Иммунопатогенетические механизмы угрозы прерывания беременности
На правах рукописи
левкович марина аркадьевна
Иммунопатогенетические механизмы
угрозы прерывания беременности
14.00.36 – аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Ростов – на – Дону
2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, профессор Сизякина Людмила Петровна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Сотникова Наталья Юрьевна
доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович
доктор медицинских наук, с.н.с. Зотова Валентина Владимировна.
Ведущая организация: ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России
Защита состоится «____» ____________2009 года в «____» часов на заседании диссертационного совета Д 208. 082. 02 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022 г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан «___ » ______________2009 года
Ученый секретарь
диссертационного совета,
д.м.н Т.Н.Кузина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
В современном обществе проблема охрана здоровья матери и ребенка имеет первостепенное значение для формирования здорового поколения с самого раннего периода жизни, являясь важной составляющей частью здравоохранения (Кулаков В.И., 2005). В условиях демографического кризиса в России становится крайне актуальным создание оптимальных условий для сохранения здоровья женщины, решения вопросов рациональной тактики ведения беременности и родов (Абрамченко В.В., 2004; Сидельникова В.М., 2005).
В последние годы всё чаще приходится констатировать, что частота осложненного течения беременности остается довольно высокой (Серов В.Н., 2002). Одной из наиболее важных проблем в современной медицине, оказывающей отрицательное воздействие на репродуктивное здоровье женщины, является преждевременное прерывание беременности (Краснопольский В.И. и соавт., 2003; Апресян С.В., 2003; Несяева Е.В., 2005). По данным многих авторов, частота данного осложнения, не имеющая тенденции к снижению на протяжении последних 20 лет, составляет 10-25% от всех беременностей (Тетруашвили Н.К., 2008; Genazzi A.R., 2003). Длительная угроза прерывания беременности вследствие нарушения метаболизма и воспалительных изменений ткани плаценты может приводить к возникновению плацентарной недостаточности, которая является важнейшей причиной перинатальной заболеваемости и смертности, при этом частота гипоксически-ишемических поражений ЦНС значительно выше, чем при неосложненной беременности (Кулаков В.И. и соавт, 2003; Орлов А.В., 2006). На протяжении последних десятилетий лидирующими факторами, приводящими к осложненному угрозой прерывания течению беременности являются: персистирующие бактериальные и вирусные инфекции, гормональные нарушения, хронические воспалительные экстрагенитальные заболевания (Ширшев С.В., 2002; Сотникова Н.Ю., 2005; Carolyn B., 2000).
На сегодняшний день очевидно, что в исходе беременности важную роль играют иммунологические взаимоотношения между материнским организмом и плодом, однако причины нарушения клеточных и цитокин-опосредованных механизмов, обеспечивающих физиологическое течение беременности и приводящих к акушерской патологии, до настоящего времени остаются недостаточно изученными (Симбирцев А.С., 2002; Loke Y.W., King A., 2000; Vince G.S., Johnson P.M., 2000). Так, практически отсутствуют сведения об экспрессии активационных маркеров на поверхности основных субпопуляций Т-лимфоцитов и натуральных киллеров при угрозе прерывания беременности различного генеза. Важной представляется оценка роли апоптоза в качестве основного проявления негативного ответа Т-лимфоцитов. Нет однозначного мнения о диагностической значимости неоптерина, являющегося маркером активации клеточного иммунитета и отражающего совместное действие различных цитокинов. Недостаточно изучены механизмы врожденного иммунитета, представляющие первую линию защиты организма от различных патогенов. Также дискуссионной является роль активина - А и TGF- при угрозе прерывания беременности.
Для более полного раскрытия роли иммунной системы в механизмах угрозы прерывания беременности различного генеза важное значение может иметь изучение, как системных параметров, так и местных компонентов иммунной системы, что позволит оценить уровень иммунологической резистентности и направленность иммунного ответа при воздействии патологических агентов. Представляется необходимым более углубленное изучение особенностей функционирования иммунной системы с целью выявления закономерностей реализации перинатальных осложнений. В этой связи, приоритетной задачей, направленной на снижение репродуктивных потерь, детской заболеваемости и смертности является предупреждение угрозы прерывания беременности путем поиска cкрининговых маркеров, позволяющих выявить доклинические формы будущей патологии и предусмотреть меры, препятствующие её дальнейшему распространению. Своевременная диагностика и разработка алгоритмов прогнозирования угрозы прерывания беременности с учетом этиопатогенеза позволит доносить беременность до срока, снизить перинатальные потери, что и побудило нас к проведению настоящего исследования, определило его цель и задачи.
Цель исследования.
Выявление патогенетически значимых изменений иммунной системы и разработка иммунологических критериев диагностики и прогнозирования угрозы прерывания беременности с целью снижения частоты перинатальных осложнений.
Основные задачи исследования.
- Определить роль процессов позитивной активации клеток иммунной системы, молекул межклеточной адгезии на основании изучения CD25+, CD69+, CD71+, HLA-DR+, CD11b+, CD54+ у пациенток с угрозой прерывания беременности при персистирующих формах урогенитальной инфекции, гормональных нарушениях, хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях.
- Установить характер нарушений процессов негативной активации (апоптоз) клеток иммунной системы на основании определения CD95+, AnnexinV+, PI+ у пациенток с угрозой прерывания беременности инфекционного и гормонального генеза.
- Изучить эффекторные функции иммунной системы, включая секрецию неоптерина, определение про- и противовоспалительных цитокинов IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-, TNF-, IL-4, IL-10 в биологических жидкостях (сыворотке крови и слизи цервикального канала) и рецепторов к IL-2, IL-4, IL-6 при персистирующих формах урогенитальной инфекции, гормональных нарушениях, хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях.
- Определить роль экспрессии TLR – рецепторов (CD282+, CD284+) на мононуклеарах периферической крови при угрозе прерывания беременности различной этиологии.
- Выявить диагностическую значимость продукции активина-А и TGF- у беременных с угрозой прерывания при персистирующих формах урогенитальной инфекции, гормональных нарушениях, хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях.
- На основании патогенетических нарушений иммунного гомеостаза разработать алгоритмы диагностики и прогнозирования риска угрозы прерывания беременности различного генеза.
Научная новизна работы.
- Впервые разработан способ прогнозирования угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции, обусловленный повышением уровня неоптерина и IFN- в сыворотке крови и слизи цервикального канала, что отражает интенсивность воспалительного процесса (Патент на изобретение № 2281504 от 10.08.2006).
- В основу прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции легло повышение уровня IL-12 в цервикальной слизи, коррелирующее с повышением содержания CD16+ (Патент на изобретение №2341799 от 20.12.2008 г.).
- Впервые установлено, что значимыми причинами угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции и хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях является увеличение экспрессии TLR -2 и TLR -4 рецепторов, приводящих к TLR- опосредованному апоптозу трофобласта и синтезу провоспалительных цитокинов, способствующих нарушению нормального течения беременности за счёт изменения динамического иммунологического баланса в системе мать-плацента-плод.
- Установлено, что повышение экспрессии маркеров апоптоза при угрозе прерывания беременности на фоне урогенитальной инфекции свидетельствует об участии Fas -системы в реализации иммунного ответа на воспаление.
- Впервые показано, что наиболее значимыми причинами угрозы прерывания беременности на фоне гормональных нарушений фетоплацентарного комплекса является дисбаланс процессов активации и апоптоза. Установлено, что повышение содержания неоптерина, смещение цитокинового баланса в сыворотке крови в сторону продукции провоспалительных цитокинов при угрозе прерывания беременности на фоне гормональных нарушений ассоциировано со снижением экспрессии рецепторов к IL-4, повышением рецепторов к IL-2 и повышением продукции активина – А.
- Выявленные корреляционные взаимосвязи между иммунологическими параметрами на местном и системном уровне позволили создать концептуальную модель, отражающую патогенетические механизмы формирования угрозы прерывания беременности различной этиологии и разработать алгоритмы прогнозирования невынашивания беременности.
Теоретическая и практическая значимость.
1. Расширены представления о патогенетической роли иммунных изменений при угрозе прерывания беременности, обусловленных нарушением процессов дифференцировки, активации, апоптоза и эффекторных функций иммунокомпетентных клеток, что отражается в изменении уровня про- и противовоспалительных цитокинов, активации процессов межклеточного взаимодействия, нарушении экспрессии TLR-рецепторов, процессов апоптоза.
2. Усовершенствованы методы диагностики угрожающего течения и исхода беременности различного генеза для отбора женщин в группу риска, своевременного назначения профилактических и лечебных мероприятий.
3. На основании сравнительного анализа уровней изучаемых параметров определены предикторы риска угрозы прерывания беременности: при урогенитальной инфекции - повышение уровней неоптерина, IL-6 в сыворотке крови и цервикальной слизи, IL-12 в цервикальной слизи, соотношения IL-8/IL-10 в сыворотке крови, уровня экспрессии CD126+, CD25+, CD14+ CD282+; при гормональной дисфункции фетоплацентарного комплекса - повышение уровней неоптерина, TNF- в сыворотке крови, экспрессии CD4+, CD16+; при хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях - повышение уровней неоптерина, TNF-, IL-1 сыворотке крови.
4. Разработанные алгоритмы могут быть использованы для прогнозирования угрозы прерывания беременности и анализа эффективности проводимой терапии в женских консультациях, центрах охраны материнства и детства, что позволит повысить уровень лечебно-диагностического процесса и приведет к снижению перинатальных осложнений и плодовых потерь.
Положения, выносимые на защиту.
У беременных с урогенитальной инфекцией ведущим в формировании адаптивного иммунного ответа при угрозе прерывания беременности является нарушение процессов дифференцировки, активации, пролиферации, апоптоза и эффекторных функций иммунокомпетентных клеток, что отражается в увеличении клеток с супрессорно-цитотоксической активностью, повышении маркеров активации CD69+, CD25+, HLA-DR+ на их поверхности, повышении CD25+ на поверхности NK клеток, повышении маркеров апоптоза лимфоцитов CD95+, AnnexinV+, AnnexinV+PI+, увеличении экспрессии молекул адгезии CD11b+, CD54+, повышении количества TLR-2 и TLR-4 рецепторов на мононуклеарах периферической крови, усилении продукции неоптерина и провоспалительных цитокинов IL-1, IL-8, IL-6, IL-12, TNF-, IFN- в сыворотке крови и цервикальной слизи.
Выраженность воспалительного процесса родовых путей при урогенитальной инфекции обусловлена дисбалансом продукции IL-8, IL-6, IL-12, IFN- и неоптерина в цервикальной слизи, что имеет большое значение в генезе угрозы прерывания беременности.
Для беременных с гормональными нарушениями при угрозе прерывания беременности характерен дисбаланс в клеточном и гуморальном звене иммунной системы, верифицируемый увеличением клеток с хелперно-индукторной активностью CD4+, повышением активационных маркеров CD69+, CD25+ на их поверхности, снижением количества лимфоцитов, несущих маркеры апоптоза CD95+, AnnexinV+, AnnexinV+PI+, повышением уровня ЦИК, усилением продукции неоптерина и провоспалительных цитокинов IL-1, IL-2, IL-12, TNF-, IFN- в сыворотке крови.
Иммунологические нарушения при угрозе прерывания беременности на фоне хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваний сопровождаются усилением экспрессии маркеров активации CD69+, HLADR+ в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих цитотоксическими свойствами CD8+ и хелперно-индукторными свойствами CD4+, повышением уровня ЦИК, повышением маркеров апоптоза лимфоцитов CD95+, AnnexinV+, AnnexinV+PI+, повышением содержания неоптерина и провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNF- в сыворотке крови.
Внедрение результатов работы в практику.
Полученные результаты внедрены в практику работы консультативной поликлиники, отделения патологии беременных ФГУ «Ростовского НИИ акушерства и педиатрии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», используются в лекционных курсах на семинарах врачей ЮФО, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФПК и ППС РостГМУ.
Апробация работы и личное участие автора.
Основные положения работы представлены:
- на Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 г.г.; I Всероссийской конференции «Физиология иммунной системы», Сочи, 2003г; Объединенном иммунологическом форуме, Екатеринбург, 2004г.; I, II Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции», Иваново, 2005 г., Сочи, 2007 г.; Международном конгрессе «Иммунитет и болезни - от теории к терапии», Москва, 2005 г.; II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии, Москва, 2005 г.; Всероссийском форуме «Мать и дитя», Москва, 2005, 2007 г.г.; VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Москва 2006 г.; V симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний», Москва, 2006 г.; XII международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Дубай, 2008 г.; Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008г.; Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология-междисциплинарные проблемы», Москва, 2008 г.; Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», Москва, 2008 г.; VII съезде союза аллергологов и иммунологов СНГ и Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии, Санкт-Петербург, 2009г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 42 печатные работы, из них, в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МО и науки РФ –24 публикации, получено 4 патента на изобретения, подготовлено 2 медицинских технологии.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 314 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы.
Библиографический указатель включает 150 отечественных и 143 иностранных источников литературы. Работа иллюстрирована 134 таблицами, 43 рисунками, 3 схемами.
Содержание диссертационной работы.
Общая характеристика материалов и методов исследования.
