Исследование специфичности и биологической активности моноклональных аутоантител против тиреоглобулина
На правах рукописи
ШАШКОВА
Ольга Александровна
ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АУТОАНТИТЕЛ ПРОТИВ ТИРЕОГЛОБУЛИНА
14.00.36 – аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
| Научный руководитель: | доктор медицинских наук, профессор Климович Владимир Борисович |
| Официальные оппоненты: | доктор биологических наук, профессор |
| Ведущее учреждение: | Сесь Татьяна Павловна доктор медицинских наук, профессор Бубнова Людмила Николаевна Федеральное государственное учреждение Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М.Никифорова Министерства Российской Федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий |
Защита состоится “ ” ______________ 2009 года в ____ часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д.69/71).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12.
Автореферат разослан “ ” ______________ 2009 года
Ученый секретарь
Диссертационного совета
доктор медицинских наук Л.А. Бурова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Антитела, которые выявляют во взрослом организме при очевидном отсутствии иммунизирующих стимулов, а также у новорожденных и у стерильных животных, называют естественными [Avrameas, 1991]. Они способны реагировать со многими чужеродными антигенами, что дало повод обозначать их как полиреактивные [Notkins, 2004]. Эти антитела также взаимодействуют с аутоантигенами, поэтому их называют естественными аутоантителами (ЕАА) [Avrameas, Ternynk, 1995]. Репертуар ЕАА формируется на ранних этапах онтогенеза и остается стабильным в течение жизни индивида [Merbl et al., 2007]. Большая часть ЕАА кодируется V генами зародышевой линии, относится преимущественно к IgM и обладает низкой (Kd 104-107 mol/l) аффинностью [Coutinho, Kazatchkine, 1995]. Четко установленным различием между ЕАА и монореактивными антителами, выявляемыми при иммунизации и при патологических состояниях, является их эпитопная специфичность [Stahl et al., 2000; Zhou et al., 2007]. ЕАА распознают главным образом эволюционно консервативные антигенные детерминанты [Bouvet, Dighiero, 1998].
Роль ЕАА в организме остается недостаточно изученной. Показано, что с ними связана бактерицидная активность сыворотки крови, что они участвуют в реакциях нейтрализации, опсонизации и активации системы комплемента [Zhou et al., 2007]. Поэтому предполагают, что ЕАА являются одним из компонентов первой линии защиты от инфекций. Возможно, они принимают участие в поддержании естественной толерантности [Boes et al., 1998, Ehrenstein et al., 2000, Reitan et al., 2002].
К числу аутоантигенов, с которыми реагируют ЕАА в норме и при патологии, относится тиреоглобулин (Тг). В крови здоровых людей и животных обнаруживают значимые количества ЕАА против Тг. При развитии аутоиммунного тиреоидита их содержание по сравнению с нормой возрастает в десятки раз [Gentile et al., 2004], а репертуар распознаваемых эпитопов сужается [Caturegli et al., 1994]. На молекуле Тг выявлено около 40 антигенных детерминант [Ruf et al., 1987], степень вовлечения которых в продукцию ЕАА и во взаимодействия с ними может быть различной.
Данные о биологической активности антител против Тг ограничены. В большей части исследований были использованы выделенные из сыворотки поликлональные антитела. Введение таких препаратов экспериментальным животным не дало однозначных результатов [Vladutiu, Rose, 1971; Inoue et al., 1993; Tomer et al., 1997]. В работах по получению гибридом из клеток неиммунизированных взрослых или новорожденных мышей [Dighiero et al., 1983; Ternynck, Avrameas, 1986] свойства ЕАА против Тг не исследованы. Моноклональные антитела (МКАТ) способны распознавать отдельные эпитопы молекул антигенов. Это дает возможность выявить те детерминанты Тг, которые взаимодействуют с ЕАА, а также оценить влияние ЕАА с разной эпитопной специфичностью на функции щитовидной железы.
Цель исследования состояла в получении моноклональных вариантов ЕАА против Тг, изучении их свойств и возможной роли в развитии нарушений тиреоидного статуса у мышей.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи.
1. Создать панель МКАТ, распознающих Тг мыши.
2. Исследовать эпитопную специфичность и перекрестную реактивность полученных МКАТ.
3. Сравнить свойства МКАТ и ЕАА, присутствующих в сыворотке интактных мышей.
4. Изучить влияние МКАТ c различной эпитопной специфичностью на тиреоидный статус мышей.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Получена панель МКАТ, распознающих 19 эпитопов на молекуле Тг мыши.
2. На основании данных об эпитопной специфичности и перекрестной реактивности среди полученных МКАТ отобраны реагенты, которые представляют собой моноклональные варианты ЕАА.
3. Введение МКАТ, обладающих свойствами ЕАА, вызывает у мышей изменения структуры и функции щитовидной железы.
4. Иммунизация мышей Тг на фоне введения МКАТ, связывающих некоторые эпитопы Тг, вызывает развитие лимфоцитарной инфильтрации щитовидной железы.
Научная новизна работы.
