Значение определения антиген индуцированного интерферона- а mma в диагностике туберкулёза органов дыхания
На правах рукописи
Макарова Наталья Владимировна
зНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНИНДУЦИРОВАННОГО
интерферона-АMMA В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЁЗА
органов дыхания
14.01.16 - фтизиатрия
Автореферат
диссертации на соискание ученой
степени кандидата медицинских наук
Москва, 2010
Работа выполнена в НИИ фтизиопульмонологии ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор Сергей Евгеньевич Борисов
Доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Владимирский
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Владимир Юрьевич Мишин
Доктор медицинских наук, профессор Владимир Анатольевич Стаханов
Ведущее учреждение
Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН
Защита диссертации состоится 2010г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.06. в НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 127994, г. Москва, ул. Достоевского д.4
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Росздрава (117998, г.Москва, Нахимовский пр-т, д.49)
Автореферат разослан «____»_________________2010г.
Ученый секретарь доктор медицинских наук, профессор
диссертационного совета Марина Петровна Грачева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
На протяжении многих десятилетий патология органов дыхания, где ведущее место принадлежит воспалительным заболеваниям, представляют серьезную проблему для здравоохранения [А.Г. Чучалин, 2004, Е.И. Шмелев, 2004; WHO report, 2008]. Особое место среди воспалительных заболеваний легких занимает туберкулёз, являющийся ведущей причиной смерти от инфекционных и паразитарных заболеваний среди взрослых [М.И.Перельман, 2007; М.В. Шилова, 2008; WHO report, 2006, 2007,2008,].
Дифференциальная диагностика туберкулеза и нетуберкулезных воспалительных заболеваний легких в ряде случаев достаточно сложна. Схожесть клинико-рентгенологических проявлений приводит к несвоевременному распознаванию туберкулёза у больных с неспецифическими заболеваниями легких [А.Г. Хоменко, 1998; В.Ю. Мишин и др., 2003, 2004]. Значительная доля больных с саркоидозом изначально получает специфическую терапию по поводу предполагаемого туберкулёза. При дифференциальной диагностике гранулематозных заболеваний не только клинико-рентгенологическая картина, но и гистологическое исследование биоптатов ткани легкого и лимфатических узлов порой не может дать однозначное заключение о нозологической природе процесса [Е.И. Шмелев, 2001; И.П. Соловьева, 2002]. В связи с этим, представляется целесообразным поиск дополнительных критериев дифференциальной диагностики этих заболеваний, основанных на особенностях иммунологических реакций.
Элиминация инфекционного агента с сохранением памяти о нем – это главная задача системы защиты от туберкулеза. Ключевая роль в реализации защиты принадлежит цитокинам [А.А. Ярилин, 2006]. Современные лабораторные технологии позволяют изучить процессы, происходящие в организме на уровне in vitro. Особый интерес представляет работа клеток памяти, их ответ на специфические антигены вне организма. Известно, что Т-лимфоциты, премированные антигенами M.tuberculosis, циркулируют в крови и в ответ на взаимодействие с молекулой антигена вырабатывают интерферон-гамма (ИФН-), играющий важную роль в противотуберкулёзной защите [А.А. Ярилин, 2006; Т.Е. Тюлькова и соавт., 2008, S. Fulton et al., 1996; J. Flynn, 1999].
Установление диагностической информативности метода определения антигениндуцированной продукции ИФН- клетками периферической крови в дифференциальной диагностике туберкулёза и других воспалительных легочных заболеваний стало определяющим предметом нашего исследования.
Цель исследования: повышение эффективности дифференциальной диагностики туберкулёза на основе применения иммунологических методов исследования.
Задачи исследования:
1. Определить количественные характеристики продукции ИФН- клетками цельной периферической крови в ответ на стимуляцию туберкулином (PPD) и специфическим антигеном для M. tuberculosis (ESAT-6) in vitro у больных туберкулезом, саркоидозом и неспецифическими воспалительными заболеваниями легких.
2. Сформировать основанные на исследовании продукции ИФН- клетками цельной периферической крови при стимуляции туберкулином PPD и ESAT-6 in vitro дополнительные критерии нозологической диагностики легочных гранулематозов (туберкулёза и саркоидоза).
3. Изучить динамику антигениндуцированной продукции ИФН- in vitro у впервые выявленных больных туберкулезом легких в ходе основного курса этиотропного лечения.
4. Установить значение определения концентрации ИФН- в плевральном экссудате для дифференциальной диагностики туберкулезных плевритов.
Научная новизна.
- Изучены и сопоставлены количественные параметры индуцированной продукции ИФН- клетками цельной периферической крови в ответ на стимуляцию антигенами PPD и ESAT-6 in vitro при туберкулезе, саркоидозе и неспецифических воспалительных заболеваниях легких.
- Определена высокая диагностическая эффективность метода антигенспецифической индукции ИФН- в образцах цельной периферической крови для дифференциальной диагностики туберкулёза и саркоидоза.
