Диагностическая значимость цитокинового профиля конденсата выдыхаемого воздуха у пациентов с бронхиальной астмой
На правах рукописи
Дугарова Ирина Далаевна
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ КОНДЕНСАТА ВЫДЫХАЕМОГО
ВОЗДУХА У ПАЦИЕНТОВ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
14.01.25 – пульмонология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Осипова Галина Леонидовна
ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России
доктор медицинских наук, профессор Ненашева Наталия Михайловна
Российская медицинская академия последипломного образования
Ведущая организация:
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России
Защита состоится «……..» ……………………… 2010 г. в.……. часов
на заседании диссертационного совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)
Автореферат разослан «……..» ……………………… 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук Анаев Э.Х.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Бронхиальная астма (БА) является глобальной проблемой мирового здравоохранения. Люди всех возрастов во всем мире страдают этим хроническим заболеванием, и в случае тяжелого неконтролируемого течения эта болезнь ограничивает и значительно ухудшает качество жизни человека и подчас заканчивается летальным исходом. Эта болезнь приводит к потере трудоспособности и снижает участие пациента в жизни семьи [GINA, 2006].
Несмотря на большое число исследований, начиная от эпидемиологических и заканчивая изучением тонких механизмов реализации болезни на молекулярном уровне, в понимании БА, её течении, механизмах развития и подходах к лечению, существует много неясностей и противоречий, что заставляет продолжать исследования в данной области [Чучалин А.Г., 2007].
В настоящее время наибольшее значение для диагностики БА имеют клинические и функциональные тесты. Однако симптомы болезни не всегда отражают природу и степень выраженности воспаления, о чем свидетельствуют слабовыраженные взаимосвязи между значениями функциональных тестов и маркеров воспаления [Robroeks C.M. et al., 2007].
БА является комплексным хроническим воспалительным заболеванием с вовлечением многих структурных клеток и клеток воспаления, с высвобождением медиаторов воспаления, которые приводят к формированию основных патофизиологических механизмов заболевания [Barnes P.J., 1996]. На данный момент известно около 50 цитокинов и хемокинов, играющих важную роль в патогенезе БА [Barnes P.J., 2007], однако их роль в управлении патофизиологическими процессами до конца не изучена.
Исследование маркеров воспаления в легких обычно осуществляется при использовании метода индуцированной мокроты [Berlyne G.S. et al., 2000; Hargreave F.E., 2007], бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), бронхобиопсий [Adelroth E., 1998], а также сыворотки крови и мочи для оценки системных эффектов. Однако получение БАЛ и бронхобиоптатов являются инвазивными, травматичными методами, вызывающими множественные побочные эффекты, вследствие чего не могут проводиться через короткий промежуток времени, а также у тяжелых больных, детей и в амбулаторной практике [Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002].
В последние годы в клиническую практику широко внедряются неинвазивные методы диагностики и контроля лечения БА, в частности исследование биомаркеров в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) [Horvath I. et al., 2005]. Анализ КВВ позволяет оценить активность воспаления в легких и уточнить состояние местного воспаления в дыхательных путях, а также оценить роль цитокинов в нем. Однако работы, посвященные изучению концентраций цитокинов, как ключевого звена воспаления при БА, носят единичный, разрозненный, не систематизированный и дискуссионный характер.
Цель исследования:
Изучить значение цитокинов атопии (ИЛ-4, ИЛ-13), провоспалительных (ИЛ-6, ФНО-), противовоспалительного (интерферон-) и хемокина (ИЛ-8) в КВВ и сыворотке крови, установить взаимосвязь между концентрацией цитокинов и клинико-функциональными показателями у больных БА среднетяжелого течения в разные фазы течения заболевания.
Задачи исследования:
- Определить содержание различных цитокинов в КВВ и сыворотке крови у здоровых субъектов и больных БА в период обострения и ремиссии.
- Установить диагностическую значимость концентрации цитокинов в КВВ для оценки активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА.
- Провести сравнительную оценку концентраций цитокинов в КВВ и сыворотке крови у больных БА в разные периоды заболевания.
- Изучить взаимосвязь уровня цитокинов с клинико-функциональными показателями БА в разные периоды течения заболевания.