Для решения поставленных задач на базе Ростовского НИИ акушерства и педиатрии, было проведено комплексное обследование 641 беременной женщины, наблюдаемых по программе обследования «Акушерский мониторинг», организованной в Ростовском НИИ акушерства и педиатрии с 2000 года. Наблюдение в рамках этой программы включало динамическое клиническое, гормональное, биохимическое, генетическое, ультразвуковое и допплерометрическое обследование беременных с учетом специфики каждого триместра. При первоначальном обследовании пациенток получали информированное согласие о включении женщины в программу «Акушерского мониторинга». Помимо этого одобрение на проведение исследований было получено от локального этического комитета Ростовского НИИ акушерства и педиатрии. При обследовании использовали общепринятые методы: сбор анамнеза, общелабораторные исследования. При сборе анамнеза особое внимание обращалось на наличие клинических признаков иммунопатологических состояний (инфекционный синдром, аллергический синдром, аутоиммунный синдром, лимфопролиферативный синдром) (Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В., 1997). Изучался наследственный и семейный анамнез, паритет родов, абортов, особенности течения постабортных и послеродовых периодов, перенесенные гинекологические заболевания. Обращалось также внимание на бесплодие в анамнезе и способы его коррекции, наличие у женщины соматических заболеваний, эндокринной патологии, профессиональных вредностей. Особое внимание уделялось инфекционному статусу пациенток до наступления беременности и в течение периода гестации. Изучение анамнеза показало, что практически у каждой обследованной пациентки имелся комплекс причин, влияющих на способность к вынашиванию беременности. Однако результаты лабораторного и клинического обследования позволили выделить доминирующий фактор, приводящий к нарушению репродуктивной функции. Формирование клинических групп проведено по нескольким признакам: наличию или отсутствию маркеров урогенитальной инфекции, гормональных нарушений фетоплацентарного комплекса, хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваний, характеру течения беременности, ее исходам. Контрольную группу - составили 64 женщины с физиологическим течением беременности. Маркеры урогенитальной инфекции были выявлены у 319 женщин (I группа). Угроза прерывания беременности в этой группе отмечена у 280 женщин, из них в I триместре обследовано 67 женщин, во II триместре -130, в III триместре -83 (Iа подгруппа). У 39 женщин беременность протекала без выраженных осложнений (Iб подгруппа). Гормональные нарушения фетоплацентарного комплекса были выявлены у 152 женщин (II группа). Угроза прерывания беременности в этой группе отмечена у 124 женщин, из них в I триместре обследовано 59 пациенток, во II триместре -37, в III триместре -28 (IIа подгруппа). У 28 женщин беременность протекала без выраженных осложнений (IIб подгруппа). Хронические воспалительные экстрагенитальные заболевания были выявлены у 106 женщин (III группа), угроза прерывания беременности в этой группе отмечена у 75 женщин, из них в I триместре обследовано 26 пациенток, во II триместре -15, в III триместре -35 (IIIа подгруппа). У 31 женщины беременность протекала без выраженных осложнений (IIIб подгруппа). Диагностика угрозы прерывания беременности основывалась на данных акушерского обследования, ультразвуковой хорион - и плацентометрии, допплерометрии, а также гормональных исследований.
Определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови, уровень экспрессии маркеров активации, молекул адгезии, рецепторов к цитокинам, TLR -рецепторов методом одно- и двухпараметрического фенотипирования, используя реагенты фирмы Immunotex (Франция), Caltag (США), HyCultbiotechnology (Нидерланды): FITC (изотиоцианат флуоресцеина) - меченые CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, СД19+, СD284, CD286+, CD54+, CD11b+ и PE(фикоэритрин) - меченые CD 95+, CD25+, CD69+, CD71+, НLA-DR+, CD122+, CD124+, СD126+, CD14+. Количество лимфоцитов, вступивших в апоптоз выявляли с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-V+, меченый FITC и пропидиум йодид (PI+), меченый PE (Caltag, США). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили с использованием лизирующего раствора OptiLise C фирмы Immunotex (Франция). Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре BECKMAN COULTER EPICS XL-II (США), используя стандартные протоколы. Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности живым лимфоцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию и CD45.
Количественное содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini et al., 1965). Интенсивность кислородзависимого метаболизма определяли в НСТ-тесте по Пинегину Б.В. и соавт. (1989). Количество ЦИК определяли методом преципитации сыворотки в ПЭГ (Haskova et al.,1978). Определение содержания цитокинов в сыворотке крови и цервикальной слизи проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Реакцию проводили согласно рекомендациям производителя. IL-1, IL- 2, IL- 4, IL-6, TNF-, IFN- с использованием тест-систем фирмы Цитокин (С-Петербург, Россия), IL-8- с использованием тест-систем Bender Medsistems (Австрия), IL-12, IL-10, TGF-1 с использованием тест-систем Biosource (США), активина - А с использованием тест-систем DSL (США), неоптерина - с использованием тест-системы IBL (Германия). Учет реакции проводили на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением 1420 Multilabel Counter Victor (Финляндия).
С целью установления инфекционного статуса пациенток использовались следующие методы: бактериологический, полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа (ИФА). При культуральном исследовании определяли видовой и количественный состав всех ассоциатов микроценоза изучаемых образцов. Посев материала проводили на набор стандартных питательных сред для выделения облигатных и факультативных анаэробов, микроаэрофилов, включая U. urealiticum, G.vaginalis, Candida и T.vaginalis. Видовую идентификацию, выделенных возбудителей проводили с помощью компьютерной программы и идентификационных наборов фирмы Becton Dickinson BBL Crystal Systems. Метод полимеразной цепной реакции использовали для выявления Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae, T.vaginalis, а также вирусов герпеса (HSV- 1/2), вируса цитомегалии (CMV), вируса Эп-штейна - Барр (EBV), вируса папиломы (HPV). Обнаружение вышеперечисленных возбудителей методом ПЦР проводилось с использованием наборов реагентов производства НПФ «Литех» при НИИ ФХМ (Россия). Определение антигена Chlamydia trachomatis проводили методом ИФА (Вектор-бест, Россия). В качестве материала для исследования у беременных служили соскобы эпителия влагалища и цервикального канала. Определение в сыворотке крови специфических антител к Chlamydia trachomatis класса А, G выполнялось методом ИФА с использованием диагностических наборов фирмы МБС, (Россия), определение IgG к МОМР+ pgp3 Chlamydia trachomatis, Ig М, Ig G к HSV- 1/2 и CMV, Ig G к T.vaginalis с использованием диагностических наборов фирмы Вектор-бест, (Россия), определение IgM к капсидному антигену (VCA) и IgG к ядерному антигену (EBNA) EBV c использованием наборов фирмы BCM DIAGNOSTIC (США).
Диагностика урогенитальной инфекции основывалась на комплексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз хронической хламидийной инфекции ставился при выявлении IgG к МОМР + плазмидному белку pgp3, IgG и IgА к Chlamydia trachomatis, определении ДНК Chlamydia trachomatis, а также хламидийного антигена. Диагноз трихомониаза ставился на основании определения антител класса G к T.vaginalis, результатов цитологического мазка, определении ДНК T.vaginalis, положительных результатов бактериологического исследования. Диагноз персистирующей герпетической инфекции ставился на основании частых реактиваций, определения специфических антител к HSV(1,2) и их динамики, определении ДНК HSV.
На этапе обследования с целью оценки гормонального состояния фетоплацентарного комплекса беременных проводилось определение концентрации уровня гормонов в сыворотке крови – стероидных гормонов: эстриола, прогестерона, хорионического гонадотропина, альфа-фетопротеина, плацентарного лактогена, эстрадиола, а также 17-ГОП, ДГЭА-С, тестостерона и тиреоидных гормонов (Т3, Т4, ТТГ) иммунофлюоресцентным методом с использованием тест-систем Delfia (Wallac Oy, Turku, Finland).
Для формирования базы данных и при проведении статистического исследования использовались возможности табличного процессора Excel 2003 и пакетов прикладных программ («Мегастат» и Statistica 6.0). При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для зависимых групп при максимально допустимом уровне ошибки первого рода р=0,05. Показатели описательной статистики представлены в виде выборочной средней и стандартного отклонения (М ± s). Для анализа различия частот в двух независимых группах применялся точный критерий Фишера-Ирвина с принятым уровнем ошибки первого рода р=0,05. Для оценки тесноты связи отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену, при р<0,05 принимается гипотеза о наличии линейной связи (Реброва О.Ю., 2005; Thomas W., 1996). Для выявления значимых признаков соответствующих клиническим группам был применен метод «деревьев решений» (дискриминантное одномерное деление по категориальным предикторам). Этот метод позволяет выявить следственную связь между признаками и получить точки раздела клинических групп, в отдельных случаях применялся метод ROC-Lines. Формирование диагностических правил осуществлялось методом логит-регрессии, расчет проводился в среде Statistica 6.0. С целью оценки точности, чувствительности и специфичности полученного правила использовались возможности табличного процессора Excel 2003.
Считаем приятным долгом выразить глубокую благодарность за консультативную помощь при анализе материала и написании работы директору ФГУ “РНИИАП Росмедтехнологий”, доктору медицинских наук, профессору, Заслуженному деятелю науки РФ Орлову Владимиру Ивановичу.
Результаты исследования и их обсуждение.
При изучении данных у наблюдаемых женщин I группы определены патогенетические факторы, способствующие угрозе прерывания беременности.
С целью выявления состояния микробиоценоза и наличия связи между биотопами в организме женщины с верифицированной урогенитальной инфекцией и угрозой прерывания беременности, нами проведено обследование микроценоза генитального тракта здоровых беременных и пациенток высокого перинатального риска. Наиболее благоприятный микробный пейзаж отмечен в группе с физиологическим течением беременности, у всех обследуемых которой выявлялся нормоценоз. Изучение показателей микробиоценоза у беременных Iа подгруппы, в отличие от обследуемых Iб подгруппы и группы с физиологическим течением беременности, выявило абсолютное отсутствие пациенток с нормальным состоянием микрофлоры генитального тракта. Изменения микрофлоры влагалища и цервикального канала в этой подгруппе сопровождались преимущественно воспалительной реакцией (вагиниты, цервициты). Количество пациенток с диагностированными вагинитами было в 6,9 раз больше, чем у беременных Iб подгруппы. Данный факт подтвердили результаты статистического анализа, выявившего обоснованные различия, по частоте встречаемости специфических и неспецифических вагинитов. Важно отметить, что в Iа подгруппе практически в 18,2% случаев воспалительный процесс из влагалища распространялся на цервикальный канал, вызывая неспецифические цервициты, а в 37,1% - специфические цервициты. Данная ситуация не отмечалась в подгруппе с неосложненным течением беременности. Оценка среднего уровня интенсивности микробной колонизации в подгруппе Iа составила 6,3±0,5 lg КОЕ/мл, что превышало показатели в подгруппе Iб (3,1±0,5 lg КОЕ/мл) и группе с физиологическим течением беременности (2,8±0,7 lg КОЕ/мл) (р<0,05). Анализ спектра патогенной урогенитальной микрофлоры показал, что в подгруппе Ia в соскобах из влагалища и цервикального канала методом ПЦР хламидии выявлялись у 16,1% женщин, у 4,3 % были обнаружены возбудители гонореи, у 7,9 % выявлялись возбудители трихомониаза. В подгруппе Iб патогенные урогенитальные возбудители не были выявлены. Согласно нашим исследованиям, в подгруппе Ia наблюдалась значительно более высокая частота выделения CMV (у 10,7% женщин), HSV (у 15,0%), EBV в подгруппе Ia выявлялся у 6,8%, HPV у 8,9% обследованных, данные патогены не были обнаружены при неосложненном течении гестации. Таким образом, проведенный сравнительный анализ состояния биоценоза родовых путей у беременных с выявленной урогенитальной инфекцией и различным клиническим течением гестации установил, что при угрозе прерывания беременности обследуемые имеют более инфицированные половые пути, как за счет увеличения числа и интенсивности колонизации микроорганизмами, так и за счет увеличения частоты их выделения. Бактериологическое и ПЦР-исследование показало, что при угрозе прерывания беременности в подгруппе Iа у 51,4% женщин отмечено формирование многокомпонетных вирусно-бактериальных ассоциаций, в то время как при неосложненном течении беременности данная ситуация не была отмечена ни в одном случае.
В последние годы вопросы патогенеза различных осложнений беременности рассматриваются с позиций клинической иммунологии. Состояние иммунной системы является одним из важных составляющих полноценности функциональных гомеостатических механизмов беременной, обеспечивающих динамическое равновесие в системе мать-плацента-плод. В этой связи, для определения роли иммунных изменений в генезе угрозы прерывания беременности было проведено их определение на системном и локальном уровнях. В результате проведенных исследований установлено, что развитие угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции сопровождалось значительными изменениями показателей иммунного статуса – в нашей работе документирована редукция содержания CD 4+ лимфоцитов в I триместре в сочетании с достоверным повышением лимфоцитов, экспрессирующих CD8+ по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех триместрах гестации (достоверные различия выявлены по абсолютным значениям), (табл.1).