- Установлено динамическое изменение антигениндуцированной продукции ИФН- клетками цельной периферической крови в ходе основного курса химиотерапии: у больных с распространённым лёгочным туберкулезным процессом показатель антигениндуцированной продукции ИФН- снижается на фоне этиотропной терапии.
- Определена пороговая концентрация ИФН- в плевральном экссудате, превышение которой может служить важным критерием при дифференциальной диагностике туберкулёзных плевритов.
Практическая значимость.
Разработан дополнительный критерий нозологической диагностики саркоидоза и туберкулёза, основанный на определении антиген-индуцированной продукции ИФН- клетками цельной периферической крови в ответ на стимуляцию ESAT-6 и PPD in vitro.
Определено пороговое значение концентрации ИФН- в плевральной жидкости для дифференциальной диагностики экссудативных плевритов туберкулёзной этиологии.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Определение антигениндуцированной продукции ИФН- клетками цельной периферической крови in vitro может служить дополнительным критерием в дифференциальной диагностике основных легочных гранулематозов - туберкулёза и саркоидоза. Значимость данного метода в дифференциальной диагностике неспецифических воспалительных заболеваний легких и туберкулёза ниже, чем в дифференциальной диагностике саркоидоза и туберкулёза.
2. Уровень антигениндуцированной продукции ИФН- зависит от распространённости туберкулёза легких. При динамическом наблюдении уровень антигениндуцированной продукции ИФН- у больных с распространёнными процессами достоверно уменьшается в ходе эффективной противотуберкулёзной терапии.
3. Пороговый уровень концентрации ИФН- в плевральной жидкости более 50 пг/мл является важным дифференциально-диагностическим критерием активного экссудативного плеврита туберкулёзной этиологии.
Внедрение.
Результаты работы используются в лечебной практике клиники фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова.
Апробация работы.
Основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийской конференции студентов и молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом (г. Москва, 2006), на постерной сессии VI съезда аллергологов и иммунологов СНГ (г. Москва, 2006), на VIII Российском съезде фтизиатров (г. Москва, 2008), на научно-практической конференции «Новые иммунологические методы диагностики туберкулёза» (г. Москва, 2008), на конкурсе «Перспективные научные работы молодых ученых» в рамках «Российского медицинского форума-2008».
Материалы диссертации прошли официальную апробацию на совместном заседании терапевтического, лабораторного, хирургического отделов НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова 30 ноября 2009 года.
Публикации.
Основные положения работы отражены в 6 печатных работах, из них 1 - в центральном журнале, рекомендованном ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав (обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, три главы результатов собственного исследования), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 319 источников (125 наименований отечественных и 194 - зарубежных авторов). Работа изложена на 177 страницах машинописного текста (основной текст – 142 страницы), иллюстрирована 35 таблицами, 17 рисунками и 3 клиническими примерами.
ОСНОВНОЕ Содержание работы
Работа основана на результатах исследования 244 больных, находившихся в клинике НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И. М. Сеченова в 2005-2008 гг. Для решения первой поставленной задачи сопоставлены клинические проявления и уровень антигениндуцированного ИФН- в периферической крови у 171 больного (у 60 диагностирован туберкулез легких, у 67 – саркоидоз и у 44 - неспецифические воспалительные заболевания легких - НВЗЛ), в возрасте 17-76 лет (средний возраст – 38,5±1,1 лет). ИФН- в плевральной жидкости исследован у 73 больных с плевральным выпотом различного генеза (16-74 лет, средний возраст 41,8±2,0 года). Среди них большинство мужчин - 45 пациентов (61,6%), женщин соответственно 28 (38,4%). Зачисление в группы осуществляли «сплошным» методом, по мере поступления больных в клинику.
Из 60 больных с впервые выявленным туберкулёзом 31 обследован в динамике через 2 и 4 мес. противотуберкулёзной терапии (16 мужчин и 15 женщин, в возрасте 21-67 лет). Среди них было 7 больных (22,6%) с очаговым туберкулёзом, 19 (61,3%) - с инфильтративным, 4 (12,9%) - с диссеминированным и 1 (3,2%) - с туберкулёмой, осложнённой экссудативным плевритом.
Всем больным проведен комплекс обследования, включающий рентгенологическое, функциональное, клинико-лабораторное, биохимическое, микробиологическое исследования; при необходимости и при отсутствии противопоказаний применены инвазивные методы диагностики с биопсией ВГЛУ и/или легких, плевры. Клинико-рентгенологические и лабораторные данные у исследуемых нами больных соответствовали общепринятым классическим представлениям о туберкулезе, саркоидозе, НВЗЛ, экссудативном плеврите. Однако в большинстве случаев полиморфизм симптоматики каждого из заболеваний затруднял диагностические суждения, что требовало включения в комплекс обследования дополнительных иммунологических методов.