Научная новизна
В представленной работе впервые:
- проведено определение цитокинового профиля КВВ у пациентов со среднетяжелым течением БА в разные фазы течения заболевания;
- показано, что частота определения различных интерлейкинов, ИФН- и ФНО- в КВВ выше, чем в сыворотке крови;
- полученные значения неинвазивных маркеров определяют степень активности местного воспаления в дыхательных путях при БА;
- показано, что высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ свидетельствует о степени тяжести обострения заболевания;
- установлено, что обострение при БА проявляется воспалительным отеком в слизистой оболочке стенки бронхов и гиперсекрецией слизи, о чем свидетельствует достоверное увеличение объема КВВ и снижение его рН;
- выявленная высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с атопической БА указывает на наличие фенотипа заболевания с преобладанием Th2-типа иммунного ответа;
- обнаружена обратная корреляционная взаимосвязь между уровнем ИЛ-4 в КВВ со степенью бронхиальной обструкции в фазе обострения БА;
- выявлена прямая взаимосвязь между содержанием ИЛ-13 в КВВ с показателями функции внешнего дыхания (ФВД) у пациентов с БА в период ремиссии, что свидетельствует о персистирующем характере воспаления в дыхательных путях;
- обнаружена прямая корреляционная зависимость между эозинофилией крови и коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН- в КВВ, что отражает взаимосвязь системной реакции организма с активностью местного воспаления.
Практическая значимость
- Анализ цитокинов в КВВ следует использовать в качестве неинвазивного метода оценки активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА.
- Определение концентрации различных интерлейкинов, ИФН- и ФНО- в КВВ позволяет оценить эффективность проводимого лечения.
- Исследование цитокинов в КВВ, отражающих природу и особенности местного воспаления, позволяет корректировать дальнейшую тактику ведения пациентов с БА.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- Анализ цитокинового профиля (различных интерлейкинов, ИФН- и ФНО-) КВВ более четко отражает активность местного воспалительного ответа в дыхательных путях при БА, чем исследование сыворотки крови.
- Высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с обострением БА, а также их взаимосвязь с легочной функцией указывает на преобладание Th2-типа иммунного ответа и персистирующий воспалительный процесс в дыхательных путях при ремиссии заболевания.
- Выявленная прямая зависимость между эозинофилией крови и коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН- в КВВ указывает на взаимосвязь системной реакции организма с местным воспалением.
Внедрение в практику здравоохранения
Исследование цитокинов в КВВ внедрено в качестве дополнительного метода диагностики у больных БА в аллергологическом отделении ГКБ №57 г.Москвы. Материалы исследования включены в лекционный курс на кафедре пульмонологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
- 17-м, 19-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Казань, 2007; Москва, 2009);
- Научной сессии НИИ пульмонологии Росздрава (Рязань, 2007);
- 3-ей международной научной конференции (Улан-Удэ, 2008);
- Ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Берлин, 2008);
- Ежегодном конгрессе Германского общества пульмонологов (Маннхайм, 2009);
- Совместном заседании Ученого совета ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 23.06.2010.).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в журнале, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста. Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстрирована 15 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 21 отечественных и 143 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Общее количество пациентов, участвовавших в исследовании, составило 28 больных БА и 14 здоровых добровольцев.
Критерии включения:
Обязательными клиническими и функциональными критериями для включения в исследование были: больные обоего пола в возрасте от 18 до 60 лет; пациенты с подтвержденным диагнозом БА среднетяжелого течения [в соответствии с критериями GINA, 2006]; наличие атопии в анамнезе, подтвержденной кожными пробами (prick-test) и повышением уровня общего иммуноглобулина Е (IgЕ) сыворотки крови; длительность заболевания более 2-х лет; базисная терапия ингаляционными глюкокортикоидами (ГК) в дозе 1000 мкг (в пересчете на беклометазон); обратимая обструкция дыхательных путей (КБДОФВ112% от должного и 200 мл); наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании.
Критерии исключения:
наличие ХОБЛ, туберкулеза и других заболеваний легких, в т.ч. пневмония в течение последних 6 месяцев; тяжелые сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой системы, органов пищеварения, мочеполовой и нервной системы; прием системных ГК; курение (ИКЧ 10 пачка/лет); злоупотребление алкоголем и наркотиками в анамнезе; хронические инфекционные заболевания верхних дыхательных путей (гаймориты и другие); беременность и кормление грудью.