1. Создана наиболее широкая из описанных в литературе панелей МКАТ, распознающих эволюционно консервативные эпитопы Тг мыши.
2. Впервые установлено, что репертуар эпитопов Тг, распознаваемых ЕАА интактных инбредных мышей, варьирует индивидуально и не коррелирует с генетически обусловленной восприимчивостью животных к индукции аутоиммунного тиреоидита.
3. Впервые показано, что введение моноклональных ЕАА, распознающих некоторые эпитопы Тг мыши, вызывает нарушения синтеза тиреоидных гормонов и структуры ткани щитовидной железы.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Работа направлена на решение фундаментальной проблемы иммунологии – расшифровку механизмов, участвующих в нарушении иммунологической толерантности при развитии аутоиммунных заболеваний. В результате исследования созданы МКАТ, представляющие собой моноклональные варианты ЕАА. Полученные реагенты открывают новые возможности для изучения репертуара ЕАА против Тг и антигенной структуры Тг животных различных видов.
Данные о влиянии моноклональных вариантов ЕАА на тиреоидный статус мышей согласуются с гипотезой, что ЕАА могут участвовать в развитии аутоиммунных патологических процессов. Полученные МКАТ могут быть использованы при разработке новых экспериментальных моделей аутоиммунного тиреодита.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты 99-04-49823, 01-04-49781 и 05-04-48862).
Личный вклад автора в проведение исследований. Основные данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором проведены все экспериментальные исследования на животных, изучен их тиреоидный статус и свойства ЕАА. Получение МКАТ и изучение их свойств осуществлялось совместно с группой сотрудников лаборатории гибридомной технологии ФГУ Российского научного центра радиологии и хирургических технологий МЗСР РФ. Автором выполнены все этапы создания гибридом, получения МКАТ, изучения их свойств. Обработка результатов экспериментов и подготовка публикаций сделаны автором диссертации совместно с научным руководителем. При оценке гистологического материала автор пользовался консультативной помощью сотрудников лаборатории иммуногистохимии, группы патоморфологии с прозектурой ФГУ Российского научного центра радиологии и хирургических технологий МЗСР РФ и кафедры цитологии и гистологии Санкт-Петербургского государственного университета.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на XII Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001), Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2002), Всероссийских форумах "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 1999, 2002, 2003, 2005, 2006), Международной научно-практической школе-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет" (Санкт-Петербург, 2002), 6-ой и 7-ой школах Джона Хамфри по иммунологии (Пущино, 2002; Москва, 2005), 5-ом Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2002), научно-практической конференции "Современные технологии в клинической медицине" (Санкт-Петербург, 2003), II и III съездах иммунологов России (Сочи, 1999, Екатеринбург, 2004), научной конференции "От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгено-радиологического института" (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации. Материалы диссертации отражены в 6 статьях и 21 тезисах.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения; обзора литературы; экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования; обсуждения; выводов; списка литературы, состоящего из 281 источника; приложения. Работа изложена на 127 страницах и содержит 29 рисунков и 19 таблиц.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Животные. В работе были использованы мыши линий SJL/j, CBA, BALB/c, а также межлинейные гибриды F1(SJL/jBALB/c).
Антигены. Использованы коммерческие препараты Тг человека (Алкор, Аллерген, Hytest), быка и свиньи (Sigma), ацетилхолинэстеразы из эритроцитов быка, миозина из сердца свиньи, инсулина быка (Sigma), тиреоидной пероксидазы (Hytest), трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) (Алкор). Препараты Тг мыши, крысы, человека и курицы были получены из гомогенатов щитовидных желез методом солевой экстракции с последующим осаждением полунасыщенным нейтральным раствором сульфата аммония. Тг человека и крысы подвергали дополнительно очистке методом гель-фильтрации. Тг мыши выделяли методом аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными МКАТ, полученными в ходе выполнения настоящей работы.
Антитела и антисыворотки. Для изучения взаимодействия с антигенами МКАТ и/или сывороточных антител использовали полученные в лаборатории аффинно очищенные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой из корней хрена, козьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные со щелочной фосфатазой (Sigma), МКАТ против Т3 и Т4 (Алкор). Изотипы мышиных иммуноглобулинов определяли при помощи моноспецифических антисывороток (Calbiochem).
При определении концентрации мышиных иммуноглобулинов использовали полученные в лаборатории аффинно очищенные кроличьи антитела против F(ab)2 фрагментов иммуноглобулинов мыши.
Для изучения свойств ЕАА, распознающих Тг, получены образцы пуловых и индивидуальных сывороток крови интактных мышей линий SJL/j, CBA и BALB/c, глобулиновая фракция из которых выделена с помощью осаждения сульфатом аммония.
Твердофазный иммуноферментный анализ. Способность антител взаимодействовать с Тг мыши, крысы, человека, быка, свиньи, курицы, Т3 и Т4 изучали методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для изучения специфичности МКАТ и ЕАА в отношении эпитопов Тг мыши использовали метод ингибиторного ИФА. Перекрестную реактивность МКАТ с ацетилхолинэстеразой, тиреоидной пероксидазой, кардиомиозином и инсулином исследовали методами непрямого и ингибиторного ИФА. В сыворотке крови определяли концентрацию Т4 методом ингибиторного ИФА при помощи набора реагентов "ТироидИФА-тироксин-01" для количественного определения общего Т4 в сыворотке крови человека (Алкор) и титр антител против Тг крысы при помощи метода непрямого ИФА.
Гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Щитовидные железы мыши, крысы, человека, собаки, кошки и голубя фиксировали в 10%-ном водном формалине, заключали в парафин и готовили срезы толщиной 3-5 мкм. Срезы ткани окрашивали гематоксилином и эозином. Взаимодействие МКАТ с Тг на срезах ткани щитовидных желез мыши, кошки, собаки и голубя было изучено при помощи непрямого иммуногистохимического метода.
Получение гибридомных клеток-продуцентов МКАТ против Тг мыши. Мышей линии SJL/j иммунизировали экстрактом из ткани щитовидной железы крысы или Тг человека в количестве 10-20 мкг на инъекцию: первый раз внутрикожно, второй – подкожно, в полном и неполном адъюванте Фрейнда, соответственно (Sigma). В последующем 5-30 мкг антигена вводили внутрибрюшинно в фосфатно-солевом буфере. Гибридомы получали согласно общепринятой методике [Galfe et al., 1977] путем слияния иммунных клеток селезенки или смеси клеток селезенки, костного мозга, паховых и подколенных лимфатических узлов и клеток миеломного штамма 653А.
Присутствие в культуральной жидкости антител к иммуногену выявляли с помощью метода непрямого ИФА. Позитивные культуры клонировали методом лимитирующих разведений. Гибридомы-продуценты МКАТ, распознающих Тг мыши, отбирали с помощью непрямого иммуногистохимического метода на срезах ткани щитовидных желез интактных мышей линии SJL/j при использовании супернатантов массовых культур.
Клетки гибридом прививали мышам F1(SJL/jBALB/c). МКАТ из асцитической жидкости осаждали сульфатом аммония. Дальнейшую очистку осуществляли при помощи метода аффинной хроматографии с использованием протеин-G-сефарозы. МКАТ конъюгировали с перексидазой из корней хрена по методу Накане.
Методы статистического анализа. Сравнение обратных титров антител против Тг и концентраций Т4 проводили при помощи U-критерия Манна-Уитни в программе Statistica (StatSoft).
.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Получение МКАТ, распознающих Тг мыши, и изучение их свойств.
Для создания МКАТ, взаимодействующих с Тг мыши, было использовано два подхода. Один из них предполагал создание антител против антигенных детерминант общих для Тг мыши и человека, второй – для Тг мыши и крысы. Донорами иммунных лимфоцитов служили мыши линии SJL/j, которые обладают ослабленным контролем экспансии В-лимфоцитов, что предполагает синтез более широкого репертуара антител, чем у животных других инбредных линий, и генетической восприимчивостью к индукции аутоиммунного тиреоидита с помощью Тг [Haran-Ghera et al., 1967; Vladutiu, Rose, 1971]. Было испытано несколько схем иммунизации, которые различались количеством введений антигена и интервалами между ними, общей длительностью иммунизации. В результате пяти проведенных слияний отобрано 23 стабильных штамма гибридом-продуцентов антител искомой специфичности. Для удобства изложения всем МКАТ были присвоены порядковые номера.
Среди МКАТ преобладают реагенты IgG изотипа (IgG1 – 30%, IgG2a – 26%, IgG2b – 13%), треть реагентов (30%) относится к классу IgM.
Из полученных 23 МКАТ пять обладают сильным сродством к Тг мыши – распознают антиген в концентрациях менее 1 мкг/мл, тогда как остальные – только в количествах превышающих 1 мкг/мл (рис. 1). Таким образом, большинство МКАТ обладает низкой способностью связывать аутоантиген. Специфичность взаимодействия МКАТ с Тг мыши была подтверждена в иммуногистохимическом исследовании.
 | Рис. 1. Взаимодействие МКАТ с иммобилизованным на твердой фазе Тг мыши. По оси абсцисс – концентрация МКАТ (мкг/мл). По оси ординат – оптическая плотность. |
Выявлены реагенты, взаимодействующие с эпитопами, представленными на Тг млекопитающих (10 МКАТ) или Тг млекопитающих и птиц (13 МКАТ). Для исследования эпитопной специфичности МКАТ оценивали их способность ингибировать взаимодействие друг друга с Тг мыши. Чтобы установить, распознают ли антитела, которые взаимно препятствуют связыванию с антигеном двух и более МКАТ, общий эпитоп, сопоставили их перекрестную реактивность с Тг животных разных видов. В результате было показано, что полученные МКАТ распознают на молекуле Тг мыши, по крайней мере, 19 консервативных эпитопов (табл. 1 и 2). Изучена перекрестная реактивность антител с антигенами, которые обладают общими эпитопами с Тг (тиреоидными гормонами, ацетилхолинэстеразой и тиреоидной пероксидазой), и негомологичными антигенами, которые, также как и Тг, вовлекаются в аутоиммунные процессы (инсулином и кардиомиозином). Ряд МКАТ взаимодействует помимо Тг с ацетилхолинэстеразой, тиреоидной пероксидазой, инсулином или кардиомиозином (табл. 1 и 2). Не выявлено реагентов, связывающихся с тиреоидными гормонами, таким образом МКАТ не направлены к гормоногенным участкам Тг.