Таблица 1
Показатели иммунного статуса у женщин I группы при угрозе
прерывания беременности и группы с физиологическим течением
беременности
| Показатель | I триместр | II триместр | III триместр | |||
| I а | Физ. течение | I а | Физ.течение | I а | Физ.течение | |
| Лейкоциты | 7,4±0,3* | 6,0±0,1 | 9,0±0,4* | 5,9±0,2 | 9±0,5* | 6,2±0,2 |
| Лимфоциты | 24±1,8 | 19±2,4 | 22,5±0,9 | 21±1,1 | 21±1,4 | 21±1,0 |
| 10 9/л | 1,8±0,1* | 1,1±0,1 | 2,0±0,1* | 1,2±0,1 | 1,9±0,2* | 1,3±0,1 |
| СD 3+, % | 70,0±1,0 | 70,1±2,1 | 70,1±2,9 | 71,9±2,3 | 71,8±3,5 | 72±0,9 |
| 10 9/л | 1,2±0,02* | 0,8±0,02 | 1,4±0,06* | 0,9±0,01 | 1,4±0,1* | 0,9±0,01 |
| CD 4+,% | 37,1±0,6* | 44,4±2,2 | 45,2±7,6 | 50±2,1 | 50,1±2,9 | 52,9±2,5 |
| 10 9/л | 0,6±0,01 | 0,5±0,02 | 0,9±0,2 | 0,6±0,02 | 0,9±0,1 | 0,7±0,03 |
| CD 8+,% | 26,7±0,7 | 25,4±1,2 | 27,6±0,9* | 24,4±0,9 | 25,1±1,1 | 24,4±1,7 |
| 10 9/л | 0,5±0,01* | 0,3±0,01 | 0,6±0,02* | 0,3±0,01 | 0,5±0,02* | 0,3±0,02 |
| CD4:CD8 | 1,4±0,1 | 1,7±0,2 | 1,8±0,9 | 2±0,3 | 1,9±0,1 | 2,1±0,3 |
| CD 16+,% | 12,5±0,8* | 6,1±0,5 | 10,8±0,6* | 6,8±0,2 | 8,1±0,4* | 6,4±0,3 |
| 10 9/л | 0,2±0,01* | 0,1±0,01 | 0,2±0,01* | 0,1±0,01 | 0,2±0,01* | 0,1±0,03 |
| CD 19+,% | 7,2±0,6 | 7,3±0,8 | 7,4±0,6 | 7,4±0,5 | 6,8±0,7 | 6,9±0,6 |
| 10 9/л | 0,1±0,01 | 0,1±0,01 | 0,1±0,01 | 0,1±0,01 | 0,1±0,01 | 0,1±0,01 |
| IgG, г/л | 9,9±0,4 | 9,9±0,9 | 9,1±0,4 | 9,4±0,9 | 10±0,7 | 9,2±0,7 |
| IgA, г/л | 1,7±0,1 | 1,4±0,2 | 1,6±0,1 | 1,4±0,2 | 1,6±0,2 | 1,5±0,2 |
| IgM, г/л | 2,4±0,1* | 0,9±0,2 | 2,1±0,9* | 1,2±0,1 | 2,1±0,2* | 1,2±0,2 |
| НСТ спонт.
| 109±10,8 | 90±12,7 | 89±9,1 | 100±15,3 | 89±9,2 | 80,2±6,2 |
| НСТ стим. | 185±12,4* | 147±17,3 | 152,5±12,1 | 140±18,2 | 200±30,3 | 160±9,2 |
| К нст | 1,8±0,2 | 1,6±0,2 | 1,7±0,2 | 1,4±0,2 | 2,2±0,1 | 2,0±0,1 |
| цик 3 %,у.е. | 21±2,4 | 20±1,5 | 22±2,1 | 20±2,4 | 24,9±1,7 | 25,9±0,5 |
| цик 4%,у.е. | 36±2,8 | 36,0±3,5 | 54,5±4,0* | 30,5±5,9 | 119,5±2,3* | 44,6±0,6 |
| К цик | 1,7±0,3 | 1,8±0,2 | 2,4±0,6* | 1,4±0,3 | 4,8±0,2* | 1,7±0,01 |
Примечание: * - p<0,05, достоверность различий показателей по сравнению с группой женщин с физиологическим течением беременности (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
Известно, что на ранних этапах физиологической беременности отмечается резкое снижение в крови численности CD16+ NK-клеток, т.к. CD16+ является единственным Fc-рецептором, ответственным за антителозависимую клеточную цитотоксичность NK- и Т-лимфоцитов (Воробьев А.А. и соавт., 2006). Анализируя показатели содержания натуральных киллеров (CD16+ лимфоцитов) в подгруппе Iа отмечено достоверное увеличение их относительного и абсолютного количества, а также усиление экспрессии маркеров ранней активации CD25+ на их поверхности по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех триместрах.
При этом в I триместре выявлена прямая корреляционная зависимость между количеством СD16+ и содержанием в сыворотке крови TNF– (rs=0,46, p=0,03) и IFN- (rs=0,50, p=0,05), что можно объяснить усилением цитолитической функции, направленной, в том числе, и на клетки трофобласта. Наши данные согласуются с данными литературы о повышении содержания NK - клеток с цитотоксической активностью в децидуальной ткани и периферической циркуляции у женщин с самопроизвольными выкидышами (Emmer P.M. et al., 2000; Andalib A. et al., 2005) и указывают на неблагоприятное влияние урогенитальной инфекции на иммунобиологический симбиоз матери и плода.
Анализ функционального состояния клеток иммунной системы показал, что в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во все сроки наблюдения достоверно повышалось содержание лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры ранней активации CD69+ и CD25+ (табл.2). При этом в III триместре выявлена прямая корреляционная зависимость между количеством лимфоцитов, экспрессирующих CD69+ и содержанием IL-6 в слизи цервикального канала (rs= 0,83, p=0,006). Увеличение количества лимфоцитов, несущих маркер CD25+ отражает их готовность к пролиферации, может свидетельствовать об активации Th1-типа иммунного ответа. Повышение указанных показателей может способствовать нарушению нормального течения беременности за счёт изменения динамического иммунологического баланса в системе мать-плацента-плод.
Примечательно, что у женщин в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех трех триместрах увеличивалось количество лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры пролиферации СD71+, определяющих возможность иммунокомпетентных клеток к делению в ответ на активирующий стимул (табл.2), при этом в I триместре выявлена корреляционная зависимость между количеством лимфоцитов, экспрессирующих CD71+ и содержанием IFN- в сыворотке крови (rs=0,41, p=0,02). Аналогичные данные получены и по содержанию НLA-DR+ лимфоцитов, характеризующих поздние этапы активации лимфоцитов, их повышение отмечено во все сроки наблюдения беременных, при этом во II триместре выявлена связь между количеством лимфоцитов, экспрессирующих маркеры поздней активации HLA-DR+ и содержанием TNF – в сыворотке крови (rs=0,41, p=0,05), что также является показателем активированного состояния Т-лимфоцитов.
Таблица 2
Функциональная активность лимфоцитов у женщин I группы при
угрозе прерывания беременности и группы с физиологическим
течением беременности
| Показатель | I триместр | II триместр | III триместр | |||
| I а | Физ. течение | I а | Физ.течение | I а | Физ.течение | |
| CD69+,% | 3,7±0,7* | 1,6±0,2 | 4,1±0,4* | 0,8±0,4 | 4,5±0,8* | 0,8±0,3 |
| 10 9/л | 0,1±0,01* | 0,01±0,002 | 0,1±0,01* | 0,01±0,004 | 0,1±0,02* | 0,01±0,004 |
| CD 25+,% | 3,7±0,6* | 1,1±0,4 | 3,5±0,8* | 1±0,2 | 5,6±0,9* | 1,3±0,3 |
| 10 9/л | 0,1±0,01* | 0,01±0,004 | 0,1±0,02* | 0,01±0,002 | 0,1±0,02* | 0,02±0,004 |
| CD 71+,% | 3,2±0,6* | 2,1±0,5 | 4,1±0,8* | 2,5±0,3 | 3,3±0,7* | 1,2±0,4 |
| 10 9/л | 0,1±0,01* | 0,02±0,01 | 0,1±0,02* | 0,03±0,003 | 0,1±0,01* | 0,02±0,01 |
| HLADR+,% | 12,2±0,7* | 6,4±0,9 | 11,4±0,8* | 8,9±1,0 | 12,9±1,4* | 8,7±1,0 |
| 10 9/л | 0,2±0,02* | 0,1±0,01 | 0,2±0,02* | 0,1±0,01 | 0,2±0,03* | 0,1±0,01 |
| CD11b+,% | 14,7±1,2* | 5,7±0,8 | 13,2±1,2* | 7,9±0,9 | 15,6±1,1* | 8,1±0,8 |
| 10 9/л | 0,2±0,02* | 0,1±0,01 | 0,3±0,02* | 0,1±0,01 | 0,3±0,02* | 0,1±0,01 |
| CD 54+, % | 13,2±2,0* | 6,5±0,7 | 13,8±1,9* | 8,1±1,1 | 15,5±2,7* | 8,4±1,1 |
| 10 9/л | 0,2±0,1* | 0,1±0,01 | 0,3±0,04* | 0,1±0,01 | 0,3±0,1* | 0,1±0,01 |
Примечание: * - p<0,05, достоверность различий показателей по сравнению с группой женщин с физиологическим течением беременности
Выявлено достоверное усиление процессов ранней и поздней активации в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих хелперно-индукторными свойствами (CD4+CD69+ и СD4+ НLA-DR+), кроме того, отмечено повышение маркеров ранней (CD69+, CD25+) и поздней активации (НLA-DR+) на поверхности CD8+ по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех исследуемых триместрах (табл.3).
В настоящее время большое внимание уделяется изучению взаимодействия клеток иммунной системы при различных иммунопатологических состояниях. Одним из важнейших их свойств является способность к миграции, что позволяет им осуществлять основную функцию иммунного надзора и реализуется при помощи молекул адгезии, способствующих более эффективному взаимодействию с клетками-мишенями. Анализ количества лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD11b+, участвующих в иммунном воспалении через механизм межклеточной адгезии, выявил их значительное увеличение в подгруппе Iа во всех трех триместрах гестации (табл.2).
Особенно выраженные отличия отмечены в I триместре – содержание CD11b+ повышалось в 2,6 раза по сравнению с показателями в группе с физиологическим течением беременности.
Таблица 3
Экспрессия маркеров активации в субпопуляциях Т-лимфоцитов и NK у женщин I группы при угрозе прерывания беременности и группы с физиологическим течением беременности
| Показатель | I триместр | II триместр | III триместр | |||
| I а | Физ. течение | I а | Физ.течение | I а | Физ.течение | |
| CD4+CD69+, % | 1,5±0,1* | 0,2±0,01 | 1,5±0,1* | 0,2±0,01 | 1,2±0,2* | 0,2±0,05 |
| CD4+CD25+, % | 0,7±0,2 | 0,5±0,01 | 0,8±0,2 | 0,5±0,01 | 0,7±0,2 | 0,5±0,01 |
| CD4+DR +, % | 1,8±0,1* | 0,2±0,02 | 1,9±0,1* | 0,2±0,03 | 1,8±0,1* | 0,2±0,01 |
| CD8+CD69 +, % | 2,3±0,2* | 0,3±0,03 | 2,3±0,2* | 0,3±0,02 | 2,4±0,2* | 0,3±0,02 |
| CD8+CD25 +, % | 1,4±0,2* | 0,5±0,08 | 1,4±0,1* | 0,5±0,01 | 1,2±0,2* | 0,5±0,01 |
| CD8+DR+, % | 1,3±0,1* | 0,6±0,07 | 1,3±0,1* | 0,6±0,06 | 1,1±0,1* | 0,5±0,08 |
| CD16+CD69+, % | 0,4±0,1 | 0,2±0,01 | 0,3±0,1 | 0,2±0,01 | 0,4±0,08 | 0,2±0,01 |
| CD16+CD25+, % | 1,4±0,1* | 0,4±0,01 | 1,5±0,1* | 0,4±0,01 | 1,5±0,1* | 0,6±0,02 |
| CD16+ DR+, % | 0,4±0,1 | 0,3±0,04 | 0,5±0,01 | 0,3±0,04 | 0,4±0,02 | 0,2±0,05 |
Примечание: * - p<0,05, достоверность различий показателей по сравнению с группой женщин с физиологическим течением беременности
При этом количество лимфоцитов, экспрессирующих CD11b+ прямо коррелировало, как с содержанием в сыворотке крови IL-8 (rs= 0,43, p=0,04), так и с уровнем IL-1 (rs= 0,47, p=0,026). Увеличение экспрессии CD11b+ при угрозе прерывания беременности может свидетельствовать о значительной напряженности иммунных реакций на фоне урогенитальной инфекции. К межклеточным взаимодействиям в иммунной системе прямое отношение имеют интегрины. Анализ количества лимфоцитов, экспрессирующих CD54+(IСAM-1) показал их повышение в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности всех трех триместрах гестации (табл.2). Возможно, что CD54+ (IСAM-1) экспрессируется под влиянием цитокинов IL-1, TNF-, IFN-, что коррелирует с активностью инфекционного воспаления и активизацией процессов межклеточного взаимодействия.
Значительную роль в механизмах сохранения клеточного баланса, регулируемой клеточной гибели играет апоптоз. С помощью механизма апоптоза удаляются аутоспецифичные клоны и клетки, реализуется клеточно-опосредованный цитолиз (Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005; Galan A. et al., 2000). Учитывая важное значение процессов апоптоза в поддержании гомеостаза, было проанализировано содержание лимфоцитов, экспрессирующих Fas рецептор CD95+, как маркер поздней активации, характеризующий готовность к апоптозу. Оказалось, что в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности отмечалось достоверное повышение CD95+ как в общей популяции, так и в субпопуляции СD4+ уже в I триместре (11,9±0,9% и 6,6±0,1%, соответственно), аналогичные сдвиги отмечены во II и III триместре. Известно, что система Fas-/FasL способствует ограничению избыточного иммунного ответа. Таким образом, обнаруженное нами при угрозе прерывания беременности повышение CD95+ может указывать на возможное участие Fas -системы в реализации иммунного ответа на воспаление. Проведенное сравнение содержания СD95+ в субпопуляциях лимфоцитов с цитотоксической активностью (CD8+ и CD16+) отметило тенденцию к снижению в подгруппе с угрозой прерывания, однако статистически значимых различий в группах, оппозитных по течению беременности не было выявлено.
Кроме оценки уровня экспрессии лимфоцитами СD95+, нами определялось количество клеток, вступивших в апоптоз, на основании их способности фиксировать на своей поверхности AnnexinV+ и PI+. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в периферической крови женщин в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено достоверное повышение как ранних (AnnexinV+), так и поздних (AnnexinV+ PI+) маркеров апоптоза во все сроки наблюдения, наиболее выраженные отличия отмечены в III триместре (14,2±2,0% против 6,2±0,5% и 1,3±0,3% против 0,7±0,1%, соответственно). Возможно, что реакция усиления апоптоза обусловлена необходимостью элиминации активированных лимфоцитов при урогенитальной инфекции.