В исследование было включено 28 больных БА средней степени тяжести заболевания (диагноз подтвержден данными анамнеза, клинической картиной, рентгенологическими, функциональными методами диагностики), из них 14 пациентов в стадии обострения средней тяжести и 14 - в стадии стабильного течения заболевания. Контрольную группу составили 14 человек – здоровые добровольцы (ИКЧ 5 пачка/лет), не страдающие аллергическими и хроническими, в т.ч. бронхолегочными заболеваниями.
Пациенты в стадии обострения находились на стационарном лечении в аллергологическом отделении ГКБ №57 с 2006 по 2009 год, остальные пациенты наблюдались амбулаторно в ФГУ НИИ пульмонологии.
Характеристика больных БА и здоровых добровольцев, включенных в исследование, представлена в табл. 1.
Таблица 1.
Характеристика больных БА, включенных в исследование.
| Признаки | Mean±SD | ||
| БА, стадия обострения (n=14) | БА, стадия ремиссии (n=14) | Здоровые добровольцы (n=14) | |
| Пол, муж/жен (n) | 2/12 | 4/10 | 2/12 |
| Возраст, лет | 47,4±12,7 | 36,9±13,7 | 25,9±5,3 |
| Курящие, n | 2 | 2 | 2 |
| Длительность заболевания, лет | 6,4±2,5 | 6,8±3,1 | - |
| Кашель, баллы | 3,5±0,7 | 0,9±0,5 | - |
| Приступы удушья, в сутки | 5,4±1,0 | 0,9±0,4 | - |
| Потребность в 2-агонистах, в сутки | 6,8±1,5 | 1,4±0,6 | - |
| Лейкоциты крови, 109/л | 10,3±2,63* | 8,86±2,30 | 6,18±0,91 |
| Эозинофилы крови, % | 3,57±1,83* | 2,64±0,93 | 2,24±1,29 |
| Эозинофилы крови, клеток/мкл | 287±118 | 166±59 | 112±65 |
| ОФВ1, %должн. | 66,7±21,3* | 78,1±14,7* | 102,7±9,8 |
| ФЖЕЛ, %должн. | 85,6±33,1* | 93,3±14,7 | 114,1±9,4 |
| ОФВ1/ФЖЕЛ, %должн. | 71,5±19,6 | 78,4±7,7 | 84,5±2,1 |
| КБДОФВ1, % | 29,5±10,1* | 14,7±4,2* | 3,8±2,0 |
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со здоровыми добровольцами.
Методы исследования.
Во всех группах проводилась оценка клинико-функциональных показателей, маркеров системного воспаления, оценка взаимосвязи иммунологических маркеров воспаления с клинико-функциональными показателями.
У всех больных оценивались приведенные ниже клинические и функциональные показатели:
Клинико-физикальное обследование включало сбор анамнеза и жалоб пациента, оценку объективных данных. Клиническая оценка симптомов БА (кашель, мокрота, одышка) проводилась однократно по 4-х балльной шкале (0 – отсутствие симптома, 3 – максимальное проявление симптома). Также оценивали число приступов удушья и потребность в симпатомиметиках короткого действия.
Лабораторно-инструментальные исследования включали: общий и биохимический анализ крови, анализ мокроты, ЭКГ, рентгенографию органов грудной клетки.
Аллергологическое обследование включало: сбор аллергологического анамнеза, методы, подтверждающие наличие атопии у пациентов (уровень общего IgE, кожные аллергопробы – Prick-test с бытовыми, эпидермальными, пыльцевыми аллергенами) вне обострения БА.
Уровень общего IgE измеряли с использованием реагентов для количественного иммуноферментного анализа определения общего IgE в сыворотке крови в соответствии с инструкцией по применению. За нормальный уровень общего IgЕ принимали значения ниже 130 МЕ/мл.
Исследование ФВД проводили с помощью прибора MasterScreen Spiro фирмы "Erich JAEGER" (Германия) в соответствии с рекомендациями ERS (Европейского респираторного общества). Оценивали объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), ОФВ1/ФЖЕЛ. Оценку полученных результатов проводили при сопоставлении данных с должными величинами, вычисленными по формулам, предложенным консенсусом ERS и ATS (Американского торакального общества) [Miller M.R. et al., 2005], а их интерпретацию осуществляли с использованием методических рекомендаций [Чучалин А.Г., 2009].
Сбор КВВ.