Таблица 1.
Перекрестная реактивность МКАТ, распознающих Тг млекопитающих
| антигены | номер МКАТ | ||||||||
| 21 | 18 | 10/14 | 6 | 11 | 7 | 5 | 13 | 16 | |
| Тг крысы | |||||||||
| Тг человека | |||||||||
| Тг быка | |||||||||
| Тг свиньи | |||||||||
| Тг кошки | |||||||||
| Тг собаки | |||||||||
| ацетилхолинэстераза | |||||||||
| инсулин | |||||||||
| кардиомиозин | |||||||||
Таблица 2.
Перекрестная реактивность МКАТ, распознающих Тг млекопитающих и птиц
| антигены | номер МКАТ | |||||||||
| 1/23 | 8 | 9 | 2/22 | 12 | 4 | 17 | 20 | 19 | 3/15 | |
| Тг крысы | ||||||||||
| Тг человека | ||||||||||
| Тг быка | ||||||||||
| Тг свиньи | ||||||||||
| Тг кошки | ||||||||||
| Тг собаки | ||||||||||
| Тг курицы | ||||||||||
| Тг голубя | ||||||||||
| ацетилхолинэстераза | ||||||||||
| тиреоидная пероксидаза | ||||||||||
| кардиомиозин | ||||||||||
Примечание: Через дробь обозначены МКАТ, направленные к одному эпитопу Тг (ингибируют взаимодействие друг друга с Тг мыши и обладают идентичной видовой специфичностью).
| – наличие перекрестного взаимодействия с антигеном. |
2. Сопоставление свойств МКАТ и ЕАА мышей.
Исследовали содержание аутоантител против Тг в сыворотках крови интактных мышей линий резистентных (BALB/c) и восприимчивых (SJL/j, CBA) к индукции аутоиммунного тиреоидита. У мышей инбредного штамма CBA значения титров находятся в диапазоне 1/50–1/450, у SJL/j и BALB/c – 1/20–1/50. Таким образом, содержание ЕАА, распознающих Тг, у мышей линии CBA достоверно выше, чем у животных других линий (р<0,05). Различий между титрами ЕАА у мышей SJL/j и BALB/c не выявлено.
Изучена специфичность ЕАА мышей в отношении всех эпитопов Тг мыши, выявленных в настоящей работе. Использованы 19 МКАТ, каждое из которых распознает отдельный эпитоп аутоантигена. Глобулиновые фракции пуловых сывороток мышей всех трех линий ингибируют связывание с Тг мыши 10 МКАТ и не препятствуют связыванию с антигеном 9 МКАТ. Аналогичное исследование было проведено с использованием индивидуальных сывороток интактных мышей линий SJL/j и BALB/c. Все образцы индивидуальных сывороток ингибируют взаимодействие с Тг большинства МКАТ. Связыванию шести реагентов с антигеном препятствовали индивидуальные сыворотки 2-5 мышей каждой линии (табл. 3).
Таблица 3.
Влияние глобулиновых фракций пуловых и индивидуальных сывороток интактных мышей на взаимодействие МКАТ с Тг мыши
| номер МКАТ | пуловые сыворотки | индивидуальные сыворотки | |||||||||||||
| линия мышей | линия мышей / образец сыворотки | ||||||||||||||
| CBA | SJL/j | BALB/c | SJL/j | BALB/c | |||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||
| 1 | |||||||||||||||
| 3 | |||||||||||||||
| 4 | |||||||||||||||
| 5 | |||||||||||||||
| 8 | |||||||||||||||
| 10 | |||||||||||||||
| 11 | |||||||||||||||
| 17 | |||||||||||||||
| 19 | |||||||||||||||
| 21 | |||||||||||||||
| 2 | |||||||||||||||
| 6 | |||||||||||||||
| 7 | |||||||||||||||
| 9 | |||||||||||||||
| 12 | |||||||||||||||
| 13 | |||||||||||||||
| 16 | |||||||||||||||
| 18 | |||||||||||||||
| 20 | |||||||||||||||
Примечание:
| – ингибирование (> 30%) сульфатными фракциями сывороток связывания | |
| меченных перексидазой из корней хрена МКАТ с Тг мыши. | |
| – отсутствие ингибирования. |
Таким образом, все эпитопы, к которым направлены полученные МКАТ, распознаются ЕАА. Не выявлено различий в эпитопной направленности ЕАА, распознающих Тг, у мышей линий генетически восприимчивых (SJL/j, CBA) и устойчивых (BALB/c) к индукции аутоиммунного тиреоидита. Индивидуальные сыворотки интактных мышей одной и той же линии обладают различными спектрами эпитопной направленности распознающих Тг ЕАА.