Количественное определение ИФН- в периферической крови и в плевральной жидкости проводили с помощью иммуноферментной тест-системы, предоставленной НИИ экспериментальной кардиологии РКНПК Росмедтехнологий. Тест основан на «сэндвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением пары моноклональных антител, специфических к различным эпитопам ИФН- (чувствительность тест-системы - 10 пг/мл). Определяли концентрацию ИФН-, выделяемого клетками цельной периферической крови через 24 часа инкубации в присутствии антигенов МБТ: туберкулина PPD (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток) и специфического рекомбинантного антигена ESAT-6 (любезно предоставлен лабораторией биологически активных наноструктур НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН); рассчитывали разность между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН- (). У больных с плевральным выпотом определяли концентрацию спонтанного ИФН- в плевральной жидкости.
Показатели, подчиняющиеся нормальному распределению, были представлены в виде М±m (cреднее значение ± стандартная ошибка среднего); показатели с распределением, отличающимся от нормального, описывали при помощи медианы и 95%-ных доверительных интервалов (95%ДИ); качественные показатели – в долях (процентах), либо по ординальной шкале и/или факту наличия признака. Статистический межгрупповой анализ данных, подчиняющихся нормальному распределению, проводился с помощью двухстороннего критерия Стьюдента, внутригрупповой – с применением парного критерия Стьюдента. Статистический межгрупповой анализ данных, не подчиняющихся нормальному распределению, проводили с помощью критериев Манна и Уитни или Уилконсона. Для оценки достоверности различия качественных признаков (долей в группах) использовали точный критерий Фишера (для двух параметров) и 2-критерий (для трех и более параметров). В качестве критического уровня достоверности различий был принят уровень 0,05. Статистическую связь между клинико-лабораторными данными и показателями концентрации ИФН- оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Результаты исследований и их обсуждение
Первую часть исследования составило изучение содержания антиген-индуцированного ИФН- в периферической крови больных туберкулезом, саркоидозом, НВЗЛ.
Проведено сравнение PPD- и ESAT-6-индуцированного ИФН- при разных формах туберкулеза. Средняя концентрация ИФН- при индукции PPD была максимальной при диссеминированном туберкулёзе (383,0±116,7 пг/мл), минимальной - при туберкулеме легкого (149,8±81,8 пг/мл); достоверными (р < 0,05) различия средних концентрации были только при инфильтративном (335,3±41,4 пг/мл) и очаговом туберкулёзе легких (189,8±54,9 пг/мл). Индукция антигеном ESAT-6 способствовала достоверно большему (р = 0,01) увеличению продукции ИФН- при инфильтративном туберкулезе (108,0±24,6 пг/мл) по сравнению со средними показателями, отмеченными при туберкулеме (37,0±12,8 пг/мл).
По совокупности клинико-рентгенологических и лабораторных данных выделены две подгруппы больных - с преимущественно экссудативным и с преимущественно продуктивным типом воспаления. Уровень PPD-индуциро-ванного ИФН- был достоверно выше при преимущественно экссудативном характере процесса и составил 343,1±39,2 пг/мл (р = 0,028), что почти в 2 раза выше, чем при преобладании продуктивных реакций (179,1±44,6 пг/мл). Содержание ESAT-6-индуцированного ИФН- у групп больных с различным типом воспаления достоверно не различалось, хотя показатели концентрации ИФН- также были выше при экссудативном типе воспаления (101,9±20,7 пг/мл), чем при продуктивном (65,7±24,8 пг/мл).
Наличие или отсутствие выделения с мокротой МБТ является одной из важных характеристик туберкулеза легких, отражающих, в частности, величину микобактериальной популяции. Однако статистически достоверных различий в содержании ИФН- (как PPD-, так и ESAT-6-индуцированного) между этими двумя группами больных выявлено не было, хотя более высокие значения индуцированного PPD ИФН- (442,0±111,4 пг/мл) и ESAT-6 (123,0±52,6 пг/мл) отмечены все-таки при массивном бактериовыделении. Возможно, данные изменения могут указывать на увеличение пула Т-лимфоцитов-продуцентов ИФН- в периферической крови и снижение их числа в очаге, что и приводит к недостаточному ограничению числа возбудителя и выделению МБТ в значительном количестве с мокротой.
Не выявлено достоверных различий при сопоставлении полученных нами данных между группами больных, с рентгенологическими признаками деструкции легочной ткани и без деструкции, в содержании как PPD-индуцированного - ИФН- (295,6±41, пг/мл и 311±53,9 пг/мл соответственно), так и ESAT-6-индуцированного - ИФН- (100,4±23,8 пг/мл и 82,2±22,9 пг/мл соответственно).
У больных туберкулёзом более чем в половине случаев (51,7%) рентгенологические изменения были ограниченными (1-2 сегмента легких). Уровень индуцированного обоими антигенами ИФН- был выше при распространённых процессах (более 2 сегментов), но достоверно не отличался от такового при ограниченных процессах. Уровень индуцированного ИФН- при двусторонних процессах (22% случаев) был выше почти в 2 раза, чем при односторонних, но различия были статистически достоверны только при индукции ESAT-6.