В последние годы большой интерес вызывает изучение механизмов врожденного иммунитета, представляющих первую линию защиты организма от различных патогенов. Распознающими рецепторами врожденной иммунной системы являются TLR – рецепторы, которые экспрессируются на клетках моноцитарной системы и распознают связанные с патогенами паттерны, присутствующие на инфекционных агентах (Flo T. H. et al., 2001; Haruta Y. et al., 2007). Клетки врожденного иммунитета важны при нормальной беременности для обеспечения успешной имплантации и для разрешения инфекции в зоне мать-плацента-плод, они же могут способствовать развитию осложнений беременности (Макаров О.В., 2007). В нашем исследовании в подгруппе Iа выявлено достоверное повышение экспрессии TLR –2 (CD282+) и TLR – 4 (CD284+) на моноцитах периферической крови во всех исследуемых триместрах. При этом в I триместре уровень экспрессии TLR-2(CD282+) составил 77,1±4,7% против 39,3±4,2% в группе с физиологическим течением беременности и коррелировал с маркерами раннего апоптоза (rs=0,90, p=0,03). Возможно, что грамм-положительные бактерии, экспрессирующие пептидогликан или липотейхоевую кислоту могут вызывать гибель клеток трофобласта через активацию TLR –2 (Abrahams V.M., 2005). Во II триместре количество моноцитов, экспрессирующих рецепторы к TLR-4(CD284+) составило 67,4±4,3% против 30,8±3,5% в группе с физиологическим течением беременности, была выявлена взаимосвязь с содержанием IL-1 (rs= 0,9, p=0,03). Наши данные согласуются с исследованиями Ковальчук Л.В. и соавт. (2005), сообщающих, что в раннюю фазу врожденного иммунного ответа взаимодействие микроорганизмов с TLR - 4 индуцирует синтез активационных молекул, хемокинов, провоспалительных цитокинов опасных для состояния беременности. На основании полученных данных можно заключить, что обнаруженное нами усиление экспрессии TLR –2 и TLR –4 может обусловливать их непосредственное участие в развитии угрозы прерывания беременности.
По данным современных исследований, основными медиаторами взаимодействия клеток иммунной системы между организмом матери и плода являются цитокины, играющие важную роль в репродукции - имплантации, росте и развитие эмбриона. Посредством цитокинов и их рецепторов происходит взаимодействие между трофобластом и децидуальными клетками, что обеспечивает толерантность между организмом матери и плодом (Zhang J. et al., 2003). Результатом межклеточного взаимодействия является экспрессия про- и противовоспалительных цитокинов. Несмотря на интенсивные исследования в области иммунологии репродукции, до настоящего времени остается не до конца изученной роль различных цитокинов в генезе физиологической беременности, окончательно не решены вопросы определения скрининговых маркеров ее патологического течения.
Известно, что IL-1 является центральным медиатором локальных и системных воспалительных реакций (Симбирцев А.С., 2002). Связывание IL-1 с рецепторами в материнском организме является необходимым для имплантации, стимулирует пролиферацию клеток, образующих плацентарный барьер, избирательно активирует процессы синтеза и секреции стероидных гормонов, уровень которых оказывает влияние на течение беременности (Coulam C.,2000). С другой стороны, для IL-1 характерна способность стимулировать продукцию простагландинов, тем самым запускать механизмы преждевременного отторжения плода (Dinarello C.A., 2002; Xia H. et al., 2006).
В нашем исследовании в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности уже в I триместре отмечается достоверное повышение содержания IL-1 в как сыворотке крови, так и в цервикальной слизи имеющее прогрессирующее увеличение в динамике гестации (табл.4). Интересные данные получены в I триместре об обратной корреляционной зависимости между содержанием в цервикальной слизи IL-1 и IL-10 (rs=-0,51, p=0,004). Возможно, что повышенная секреция IL-1 при инфекционной патологии приводит к провоспалительному каскаду, тем самым запуская механизмы преждевременного отторжения плода, а супрессия IL-10 отменяет ингибирующие эффекты клеточно-опосредованного иммунитета, который несовместим с формированием и развитием фетоплацентарной единицы. Согласно данным Л.В. Ковальчука и соавт. (2006), определение в сыворотке крови высоких уровней цитокинов наблюдается при выраженных патологических процессах и свидетельствует о нарушении функционирования цитокиновой сети.
По данным литературы, IL-6 секретируясь трофобластом, способствует успешной имплантации (Ширшев С.В., 2002; Сухих Г.Т., Ванько Л.В, 2003). Активируя супрессорное звено лимфоцитов, может затруднять реализацию эффекторных реакций иммунной системы матери по отношению к плоду (Margni R. et al., 2001; Zenclussen A., 2002). С другой стороны IL-6 является главным медиатором белков острой фазы, активирует коагуляционные реакции, может привести к нарастанию продукции простагландинов и преждевременному развитию родовой деятельности (Тетруашвили Н.К., 2000). Анализируя результаты исследования содержания IL-6, нам удалось установить следующие факты: в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено достоверное однонаправленное повышение IL-6, как в сыворотке крови, так и в цервикальной слизи в динамике гестации. Наиболее выраженное увеличение содержания IL-6 отмечено в цервикальной слизи (табл.4).
Таблица 4
Средние значения содержания про- и противовоспалительных
цитокинов у женщин I группы при угрозе прерывания
беременности и группы с физиологическим течением беременности
| Показатель, пг/мл | I триместр | II триместр | III триместр | |||
| I а | Физ. течение | I а | Физ. течение | I а | Физ. течение | |
| IL-8, сыворотка крови | 168,1±15,0* | 33,1±4,4 | 187,3±33,5* | 34±13,2 | 192,9±28,1* | 39±6,5 |
| IL-8, цервик. слизь | 1376±129,7* | 117±17,6 | 1390±259,9* | 170±37,8 | 1450±292,6* | 220±56,5 |
| IL-6, сыворотка крови | 57,3±4,3* | 8,1±3,1 | 83,2±13,6* | 8±3,0 | 87±19,8* | 6±1,4 |
| IL-6, цервик. слизь | 230,3±25,5* | 15,2±1,9 | 257±55,2* | 20±3,8 | 320±47,6* | 24±5,7 |
| TNF-, сыворотка крови | 75,6±9,9* | 35±4,7 | 102,4±32,1* | 28±4,6 | 155±39,1* | 28±5,3 |
| TNF-, цервик. слизь | 88,5±8,5* | 23±4,4 | 100±31,9* | 22±5,5 | 120±35,0* | 29±7,9 |
| IL-1-, сыворотка крови | 79±8,1* | 22±7,1 | 97±7,2* | 55±9,4 | 107±26,5* | 25±5,7 |
| IL-1-, цервик. слизь | 48,3±7,0* | 15±3,4 | 70,1±16,8* | 22,8±9,7 | 77±20,9* | 24,6±6,7 |
| IL-2, сыворотка крови | 28,9±8,7 | 17±4,6 | 54,2±19,0 | 35±7,7 | 57,6±20,4 | 33±5,6 |
| IFN-, сыворотка крови | 159±28,5* | 36,1±7,4 | 134±13,2* | 18±7,1 | 72,4±16,6* | 25±3,1 |
| IFN--, цервик. слизь | 80,8±10,4* | 33,1±5,2 | 62,8±29,0 | 29±4,1 | 33,8±10,1 | 22±3,9 |
| IL-12, сыворотка крови | 162,5±15,5* | 70,4±11,6 | 170,7±19,1* | 55,5±8,5 | 190±24,4* | 58±7,7 |
| IL-12, цервик. слизь | 93±7,7* | 24,5±8,2 | 106,5±15,7* | 23,4±8,0 | 134,2±18,3* | 30±6,4 |
| IL-4, сыворотка крови | 68,9±6,9 | 70,4±11,1 | 90,1±20,5 | 65±5,2 | 120±17,2* | 45±7,8 |
| IL-4, цервик. слизь | 99,3±12,7* | 50,2±11,4 | 160±23,4* | 51,1±12,0 | 129,6±29,9* | 46±7,7 |
| IL-10, сыворотка крови | 3,2±0,4* | 8,5±1,3 | 3,2±0,3* | 11,7±1,4 | 3,1±0,7* | 9,2±0,9 |
| IL-10, цервик. слизь | 6,2±2,1* | 25,6±2,9 | 6±1,4* | 12,7±1,5 | 5,2±1,1* | 11,3±1,9 |
Примечание: * - p<0,05, достоверность различий показателей по сравнению с группой женщин с физиологическим течением беременности.
При этом результаты корреляционного анализа, выявили прямую зависимость содержания IL-6 в цервикальной слизи и воспалительным процессом родовых путей (r=0,6, р=0,01), кроме того, в I триместре выявлена взаимосвязь между содержанием IL-6 в слизи цервикального канала и количеством клеток, экспрессирующих CD16+ в периферической крови (rs= 0,73, p=0,05). Из данных литературы следует, что IL-6 в сочетании с другими факторами усиливает пролиферацию и дифференцировку цитотоксических Т- лимфоцитов, повышает активирующее действие IFN- на NK-клетки и образование ЛАК-клеток (Ярилин А.А., 1999). С учетом выявленных фактов, можно полагать, что под воздействием инфекции IL-6 стимулирует нейтрофилы, макрофаги к местной выработке провоспалительных цитокинов, которые способствуют процессу созревания и раскрытия шейки матки, нарастанию продукции простагландинов и преждевременному развитию родовой деятельности.
Неоднозначную роль во время беременности играет продукт активированных макрофагов IL-8, являясь цитокином, обеспечивающем ангиогенез и защиту плацентарных оболочек. Вызывая направленную миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, он повышает внутриклеточную гибель микроорганизмов, активируя освобождение ими коллагеназы и эластазы, ферментов, расщепляющих внеклеточный матрикс, вырабатываемый цервикальными фибробластами, вовлекается в патологический процесс при преждевременных родах (Caballero-Campo P. et al., 2002). По нашим данным в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности обнаружено достоверное однонаправленное повышение IL-8, как в сыворотке крови, так и в цервикальной слизи, более выраженное в цервикальной слизи, прогрессирующее в динамике беременности (табл.4). При этом в I триместре выявлена прямая корреляционная зависимость между содержанием IL-8 в слизи цервикального канала и воспалительным процессом родовых путей (rs =0,68; р=0,01 ), содержанием IL-1 в сыворотке крови (rs= 0, 40, p=0,03), что согласуется с данными литературы об усилении продукции IL-8 фибробластами, эндотелиальными и эпителиальными клетками в ответ на действие IL-1 или TNF- (Sharma A., 2007). Можно предположить, что выявленное нами усиление продукции IL-8 происходит под воздействием бактериальных и вирусных продуктов, провоспалительных цитокинов и может явиться ранним диагностическим маркером преждевременных родов при микробной инвазии.
Синтезируемый активированными макрофагами децидуальных и трофобластных клеток, TNF- играет регуляторную роль в процессах инвазии клеток трофобласта и мезинхимальном ангиогенезе, контролируя рост плаценты соответственно нормальному развитию плода (Степаничев М.Ю., 2005; Demir R., 2004). С другой стороны, TNF- приводит к возникновению локальных микротромбозов в области плацентации с последующей отслойкой плаценты, стимулируют высвобождение арахидоновой кислоты и усиливают выработку простогландинов миометрием, повышая выработку матриксной металлопротеиназы (Roh C. et al., 2000).
В нашем исследовании при угрозе прерывания беременности по сравнению с группой с физиологическим течением беременности установлено достоверное однонаправленное повышение TNF -, как в сыворотке крови, так и в цервикальной слизи (табл.4). При этом содержание TNF – в сыворотке крови в III триместре прямо коррелировало, с маркерами поздней активации и готовности к апоптозу CD95+(rs= 0,62, p=0,01), а в I триместре с маркерами позднего апоптоза (rs= 0,63, p=0,02), что согласуется с данными литературы об исключительно большом значении роли TNF - в регуляции процессов апоптоза при беременности (Galan A. et al.,2000; Mor G., 2002; Ashton S.V. et al., 2005; Staszewski-Chavez S. et al., 2005).
С учетом выявленных фактов, можно полагать, что TNF -, вырабатываясь в процессе острого воспаления через специализированные рецепторы запускает в клетках сигналы, ведущие к дифференциации и клеточной гибели по типу апоптоза. Кроме того, в нашем исследовании в I триместре выявлена прямая корреляционная зависимость между содержанием TNF – в сыворотке крови и количеством лимфоцитов, экспрессирующих рецептор для IL-6 (CD126+), (rs= 0,57, p=0,02). В пользу данного положения свидетельствуют сообщения о способности TNF - стимулировать продукцию IL-6, оказывать выраженное хемотактическое действие на моноциты, принимая активное участие в воспалительных реакциях (Сидельникова В.М. и соавт., 2004). Вероятно, компоненты патогенов являются индуцирующими продуктами синтеза TNF - в сыворотке крови и цервикальном секрете при угрожающем течении беременности. Гиперсекреция TNF - может служить одним из факторов, способствующих невынашиванию беременности.
Многообразие изученных свойств IFN- свидетельствует о его регуляторном влиянии на все основные клетки иммунной системы. IFN- причастен к регуляции развития плода, вносит значительный вклад в развитие децидуальной ткани и сосудов матки. Низкий уровень IFN- обеспечивает преобладание супрессорной активности над хелперной, что способствует ингибиции отторжения плода (Zhang J. et al., 2003). В тоже время, IFN- может быть вовлечен в патогенез осложнений беременности. При угрозе прерывания беременности локально может иметь место гиперфункция Тh-1 клеток, продуцирующих провоспалительные цитокины в том числе и IFN-, что может приводить к избыточно выраженным воспалительным реакциям в организме, особенно при персистенции инфекционных агентов (Faas M.M. et al., 2000).