Сбор КВВ проводили в утренние часы, после двукратного ополаскивания ротовой полости водой. Для сбора КВВ использовался аппарат ECoScreen (Erich JAEGER GmbH, Германия), снабженный клапанной системой, которая позволяет осуществлять вдох из окружающей среды, а выдох – в устройство с конденсацией паров, то есть клапан не позволяет смешиваться вдыхаемому и выдыхаемому воздуху. Двухсторонний клапан используется также как уловитель слюны. Метод основывается на так называемом принципе противотока. Вещества охлаждаются приблизительно до -10 °С.
Сбор проводили в течение 10 мин в сидячем положении и спокойном дыхании обследуемого со средней частотой 15 в мин. Для исключения носового дыхания использовали специальные зажимы для носа. Измеряли объем собранного КВВ и немедленно помещали его в герметичные сухие термоустойчивые ДНК- и РНК- очищенные стерильные полипропиленовые пробирки типа Эппендорф (компания GREINER BIO-ONE, Австрия) объемом 1,5 мл. Пробирки с материалом немедленно замораживались в морозильнике при температуре -70 °C. Собранные образцы хранились при данной температуре до проведения анализов сроком не более 1 месяца. Сбор КВВ и сыворотки крови здоровым добровольцам и больным с ремиссией БА проводили однократно. Пациентам с обострением заболевания сбор КВВ и сыворотки проводился однократно в первый-второй день поступления в стационар. Сразу после сбора проводилось измерение объема и уровня рН полученного КВВ.
Измерение pH КВВ проводили немедленно после получения образца с помощью ф32 рН-метра (Beckman, США) со стеклянным микроэлектродом. Калибровку рН-метра проводили стандартными растворами с рН 4,00; 7,00 и 10,00. Измерения рН в образцах КВВ проводили четырехкратно, и полученные значения обрабатывали статистически для получения средней величины. Для анализа требовалось 0,3 мл КВВ.
Определение цитокинов в КВВ.
Количественные уровни цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-13, ФНО-, ИФН-) в КВВ и параллельно в сыворотке крови определяли методом ИФА с помощью тест-систем «BioSource» (Бельгия) согласно приложенным инструкциям на базе лаборатории индукторов интерферона ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН. Работа выполнена совместно с к.м.н. Оспельниковой Т.П.
Данный тест основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Микропланшет покрывается моноклональными антителами к исследуемому цитокину (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13). В ходе реакции в лунки планшеты добавляются стандарты, контроли и исследуемые образцы.
Во время первой инкубации антиген цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13) связывается с иммобилизованными в лунках антителами одним сайтом связывания. После промывки добавляются вторые биотилированные моноклональные антитела против антигена (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13). Во время второй инкубации эти антитела связываются с иммобилизованным антигеном (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13), захваченным во время первой инкубации. После удаления избытка вторых антител добавляется стрептавидин-пероксидаза, которая связывается с биотилированными антителами с формированием сэндвич-комплекса из 4-х реагентов. После третьей инкубации и промывки удаляется несвязавшийся фермент, после чего добавляется субстратный раствор, который взаимодействует с ферментом с образованием цветного комплекса. Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13), присутствующего в образце. Оптическая плотность содержимого ячеек определялась с использованием автоматического фотометра для микропланшетов при длине волны 450 нм. Концентрация цитокинов определялась по калибровочной кривой «оптическая плотность/концентрация», используя данные по концентрациям стандартов.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 for Windows. Все численные данные представлены как mean±SD. Достоверность различий одноименных показателей внутри одной группы определяли при помощи парного t-критерия. Различия считались статистически достоверными при p<0,05. Для выявления зависимости между показателями использовали линейный регрессионный анализ и метод Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Уровень рН и объем КВВ.
Объем собранных образцов КВВ в группах с обострением и ремиссией БА, и в группе здорового контроля достоверно не различался (1,64±0,51 мл/10 мин; 1,48±0,22 мл/10 мин и 1,61±0,25 мл/10 мин, соответственно; р>0,05).
Уровень рН КВВ у больных с обострением и ремиссией БА был достоверно ниже, чем у здоровых добровольцев (6,12±0,47 и 6,41±0,49 напротив 6,99±0,36; p<0,05) (Рис. 1). В группе с обострением БА средние значения рН были достоверно ниже по сравнению с группой ремиссии, что указывает на высокую степень активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА и разнородность исследуемых групп.
Концентрация цитокинов в КВВ и сыворотке крови.