Созданные МКАТ представляют собой мышиные аутоантитела против Тг, поскольку получены от мышей и взаимодействуют с аутоантигеном. Все моноклональные аутоантитела соответствуют ЕАА мышей по эпитопной специфичности. Среди них выделено 10 реагентов также обладающих еще двумя из таких характерных свойств ЕАА как перекрестная реактивность с негомологичными антигенами, низкая способность связываться с Тг мыши и принадлежность к IgM изотипу, и 10 других МКАТ одним свойством – низкой способностью взаимодействовать с аутоантигеном. Оставшиеся три реагента с наименьшей долей вероятности могут быть отнесены к ЕАА, поскольку соответствуют им только по эпитопной специфичности (табл. 4).
Таблица 4.
Сопоставление свойств полученных МКАТ и ЕАА*
| номер МКАТ | аффинитет | изотип | полиреактивность | |
| 1 | низкий | IgM | тиреоидная пероксидаза | |
| 10 | низкий | IgM | не выявлено | |
| 14 | низкий | IgM | не выявлено | |
| 17 | низкий | IgM | ацетилхолинэстераза | |
| 22 | низкий | IgM | не выявлено | |
| 3 | высокий | IgM | кардиомиозин | |
| 15 | высокий | IgM | кардиомиозин | |
| 5 | низкий | IgG2a | инсулин | ацелилхолинэстераза |
| 11 | низкий | IgG2b | кардиомиозин | |
| 19 | низкий | IgG1 | кардиомиозин | |
| 2 | низкий | IgG2b | не выявлено | |
| 4 | низкий | IgG2a | ацелилхолинэстераза | |
| 6 | низкий | IgG1 | не выявлено | |
| 7 | низкий | IgG2b | не выявлено | |
| 8 | низкий | IgG2a | не выявлено | |
| 9 | низкий | IgG2a | не выявлено | |
| 12 | низкий | IgG1 | не выявлено | |
| 13 | низкий | IgG1 | не выявлено | |
| 18 | низкий | IgG1 | не выявлено | |
| 23 | низкий | IgG1 | тиреоидная пероксидаза | |
| 16 | высокий | IgG2a | не выявлено | |
| 20 | высокий | IgG1 | не выявлено | |
| 21 | высокий | IgG2a | не выявлено | |
Примечание:
| – соответствие свойствам ЕАА. |
* – все МКАТ соответствуют ЕАА по эпитопной специфичности.
3. Изучение влияния введения аутоантител против Тг на тиреоидный статус мышей.
Для исследования влияния эпитопной специфичности инъецированных аутоантител на тиреоидный статус мышей линии SJL/j было выбрано 9 МКАТ. Каждое МКАТ распознает отдельную антигенную детерминанту и в различной степени обладает характеристиками ЕАА. Помимо эпитопной специфичности антитела 1, 11, 14, 15 обладают еще двумя свойствами ЕАА (перекрестная реактивность с негомологичными антигенами и/или низкая способность связываться с Тг мыши и/или принадлежность к IgM изотипу); антитела 2, 4, 7, 13 – только низкой способностью взаимодействовать с аутоантигеном; антитело 21 – ни одним. Чтобы выяснить, существуют ли различия в ответе животных различных инбредных штаммов на введение одних и тех же МКАТ, три реагента инъецировали мышам линии CBA.
МКАТ вводили внутрикожно в полном адъюванте Фрейнда в количестве 0,02 мг на животное, через две недели осуществляли повторное введение антител в той же дозе подкожно в неполном адъюванте. Контролем служили интактные мыши соответствующей линии, а также животные, которым вводили полученные в лаборатории МКАТ против флуоресцеина (2А3), МКАТ против видоспецифичного эпитопа Тг человека (5Е6) или только адъювант Фрейнда.
Введение любого из МКАТ, распознающих Тг мыши, вызывало у реципиентов нарушения тиреоидного статуса (табл. 5).
Таблица 5.
Результаты исследования тиреоидного статуса мышей после введения МКАТ
| номер МКАТ | структура щитовидной железы | Т4 | антитела против Тг | ||||
| сутки от начала опыта | |||||||
| 14 | 28 | 42 | 56 | 70 | |||
| мыши линии SJL/j | |||||||
| 1 | N | N | N | ||||
| 11 | N | ||||||
| 14 | N | N | н.и. | ||||
| 15 | N | N | N | н.и. | |||
| 2 | N | N | н.и. | ||||
| 4 | N | N | N | N | N | ||
| 7 | N | ||||||
| 13 | N | N | н.и. | ||||
| 21 | N | N | N | N | N | ||
| мыши линии CBA | |||||||
| 11 | N | N | н.и. | ||||
| 15 | N | N | N | N | н.и. | ||
| 21 | N | н.и. | |||||
Примечание: N – не отличается от наблюдаемого у интактных мышей.
– достоверно выше/ниже, наблюдаемого у интактных мышей (p<0,05).