Сравнительное изучение содержания IFN- у беременных клинических групп выявило определенный ряд принципиальных отличий в его содержании, как в сыворотке крови, так и в слизи цервикального канала. Так, в подгруппе Iа содержание IFN- достоверно превысило показатели, характерные для группы с физиологическим течением беременности в сыворотке крови во всех трех триместрах гестации, причем наиболее высокие показатели отмечены в I -м триместре беременности. Повышение содержания IFN- в цервикальной слизи в подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено только в I триместре (табл.4). При этом выявлена прямая корреляционная зависимость между содержанием IFN- в цервикальной слизи и воспалительным процессом родовых путей (rs=0,55; р=0,05 ). Кроме того, обнаружена корреляционная взаимосвязь между содержанием IFN- в сыворотке крови и маркерами раннего апоптоза (rs=0,90, p=0,03). Возможно, что IFN- регулирует апоптоз нормальных и инфицированных клеток, а потенциально опасное воздействие на беременность связано с индукцией апоптоза трофобласта и снижением продукции прогестерона. По данным литературы IFN- усиливает апоптоз клеток плаценты, изменяя соотношение IFN- Bcl-2 и Bax в сторону увеличения экспрессии Bax, а также каспазы-3 (Воробьев А.А., 2006; Liu Z. et al., 2002). Вероятно, урогенитальная инфекция приводит к повышению синтеза IFN- в сыворотке крови и слизи цервикального канала у беременных с угрозой прерывания. При персистенции инфекционных агентов может иметь место гиперфункция Тh-1 клеток, продуцирующих провоспалительные цитокины в том числе и IFN-, что может приводить к избыточно выраженным воспалительным реакциям в организме, следствием чего является развитие угрозы прерывания беременности.
Важнейшим связующим звеном между механизмами неспецифической защиты и специфического иммунитета служит IL-12. (Elenkov I. et al., 2001; Zenclussen A. et al., 2002). Полученные нами результаты исследования содержания IL-12 в исследуемых подгруппах позволяют сделать следующий вывод: в подгруппе Iа его содержание превысило показатели, характерные для группы с физиологическим течением беременности, как в периферической крови, так и в цервикальной слизи во всех трех триместрах беременности (табл.4). При этом в I триместре обнаружена прямая корреляционная связь между уровнем IL- 12 в цервикальной слизи и воспалительным процессом родовых путей (rs=0,78; р=0,004), а также между содержанием IL-8 (rs=0,40, p=0,03). Кроме того, выявлена зависимость между содержанием IL- 12 в сыворотке крови и CD126+(rs=0,52, p=0,03). В III триместре - между содержанием IL- 12 в сыворотке крови и количеством CD8+(rs=0,58, p=0,02), CD16+(rs=0,62, p=0,01), CD25+(rs=0,81, p=0,003). С учетом этого можно предположить, что в процессе инициации иммунного ответа под воздействием инфекции IL-12 играет важную роль в дифференцировке Т-хелперов в направлении Th1,что опосредовано повышением продукции IFN-, стимулирует активность и пролиферацию цитотоксических лимфоцитов, NK клеток, и повышает выработку провоспалительных цитокинов, приводя к повреждению плацентарной васкуляризации, ограничению роста плода, являясь фактором риска угрозы прерывания беременности.
На основании приведенных данных впервые было установлено, что повышение уровня IL-12 в цервикальной слизи свидетельствует о риске невынашивания беременности (Патент на изобретение «Способ прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции» №2341799 от 20.12.2008г.). Точность данного метода составила 88,0%,чувствительность 90,0%, специфичность 85,0%. Предлагаемый способ является не инвазивным, позволяет прогнозировать невынашивание беременности. В клинической практике это позволит снизить угрозу перинатальных потерь за счет своевременного выявления беременных группы риска и своевременного начала адекватных лечебных мероприятий.
Нормальное течение беременности ассоциируется с преобладанием в децидуальной ткани IL- 4 по сравнению с беременными с отслойкой ветвистого хориона и привычным невынашиванием в анамнезе (Zhang J. et al., 2003). В частности, с увеличением продукции IL-4 связывают доминирование гуморального иммунитета над клеточным. Полученные нами результаты исследования противовоспалительных цитокинов в исследуемых группах позволяют сделать следующий вывод: в цервикальной слизи содержание IL-4 в подгруппе Iа достоверно превышало показатели, характерные для группы с физиологическим течением беременности во всех трех триместрах, однако, в сыворотке крови данные изменения были выявлены только в III триместре (табл.4). При этом во II триместре отмечена прямая корреляционная зависимость содержания IL-4 и уровня TGF- в сыворотке крови (rs=0, 49, p=0,04), что согласуется с данными литературы о синергичности действия IL-4 с другими макрофаг-деактивирующими цитокинами (TGF- ), (Воробьев А.А. и соавт., 2006). Вероятно, что повышение продукции IL-4 при угрозе прерывания беременности при урогенитальной инфекции следует рассматривать, как компенсаторный механизм в ответ на увеличение IFN-, обусловленный необходимостью угнетения воспалительного ответа, как на локальном, так и на системном уровне.
Учитывая, что IL-10, как противовоспалительный цитокин, обладая способностью угнетать клеточно-опосредованные иммунные реакции, оказывает протективное действие на нормальное течение беременности (Moore K. et al., 2001), нами было обнаружено, что его содержание в подгруппе Iа было достоверно ниже, чем в группе с физиологическим течением беременности, как в сыворотке крови, так и в слизи цервикального канала. Снижение продукции IL-10 было зафиксировано во все сроки осложненного угрозой прерывания течения беременности (табл.4). При этом, в I триместре корреляционный анализ выявил обратную взаимосвязь между содержанием IL-10 в сыворотке крови и маркерами раннего и позднего апоптоза (rs=-0,78, p=0,03) и (rs=-0,74, p=0,005), соответственно, а также количеством лимфоцитов, экспрессирующих СD11 b+(rs= - 0,44, p=0,04). Аналогичная зависимость выявлена между содержанием IL-10 и IL-1 в цервикальной слизи (rs= - 0, 51, p=0,004). Возможно, что недостаточная продукция IL-10 при урогенитальной инфекции приводит к усилению клеточно-опосредованных иммунных реакций, снижению протективного действия на нормальное течение беременности.
Так как баланс в системе цитокинов играет важную роль в успешном пролонгировании беременности, представляло интерес определение экспрессии рецепторов к IL-4 (СD124+), IL-6 (СD126+) и IL-2 (CD122+) на поверхности лимфоцитов. В подгруппе Iа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено достоверное повышение уровня лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD124+ в динамике гестации, наиболее высокие показатели отмечены в III триместре (9,7±0,7% и 6,1±0,8%, соответственно) и СD126+ (12,1±1,1% и 3±0,7%), что свидетельствует о том, что механизмы угрозы прерывания могут быть обусловлены не только нарушением продукции цитокинов, но и изменением синтеза рецепторов к ним.
Известно, что неоптерин играет значительную роль в механизмах цитотоксического действия активированных макрофагов. Увеличение его концентрации связано с интенсивностью воспалительного процесса (Шевченко О.П. и соавт., 2001; Baier-Bitterlich G., 1995; Oleszczuk J. et al., 1997). В этой связи, представляло интерес определение содержания неоптерина у женщин с оппозитным течением беременности. При анализе собственных результатов в подгруппе Iа выявлено однонаправленное достоверное повышение уровня неоптерина, как в сыворотке крови, так и в цервикальной слизи, на протяжении всего периода гестации. Наиболее выраженное увеличение содержания неоптерина отмечено в цервикальной слизи, составив в I триместре 10,2±0,5 нг/мл против 3,5±0,1 нг/мл в группе с физиологическим течением беременности. При этом выявлена коррелятивная взаимосвязь между уровнем неоптерина в цервикальной слизи и воспалительным процессом родовых путей (rs =0,66; р=0,01), а также между содержанием неоптерина в сыворотке крови и содержанием IFN- в цервикальной слизи (rs=0,39, p=0,03). Повышение уровня неоптерина при угрозе прерывания беременности представляется вполне логичным, поскольку, по нашим данным, при обследовании женщин с осложненным угрозой прерывания течением беременности на фоне урогенитальной инфекции выявлен высокий уровень IFN-, который активирует гуанозинтрифосфат-циклогидроксилазу – ключевой фермент в цепи превращения гуанозинтрифосфата в неоптерин.
На основании приведенных данных впервые было установлено, что повышение уровня неоптерина в цервикальной слизи и в сыворотке крови является ранним диагностическим маркером формирования угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции (Патент на изобретение «Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции» № 2281504 от 10.08.2006). Предлагаемый способ позволяет диагностировать субклиническую стадию угрозы прерывания беременности, предшествующую клиническим проявлениям, для отбора женщин в группу риска, что снизит процент перинатальной патологии за счет своевременного назначения профилактических и лечебных мероприятий.
В настоящее время установлено, что важную роль в развитии плаценты и плода играет TGF-. Обладая иммуносупрессивными свойствами, TGF- регулирует клеточный рост, адгезию и дифференцировку, снижает продукцию простогландинов в амнионе и децидуальных клетках, угнетает активированные лимфокинами NK-клетки, негативно регулирует апоптоз за счет контроля Fas-L (Moore A. et al., 2000; Matsumura T. et al., 2004).
Полученные нами результаты исследования содержания TGF- в исследуемых подгруппах позволяют сделать следующий вывод: достоверное повышение ТGF- отмечено в сыворотке крови при угрозе прерывания беременности на фоне урогенитальной инфекции по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех трех триместрах гестации, наиболее выраженное повышение содержания TGF- отмечено в I триместре (1900±122,8 пг/мл и 1000±172,6 пг/мл, соответственно). В III триместре выявлена взаимосвязь между содержанием TGF- в сыворотке крови и маркерами позднего апоптоза (rs=0, 67, p=0,04). С учетом выявленных фактов можно полагать, что негативное влияние повышенного уровня TGF- при угрозе прерывания беременности может быть связано с ингибированием синтеза ДНК клетками трофобласта (Сотникова Н.Ю., 2005). Если учесть важную роль TGF- в экспрессии гена СЭФР и в подавлении активности NO синтетазы, становится понятным его высокое содержание при осложненном течении беременности (Орлов А.В., 2006).
В последнее время появляются работы о роли активина-А, как модулятора иммунных реакций при беременности. Активин - A, член суперсемейства TGF, является плюрипотентным фактором роста и дифференцировки. Синтезируясь цитотрофобластом, ингибирует активность IL-1 и IL-6, являясь антагонистом их функций. С другой стороны, активин - A может повышать экспрессию IL-6 и IL-8 во время беременности, что подчеркивают дихотомию между про-и противовоспалительными свойствами этого цитокина (Muttukrishna S. et al., 2002). Анализ содержания активина - A у пациенток клинических групп приводит к следующему выводу: в подгруппе Iа его уровень в сыворотке крови достоверно превышал показатели в группе с физиологическим течением беременности во все сроки гестации, наиболее высокие показатели отмечены в I триместре (17,2±1,4 пг/мл и 4,2±0,2 пг/мл, соответственно). При корреляционном анализе в III триместре выявлена взаимосвязь между содержанием активина - A в сыворотке крови и количеством лимфоцитов, экспрессирующих маркеры поздней активации и готовности к апоптозу CD95+ (rs=0,83, p=0,007). Возможно, что повышенный уровень активина - А при угрозе прерывания беременности ассоциируется с его способностью индуцировать гибель клеток децидуальной оболочки по механизму апоптоза.
На основании сравнительного анализа соотношений про- и противовоспалительных цитокинов у беременных I группы, было отмечено достоверное смещение баланса в сторону продукции провоспалительных цитокинов у пациенток с угрозой прерывания беременности: TNF-/IL-10, IL -8/ IL- 10, IFN-/IL-4, IFN-/IL-10 в сыворотке крови и TNF-/IL-10, IL -8/ IL- 10, IFN-/IL-10 в цервикальной слизи, имеющие динамическое нарастание в динамике гестации. Параметры иммунного статуса, функциональной активности клеток иммунной системы, апоптоза, содержания про- и противовоспалительных цитокинов в подгруппе с неосложненным течением беременности (Iб) достоверно не отличались от аналогичных показателей в группе с физиологическим течением гестации.
Дальнейшие наши исследования были посвящены сравнительному изучению параметров иммунной системы в I группе при различных исходах беременности. В нашей работе в подгруппе Iа прерывание беременности в I триместре произошло у 14 женщин.
Данные, полученные нами, выявили достоверные различия между подгруппами прерванной и пролонгированной беременности по уровню экспрессии CD16+ (16,8±1,4% и 11,5±1,1%, соответственно) и CD16+CD25+ (1,7± 0,03% и 0,5±0,02%). Исследование функциональной активности лимфоцитов у беременных сравниваемых подгрупп выявило достоверное повышение содержания CD69+ (7,2±0,8% и 3,5±0,4%), CD25+ (6,4±0,8% против 3,3±0,5%), CD71+ (11,1±1,4% и 2,7±0,5%, соответственно), CD11b+ (24,3±3,3% и 13,1±1,4%) по сравнению с пациентками, беременность которых прервалась. Сравнительный анализ экспрессии рецепторов к TLR-2 (CD282+), TLR-4 (CD284+) на моноцитах периферической крови у беременных сравниваемых подгрупп обнаружил различия по содержанию CD14+ CD282+ (80,1±3,7% и 60,8±3,9%).
Анализ экспрессии рецепторов к цитокинам выявил достоверные отличия по содержанию CD126+(18,4±1,8% и 7,4±0,5%, соответственно).
Сравнительное изучение содержания провоспалительных цитокинов и неоптерина выявило статистически обоснованные различия между подгруппами прерванной и пролонгированной беременности по содержанию в сыворотке крови IFN- (226,2±58 пг /мл и 118,4±15,9 пг /мл), неоптерина (3,8±0,1 нг/мл против 3,1±0,1 нг/мл) и в цервикальной слизи неоптерина (11,9±0,7 нг/мл и 8,4±0,5 нг/мл), IL-8 (1677±246,0 пг/мл и 967,5±141,1 пг/мл), IL-6 (279,5±29,9 пг/мл и 99,6±37,8 пг/мл, соответственно). Исследование содержания противовоспалительных цитокинов выявило статистически обоснованные различия между подгруппами прерванной и пролонгированной беременности по уровню в цервикальной слизи IL- 10 (5±0,3 пг/мл против 11,8±2,3 пг/мл), IL- 4 (150,1±20,1 пг/мл и 77,3±13,4 пг/мл, соответственно).
Таким образом, при неблагоприятном исходе беременности, более выраженные иммунологические нарушения на системном уровне касаются продукции IFN- и неоптерина, а на локальном уровне IL-8, IL-6 и неоптерина.