Концентрация ИФН- при индукции PPD была выше, чем при индукции ESAT-6. При этом имел место значительный разброс количественных значений концентрации ИФН- при индукции ESAT-6, что затрудняло трактовку средних величин. Возможно, предшествующее «обучение» Т-лимфоцитов в ходе вакцинации, ревакцинации, а также инфицирование микобактериями других видов способствует увеличению пула Т-лимфоцитов, активно реагирующих на туберкулин выбросом ИФН-. Т-лимфоциты, специфично реагирующие на присущий только M. tuberculosis complex ESAT-6, у больных активным туберкулёзом, скорее всего, находятся в очаге поражения, а количество их в циркулирующей крови снижается, что отражается на концентрации продуцируемого ИФН- в периферической крови при экзогенной индукции.
Роль MБТ в патогенезе туберкулёза хорошо изучена, но роль данного микроорганизма в развитии саркоидоза остаётся спорной. При саркоидозе активация Т-клеточного звена иммунитета сопоставима с таковой при туберкулёзе и иммунопатогенез гранулематозного воспалительного процесса при саркоидозе, в целом, сходен с таковым при туберкулезе. В работе мы попытались оценить уровень ответа клеток периферической крови больных саркоидозом на индукцию туберкулином и специфическим антигеном ESAT-6 и сравнить полученные концентрации ИФН- с уровнем ответа при туберкулёзе.
Наличие PPD-индуцированного ИНФ- в периферической крови выявлено у всех больных саркоидозом, наиболее высокий его уровень (76,7±23,9 пг/мл) отмечен у больных саркоидозом ВГЛУ и легких. Индукция ИФН- ESAT-6 не была отмечена ни у одного больного саркоидозом с поражением только ВГЛУ и была максимально высокой у больных генерализованным саркоидозом (16,6±9,2 пг/мл). Достоверное отличие индукции ИФН- ESAT-6 отмечено между больными с саркоидозом ВГЛУ и больными с саркоидозом ВГЛУ, легких.
У больных с различной распространенностью саркоидоза ни показатели индуцированного ИФН-, ни традиционные лабораторные показатели активности статистически достоверно не различались. Можно отметить лишь более высокую концентрацию PPD-индуцированного ИФН- при саркоидозе органов дыхания (73,2±21,3 пг/мл), чем при генерализованном саркоидозе (44,1±12,6 пг/мл). При индукции ESAT-6 у больных с генерализованными процессами, наоборот, имела место тенденция к росту концентрации ИФН- (16,7±9,2 пг/мл) по сравнению с больными саркоидозом только органов дыхания (7,1±2,8 пг/мл).
В группе больных саркоидозом у трети пациентов (33,8%) изменения в легких изначально трактовали как туберкулёзный процесс без бактериовыделения, практически у всех имела место туберкулиновая анергия, а противотуберкулёзная терапия проводилась от 1 месяца до 7 лет. Достоверного влияния проведенной ранее противотуберкулёзной терапии на показатели индуцированного и PPD, и ESAT-6 ИФН-, а также на основные показатели гемограммы и биохимические маркеры воспаления, не выявлено.
Продукция ИФН-, индуцированная выбранными антигенами, у больных саркоидозом была существенно ниже, чем у больных туберкулёзом. Ответ клеток крови на антигены-индукторы выбросом ИФН- у некоторых больных может свидетельствовать о предшествующем инфицировании МБТ и наличии сформированного иммунного ответа. Не исключено также, что у тех больных саркоидозом, у которых отмечена продукция на антигены-индукторы, потенциальная способность к гранулемообразованию обусловлена МБТ или их антигенами как возможными триггерами саркоидозного процесса.
У больных НВЗЛ влияние антигенов на продукцию ИФН- схожа с ответом у больных туберкулёзом: индукция на ESAT-6 почти в 2 раза ниже, чем на PPD. Наименьший уровень индуцированного (как PPD, так и ESAT-6) ИФН- выявлен при неспецифической пневмонии, более выраженный ответ отмечен при необструктивном бронхите. Различия ответа при разных НВЗЛ (хотя и статистически недостоверная) может свидетельствовать об участие в воспалительном процессе лимфоцитов, продуцирующих ИФН-. Т.е. происходит перераспределение лимфоцитов из кровяного русла в зону воспаления, которая при пневмонии имеет большую распространённость, чем при иных НВЗЛ.
Концентрация ИНФ- при индукции PPD у больных туберкулёзом коррелирует только с концентрацией ИНФ-, индуцированного ESAT-6 (s = 0,6). У больных туберкулёзом легких выявлена прямая слабая корреляция концентрации ИНФ-, индуцированного ESAT-6, и числа лейкоцитов периферической крови (s = 0,3), что объяснимо зависимостью концентрации ИНФ- от числа клеток-продуцентов.
При саркоидозе уровни PPD- и ESAT-6-индуцированного ИНФ- не коррелировали с показателями ЦИК, фибриногена, общего белка и его фракций, общего анализа крови. Отмечена корреляционная связь между концентрациями ИНФ-, индуцированного ESAT-6 и индуцированного PPD (s=0,559).
При НВЗЛ корреляционная связь также выявлена только между концентрацией ИНФ-, индуцированного ESAT-6, и концентрацией ИНФ-, индуцированного PPD (s=0,807).
