.Yu.).
- Сравнительная оценка индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами циклоплатамом и оксалиплатином. // Российский биотерапевтический журнал, №1, т.4, 2005, C.65-66. (Авторы: Огородникова М.В., Лысюк Е.Ю., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю.).
- Сравнительная оценка апоптоза индуцированного циклоплатамом и оксалиплатином методом проточной цитофлуориметрии. // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике». Барнаул, 2005, C.96-97. (Авторы: Огородникова М.В., Лысюк Е.Ю., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю.).
- Оценка цитотоксической активности препаратов группы платина с использованием МТТ-теста. // Проблемы клинической медицины. №1, 2006, C.39-42. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.).
- Исследование цитотоксической активности циклоплатама в отношении клеточной линии рака молочной железы Т47D. // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи». Барнаул, C.218-219. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.).
- Исследование циклоплатам и оксалиплатин индуцированного апоптоза методами in vitro. // Материалы V симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Москва, 2006, C.17. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю.).
- Сравнительное изучение действия циклоплатама и оксалиплатина на индукцию апоптоза методом проточной цитофлуориметрии. // Российский биотерапевтический журнал. №4, т.5, 2004, C.73-78. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю., Оборотова Н.А., Шишкин Ю.В.).
- Сравнительная оценка действия циклоплатама и оксалиплатина на экспрессию активной каспазы-3. // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. Ташкент, 2008, C.61. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.).
- Flow cytometry of apoptosis induction by cycloplatam and oxaliplatin on PC3 cell line. // 20th International Congress on Anti-Cancer Treatment. Paris, France, 2009, P.432-433. (Shishkin Y.V., Ogorodnikova M.V., Baryshnikov A.Y.).