На основании метода логистической регрессии была рассчитана чувствительность и специфичность для иммунологических маркеров, имеющих достоверные различия в нашем исследовании. Наиболее высокая чувствительность и специфичность выявлена для неоптерина, IL-6 в сыворотке крови и цервикальной слизи, IL-12 в цервикальной слизи, соотношения IL-8/ IL-10 в сыворотке крови, сочетания тестов СD126+ и СD25+, СD14+СD282+ (рис.1). Была установлена оптимальная точка «cutoff», которая позволила рассчитать предсказательную ценность положительного результата (ПЦП) и предсказательную ценность отрицательного результата (ПЦО) для каждого теста. Для проведения контроля полученных результатов использовался метод ROC-Lines. Таким образом, используя полученные данные, можно прогнозировать развитие угрозы прерывания у беременных с урогенитальной инфекцией с достаточно высокой степенью вероятности. Кроме того, для этого может быть использована прогностическая формула, полученная при помощи метода логистической регрессии. Если 3,76 а + 6,7 б + 0,156 с > 67,6, то высока вероятность формирования угрожающего течения беременности, где а-уровень содержания неоптерина в сыворотке крови, б - уровень неоптерина в цервикальной слизи, с- уровень экспрессии TLR-2 на мононуклеарах периферической крови.
 |
Рисунок 1. Алгоритм прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции
При изучении данных у наблюдаемых женщин II группы определены иммунопатогенетические факторы, способствующие угрозе прерывания беременности.
Оценка дифференцировочных потенций лимфоцитов выявила, что у женщин в подгруппе IIа содержание общего количества Т лимфоцитов CD3+ достоверно превысило показатели по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во II триместре (79,4±1,9% и 71,9±2,3%, соответственно) и III триместре (80,6±2,2% и 72±0,9%).
Во всех триместрах гестации выявлено повышение количества лимфоцитов, обладающих хелперно-индукторными свойствами, наиболее выраженное повышение отмечено в III триместре (62,9±2,4% и 52,9±2,5%, соответственно). Кроме того, обнаружено статистически значимое усиление процессов ранней активации в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих хелперно-индукторными свойствами СD4+ CD69+ во всех исследуемых триместрах и СD4+ CD25+ в I и II триместрах.
Абсолютное и относительное количество цитотоксических лимфоцитов CD8+ в подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности в III триместре было ниже, чем в группе с физиологическим течением беременности (18,5±1,4% и 24,4±1,7%, соответственно).
Сравнение средних значений натуральных киллеров CD16+ в подгруппе IIа выявило достоверное повышение по сравнению с группой с физиологическим течением беременности в I триместре (10,6±0,9% и 6,1±0,5%) и II триместре (9,9±0,8% и 6,8±0,2%, соответственно). При этом в I триместре выявлена корреляционная взаимосвязь между количеством CD16+ и содержанием TNF - в сыворотке крови (rs=0,36, p=0,03). Данный факт можно объяснить тем, что NK - клетки, активирующиеся под воздействием TNF –, превращаются в ЛАК-клетки, способные лизировать клетки трофобласта. С другой стороны, сами NK клетки опосредуют свои цитотоксические эффекты через секрецию TNF –, высокие концентрации которого приводят к сокращению гладкой мускулатуры сосудов с последующим развитием ишемического некроза (Сидельникова В.М., Кирющенков П.А., 2004).
В подгруппе II а выявлено достоверное повышение IgM по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех трех триместрах и IgА в I и III триместрах. Содержание 4% ЦИК в подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности достоверно повышалось во всех трех триместрах беременности и 3% ЦИК во II и III триместре. Указанные изменения могут отражать напряженность процессов иммуногенеза при гормональных нарушениях.
При исследовании функциональной активности лимфоцитов периферической крови выявлено, что в подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности достоверно повышалось содержание лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры ранней активации CD69+ и CD25+ во всех трех триместрах. Аналогичные изменения были характерны и для CD71+ лимфоцитов. При этом во II триместре выявлена корреляционная связь между содержанием CD69+ и содержанием TNF- в сыворотке крови (rs=0,71, p=0,04), что может быть обусловлено усилением его продукции активированными Т- лимфоцитами (Ярилин А.А., 1999).
Содержание НLA-DR+ лимфоцитов, характеризующих поздние этапы активации, повышалось в подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности только в I триместре (9,8±0,6% и 6,4±0,9%, соответственно). При этом обнаружена зависимость между содержанием НLA-DR+ и уровнем экспрессии CD4+(rs=0,65, p=0,01). Известно, что высокая экспрессия НLA-DR+ на поверхности лимфоцитов служит показателем активности специфического иммунного ответа. Выявленные изменения можно объяснить тем, что основным продуктом специфических активированных Т-клеток является IFN-. Под его влиянием усиливается экспрессия молекул НLA-DR+, обуславливая участие этих клеток в процессах антигенной презентации (Колесникова И.К., 2004).
В подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено статистически значимое усиление процессов ранней активации в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих хелперно-индукторными свойствами СD4+ CD69+ и во всех исследуемых триместрах и СD4+ CD25+ в I и II триместрах
Изучение процессов поздней активации и готовности к апоптозу в подгруппе IIа обнаружило тенденцию к снижению CD95+ в общей популяции, однако достоверные различия от показателей в группе с физиологическим течением беременности отмечены только во II триместре. Вместе с тем, в I триместре выявлено достоверное снижение количества лимфоцитов, экспрессирующих СD95+ на поверхности СD4+(0,2±0,01% и 0,4±0,01%, соответственно). Снижение экспрессии СD95+ лимфоцитами периферической крови у женщин с угрозой прерывания беременности на фоне гормональных нарушений, вероятно, свидетельствует о снижении готовности клеток к апоптозу. Данное предположение подтверждается полученными нами результатами о снижение ранних маркеров апоптоза в периферической крови женщин в подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех исследуемых триместрах.
Сравнительное изучение содержания провоспалительных цитокинов в подгруппе с осложненным угрозой прерывания периодом гестации на фоне гормональных нарушений выявило, что в сыворотке крови уже в I триместре отмечается достоверное повышение IL-1, имеющее прогрессирующее увеличение в динамике гестации (табл.5). Можно предположить, что негативное влияние повышенного уровня IL-1 у беременных с гормональными нарушениями может быть связано как с эмбриотоксическим эффектом, так и с активацией протромбиназы, что обуславливает угрозу прерывания беременности и развитие плацентарной недостаточности (Сидельникова В.В., 2002).
Известно, что под действием прогестерона подавляется продукция цитокинов, вызывающих воспалительные и тромбофилические реакции (TNF-, IL-1 ). Кроме того, прогестерон и его производные стимулируют в эндометрии продукцию протеинов, которые вызывают апоптоз естественных киллеров, а нарушение лютеиновой функции приводят к изменению уровней циркулирующего TNF– (Сидельникова В.М., 2000; Genazzani A.R., 2002; Croy A. et al., 2002). В нашем исследовании содержание TNF - в подгруппе IIа в сыворотке крови превысило показатели, характерные для группы с физиологическим течением беременности во всех трех триместрах беременности (табл.5). Возможно, что повышение продукции TNF – в сыворотке крови у беременных с гормональными нарушениями негативно влияет на формирование иммуносупрессии и провоцирует развитие осложнений беременности (Селедцова Н.В. и соавт., 2006).
Анализируя содержание IFN-, было выявлено повышение его содержания в сыворотке крови в подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех трех триместрах (табл.5). Можно предположить, что гиперандрогения способствует стимуляции сывороточного уровня IFN-, что свидетельствует о сдвиге Th1/Th2 цитокинового баланса, являясь фактором риска угрозы прерывания беременности (Corsini E., Racchi M., 2005).
Известно, что IL-12 служит посредником между макрофагами и лимфоцитами, что проявляется в его способности регулировать соотношение клеточного и гуморального иммунного ответа через стимуляцию дифференцировки Т хелперов. Изучение содержания IL-12 в сыворотке крови в подгруппе IIа во II и III триместре отметило повышение показателей по сравнению с группой с физиологическим течением беременности (табл.5). При этом во II триместре выявлена прямая зависимость между содержанием в сыворотке крови IL-12 и уровнем экспрессии СD4+ (rs=0,40, p=0,02), а также обратная зависимость между содержанием IL-4 (rs=0,44, p=0,01). Возможно, что снижение уровня прогестерона приводит к экспрессии эффекта синергизма между IL-12 и TNF–, вызывая доминирование цитокинов Th1 типа, кроме того, гормональная недостаточность отменяет IL-4 и IL-10 стимулирующее действие, что приводит к риску прерывания беременности (Ширшев С.В., 2002; Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003, 2005).
Содержание IL-2 в подгруппе II а в сыворотке крови в I триместре составило 28,7±3,6 пг/мл, что превысило показатели в группе с физиологическим течением беременности в 1,7 раза. В то же время, содержание IL-4 в подгруппе II а в сыворотке крови практически не отличалось от группы с физиологическим течением беременности в динамике гестации.
Напротив, содержание IL-10 в подгруппе IIа в сыворотке крови было достоверно сниженным во все сроки осложненного угрозой прерывания течения беременности (табл.5). Продукции низкого уровня IL-10 мононуклеарами периферической крови у женщин с угрозой прерывания на фоне гормональных нарушений свидетельствует об изменении супрессорной реаранжировки, что может приводить к срыву толерантности и прерыванию беременности.
В подгруппе IIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности, обнаружено достоверное снижение экспрессии CD124+ во всех трех триместрах. Изучение количества лимфоцитов, экспрессирующих СD122+, выявило их повышение по сравнению с группой с физиологическим течением беременности в I и II триместрах, достоверные различия найдены по абсолютным значениям.
Анализ содержания неоптерина в сыворотке крови в подгруппе IIа выявил его статистически значимое повышение по сравнению с показателями в группе с физиологическим течением в I и II триместрах беременности, наиболее выраженные изменения выявлены в I триместре (3,2±0,1 нг/мл и 1,8±0,1 нг/мл, соответственно), что отражает активацию клеточного звена иммунной системы. В слизи цервикального канала в трех триместрах гестации статистически достоверных различий содержания про- и противовоспалительных цитокинов и неоптерина не обнаружено.
Таблица 5
Средние значения содержания про- и противовоспалительных
цитокинов у женщин II группы при угрозе прерывания беременности и
группы с физиологическим течением беременности
| Показатель, пг/мл | I триместр | II триместр | III триместр | |||
| II а | Физ.течение | II а | Физ.течение | II а | Физ.течение | |
| IL-8, сыворотка крови | 34±5,3 | 33,1±4,4 | 47,5±8,3 | 34±13,2 | 44,5±12,1 | 39±6,5 |
| IL-8, цервик. слизь | 147±15,3 | 117±17,6 | 198±31,6 | 170±37,8 | 230±20,7 | 220±56,5 |
| IL-6, сыворотка крови | 10,3±0,5 | 8,1±3,1 | 12±2,3 | 8±3,0 | 10,1±2,1 | 6±1,4 |
| IL-6, цервик. слизь | 20,3±1,9 | 15,2±1,9 | 21,8±6,7 | 20±3,8 | 32,7±2,4 | 24±5,7 |
| TNF-, сыворотка крови | 70±5,9* | 35±4,7 | 80,6±15,5* | 28±4,6 | 160±39,5* | 28±5,3 |
| TNF-, цервик. слизь | 26±2,3 | 23±4,4 | 36±8,1 | 22±5,5 | 37±10,7 | 29±7,9 |
| IL-1-, сыворотка крови | 120±17,8* | 22±7,1 | 136±11,9* | 55±9,4 | 170±51,7* | 25±5,7 |
| IL-1-, цервик. слизь | 18,3±1,5 | 15±3,4 | 39±5,6 | 22,8±9,7 | 28±9,7 | 24,6±6,7 |
| IL-2, сыворотка крови | 28,7±3,6* | 17±4,6 | 40±5,4 | 35±7,7 | 27±7,4 | 33±5,6 |
| IFN-, сыворотка крови | 74,5±7,8* | 36,1±7,4 | 65±10,3* | 18±7,1 | 46±4,1* | 25±3,1 |
| IFN--, цервик. слизь | 40,3±3,1 | 33,1±5,2 | 37±5,6 | 29±4,1 | 33±5,2 | 22±3,9 |
| IL-12, сыворотка крови | 90,2±8,6 | 70,4±11,6 | 188±20,2* | 55,5±8,5 | 102,3±16,4* | 58±7,7 |
| IL-12, цервик. слизь | 22,8±3,1 | 24,5±8,2 | 35±8,4 | 23,4±8,0 | 30,1±7,3 | 30±6,4 |
| IL-4, сыворотка крови | 56,7±8,8 | 70,4±11,1 | 50,5±12,0 | 65±5,2 | 35±6,1 | 45±7,8 |
| IL-4, цервик. слизь | 50,9±6,4 | 50,2±11,4 | 55±11,9 | 51,1±12,0 | 35±7,5 | 46±7,7 |
| IL-10, сыворотка крови | 4,6±0,4* | 8,5±1,3 | 2,8±0,4* | 11,7±1,4 | 3,4±0,4* | 9,2±0,9 |
| IL-10, цервик. слизь | 22,5±7,8 | 25,6±2,9 | 12±1,8 | 12,7±1,5 | 8±1,6 | 11,3±1,9 |
Примечание: * - p<0,05, достоверность различий показателей по сравнению с группой женщин с физиологическим течением беременности
Отмечено достоверное повышение содержания активина-А в сыворотке крови в подгруппе IIа во всех трех триместрах, что согласуется с исследованиями Ogawa K. et al. (2006), о способности активина-А участвовать в воспалительном каскаде, активируя IL-1, TNF –.
На основании сравнительного анализа соотношений про - и противовоспалительных цитокинов у беременных II группы, было отмечено достоверное смещение баланса TNF-/IL-10, IFN-/IL-4, IFN-/IL-10, IL-8/IL-10 в сыворотке крови в сторону продукции провоспалительных цитокинов у пациенток с угрозой прерывания беременности.