Согласно U-тесту (метод Манна и Уитни), концентрация ИФН- при индукции PPD высоко достоверно различалась как при туберкулёзе и саркоидозе, туберкулёзе и НВЗЛ, так и при саркоидозе и НВЗЛ. Средние значения концентрации ИФН- при индукции PPD наиболее высокими были при туберкулёзе (302,1±32,6 пг/мл), а наименьшими при саркоидозе (66,7±16,8 пг/мл), составив при НВЗЛ 198,2 ±41,9 пг/мл.
При индукции более специфическим антигеном ESAT-6 средние показатели концентрации ИФН- были существенно ниже, чем при индукции PPD. При саркоидозе индукция ИФН-, обусловленная ESAT-6, отсутствовала более, чем в половине случаев (средняя концентрация 9,2 ± 2,98 пг/мл). А при НВЗЛ основная доля значений (75%) не превышала 69 пг/мл (95,2 ± 29,4 пг/мл). И хотя у некоторых больных во всех изучаемых нами группах имелись показатели существенно превышающие средние значения, зависимости высокой концентрации индуцированного ИФН- от клинической, рентгенологической картины, лабораторных показателей, бактериовыделения нами не получено. Согласно U-тесту (метод Манна и Уитни) концентрации ИФН- при индукции ESAT-6 также высоко достоверно отличались как между туберкулёзом и саркоидозом, туберкулёзом и НВЗЛ, так и между саркоидозом и НВЗЛ.
Учитывая оптимальное соотношение чувствительности и специфичности метода на наш взгляд, величина 70 пг/мл более предпочтительна в качестве порогового значения концентрации антигениндуцированного ИФН- (в пользу туберкулёзной этиологии – превышение показателями пороговой величины). В работе по изучению антигениндуцированного ИФН- среди детей и подростков концентрация ИФН- равная 70 пг/мл [Л.И.Мордовская и соавт.,2008,2009] также выделена в качестве порогового значения.
В целом из 171 изученного нами пациента показатель индуцированного ИФН- >70 пг/мл на оба антигена-индуктора имели 48 из 60 больных туберкулёзом (80%), 16 из 67 пациентов саркоидозом (23,9%) и 23 из 44 пациентов НВЗЛ (52,3%). Шансы на наличие туберкулёза легких при показателе индуцированного ИФН- >70 пг/мл выше в 7,4 раза [95%ДИ 3,316,7], чем на наличие нетуберкулёзного заболевания. При данных условиях чувствительность метода составляет 80% [95%ДИ 69,688,1], а специфичность 65% [95%ДИ 5969]. Диагностическая эффективность принятого критерия для определения туберкулёза в дифференциальной диагностике между туберкулёзом и нетуберкулёзными заболеваниями легких равна 70,2%. О высокой достоверности результатов свидетельствует критерий 2 (p <0,001).
Таблица 1
Диагностические критерии наличия саркоидоза или туберкулёза в зависимости от пороговой величины концентрации ИФН-
| Пороговые величины индуцированного ИФН- на оба антигена | |||
| <50 пг/мл | <70 пг/мл | <100 пг/мл | |
| Число больных саркоидозом | 46 | 51 | 56 |
| Отношение шансов [95% ДИ] | 14,2 [5,339,4] | 12,8 [5,132,8] | 18,4 [6,950,2] |
| Чувствительность [95% ДИ] | 68,7 % [60,674,7%] | 76,1% [67,882,7%] | 83,6% [75,589,7%] |
| Специфичность [95% ДИ] | 86,7% [77,693,1%] | 80% [70,787,3%] | 78,3% [69,385,2%] |
| Диагн. эффективность | 77,2% | 77,9% | 81,1% |
| Критерий 2 | р < 0,001 | р < 0,001 | Р < 0,001 |
Диагностическая эффективность принятого критерия для определения туберкулёза в дифференциальной диагностике между туберкулёзом и саркоидозом равна 77,9%. При наличии в плазме индуцированного ИФН- < 70 пг/мл шансы на наличие у больного саркоидоза выше, чем на наличие туберкулеза в 12,8 раз (95%ДИ 5,1 32,8).Чувствительность данного теста для дифференциального анализа между саркоидозом и туберкулёзом в пользу саркоидоза составляет 76,1%, а специфичность 80%. О высокой достоверности результатов свидетельствует критерий 2 (p < 0,001).
Диагностическая эффективность принятого критерия для определения НВЗЛ в дифференциальной диагностике между туберкулёзом и НВЗЛ равна 66,3%. При наличии в плазме индуцированного ИФН- в концентрации менее 70 пг/мл шансы на наличие у больного неспецифического воспалительного заболевания органов дыхания выше, чем наличия туберкулеза, в 3,7 раз (95%ДИ 1,49,6). При дифференциальной диагностике НВЗЛ и туберкулёза чувствительность данного теста в пользу НВЗЛ составит 47,7%, а специфичность – 80%. Критерий 2 свидетельствует о достоверности результатов (p <0,001).