Все цитокины, за исключением ИЛ-8, удалось обнаружить во всех образцах КВВ у здоровых добровольцев, тогда как в сыворотке крови удалось определить их содержание менее чем в половине образцов (рис. 2).
Аналогичная ситуация была у больных БА (рис. 3), то есть все цитокины, за исключением ИЛ-8, в КВВ определялись намного чаще, чем в образцах сыворотки крови.
Частота определения цитокинов в сыворотке крови распределилась следующим образом. В группе с обострением ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО- и ИФН- удалось определить в 21,4%, 28,6%, 21,4%, 28,6%, 100% и 64,3% случаев, соответственно. У пациентов с ремиссией заболевания ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО- и ИФН- удалось определить в 28,6%, 28,6%, 21,4%, 28,6%, 100% и 64,3% случаев, соответственно. В группе здорового контроля ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО- и ИФН- удалось определить в 21,4%, 14,3%, 14,3%, 21,4%, 100% и 85,7% случаев, соответственно.
Средние значения ИЛ-4 в КВВ у пациентов с БА в фазе обострения и ремиссии болезни были достоверно выше по сравнению со здоровыми добровольцами (1,49±0,53 и 1,44±0,50 напротив 0,81±0,36 пг/мл; p<0,05) (Рис. 4). Содержание ИЛ-4 в сыворотке крови удалось определить у 3 человек в фазе обострения и у 4 пациентов в фазе ремиссии, и у 3 человек в группе здорового контроля.
Повышение уровня ИЛ-4 в КВВ у пациентов с БА можно объяснить основными свойствами ИЛ-4. Этот цитокин относят к основным пусковым медиаторам воспаления Th2-типа. ИЛ-4 выполняет ключевую роль в продукции IgЕ и экспрессии молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1) на эндотелиальных клетках, который тем самым вызывает миграцию эозинофилов из крови [Moser R. et al., 1992]. Многие авторы отмечают более высокие концентрации ИЛ-4 в КВВ у больных БА [Суровенко Т.Н. и др., 2002; Shahid S.K. et al., 2002; Matsunaga K et al., 2006; Brunetti L. et al., 2008]. В работе Robroeks и соавт. (2007) методом мультивариантной статистической регрессии показана диагностическая значимость ИЛ-4 в КВВ при постановке диагноза БА.
У больных с обострением БА концентрация ИЛ-13 в КВВ была достоверно выше на 43% по сравнению со здоровыми добровольцами, а именно в фазе обострения его значения составили 21,05±10,04 пг/мл, в фазе ремиссии - 15,06±9,42 пг/мл, в группе здоровых добровольцев - 11,97±6,29 пг/мл (Рис. 5). Однако уровень ИЛ-13 в КВВ был значимо повышен в группе с обострением БА (p<0,05). В сыворотке крови ИЛ-13 удалось определить у небольшой части больных: в группе обострения БА – у 3 больных, в группе ремиссии - у 3 пациентов, в группе контроля - у 2 человек.
Повышение ИЛ-13 можно объяснить рядом его свойств, а именно, он имеет схожую биологическую активность c ИЛ-4. ИЛ-13 также повышает синтез ИЛ-4, увеличивая количество В-лимфоцитов, усиливая синтез IgE, увеличивает экспрессию CD23 на В-лимфоцитах. ИЛ-13 отвечает за развитие и поддержание воспалительного процесса при БА. Одним из его общих свойств с ИЛ-4 является подавление Th1-клеток путем подавления продукции ИЛ-12 моноцитами, тем самым, активируя развитие Th2-типа воспалительной реакции [Le Gros G. et al., 1990; Swain S.L. et al., 1990].
Повышение экспрессии мРНК ИЛ-13 в гладкомышечном слое бронха было обнаружено у пациентов с атопической и неатопической БА [Humbert M. et al., 1997; Naseer T. et al., 1997]. Также отмечалось увеличение концентрации ИЛ-13 в БАЛ у больных БА после введения аллергена в дыхательные пути [Kroegel С. et al., 1996]. Лишь в одной работе данный биомаркер был определен в КВВ у пациентов с БА при использовании белкового чипа [Matsunaga K. et al., 2007].
Уровень ИЛ-6 у пациентов в стадии обострения БА составил 2,13±1,84 пг/мл, в фазе ремиссии - 1,37±0,25 пг/мл, и в группе контроля - 1,29±0,34 пг/мл. Имелась тенденция к повышению концентрации ИЛ-6 в КВВ в группе с обострением БА, однако разница была недостоверной (p>0,05).