Параметры иммунного статуса, функциональной активности клеток иммунной системы, апоптоза, содержания про- и противовоспалительных цитокинов в подгруппе с неосложненным течением беременности (IIб) достоверно не отличались от аналогичных показателей в группе с физиологическим течением гестации.
В нашей работе в подгруппе IIа прерывание беременности в I триместре произошло у 12 женщин. Сравнительный анализ параметров иммунного статуса и функциональной активности лимфоцитов выявил статистически обоснованные различия в подгруппе IIа между беременными с прерванной и пролонгированной беременностью по уровню экспрессии CD19+ (12,3±1,3% и 7,4±0,8%), CD69+ (5,2±0,4% и 2,2±0,5%), CD25+(3,7±0,2% и 0,6±0,1%), CD16+CD25+ (0,6±0,01% и 0,2±0,09%), а также по уровню в сыворотке крови TNF– (87±4,8 пг/мл и 63,1±7,5 пг/мл) и IL-10 (3,8±0,4 пг/мл и 6,5±0,6 пг/мл, соответственно).
На основании метода логистической регрессии была рассчитана чувствительность и специфичность для иммунологических маркеров, имеющих достоверные различия в нашем исследовании. Наиболее высокая чувствительность и специфичность выявлена для неоптерина, TNF – в сыворотке крови, сочетания тестов CD4+ и CD16+. Были определены точки «Cutoff», позволяющие прогнозировать развитие угрозы прерывания у беременных с гормональными нарушениями фетоплацентарного комплекса в I триместре с достаточно высокой степенью вероятности (рис.2).
 |
Рисунок 2. Алгоритм прогнозирования невынашивания беременности на фоне гормональных нарушений
При изучении данных у наблюдаемых женщин III группы определены патогенетические факторы, способствующие угрозе прерывания беременности.
В подгруппе IIIa по сравнению с группой с физиологическим течением беременности в I и II триместрах выявлено повышение абсолютного количества лимфоцитов и СD3+лимфоцитов при сохранении нормального количества регуляторных субпопуляций клеток, экспрессирующих CD 4+ и CD 8+.
Выявлено достоверное повышение содержания 4% ЦИК в динамике гестации, наиболее высокие показатели отмечены в III триместре (66,5±2,5 у.е и 44,6±0,6 у.е., соответственно).
Высокое содержание ЦИК возможно связано с длительной антигенемией и недостаточностью фагоцитарного звена при хронических воспалительных заболеваниях. В то же время, при изучении функциональной активности лимфоцитов периферической крови в подгруппе III а по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено усиление маркеров ранней активации CD69 + в III триместре (4,9±2,9% и 0,8±0,3%, соответственно) и CD25 + во II и III триместрах.
Количество лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD71+, у женщин в подгруппе IIIа повышалось на протяжении всего периода беременности, наиболее высокие показатели отмечены в III триместре (4,0±0,1% и 1,2±0,4%, соответственно), аналогичные изменения касались и НLA-DR+ лимфоцитов, характеризующих поздние этапы активации лимфоцитов (12,6±1,6% и 8,7±1,0%). При этом в I триместре выявлена положительная корреляционная связь между количеством лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR+ и CD71+ (rs=0,94, p=0,04).
Отмечено усиление процессов ранней и поздней активации в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих хелперно-индукторными свойствами СD4+CD69+ и СD4+HLA-DR+ во всех исследуемых триместрах беременности. Аналогичные сдвиги выявлены в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих цитотоксическими свойствами СD8+CD69+ в I и во II триместре (0,6±0,08% против 0,3±0,02%) и CD8+DR+ во все сроки наблюдения по сравнению с группой с физиологическим течением беременности.
Анализ экспрессии CD95+ как маркера поздней активации лимфоцитов и молекулу, характеризующую готовность к апоптозу, в общей популяции не выявил достоверных отличий в подгруппе IIIа от показателей в группе с физиологическим течением беременности, однако, усиление процессов апоптоза отмечено в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих хелперно-индукторными свойствами СD4+CD95+ во всех исследуемых триместрах, наиболее высокие показатели выявлены в III триместре (1,2±0,1% и 0,2±0,01%, соответственно). Изучение экспрессии СD95+ на поверхности CD8+ и CD16+ не обнаружило статистически значимых различий в подгруппах, различных по течению беременности.
У женщин в подгруппе IIIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено достоверное повышение как ранних маркеров апоптоза во II и III триместре, так и поздних в I и II триместре, составив во II триместре (1±0,2% и 0,6±0,01%, соответственно). При этом выявлена корреляционная зависимость между содержанием в сыворотке крови TNF- и маркерами раннего апоптоза (rs=0,77, p=0,02). Данный факт можно объяснить тем, что в процессе воспаления через специализированные рецепторы TNF- запускает в клетках сигналы ведущие к гибели по типу апоптоза, в том числе и клеток трофобласта, что может приводить к угрозе прерывания беременности.
В нашем исследовании в подгруппе IIIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности в I и III триместрах отмечено повышение экспрессии TLR-4 (CD284+) на моноцитах периферической крови. В I триместре (32,2±2,2% против 26±2,0%, соответственно), при этом выявлена корреляционная зависимость между экспрессией TLR-4 (CD284+) и содержанием в сыворотке крови TNF- (rs=0,70, p=0,01), что можно объяснить тем, что ЛПС через TLR-4 может индуцировать продукцию клетками трофобласта высокого уровня цитокинов, в том числе TNF-, вызывающим их апоптоз (Ганковская Л.В. и соавт., 2007).
Анализ содержания провоспалительных цитокинов приводит к следующему выводу: в подгруппе IIIа по сравнению с группой с физиологическим течением беременности выявлено достоверное повышение содержание IL-1 во всех исследуемых триместрах. В I триместре составило (72±24,5 пг/мл и 22±7,1 пг/мл, соответственно), при этом выявлена корреляционная зависимость между содержанием в сыворотке крови IL-1 и CD71 (rs=0,70, p=0,01), что подтверждает его важную роль в активации Т-клеток, запуске их пролиферации при взаимодействии с антигеном. Наши результаты согласуются с данными Качалиной Т.С. и соавт. (2005), о повышении IL-1 в сыворотке крови у беременных с угрозой прерывания на фоне пиелонефрита.
Достоверное повышение содержания в сыворотке крови IL-6, по сравнению с группой с физиологическим течением беременности отмечено во II и III триместре (30±8,4 пг/мл и 6±1,4 пг/мл). Содержание IL-8 в сыворотке крови практически не отличалось от показателей в группе с физиологическим течением беременности.
В то же время, содержание TNF - в сыворотке крови в подгруппе IIIа достоверно превысило показатели, характерные для группы с физиологическим течением беременности во все сроки наблюдения. Во II триместре составило (84,5±18,5 пг/мл и 28±4,6 пг/мл, соответственно), при этом выявлена корреляционная зависимость между содержанием в сыворотке крови TNF- и CD126+ (rs=0,80, p=0,01) и обратная зависимость между содержанием TGF-(-0,73, p=0,005), что объясняется тем, что отсутствие усиления продукции TGF- отменяет блокировку продукции TNF- и стимулируемое им образование простогландина, способствуя развитию преждевременной родовой деятельности. Наши результаты согласуются с данными А.И.Аутеншлюс и соавт. (1998) о достоверном увеличении содержания TNF – у беременных с почечной патологией, что объясняется тем, что TNF – является одним из ключевых цитокинов, вовлеченных в воспалительную реакцию.
Содержание IFN- в сыворотке крови в подгруппе IIIа в I и II триместре достоверно превысило показатели, характерные для группы с физиологическим течением беременности, наиболее высокие показатели отмечены в I триместре (77,8±8,8 пг/мл и 36,1±7,4 пг/мл, соответственно).
Содержание IL-10 в сыворотке крови в подгруппе IIIа было достоверно ниже уровня, характерного для группы с физиологическим течением беременности во все сроки наблюдения. При этом во II триместре выявлена обратная зависимость между содержанием в сыворотке крови IL-10 и содержанием неоптерина (-0,57, p=0,04), а в I триместре - экспрессии СD25+(-0,78, p=0,01), что показывает, что несбалансированное преобладание воспалительных маркеров над противовоспалительными может приводить к угрозе прерывания беременности.
Изучение экспрессии рецептора к IL-6 (СD126 +) в подгруппе IIIа выявил его достоверное повышение по сравнению с группой с физиологическим течением беременности во всех триместрах гестации. В I триместре отмечено снижение количества лимфоцитов, экспрессирующих СD124+ (4,5±0,6% и 6,7±0,8%, соответственно).
Изучение содержания неоптерина у женщин с угрозой прерывания беременности выявило существенное статистически достоверное его повышение в подгруппе IIIа в сыворотке крови во всех трех триместрах, составив в I триместре (2,1±0,1нг/мл против 1,8±0,1 нг/мл, в группе с физиологическим течением беременности). При этом обнаружена связь между содержанием в сыворотке крови неоптерина и IL-1 (rs=0,56, p=0,03), которая представляется логичной, поскольку концентрация неоптерина отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов (Fuchs D., 1995). В слизи цервикального канала в трех триместрах гестации статистически достоверных различий содержания про - и противовоспалительных цитокинов и неоптерина не выявлено.
Изучение содержания активина - А в подгруппе IIIа выявило повышение показателей, характерных для группы с физиологическим течением беременности во всех триместрах беременности, наиболее высокие показатели отмечены в I триместре (13±1,8 пг/мл и 4,2±0,2 пг/мл, соответственно). Возможно, что влияние повышенного уровня активина – А при осложненном течении беременности связано со способностью индуцировать гибель клеток децидуальной оболочки по механизму апоптоза (Сотникова Н.Ю., 2005).
На основании сравнительного анализа соотношений про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у беременных III группы с различным течением гестации, было отмечено достоверное смещение баланса TNF-/IL-10, IFN-/IL-10, IL8/IL-10, IFN-/IL-4 в сторону продукции провоспалительных цитокинов у пациенток с угрозой прерывания беременности. Параметры иммунного статуса, функциональной активности клеток иммунной системы, апоптоза, содержания про - и противовоспалительных цитокинов в подгруппе с неосложненным течением беременности (IIIб) достоверно не отличались от аналогичных показателей в группе с физиологическим течением гестации.
Анализ диагностической и прогностической значимости тестов определил точки «Cutoff», позволяющие прогнозировать развитие угрозы прерывания в I триместре у беременных при хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях с достаточно высокой степенью вероятности (рис.3).
 |
Рисунок 3. Алгоритм прогнозирования невынашивания беременности при хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях
Результатом нашего исследования явилась разработка принципиально нового подхода к профилактике угрозы прерывания беременности различного генеза, основанного на выделение прогностических иммунологических признаков, совокупность которых позволит формировать группы риска по невынашиванию беременности. Для клинического использования нами предложены новые способы и разработаны алгоритмы прогнозирования невынашивания беременности.
Проведенные исследования позволили охарактеризовать клеточные и цитокин-опосредованные механизмы угрозы прерывания беременности. Можно заключить, что угроза прерывания беременности различного генеза характеризуется нарушением этапов дифференцировки, активации, пролиферации, апоптоза, эффекторных функций иммунокомпетентных клеток.
Выявленные общие закономерности реакции иммунной системы при угрозе прерывания беременности различного генеза и особенности при урогенитальной инфекции, гормональных нарушениях, хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях подтверждают необходимость сохранения баланса иммунных взаимоотношений в системе «мать-плацента-плод», а с другой стороны - дают основание для дифференцированного подхода к разработке и оптимизации схем диагностики и терапии угрозы прерывания беременности при этих состояниях, что является новым научным направлением исследований в клинической иммунологии, разработка которого в рамках настоящей работы позволит добиться необходимых результатов в оказании помощи матерям и приведет к снижению перинатальных потерь.
Выводы:
1. При угрозе прерывания беременности у пациенток с урогенитальной инфекцией выявляются выраженные нарушения этапов активации, пролиферации, дифференцировки и процессов межклеточного взаимодействия, что верифицируется увеличением клеток с супрессорно-цитотоксической активностью CD8+, повышением маркеров активации CD69+,CD71+, HLA-DR+ на их поверхности, повышением CD25+ на поверхности NK клеток, увеличением экспрессии молекул адгезии CD11b+, CD54+.
2. Иммунопатологические сдвиги, выявленные у женщин с угрозой прерывания беременности на фоне гормональных нарушений характеризуются увеличением клеток с хелперно-индукторной активностью CD4+, повышением активационных маркеров CD69+,CD25+ на их поверхности, усилением экспрессии NK-клеток, повышением уровня ЦИК.
3. Для угрозы прерывания беременности при хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях характерно усиление экспрессии маркеров активации CD25+, CD69+, CD71+ в общей популяции и CD69+, HLA-DR+ в субпопуляциях лимфоцитов, обладающих цитотоксическими свойствами CD8+, хелперно-индукторными свойствами CD4+, повышение уровня ЦИК.
4. Параметры апоптоза у женщин с угрожающим прерыванием беременности при урогенитальной инфекции и хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях характеризуются повышением CD95+, AnnexinV+, AnnexinV+PI+, а при угрозе прерывания беременности на фоне гормональных нарушений снижением CD95+, AnnexinV+, AnnexinV+PI+, что свидетельствует о нарушении процессов апоптоза иммунокомпетентных клеток при угрозе прерывания беременности различного генеза.
5. При урогенитальной инфекции критерием угрозы прерывания беременности является однонаправленное повышение содержания неоптерина, IL-1, IL-6, IL-12 и смещение цитокинового баланса в сторону продукции провоспалительных цитокинов TNF-/IL-10, IL -8/ IL-10, IFN-/IL-4, IFN-/IL-10 в сыворотке крови и TNF-/IL-10, IL -8/ IL- 10, IFN-/IL-10 в цервикальной слизи, что сочетается с повышением экспрессии рецепторов к IL-4, IL-6 и свидетельствует о нарушениях эффекторных функций иммунокомпетентных клеток, существенной роли иммунологических изменений на локальном уровне.