н.и. – не исследовали.
|
Изменения структуры ткани щитовидной железы, а также содержания Т4 и антител против Тг в сыворотках крови отмечали в разных экспериментальных группах на один-четыре срока исследования. Концентрация Т4 была достоверно ниже, чем у интактных животных. Исключение составили мыши, получавшие инъекции МКАТ 4 – концентрация Т4 была достоверно выше, чем у интактных животных. У мышей линии SJL/j исследовано влияние введения некоторых из МКАТ на содержание в сыворотке крови антител против Тг. При инъекциях МКАТ 1 или 4 титр антител сохранялся на уровне нормы и был повышен после введения МКАТ 7, 11 или 21. На рисунках 2 и 3 в качестве иллюстрации представлены результаты изучения содержания Т4 и антител против Тг у мышей одной из экспериментальных групп.
 | Рис. 2. Концентрации Т4 в сыворотках крови мышей линии SJL/j, которым вводили МКАТ 11. По оси абсцисс – сутки от начала опыта. По оси ординат – концентрация Т4 (нмоль/л). Квадрат/ромб – медиана; прямоугольник – квартильный размах (25%, 75% процентили); линии – минимальное и максимальное значения; пунктир – выбросы. |
 | Рис. 3. Титры антител против Тг крысы в сыворотках крови мышей линии SJL/j, которым вводили МКАТ 11. По оси абсцисс – сутки от начала опыта. По оси ординат – обратный титр антител против Тг крысы (log3). Квадрат/ромб – медиана; прямоугольник – квартильный размах (25%, 75% процентили); линии – минимальное и максимальное значения; пунктир – выбросы. |
Выявлено три морфологических варианта изменения структуры ткани щитовидной железы. Наиболее распространенным было уплощение тиреоцитов и увеличение размеров фолликулов по сравнению с нативной структурой ткани – I тип изменений. Наряду с изменениями I типа у мышей некоторых экспериментальных групп наблюдали отложения солей кальция в коллоиде (II тип) или увеличение размера тиреоцитов, в большинстве случаев сопровождающееся отложением солей кальция в коллоиде (III тип) (рис. 4). Нарушения структуры ткани щитовидной железы наблюдали у животных всех экспериментальных групп, за исключением мышей линии SJL/j, которым вводили МКАТ 21. При этом у животных инбредного штамма СВА после введения данного антитела морфология ткани щитовидной железы была изменена. В отличие от остальных МКАТ антитело 21 направлено к наименее консервативному эпитопу аутоантигена, представленному только на Тг мыши и крысы, и соответствует ЕАА только по эпитопной специфичности. Полученные данные позволяют предположить, что генетический фон реципиента оказывает влияние на степень серьезности тиреоидных нарушений при введении антител, обладающих в основном свойствами иммуноглобулинов, ассоциированных с аутоиммунной патологией.
  | Рис. 4. Гистологическое исследование ткани щитовидных желез мышей (окрашивание гематоксилином и эозином) (200х). А – нативная структура ткани. Б – I тип изменений. В – II тип. Г – III тип. Серые стрелки указывают на коллоид, белые – на тиреоциты, черные – соли Ca2+. |
Таким образом, введение МКАТ, распознающих Тг мыши, вызывает у мышей линий SJL/j и CBA функциональные нарушения тиреоидного статуса в большинстве случаев сопровождающиеся изменениями структуры ткани щитовидной железы.
4. Изучение влияния введения аутоантител и Тг на тиреоидный статус мышей.
Изучение тиреоидного статуса после введения аутоантител и Тг проводили на мышах линии SJL/j с использованием МКАТ 11, 14 или 21. В предыдущем разделе было показано, что у мышей данной линии после введения МКАТ 11 почти на все сроки исследования изменена структура ткани щитовидной железы: уплощены тиреоциты и увеличены фолликулы, в ряде случаев происходит отложение солей кальция в коллоиде. Антитело 14 вызывает нарушения морфологии железы, наблюдаемые при инъекциях большинства из МКАТ: на три срока исследования отмечали уплощение тиреоцитов и увеличение размеров фолликулов. При инъекциях антитела 21 сохранялась нативная структура ткани щитовидной железы.
МКАТ вводили внутрибрюшинно в фосфатно-солевом буфере четыре раза с интервалом 2-3 дня в течение двух недель в количестве 0,25 мг на инъекцию. Через двое суток после последней инъекции МКАТ вводили Тг крысы. Инъекцию Тг в количестве 0,05 мг осуществляли внутрикожно в полном адъюванте Фрейнда, через две недели подкожно в неполном адъюванте. В качестве контроля отдельно исследовали влияние введения Тг без МКАТ.