Таблица 2
Диагностические критерии наличия НВЗЛ или туберкулёза в зависимости от пороговой величины концентрации ИФН-
| Пороговые величины индуцированного ИФН- на оба антигена | |||
| <50 пг/мл | <70 пг/мл | <100 пг/мл | |
| Число больных НВЗЛ | 15 | 21 | 26 |
| Oтношение шансов (ОR) [95% ДИ] | 3,4 [1,29,9] | 3,7 [1,49,6] | 5,2 [2,0413,6] |
| Чувствительность [95% ДИ] | 34,1% [23,642,8] | 47,7% [36,157,9] | 59,1% [47,269,3] |
| Специфичность [95% ДИ] | 86,7% [7993%] | 80% [71,587,4%] | 78,3% [69,685,8%] |
| Диагн.эффективность | 64,4% | 66,4% | 70,2% |
| Критерий 2 | Р<0,001 | Р<0,001 | Р<0,05 |
Для определения динамики высвобождения ИФН- на фоне подавляющей микобактериальную популяцию противотуберкулёзной терапии исследованы концентрации PPD- и ESAT-6-индуцированного ИФН- в ходе 4 месяцев основного курса противотуберкулёзной терапии.
Исходя из предположения, что уровень индукции ИФН- клетками периферической крови связан с объёмом поражения легочной ткани, мы оценили показатели антигениндуцированного ИФН- у больных с ограниченными изменениями в легких (1 группа) – 18 чел. (58%) и у больных с распространёнными процессами (2 группа) – 13 чел. (42%).
У больных с распространёнными туберкулёзными изменениями в легочной ткани средние показатели антигениндуцированного ИФН- (при индукции как PPD, так и ESAT-6) в начале лечения выше, чем при ограниченных процессах; концентрация антигениндуцированного ИФН- снижается через каждые 2 мес. и становится достоверно ниже по сравнению с исходными значениями через 4 мес. лечения (рис. 2 и 3). У больных с ограниченными процессами концентрация антигениндуцированного ИФН- на оба антигена ко 2 мес. химиотерапии незначительно снижается и нарастает по сравнению с исходными значениями (также на оба антигена) к 4 мес. лечения (рис. 2 и 3). Можно говорить о своеобразном «перекрёсте» концентраций антиген-индуцированного ИФН-: у больных с низкими показателями ИФН- на фоне противотуберкулёзной терапии концентрация ИФН- нарастает, а у больных с исходно высокими значениями концентрация ИФН- снижается. Это может свидетельствовать о разной степени напряженности иммунного ответа в зависимости от распространённости поражения. Изначально высокие показатели концентрации антигениндуцированного ИФН- у больных с распространёнными процессами могут быть подтверждением того факта, что ИФН- наряду с провоспалительным действием может быть причиной запуска цитокинопосредованного воспаления при высокой концентрации его в тканях.
В целом, при оценке уровня PPD-индуцированного ИФН- в плазме среди всех больных в ходе лечения мы выявили тенденцию к снижению как средних показателей концентрации, так и максимальных значений концентрации ИФН- через 2 месяца терапии и восстановление показателей до исходного уровня к 4 месяцу от начала противотуберкулёзной терапии. Нами не получено достоверных различий концентрации ИФН- на индукцию PPD до начала терапии и через 2-х месячные интервалы после начала лечения (по методу Манна и Уитни).
На фоне лечения у всех больных отмечена тенденция к снижению уровня ESAT-6-индуцированного ИФН- в плазме крови, как через 2, так и через 4 месяца (рис.4). Однако статистически достоверными были только различия в концентрация ESAT-6-индуцированного ИФН- до начала лечения и через 4 месяца терапии (р=0,015).
Рис.4. Динамика изменений средней концентрации индуцированного ИФН- (M±m пг/мл) на PPD и ESAT-6 через 2 и через 4 месяца противотуберкулёзной терапии (ПТТ).
Изменения концентрации индуцированного ИФН- в ответ на PPD и ESAT-6 оценены только в интенсивную фазу противотуберкулёзной химиотерапии. Выделение ИФН- при индукции разными антигенами различно. Выявлено снижение средних значений концентрации ESAT-6-индуцированного ИФН- в сыворотке крови в ходе лечения, в то время как концентрация PPD-индуцированного ИФН-, после небольшого снижения через 2 мес. противотуберкулёзной терапии, вернулась почти к исходным значениям к 4 мес. терапии. Нельзя исключить, что пул клеток, сохраняющих «память» об антигене PPD, преобладает среди циркулирующих лимфоцитов и более постоянен, в то время как клетки, несущие информацию о ESAT-6, представлены в периферической крови меньшим количеством, в большей степени задействованы в зонах туберкулёзного воспаления и их количество снижается при уменьшении микробной нагрузки. Последнее подтверждается наблюдаемым у изученных больных постепенном прекращении бактериовыделения, рассасыванием очаговых и/или инфильтративных изменений в легких, закрытием полостей распада. Возможно, изменения концентрации индуцированного ИФН- на более специфический антиген ЕSAT-6 закономерно отражают динамические изменения иммунного ответа на фоне эффективной противотуберкулёзной терапии.