6. При угрозе прерывания беременности на фоне гормональных нарушений выявлено повышение содержания неоптерина, IL- 1, IL-2, IL-12 и смещение цитокинового баланса в сторону продукции провоспалительных цитокинов TNF-/IL-10, IFN-/IL-4, IFN-/IL-10, IL-8/IL-10 преимущественно в сыворотке крови, что сопряжено с ослаблением экспрессии рецепторов к IL-4, повышением экспрессии рецепторов к IL-2, что свидетельствует о напряженности процессов иммуногенеза, изменении супрессорной реаранжировки.
7. Повышение содержания неоптерина, IL-1, IL-6, смещение цитокинового баланса в сторону продукции провоспалительных цитокинов TNF-/IL-10, IFN-/IL-10, IL8/IL-10, IFN-/IL-4 в сыворотке крови при угрозе прерывания беременности на фоне хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваний ассоциировано с усилением экспрессии рецепторов к IL-6, снижением экспрессии рецепторов к IL-4.
8. При угрозе прерывания беременности у пациенток с урогенитальной инфекцией отмечено повышение экспрессии TLR-2 и TLR-4 рецепторов на мононуклеарах периферической крови, что может приводить к избыточному синтезу провоспалительных цитокинов, способствующих нарушению нормального течения беременности и TLR- опосредованному апоптозу трофобласта. Для угрозы прерывания беременности при хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях характерно повышение экспрессии TLR-4 рецепторов.
9. При угрозе прерывания беременности у женщин с урогенитальной инфекцией, гормональными нарушениями, хроническими экстрагенитальными воспалительными заболеваниями в сыворотке крови выявлено повышение продукции активина - А, а повышение TGF- отмечено только при угрозе прерывания беременности на фоне урогенитальной инфекции.
10. У пациенток с неосложненным течением беременности процессы дифференцировки, активации, пролиферации, межклеточного взаимодействия, апоптоза и эффекторных функций иммунной системы не отличались от аналогичных показателей при физиологическом течении беременности.
11. Использование клинико-иммунологических критериев угрозы прерывания беременности различного генеза позволило разработать алгоритмы прогнозирования невынашивания беременности, что способствует предупреждению развития перинатальных осложнений и плодовых потерь, увеличению количества благоприятных исходов беременности.
Практические рекомендации:
1. У беременных с идентифицированной урогенитальной инфекцией предпочтительным материалом для исследования должна служить цервикальная слизь, а при гормональной дисфункции фетоплацентарного комплекса и хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях – сыворотка крови.
2. Для клинического использования разработаны алгоритмы прогнозирования и предложены новые способы ранней диагностики угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции в I триместре. При показателях в цервикальной слизи неоптерина > 3,7 нг/мл, IL-12>102,0 пг/мл, IL-6>35,1 пг/мл, в сыворотке крови неоптерина>2,5 нг/мл, IL-6>21,5 пг/мл, IL-8/IL-10>20,4, экспрессии CD126+>5,3%, CD25+>4,1%, CD14+ CD282+> 54,4% прогнозировать высокий риск развития угрозы прерывания беременности и начать курс превентивной терапии, предупреждая манифестацию данного осложнения беременности.
3. Предикторами риска угрозы прерывания беременности на фоне гормональной дисфункции фетоплацентарного комплекса в I триместре может служить уровень в сыворотке крови TNF- >43,7 пг/мл, уровень неоптерина > 2,2 нг/мл, повышение количества лимфоцитов, экспрессирующих CD4+>49,8%, CD16+> 9,5%, а при хронических воспалительных экстрагенитальных заболеваниях повышение содержания в сыворотке крови неоптерина >2,2 нг/мл, IL-1>88,5 пг/мл, TNF- > 49, 6 пг/мл.
СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации:
1.Левкович М.А., Орлов В.И., Ефанова Е.А., Стояненко О.О. Иммунологические маркеры угрозы прерывания беременности раннего срока при урогенитальной патологии // Медицинская иммунология. - 2003.- Т. 5, № 3-4.- С.- 338-339.
2.Левкович М.А., Дударева М.В., Ефанова Е.А., Стояненко О.О. Роль иммунологических маркеров в диагностике угрозы прерывания беременности раннего срока // Пренатальная диагностика и беременность высокого риска. - Ростов-на-Дону, 2003.- С.145-146.
3.Левкович М.А., Орлов В.И., Стояненко О.О., Дударева М.В., Ефанова Е.А. Динамика экспрессии маркеров активации лимфоцитов в ходе терапии угрозы прерывания беременности // Международный журнал иммунореабилитации.- 2003.- Т.5, №2. - С. 299.
4.Афонин А.А., Кравченко Л.В., Ефанова Е.А., Валенцева К.В., Левкович М.А. Способ прогнозирования нарушений адаптации новорожденных детей от матерей с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями // Патент на изобретение № 2237900 от 10.10.04.
- 5.Левкович М.А. Характеристика иммунного статуса беременных с урогенитальной инфекцией и фетоплацентарной недостаточностью // Российский иммунологический журнал. - 2004.- Т.9, № 1. - С. 318.
6.Левкович М.А., Орлов В.И., Плахотя Г.Г. Особенности иммунного статуса у беременных с фетоплацентарной недостаточностью // Аллергология и иммунология.- 2004.- Т.5, № 1.- С. 129.
7.Левкович М.А. Особенности иммунного статуса беременных с урогенитальной инфекцией и признаками угрозы прерывания беременности // Актуальные проблемы клинической иммунологии и аллергологии. - Пятигорск, 2004.- С.30.
8.Левкович М.А.Содержание внутриклеточных цитокинов у беременных с угрозой прерывания и урогенитальной инфекцией // Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и педиатрии.- Ростов-на-Дону, 2004.- С.44.
9.Левкович М.А. Роль иммунологических факторов в прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции // Медицинская иммунология.- 2004.- Т.6, № 3-5.- С. 382.
10.Левкович М.А., Плахотя Т.Г., Орлов В.И. Продукция цитокинов у беременных с фетоплацентарной недостаточностью и генитальной инфекцией // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т.9, № 2. - С. 170.
11.Левкович М.А., Стояненко О.О., Орлов В.И. Особенности цитокинового статуса на местном и системном уровне при угрозе прерывания беременности раннего срока // Аллергология и иммунология. – 2005. - Т.6, № 2. - С. 191-192.
12.Левкович М.А., Стояненко О.О., Орлов В.И. Роль определения неоптерина в прогнозировании невынашивания беременности // Российский иммунологический журнал. – 2005. - Т.9, № 2. -С. 272-273.
13.Левкович М.А., Стояненко О.О., Орлов В.И. Диагностическая значимость определения провоспалительных цитокинов в прогнозировании исхода беременности // Российский иммунологический журнал. – 2005. - Т.9, № 2. - С. 273.
14.Левкович М.А. Прогностические маркеры невынашивания беременности при урогенитальной инфекции // Медицинская иммунология.-2005.-Т.7, № 2. -3. - С.187.
15.Левкович М.А., Стояненко О.О. Неоптерин – скрининговый маркер угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции // Актуальные проблемы акушерства и педиатрии. Естественные науки. Известия Высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион.- Ростов-на-Дону, 2005.- С. 49-51.
16.Стояненко О.О., Левкович М.А. Прогнозирование угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции // Современные проблемы диагностики и лечения нарушений репродуктивного здоровья женщин.- Ростов-на-Дону, 2005. - С. 18-20.
17.Левкович М.А., Стояненко О.О., Орлов В.И. Иммунологические маркеры невынашивания беременности при урогенитальной инфекции на локальном и системном уровнях // Мать и дитя: материалы VII Российского форума. - М., 2005. - С. 128-129.
18.Плахотя Т.Г., Гиляновский М.Ю., Смолянинов Г.В., Орлов В.И., Левкович М.А. Новые аспекты прогнозирования перинатальных гипоксически-ишемических повреждений ЦНС // Мать и дитя: материалы VII Российского форума. - М., 2005. - С.203-204.
19.Левкович М.А., Плахотя Т.Г., Дударева М.В. Изменение параметров иммунного статуса при фетоплацентарной недостаточности // Иммунитет и болезни - от теории к терапии: Международный конгресс.- 2005.- С.151.
20.Кравченко Л.В., Афонин А.А., Бережанская С.Б., Ефанова Е.А., Левкович М.А. Прогнозирование нарушений адаптации новорожденных детей от матерей с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями // Медицинская технология.- Ростов-на-Дону, 2006. – 12 с.
21.Левкович М.А., Орлов В.И., Сизякина Л.П., Стояненко О.О. Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности при урогенитальной инфекции: патент на изобретение № 2281504 от 10.08.2006.
22.Левкович М.А., Орлов В.И., Стояненко О.О. Алгоритм прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции: медицинская технология. - Ростов-на-Дону, 2006. – 13 с.
- 23.Левкович М.А., Орлов В.И., Плахотя Т.Г., Афонин А.А., Созаева Д.И. Способ прогнозирования церебральных нарушений у новорожденных от матерей из группы высокого риска: патент на изобретение.- №2290644 от 27.12.06.
24.Левкович М.А. Роль воспалительных медиаторов в прогнозирование угрозы прерывания беременности // Актуальные вопросы акушерства и педиатрии. Естественные науки. Известия Высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион.- Ростов-на-Дону, 2006.- С.76-79.
25.Левкович М.А. Роль иммунной системы в патогенезе осложнений беременности при урогенитальной инфекции // Актуальные вопросы акушерства и педиатрии. Естественные науки. Известия Высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион.- Ростов-на-Дону, 2006.- С.51-53.
26.Левкович М.А., Стояненко О.О., Орлов В.И. Роль урогенитальной инфекции в генезе невынашивания беременности раннего срока // Аллергология и иммунология.- 2006.- Т. 7, №3. - С.387.
27.Левкович М.А. Изменение баланса популяций Т-хелперов при угрозе прерывания беременности и урогенитальной инфекции // Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний: международный симпозиум физиологии иммунной системы. - М., 2006.- С. 42-45.
28.Левкович М.А. Значение иммунологических маркеров у беременных с фетоплацентарной недостаточностью и инфекцией для прогнозирования перинатального поражения ЦНС новорожденного // Медицинская иммунология.- 2006.- Т.8, № 2.-3.- С. 313-314.
29. Левкович М.А., Дударева М.В. Иммунологические аспекты плацентарной недостаточности при урогенитальной инфекции // Актуальные проблемы педиатрии: материалы XI конгресса педиатров России.-2007.- С. 393.
30.Дударева М.В., Левкович М.А. Современные лабораторные технологии в пери и неонатологии // Актуальные проблемы педиатрии: материалы XI конгресса педиатров России.- 2007. - С. 220.
31.Левкович М.А. Изучение маркеров апоптоза при угрозе прерывания беременности на фоне урогенитальной инфекции // Российский иммунологический журнал.-2007.- Т.9.- № 4. - С. 94-95.
32.Левкович М.А., Хабибулина Е.И. Изучение уровня маркеров воспаления в ходе терапии угрозы прерывания беременности // Российский иммунологический журнал.- 2007.- Т.9. №4.- С. 95.
33.Левкович М.А. Особенности иммунного ответа при урогенитальной инфекции и плацентарной недостаточности // Российский иммунологический журнал.- 2007.- Т.9.- №4.- С. 79-80.
34.Левкович М.А. Влияние иммунных нарушений на формирование плацентарной недостаточности на фоне урогенитальной инфекции // Медицинская иммунология.-2007.-Т.9, №2-3.- С.260.
35.Левкович М.А. Способ прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции: патент на изобретение.- № 2341799 от 20.12.2008.
36.Левкович М.А., Орлов В.И., Дударева М.В. Характеристика продукции ИЛ-12 в цервикальном секрете у беременных при урогенитальной патологии // Мать и дитя: материалы IX Всероссийского форума 2007.- С. 143-144.
37.Левкович М.А., Орлов В.И., Дударева М.В. Анализ секреции цитокинов при угрозе прерывания беременности различного генеза // Российский аллергологический журнал.- 2008.- №1, прил.1.- С. 153-154.
38.Левкович М.А. Современные представления о роли цитокинов в генезе физиологического и патологического течения беременности // Российский Вестник акушерства и гинекологии.- 2008.- Т. 8, №3.- С. 37-40.
39.Левкович М.А. Орлов В.И., Дударева М.В. Экспрессия Toll-2 и Toll- 4 на моноцитах периферической крови при угрозе прерывания беременности на фоне урогенитальной инфекции // Аллергология и иммунология.- 2008. - Т. 9, № 1.- С.-80.
40.Левкович М.А. Дисбаланс цитокинов при угрозе прерывания беременности // Российский иммунологический журнал.- 2008.- Т.2, №2-3.- С.292.
41.Левкович М.А. Диагностика нарушений адаптации новорожденных детей от матерей с урогенитальной инфекцией // Аллергология и иммунология.- 2008.- Т.9, №3.-С. 349.
42.Левкович М.А. Иммунологические механизмы угрозы прерывания беременности // Аллергология и иммунология. – 2009. - Т.10, № 2. - С. 247.
Список сокращений
| ЛAK | Лимфокин активированные киллеры |
| ИКК | Иммунокомпетентные клетки |
| ЛПС | Липополисахарид |
| СЭФР | Сосудисто-эндотелиальный фактор роста |
| ЦИК | Циркулирующие иммунные комплексы |
| ТТГ | Тиреотропный гормон |
| 17-ГОП | 17-гидроксипрогестерон |
| ДГЭА-С | Дегидроэпиандростерон |
| Th | Т-хелперы |
| IL | Интерлейкин |
| TGF- | Трансформирующий фактор роста- |
| NК | Натуральные киллеры |
| CD | Кластеры дифференцировки |
| TLR | Толл-рецепторы |
| PGE | Простогландин Е |
| TNF- | Фактор некроза опухоли- |
| IFN- | Интерферон- |
| HPV | Вирус папиломы человека |
| CMV | Цитомегаловирус |
| HSV | Вирус простого герпеса |
| EBV | Вирус Эпштейна-Барр |