Повышение провоспалительной группы цитокинов при БА описано и в других работах. Так, при измерении цитокинов в сыворотке крови у пациентов с БА обнаружены более высокие значения, в частности ИЛ-6, у пациентов с тяжелым течением БА по сравнению со среднетяжелым течением заболевания [Дюсембаева Н.К. и др., 2006]. Это объясняется провоспалительными свойствами цитокинов, в частности, они способны активировать воспалительный процесс путем воздействия на провоспалительные факторы транскрипции, которые отвечают за запуск воспалительного процесса.
Взаимосвязь ИЛ-6 с воспалительным процессом описывается и в ряде других работ. Повышенный уровень ИЛ-6 в назальных смывах был обнаружен у детей, перенесших риновирусную инфекцию (Zhou Y. et al., 2001). Другими исследователями продемонстрировано повышение концентрации ИЛ-6 в КВВ у женщин с гормональным вариантом БА [Carpagnano G.E. et al., 2009].
ИЛ-8 не удалось определить ни в одном образце КВВ. В сыворотке крови ИЛ-8 определили в стадии обострения у 4 больных, в стадии ремиссии - у 4 пациентов, в группе контроля - у 3 человек. По своим свойствам ИЛ-8 относится к группе хемокинов. Было показано, что ИЛ-8 вызывает активацию и хемотаксис лейкоцитов [Teran L.M. et al., 1996]. Также было обнаружено, что ИЛ-8 в индуцированной мокроте удается определить лишь у больных с тяжелым течением БА. Этот факт объясняет, почему мы не смогли определить ИЛ-8 в КВВ у больных атопической формой БА среднетяжелого течения. Связь повышенного уровня ИЛ-8 и содержания нейтрофилов в индуцированной мокроте у пациентов с тяжелым течением БА описывает ряд исследователей, объясняя это наличием персистирующей вирусной инфекции у данной категории больных [Shannon J. et al., 2008].
Концентрация ФНО- в КВВ у больных БА в стадии обострения составила 4,35±2,14 пг/мл, в фазе ремиссии - 4,06±1,18 пг/мл, а в группе здорового контроля - 3,80±1,45 пг/мл (p>0,05). Уровень ФНО- в сыворотке крови в группе обострения составил 3,19±2,94 пг/мл, в группе ремиссии - 2,61±2,13 пг/мл и 3,09±2,01 пг/мл - в группе здоровых добровольцев. Однако различия были незначимыми.
ФНО-, как и ИЛ-6, относится к провоспалительной группе цитокинов. Согласно имеющимся данным, ФНО- повышает гиперреактивность дыхательных путей и число нейтрофилов в индуцированной мокроте [Yates D.H. et al., 1993]. Также были получены сильные корреляционные взаимосвязи между содержанием ФНО- и трансформирующего фактора роста- (TGF-) в КВВ с концентрацией метахолина при проведении провокационного теста и недельным разбросом значений пиковой скорости выдоха (ПСВ) [Matsunaga K. et al., 2007]. Роль ФНО- в развитии бронхообструктивных нарушений была подтверждена в исследовании с использованием антител к рецептору ФНО- у больных с тяжелой БА. На фоне лечения этим препаратом отмечалась положительная динамика, в т.ч. снижение гиперреактивности бронхов [Hanania N., 2010].
Концентрация ИФН- в КВВ была ниже у пациентов с обострением БА, но разница была недостоверной. Данный маркер относится к группе Th1-цитокинов. Исследования показали, что он способен снижать аллергический тип воспаления, уменьшая эозинофилию и явления гиперреактивности дыхательных путей. При анализе цитокинового профиля у детей с БА установлено достоверное снижение содержания ИФН- в КВВ [Shahid S.K. et al., 2002]. Также снижение уровня ИФН- в сыворотке крови обнаружено у пациентов с тяжелым течением БА [Hamzaoui A. et al., 2009]. Это подтверждает подавление Th1-иммунного ответа и преобладание аллергического механизма воспаления при БА.
С целью оценки баланса Th1- к Th2-типу воспалительной реакции в патогенезе БА проводили определение соотношения ИЛ-4 к ИФН- в КВВ. У пациентов с БА этот коэффициент был выше, чем у здоровых, однако разница была незначимой.