Данные как зарубежных, так и отечественных исследователей по изучению образования клетками периферической крови ИФН- на индукцию туберкулёзными антигенами в ходе лечения неоднозначны. Ferrand R.A. и соавт., 2005, в своей работе показали, что средние значения индуцированного ИФН- в ответ на ESAT-6 были существенно выше у больных туберкулёзом, закончивших лечение, чем у больных в начале лечения. Ewer K. и соавт., 2006, указывают на уменьшение продукции ИФН- Т-лимфоцитами у студентов, инфицированных МБТ, подвергавшихся профилактической химиотерапии. По мнению Салиной Т.Ю., Морозовой Т.И., 2004, снижение синтеза ИФН- мононуклеарными клетками крови больных с распространенным, полиорганным и деструктивным туберкулезом связано с повреждением иммунокомпетентных клеток и их функциональным истощением, о чём свидетельствует низкий уровень спонтанной и индуцированной M. bovis (БЦЖ) продукции ИФН- мононуклеарными клетками периферической крови. Aiken A.M. и соавт., 2006, при положительном результате в ходе противотуберкулёзной терапии отмечали значительное уменьшение числа клеток, продуцирующих ИФН- при стимуляции ESAT-6.
В рамках ещё одной задачи проводилось определение ИФН- в плевральном выпоте у больных с плевритом. В результате комплексного обследования и клинического наблюдения у 38 (52,1%) из 73 пациентов в итоге установлен диагноз экссудативного плеврита туберкулезной этиологии (1 группа) и у 25 (34,6%) диагностирована нетуберкулезная природа плеврита (2 группа). Третью группу составили 10 (1,3%) больных с выпотом в остаточной плевральной полости после пульмонэктомии по поводу фиброзно-кавернозного или цирротического туберкулёза. У данных пациентов диагноз туберкулёза легких был известен, выпот в послеоперационный период исследовали для исключения МБТ, хотя характер выпота преимущественно обусловлен трансвазатом. Из 63 пациентов 1 и 2 группы только 4 поступили в клинику с установленным диагнозом туберкулезного плеврита, у остальных этиология плеврита была неизвестна, хотя две трети из них до этого находились в стационарах различного профиля от 1 до 6 месяцев.
Получены высокодостоверные различия между концентрацией ИФН- при плеврите туберкулезной этиологии (M±m 158,6±25,67 пг/мл) и нетуберкулезном плеврите (5,36±2,5 пг/мл), а также при плеврите туберкулезной этиологии и в плевральной жидкости после пульмонэктомии (22,9±7,4 пг/мл) (p<0,0001). При плевральном выпоте нетуберкулёзного генеза, а также при неактивном туберкулёзном плеврите основная доля значений не превышала уровня концентрации ИФН-, равного 50 пг/мл (рис.5).
Достоверно концентрация ИФН- в зависимости от преобладания нейтрофилов или лимфоцитов в экссудате не различалась, но имелись достоверные различия между показателями концентрации ИФН- при лимфоцитозе и при преобладании атипичных клеток в экссудате (p < 0,05 по критерию Манна и Уитни): показатели концентрации ИФН- среди всех групп больных при преобладании лимфоцитов в выпоте варьировали от 0 пг/мл (у 16 больных) до 428,5 пг/мл; при преобладании нейтрофилов - от 0 пг/мл (у 2 больных) до 535,7 пг/мл; при преобладании атипических клеток - от 0 пг/мл (у 5 больных) до 64,7 пг/мл. Данный факт может быть связан с отсутствием пула клеток-продуцентов ИФН- в экссудате при неопластическом процессе или уменьшением их доли в клеточном составе экссудата за счёт преобладания атипических клеток. По полученным нами данным использование критерия лимфоцитоза не может однозначно указывать на туберкулёзную этиологию плеврита.
Подводя итоги работы, можно отметить существенные различия в определении ИФН- в крови и в плевральном выпоте: определение ИФН- в плевральном выпоте для выявления туберкулёзного генеза плеврита имеет высокую диагностическую эффективность, а определение в крови ИФН-, индуцированного специфическими антигенами PPD и ESAT-6, самостоятельного значения не имеет, но может использоваться как вспомогательный иммунологический критерий для дифференциальной диагностики туберкулёза.
ВЫВОДЫ
1. Индукция ИФН- микобактериальными антигенами в образцах цельной крови у большинства больных саркоидозом отсутствует или не достигает порогового уровня (70 пг/мл): уровень продукции ИФН- на туберкулин PPD был ниже порогового уровня в 76,1% случаев, а на ESAT-6 индукция отсутствовала в 97% случаев. Диагностическая эффективность теста при дифференциальной диагностике саркоидоза и туберкулёза составила 77,9%, специфичность теста, ориентируясь на PPD-индуцированные значения ИФН-, составила 80%. Отношение шансов (OR) в пользу саркоидоза составляет 12,8 [95% ДИ 5,132,8].
2. Показатели чувствительности и диагностической эффективности метода определения антигениндуцированной продукции ИФН- для дифференциальной диагностики неспецифических воспалительных заболеваний легких (НВЗЛ) и туберкулёза при пороговом значении 70 пг/мл ниже, чем при саркоидозе и туберкулёзе, и не превышают 47,7% и 66,7% соответственно (ориентируясь на PPD-индуцированные значения ИФН-). Отношение шансов в пользу НВЗЛ составляет 3,7 [95% ДИ 1,49,6]. Специфичность теста 80%.