После введения Тг в сочетании с любым из МКАТ у реципиентов в сыворотке крови увеличивалось содержание Т4 и титр антител против Тг по сравнению с интактными мышами. Исследовали только титр антител против Тг подкласса IgG1, чтобы исключить выявление введенных МКАТ, которые относятся к другим изотипам (рис. 5 и 6). Аналогичные изменения тиреоидного статуса наблюдали и при введении Тг без МКАТ.
 | Рис. 5. Концентрации Т4 в сыворотках крови мышей после введения Тг и МКАТ. По оси абсцисс – сутки от начала опыта. По оси ординат – концентрация Т4 (нмоль/л). Квадрат/ромб/треугольник/круг – медиана; прямоугольник – квартильный размах (25%, 75% процентили); линии – минимальное и максимальное значения; пунктир – выбросы. |
 | Рис. 6. Титры антител подкласса IgG1 против Тг крысы в сыворотках крови мышей после введения Тг и МКАТ. По оси абсцисс – сутки от начала опыта. По оси ординат – обратный титр антител класса IgG против Тг крысы (log3). Квадрат/ромб/треугольник/круг – медиана; прямоугольник – квартильный размах (25%, 75% процентили); линии – минимальное и максимальное значения. |
Изменения структуры ткани щитовидной железы наблюдали только при введении Тг в сочетании с аутоантителами. При использовании МКАТ 11 наблюдали развитие инфильтрации ткани железы лимфоидными клетками к 35 суткам после первого введения антигена (рис. 7). Введение Тг на фоне инъекций МКАТ 14 и 21 вызывало формирование у некоторых мышей гигантских фолликулов с уплощенными тиреоцитами. У ряда реципиентов после введения Тг и любого из МКАТ наблюдали увеличение размера тиреоцитов.
 | Рис. 7. Лимфоцитарная инфильтрация ткани щитовидной железы после введения мышам Тг и МКАТ 11 (окрашивание гематоксилином и эозином) (200х). Серые стрелки указывают на коллоид, белые – на тиреоциты, черные – лимфоциты. |
Таким образом, введение моноклонального аутоантитела 11 в сочетании с Тг индуцирует развитие у мышей линии SJL/j аутоиммунного заболевания щитовидной железы: лимфоцитарную инфильтрацию ткани железы, нарушение синтеза тиреоидных гормонов, повышение титра антител против Тг.
ВЫВОДЫ
1. На основе лимфоцитов мышей линии SJL/j, иммунизированных тиреоглобулином человека или крысы, получено 23 штамма гибридом-продуцентов моноклональных антител, распознающих на молекуле тиреоглобулина мыши 19 эволюционно консервативных эпитопов.
2. Моноклональные антитела конкурируют с естественными аутоантителами мышей линий SJL/j, CBA и BALB/c за связывание с тиреоглобулином мыши.
3. Полученные моноклональные антитела могут быть отнесены к категории естественных аутоантител на основании их интерференции с аутоантителами интактных мышей и перекрестной реактивности с другими антигенами.
4. Введение моноклональных аутоантител вызывает у мышей нарушения тиреоидного статуса и изменения структуры ткани щитовидной железы.
5. Введение моноклональных аутоантител в сочетании с тиреоглобулином индуцирует развитие у мышей инфильтрации ткани щитовидной железы лимфоидными клетками и повышение уровня тиреоидных гормонов и антител против тиреоглобулина в сыворотке крови.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1) Климович В.Б., Руденко И.Я., Василевский Д.И., Львова (Шашкова) О.А. Изотипический состав и эпитопная специфичность аутоантител против тиреоглобулина// Медицинская Иммунология. 2000. Т.2. № 4. С.377-383.
2) Волкова А.Р., Дора С.В., Львова (Шашкова) О.А. Аутоиммунный тиреоидит: современный взгляд на проблему// Медлайн Экспресс. 2003. Т.164. № 7. С.13-15.
3) Пиневич А.А., Руденко И.Я., Львова (Шашкова) О.А., Климович В.Б. Эволюционно консервативные и видоспецифические антигенные детерминанты тиреоглобулинов млекопитающих// Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии. 2005. Т. 41. № 5. С.414-420.
4) Шашкова О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Волкова А.Р., Дора С.В., Климович В.Б. Исследование аутоантител к тиреоглобулину при лечении аутоиммунного тиреоидита L-тироксином // Медицинская Иммунология. 2005. Т.7. № 5-6. С.511-516.
5) Руденко И.Я., Пиневич А.А., Шашкова О.А., Климович В.Б. Сравнительно-биологический подход к идентификации антигенных детерминант молекулы тиреоглобулина// Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии. 2008. Т.44. № 2. С.209-211.
6) Климович В.Б., Пиневич А.А., Руденко И.Я., Шашкова О.А. Антигенные детерминанты тиреоглобулинов человека и животных, выявляемые с помощью моноклональных антител// Российский Иммунологический Журнал. 2008. Т.2 (11). № 1. С.38-47.
Тезисы докладов
1) Руденко И.Я., Львова (Шашкова) О.А., Василевский Д.И., Романчишен А.Ф., Климович В.Б. Изотипический состав и эпитопная специфичность аутоантител против тиреоглобулина// Медицинская Иммунология. 1999. Т.1. № 3-4. С.82.
2) Руденко И.Я., Львова (Шашкова) О.А., Василевский Д.И., Климович В.Б. 1999. Изучение разнообразия аутоантител против тиреоглобулина// Russian Journal of Immunology. 1999. Vol.4. Suppl.1. P.140.
3) Львова (Шашкова) О.А., Руденко И.Я., Климович В.Б. Филогенетически консервативные эпитопы тиреоглобулина и их взаимодействие с аутоантителами// Сборник трудов Международной конференции "XII Международное Совещание и V Школа по эволюционной физиологии", Санкт-Петербург, 19-25 ноября 2001 г. С.85-86.
4) Львова (Шашкова) О.А. Исследование аутоантител к тиреоглобулину у здоровых людей и пациентов с аутоиммунным тиреоидитом// Вестник Российского Государственного Медицинского Университета. 2002. № 1 (22). С. 137.
5) Львова (Шашкова) О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б. Исследование ответа мышей линии SJL/J на иммунизацию тиреоглобулинами человека и крысы// Медицинская Иммунология. 2002. Т. 4. № 2. С.127-128.
6) Львова (Шашкова) О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б., Волкова А.Р. Аутоантитела к тиреоглобулину у здоровых людей и пациентов с аутоиммунным тиреоидитом// Цитокины и Воспаление. 2002. Т. 1. № 2. С. 98.
7) Lvova (Shashkova) O.A., Rudenko I.Y., Pinevich A.A., and Klimovich V.B. The study of thyroglobulin autoantibodies epitope specificity// Abstracts of the 6-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “Molecular Basis of the Immune Response", Pushchino, September 15-22, 2002. P. 80-81.
8) Pinevich A.A., Rudenko I.Y., Lvova (Shashkova) O.A., and Klimovich V.B. Immunohistochemical study of animal and human thyroglobulin in normal tissue and in pathology// Abstracts of the 6-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “Molecular Basis of the Immune Response", Pushchino, September 15-22, 2002. P.102-103.
9) Львова (Шашкова) О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б. Изучение аутоантител у мышей при иммунизации тиреоглобулином и моноклональными антителами// Сборник трудов 5-го Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 12-14 ноября 2002 г. Т. II. С.82.
10) Львова (Шашкова) О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б. Изучение роли аутоантител к тиреоглобулину при экспериментальном аутоиммунном тиреоидите// Медицинская Иммунология. 2003. Т. 5. № 3-4. С. 259-260.
11) Пиневич А.А., Руденко И.Я., Львова (Шашкова) О.А., Климович В.Б. Исследование экспрессии консервативных и неконсервативных эпитопов тиреоглобулина при помощи моноклональных антител// Медицинская Иммунология. 2003. Т. 5. № 3-4. С. 212-213.
12) Львова (Шашкова) О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б. Аутоантитела к тиреоглобулину при аутоиммунном тиреоидите// Материалы научно-практической конференции "Современные технологии в клинической медицине", Санкт-Петербург, 7-8 октября 2003 г.
13) Пиневич А.А., Руденко И.Я., Львова (Шашкова) О.А., Климович В.Б. Изучение антигенной структуры тиреоглобулинов (ТГ) позвоночных животных// Russian Journal of Immunology. 2004. Т.9. № 1. С.64.
14) Пиневич А.А., Руденко И.Я., Шашкова О.А., Климович В.Б. Изучение антигенной структуры тиреоглобулина у представителей разных таксонов позвоночных животных// Медицинская Иммунология. 2005. Т. 7. № 2-3. С. 119-120.
15) Шашкова О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б. Влияние моноклональных антител против тиреоглобулина на тиреоидный статус экспериментальных животных// Медицинская Иммунология. 2005. Т. 7. № 2-3. С. 126.
16) Pinevich A.A., Rudenko I.Y., Shashkova O.A., and Klimovich V.B. The nature of thyroglobulin epitopes recognized by monoclonal antibodies (Mab)// Abstracts of the 7-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “The Interferface Between Immunology and Medicine", Moscow, September 5-9, 2005. P. 38.
17) Shashkova O.A., Rudenko I.Y., Pinevich A.A., and Klimovich V.B. The influence of monoclonal antibodies (Mab) to thyroglobulin (Tg) on thyroid status of mice// Abstracts of the 7-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “The Interferface Between Immunology and Medicine", Moscow, September 5-9, 2005. P. 41.
18) Пиневич А.А., Руденко И.Я., Шашкова О.А., Климович В.Б. Характеристика антигенных детерминант тиреоглобулинов позвоночных животных при помощи моноклональных антител// Медицинская Иммунология. 2006. Т. 8. № 2-3. С. 167.
19) Шашкова О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б. Изучение эпитопов тиреоглобулина, к которым направлены естественные аутоантитела мышей линии SJL/j// Медицинская Иммунология. 2006. Т. 8. № 2-3. С. 190-191.
20) Пиневич А.А., Руденко И.Я., Шашкова О.А., Климович В.Б. Сравнительно-биологический подход к изучению антигенных детерминант тиреоглобулина// Материалы научной конференции “От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института (Российского научного центра радиологии и хирургических технологий)”, Санкт-Петербург, 8-10 октября 2008 г. С.316.
21) Шашкова О.А., Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б. Роль антител к тиреоглобулину при развитии повреждений ткани щитовидной железы// Материалы научной конференции “От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института (Российского научного центра радиологии и хирургических технологий)”, Санкт-Петербург, 8-10 октября 2008 г. С.319.