В работе Shahid et al. (2002) показан дисбаланс между Th2- и Th1-ответом при БА, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня ИЛ-4 и коэффициента соотношения ИЛ-4/ИФН-, а также снижение концентрации ИФН- в КВВ у детей с БА по сравнению с группой здорового контроля. Другие исследователи продемонстрировали, что коэффициент ИЛ-4/ИФН- был повышен в группе больных БА по сравнению с больными атопическим дерматитом, и его уровень снижался на фоне терапии ГК [Brunetti L. et al., 2008]. Таким образом, с помощью данного коэффициента можно оценивать эффективность проводимого лечения.
Корреляционный анализ.
Проведенный линейный корреляционный анализ выявил обратную связь между концентрацией ИЛ-4 в КВВ и показателем ОФВ1 (r=-0,56; р<0,05) в группе с обострением БА (Рис. 6). Это связано с основными патологическими свойствами ИЛ-4, прежде всего он запускает аллергический тип воспалительной реакции, вследствие чего развивается бронхиальная обструкция.
Также при обострении БА была обнаружена корреляционная связь между коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН- и абсолютным количеством эозинофилов крови (r=0,65; р<0,05). Данную взаимосвязь можно объяснить основными свойствами ИЛ-4, который способен индуцировать Th2 тип воспаления и параллельно вызывать хемотаксис эозинофилов (Рис. 7).
В фазе ремиссии БА была выявлена прямая корреляционная взаимосвязь между уровнем ИЛ-13 и значением ОФВ1 (r=0,73; р<0,05). Это свидетельствует о том, что, несмотря на купирование бронхообструктивных нарушений сохраняются явления воспаления в дыхательных путях (Рис. 8).
При помощи непараметрического корреляционного анализа Спирмена у больных с обострением БА была обнаружена обратная взаимосвязь между объемом КВВ и значением ОФВ1 (r=-0,53; р=0,049).
Это свидетельствует о том, что обструктивные нарушения связаны с развитием отека слизистой стенки бронхов и непосредственно гиперсекрецией слизи, которые являются проявлением воспалительного процесса при БА.
Также корреляционный анализ (метод Спирмена) в группе с обострением БА выявил корреляционную связь между уровнем ИЛ-4 (цитокина атопии) в КВВ и концентрацией ФНО- (провоспалительного цитокина) в сыворотке крови (r=0,73; р=0,003). Это указывает на синергизм ФНО- с ИЛ-4 [Thornhill M.H. et al., 1991] и взаимосвязь местного воспаления с проявлениями провоспалительной активности.
Помимо этого, с использованием метода непараметрической корреляции Спирмена в группе больных с ремиссией БА была обнаружена корреляционная связь между концентрацией ИФН- в КВВ и ФНО- в сыворотке крови (r=-0,61; р=0,021). Это указывает на то, что наряду с продукцией ФНО- (провоспалительного фактора), происходит последующая активация Th2-типа воспаления, и параллельное подавление Th1-иммунного ответа на местном уровне.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о доминирующей роли атопии в патогенезе БА, о наличии сохраняющейся воспалительной активности даже в фазе ремиссии заболевания. Следовательно, определение цитокинов в КВВ расширяет возможности изучения патогенеза БА, поможет определить основные биомаркеры в диагностике этого заболевания.
В данной работе нами проведено одномоментное исследование цитокинового паттерна КВВ и сыворотки крови, и полученные данные указывают на перспективу данной методики. Для более глубокого понимания роли цитокинов при БА следует оценить содержание цитокинов в КВВ у больных с разным течением и фенотипами БА, измерить их концентрацию на фоне проводимого противовоспалительного лечения. Однако в настоящее время сохраняется ряд вопросов по методике определения различных цитокинов в КВВ. До сих пор не определен, какой из методов является наиболее оптимальным, учитывая низкие их концентрации в этой биологической жидкости. Необходимо проведение дальнейших исследований с целью разработки методологических стандартов и внедрения этого метода в повседневную клиническую практику.
ВЫВОДЫ
- В КВВ больных БА удалось определить как провоспалительные, так и противовоспалительные цитокины, за исключением ИЛ-8.
- Анализ цитокинов в КВВ позволил всесторонне оценить активность местного воспаления в дыхательных путях у пациентов с БА, в то время как их уровень в сыворотке крови отражает системный характер воспаления в период обострения и ремиссии.