3. Через 4 месяца лечения у впервые выявленных больных туберкулёзом средняя концентрация антигениндуцированного (PPD и ESAT-6) ИФН- при распространённых процессах достоверно ниже, чем в начале лечения (р<0,05); при ограниченных процессах через 4 месяца лечения достоверных изменений не отмечено, но определена тенденция к повышению концентрации индуцированного ИФН-.
4. В ходе основного курса противотуберкулёзной терапии у впервые выявленных больных туберкулёзом средние показатели ИФН-, индуцированного специфическим рекомбинантным антигеном ESAT-6, к 4 месяцу статистически достоверно ниже чем в начале лечения (p<0,05), в то время как средние показатели PPD-индуцированного ИФН- достоверно не изменяются.
5. Достоверного различия средней концентрации антигениндуцирован-ного ИФН- на PPD и ESAT-6 у впервые выявленных больных туберкулёзом в зависимости от характера течения процесса и бактериовыделения не выявлено, хотя более высокие средние значения отмечены при распространённых процессах, массивном бактериовыделении, экссудативном типе воспаления.
6. Уровень концентрации ИФН- в плевральной жидкости более 50 пг/мл может служить надежным признаком туберкулезной этиологии экссудативного плеврита (диагностическая эффективность метода 92,7%, чувствительность 90 %, специфичность 96 %).
7. Определение уровня ИФН- в плевральной жидкости наиболее эффективно в острой фазе клинических проявлений экссудативного плеврита для своевременного начала специфической противотуберкулезной химиотерапии. Использование данного метода у больных с признаками регрессии плеврального выпота и на фоне противотуберкулёзной терапии малоинформативно.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Для дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза рекомендуется определение концентрации PPD- и ESAT-6- индуцированного ИФН- в образцах гепаринизированной периферической крови. Превышение концентрации 70 пг/мл может служить дополнительным аргументом в пользу туберкулёза. При обоих показателях - концентрации PPD- и ESAT-6- индуцированного ИФН- - менее 70 пг/мл более вероятен саркоидоз: чувствительность теста 76,1% [95% ДИ 67,882,7%], специфичность 80% [95% ДИ 70,787,3%]; шансы (OR) в пользу саркоидоза увеличиваются в 12,8 раз [95% ДИ 5,132,8]. Диагностическая эффективность теста 77,9% (р<0,001 по критерию 2).
- Для дифференциальной диагностики этиологии плеврита рекомендуется определение концентрации ИФН- в плевральной жидкости: показатель концентрации ИФН- более 50 пг/мл может служить достоверно эффективным диагностическим признаком туберкулезной этиологии плеврита (р<0,001 по критерию 2). Чувствительность теста составляет 90 % [95% ДИ 78,993,2%], специфичность – 96 % [95% ДИ 82,799,8%]. Диагностическая эффективность теста равна 92,7%.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Макарова Н.В., Владимирский М.А. Определение гамма-интерферона в диагностике туберкулёзной инфекции// Актуальные вопросы фтизиатрии, пульмонологии и торакальной хирургии. Сб.тез. всерос. конф. студентов и мол.учёных, посв. Всемир.дню борьбы с туб.– М.- 2006.- С.67-69.
- Макарова Н.В., Владимирский М.А., Игнашенкова Г.В., Ефремов Е.Е. Индукция интерферона-гамма антигенами микобактерий туберкулёза в образцах крови in vitro при туберкулёзе и саркоидозе легких// Аллергология и иммунология: материалы VI съезда аллергологов и иммунологов СНГ.- М.-2006.-Т.7-№3.-С.298.
- Макарова Н.В., Владимирский М.А., Борисов С.Е., Игнашенкова Г.В. Значение интерферон- в диагностике туберкулёза и саркоидоза// Туберкулез в России: материалы 8–го российского съезда фтизиатров.– М., 2007.– С. 199.
- Даренская С.Д., Владимирский М.А., Макарова Н.В., Емельянов М.Н., Кольцов К.И., Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В. Интерферон- в диагностике туберкулёзного экссудативного плеврита// Туберкулез в России: материалы 8–го российского съезда фтизиатров.– М., 2007.– С.196.
- Даренская С.Д., Макарова Н.В., Владимирский М.А., Емельянов М.Н., Кольцов К.И., Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В. Значение определения интерферона-гамма в диагностике туберкулезного экссудативного плеврита// Пробл. туберкулёза и болезней легких.- 2008. - №2. - с.29-32.
- Даренская С.Д., Макарова Н.В., Владимирский М.А., Киреева С.Г. Роль интерферона-гамма в диагностике туберкулёзного экссудативного плеврита// Междунар.конф.по торакоабдоминальной хирургии, 1-я: сбор.тез., посвящ. 100-летию со дня рождения акад. Б.В. Петровского.- М., 2008. - С.268-268.