- Увеличение концентрации ИЛ-4, 6 и 13 в КВВ у больных БА указывает на степень выраженности воспалительного процесса в дыхательных путях и позволяет оценить эффективность проводимого лечения.
- Наличие взаимосвязи между содержанием ИЛ-4 в КВВ и показателем ОФВ1, а также коэффициента ИЛ-4/ИФН- в КВВ и эозинофилии крови у больных с обострением БА свидетельствует о доминирующей роли атопического компонента в воспалительной реакции дыхательных путей.
- Выявленная корреляционная взаимосвязь между содержанием ИЛ-13 в КВВ и значением ОФВ1 в период ремиссии свидетельствует о персистирующем характере воспаления дыхательных путей у больных БА.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Анализ цитокинов в КВВ следует использовать в качестве неинвазивного метода оценки активности местного воспалительного процесса в дыхательных путях при БА.
- Определение концентрации различных интерлейкинов, ИФН- и ФНО- в КВВ является важным способом оценки эффективности проводимого лечения.
- Исследование цитокинов в КВВ следует использовать для оценки степени выраженности и природы обострения для определения фенотипа заболевания, что позволяет уточнить дальнейшую тактику ведения пациентов с БА.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Анохина Т.Н., Чучалин А.Г. Цитокиновый статус конденсата выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме. Пульмонология. 17-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник трудов конгресса. Казань, 2007; А255, с.105.
- Анохина Т.Н., Анаев Э.Х., Дугарова И.Д., Чучалин А.Г. Оценка функции легких при сборе конденсата выдыхаемого воздуха. Пульмонология. 17-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник трудов конгресса. Казань, 2007; А254, с.105.
- Dugarova I., Anaev E., Ospel`nikova T., Anokhina T., Chuchalin A. Inflammatory markers in exhaled breath condensate in patients with asthma. Materials of the III international scientific conference “Traditional medicine: a current situation and perspectives of development”. August 18-22, 2008; Ulan-Ude, Russia. - P.145.
- Dugarova I., Anaev E., Ospelnikova T., Anokhina T., Chuchalin A. Cytokines in exhaled breath condensate of patients with asthma. Eur Respir J. 2008; Vol.32, (Suppl.52). - P.187s-188s.
- Anaev E., Chuchalin A., Dugarova I., Ospelnikova T. Inflammatorische Zytokine im Atemkondensat und Serum bei Asthma bronchiale. Pneumologie. 2009; Vol.63, Suppl. - S.32.
- Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г. Экспрессия цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха и ее взаимосвязь с клинико-функциональными показателями бронхиальной астмы. Тезисы докладов научно-практической конференции «Актуальные вопросы респираторной медицины», Москва, 4-5 марта 2009 г., с.50.
- Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Чучалин А.Г. О роли цитокинов при бронхиальной астме. Пульмонология. 2009; №4, с.96-102.
- Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Чучалин А.Г. Цитокины в конденсате выдыхаемого воздуха и их взаимосвязь с клинико-функциональными показателями бронхиальной астмы. 19-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник трудов конгресса. Москва, 2009; А175, с.156.
- Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Чучалин А.Г. Экспрессия цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха и её взаимосвязь с клинико-функциональными показателями бронхиальной астмы. Пульмонология. 2010; №3, с.57-61.
Список сокращений
БА – бронхиальная астма
БАЛ – бронхоальвеолярный лаваж
ГК – глюкокортикоиды
ИКЧ – индекс курящего человека
ИЛ-4 – интерлейкин-4
ИЛ-6 – интерлейкин-6
ИЛ-8 – интерлейкин-8
ИЛ-13 – интерлейкин-13
ИФН- – интерферон-гамма
КБД – коэффициент бронходилатации
КВВ – конденсат выдыхаемого воздуха
ОФВ1 – объем форсированного выдоха за первую секунду
ПСВ – пиковая скорость выдоха
ФВД – функция внешнего дыхания
ФЖЕЛ – форсированная жизненная ёмкость легких
ФНО- – фактор некроза опухолей-
ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь лёгких
ATS – Американское торакальное общество
ERS – Европейское респираторное общество
GINA – Глобальная стратегия по бронхиальной астме
IgE – иммуноглобулин класса Е
TGF- – трансформирующий фактор роста-
VCAM-1 – молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа
