Транссклеральная диодная лазеркоагуляция сетчатки как первый этап хирургического лечения пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией

На правах рукописи

ЛЕВКИНА

Оксана Александровна

ТРАНССКЛЕРАЛЬНАЯ ДИОДНАЯ ЛАЗЕРКОАГУЛЯЦИЯ

СЕТЧАТКИ КАК ПЕРВЫЙ ЭТАП ХИРУРГИЧЕСКОГО

ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ

ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИЕЙ

14.00.08 – глазные болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва

2009

Работа выполнена в ФГУ «Московском научно – исследовательском институте глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий» (директор – заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

В. В. Нероев).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

Нероев Владимир Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Максимов Игорь Борисович

доктор медицинских наук, профессор

Рябцева Алла Алексеевна

Ведущая организация: ГОУ ДПО РМАПО Росздрава

Защита диссертации состоится «13» октября 2009 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.042.01 при ФГУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий».

Адрес института: 105062 г. Москва, ул. Садовая – Черногрязская, 14/19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий».

Автореферат разослан «04» сентября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук И. А. Филатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Глазные осложнения СД представляют серьезную медико-социальную проблему, являясь основной причиной слепоты и слабовидения в возрастной группе до 50 лет. Хирургическое вмешательство при ПДР не всегда является эффективным, в том числе в связи с высоким риском интра- и послеоперационных осложнений. Массивная неоваскуляризация сетчатки является основным фактором, приводящим к наиболее частому осложнению витрэктомии – кровоизлиянию в витреальную полость.

После витрэктомии у пациентов с ПДР нередко необходимо повторное хирургическое вмешательство, в том числе в связи с рецидивирующими витреальными кровоизлияниями. Часто их причиной является активация фиброваскулярной пролиферации в переднем отделе глаза, имеющей ишемический генез [Kreiger A., 2001]. По литературным данным, лазеркоагуляция или криопексия периферических отделов сетчатки и зон склеротомий позволяют снизить частоту этого осложнения [West J. F., Gregor Z. J., 2000; Zaninetti M. et al., 2005]. В связи с этим, особую важность для профилактики осложнений и улучшения исхода операций представляет блокирование ишемических зон и подавление активности новообразованных сосудов перед проведением эндовитреального хирургического вмешательства.

Основную роль в патогенезе неоваскуляризации на фоне ишемии и гипергликемии у пациентов с диабетической ретинопатией играет сосудистый эндотелиальный фактор роста – VEGF [Tombran – Tink J., Barnstable C. J., 2006]. Одним из основных антагонистов VEGF является фактор, выделенный из пигментного эпителия – PEDF, обладающий антиангиогенными свойствами [Tombran-Tink J., Barnstable C. J., 2003].

Повышенные уровни VEGF и низкая концентрация PEDF определялись в камерной влаге и стекловидном теле пациентов с различными стадиями диабетической ретинопатии [Patel J. I. et al., 2006]. В ряде исследований выявлена корреляция между уровнем VEGF, балансом про- и антиангиогенных факторов в витреальной полости больных с ПДР до операции и исходами интравитреальных вмешательств [Funatsu H. et al., 2003, 2004]. Однако, исследования концентрации VEGF и PEDF в легко доступной для анализа среде – СЖ пациентов с диабетической ретинопатией, не проводились.

На сегодняшний день общепринятым способом блокирования ишемических зон и стабилизации состояния глаза при диабетической ретинопатии остается лазеркоагуляция сетчатки. Экспериментальными исследованиями доказано влияние лазеркоагуляции на экспрессию генов в тканях глаза, что приводит к изменению баланса про- и антиангиогенных факторов в пользу последних [Wilson A. S. et al., 2003]. В условиях непрозрачных оптических сред применение излучения диодного лазера ближнего инфракрасного диапазона, около 70% которого проникает через склеру [Бойко Э. В., 2001], является доступным, малоинвазивным, нетравматичным способом лазеркоагуляции сетчатки.

Для объективной оценки влияния ТДЛКС на новообразованные сосуды глазного дна необходимо разработать модель неоваскуляризации сетчатки, патогенетически и морфологически близкую диабетическому поражению глаз. Особый интерес представляет изучение возможности индукции роста новообразованных сосудов сетчатки опытных животных путем интравитреального введения VEGF. Разработанная таким образом модель неоваскуляризации сетчатки может быть использована в дальнейшем для оценки эффективности лазерного воздействия.

Цель. На основании экспериментальных, иммунологических и клинико – функциональных исследований изучить эффективность ТДЛКС в качестве первого этапа хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР.

Задачи.

1. Разработать модель неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва путем интравитреального введения VEGF кроликам.
2. На основании данных инструментального и гистологического исследований изучить влияние ТДЛКС на эволюцию новообразованных сосудов в эксперименте.
3. Изучить особенности продукции VEGF и PEDF в СЖ и СК пациентов с ПДР до и после проведения ТДЛКС.
4. На основании данных клинико – функционального обследования оценить влияние ТДЛКС на состояние глаз у пациентов с осложненной ПДР.
5. Провести анализ анатомических и функциональных результатов хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР с применением ТДЛКС как первого этапа и без нее.
6. На основании данных комплексного иммунологического и клинико – функционального исследования изучить влияние содержания VEGF и PEDF в СЖ на результаты хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР.
7. Разработать практические рекомендации для проведения ТДЛКС как первого этапа хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР.

Научная новизна исследования.

1. Впервые разработана модель неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва на основании дробного интравитреального введения VEGF кроликам, позволившая изучить влияние ТДЛКС на эволюцию новообразованных сосудов у опытных животных.
2. Впервые изучены особенности локальной и системной секреции VEGF и PEDF у пациентов с ПДР, выявлены достоверные отличия содержания ростовых факторов в СЖ у пациентов с ПДР по сравнению с показателями здоровых доноров, доказано наличие дисбаланса между проангиогенным VEGF и ингибитором ангиогенеза PEDF в СЖ пациентов с ПДР.
3. Впервые выявлены иммунологические критерии риска развития осложнений пролиферативного процесса у пациентов с ПДР.
4. На основании комплексного клинико – иммунологического исследования впервые доказано положительное влияние ТДЛКС на состояние глаз у пациентов с осложненной ПДР, заключающееся в регрессе неоваскуляризации на фоне нивелирования локального дисбаланса VEGF и PEDF.
5. Впервые на основании данных клинико – функционального исследования доказана более высокая эффективность витрэктомии у пациентов с осложненной ПДР после предварительного проведения ТДЛКС.
6. Впервые на основании сравнительного анализа данных иммунологического и клинико – функционального исследований установлена связь между локальной секрецией VEGF и PEDF и результатами хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР.

Практическая значимость.

1. Разработанная модель неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва на основании дробного интравитреального введения VEGF кроликам позволяет изучить патологический процесс на всех стадиях его развития и оценить эффективность ТДЛКС в эксперименте.
2. Исследование содержания VEGF и PEDF в СЖ пациентов с ПДР до и после проведения ТДЛКС позволяет своевременно прогнозировать возможность развития осложнений пролиферативного процесса, а также оценить вероятность неблагоприятных исходов хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР.
3. ТДЛКС позволяет корригировать локальный дисбаланс между проангиогенным VEGF и ингибитором ангиогенеза PEDF, улучшая клинико – функциональное состояние глаз у пациентов с осложненной ПДР перед проведением эндовитреального хирургического вмешательства, что обусловливает более высокие и стабильные анатомические и функциональные результаты витрэктомии у этой сложной категории больных.
4. Разработаны практические рекомендации для проведения ТДЛКС в качестве первого этапа хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Дробное интравитреальное введение VEGF индуцирует неоваскуляризацию сетчатки и зрительного нерва у опытных животных. ТДЛКС способствует регрессу новообразованных сосудов сетчатки и зрительного нерва в эксперименте.
2. Показатели VEGF и PEDF в СЖ пациентов с ПДР достоверно отличаются от уровней, определяемых в СЖ здоровых доноров, отражают тяжесть течения пролиферативного процесса в глазу, зависят от наличия лазеркоагуляции сетчатки в анамнезе.
3. Для пациентов с ПДР является характерным наличие локального дисбаланса между VEGF и PEDF, выражающегося в усилении проангиогенных и ослаблении антиангиогенных влияний по сравнению с показателями здоровых доноров.
4. Проведение ТДЛКС нивелирует локальный дисбаланс между проангиогенным VEGF и ингибитором ангиогенеза PEDF, улучшая клинико – функциональное состояние глаз у пациентов с осложненной ПДР перед эндовитреальным хирургическим вмешательством.
5. Проведение витрэктомии после предварительной ТДЛКС позволяет получить более высокие и стабильные анатомические и функциональные результаты хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР.
6. Частота послеоперационных осложнений и стабилизации процесса в результате хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР зависит от особенностей локальной секреции VEGF и PEDF.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на всероссийской научно – практической конференции с международным участием «Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2008), международной научно – практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2008), VII научно – практической конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии – 2009» (Москва, 2009), IV Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2009), VIII Всероссийской научно – практической конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2009).

Апробация диссертации состоялась на межотделенческой конференции в МНИИ ГБ им. Гельмгольца 28 мая 2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 в центральной печати. Поданы заявки на выдачу патента на изобретение № 2009124328 с приоритетом от 26.06.2009 «Способ моделирования неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва у кроликов», № 2009124327 с приоритетом от 26.06.2009 «Способ диагностики развития осложнений при пролиферативной диабетической ретинопатии у пациентов с непрозрачными оптическими средами глаза».

Внедрение. Результаты исследований внедрены в клиническую практику отдела патологии сетчатки и зрительного нерва МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Материалы диссертации включены в программу лекций на декадниках отдела патологии сетчатки и зрительного нерва ФГУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца Росмедтехнологий».

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, включающих описание материалов, методов и результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, 36 рисунков. Указатель литературы включает 329 источников: 76 отечественных и 253 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть.

С целью изучения влияния ТДЛКС на новообразованные сосуды заднего отдела глаза нами была проведена серия экспериментов. На первом этапе экспериментального исследования была разработана модель неваскуляризации сетчатки и зрительного нерва на основании интравитреального введения VEGF кроликам. В правый глаз опытных животных (5 кроликов породы «шиншилла») интравитреально с помощью иглы 26 G, в 4 мм от лимба, в меридиане 12 часов вводили рекомбинантный человеческий VEGF («ProSpec» Израиль, «Pierce» США), растворенный в 0,05 – 0,1 мл стерильной воды для инъекций. Курс включал шесть инъекций препарата: на 1-е и 3-и сутки эксперимента вводили 3 мкг VEGF, на 7-е и 11-е сутки – 1,5 мкг VEGF, на 15-е сутки - 1,0 мкг VEGF, на 24-е сутки – 5,0 мкг VEGF (разрешающая доза). Суммарная доза VEGF составила 15 мкг. В качестве контроля в стекловидное тело парного глаза производилось однократное введение эквивалентного объема стерильной воды для инъекций.

Все инъекции выполнялись в стерильных условиях под контролем операционного микроскопа после внутримышечного введения комбинированного анестетика. Животных выводили из эксперимента путем воздушной эмболии на 35-е сутки, глаза энуклеировали. Клиническую оценку состояния глаз кроликов в динамике проводили с помощью биомикроскопии и офтальмоскопии. Флюоресцентная ангиография (ФАГ) глазного дна производилась на 14-й, 28-й, 30-й дни эксперимента. Фоторегистрация глазного дна осуществлялась на 1-е, 7-е, 21-е сутки.

Патоморфологическое исследование проводили в отделе патологической анатомии и гистологии глаза МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца (руководитель отдела – доктор медицинских наук, профессор И. П. Хорошилова – Маслова). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Светооптическое исследование проводили на микроскопической системе фирмы «Leica» (Германия) при Х40, Х100, Х200 и Х400.

По данным инструментальных и патоморфологических исследований было выявлено, что патологический процесс формирования пролиферативных изменений на глазном дне опытных животных носит стадийный характер. После первого введения 3 мкг VEGF наблюдалось расширение и извитость сосудов сетчатки. Введение 6 мкг препарата (две инъекции по 3 мкг) вызвало появление множественных ретинальных геморрагий, что свидетельствовало о нарушении проницаемости внутреннего гематоретинального барьера. Дальнейшие инъекции VEGF (две инъекции по 1,5 мкг) поддерживали имеющиеся изменения ретинальных сосудов опытных животных, но появления неоваскуляризации не наблюдалось. По данным ФАГ, проведенной на 14-й день эксперимента после суммарного введения 9 мкг VEGF (всего четыре инъекции), выявлялось обогащение сосудистой сети сетчатки по сравнению с контрольными глазами за счет открытия в норме не функционирующих капилляров. Экстравазального выхода флюоресцеина не было. С этого момента наблюдались признаки регресса изменений со стороны ретинальных сосудов, несмотря на дополнительное введение 1,0 мкг VEGF, что можно объяснить компенсаторной активацией факторов – антагонистов VEGF в ответ на введение опытных доз ростового фактора здоровым животным. На 24-е сутки после начала эксперимента проводилось одномоментное введение 5,0 мкг VEGF (шестая инъекция). Высокая доза препарата оказалась разрешающей для кроликов с уже «скомпрометированным» сосудистым руслом сетчатки. В опытных глазах отмечалось появление массивных ретинальных и интравитреальных кровоизлияний, препятствующих детальному осмотру глазного дна. При ФАГ, проведенной на 4-й день после введения 5,0 мкг VEGF, отмечалось интенсивное гомогенное просачивание красителя, менее выраженное при повторном исследовании через 1 неделю. Одновременно обнаруживалась гиперфлюоресценция ДЗН, усиливающаяся в поздней фазе исследования, что явилось достоверным признаком появления новообразованных сосудов. Контрольные глаза оставались интактными в течение всего исследования. При патоморфологическом исследовании было выявлено, что новообразованные сосуды появлялись в сетчатке и преламинарной части зрительного нерва, прорастали на внутреннюю их поверхность и в прилежащую зону стекловидного тела в виде почек, состоящих из пролиферирующих эндотелиоцитов, которые можно рассматривать в качестве предшественников новообразованных сосудов. На поверхности сетчатки формировалась сосудистая мембрана, в которой, наряду с геморрагическими процессами, наблюдались тракционные воздействия, приводящие к формированию складок сетчатки с ее плоской отслойкой. Морфологический анализ эпиретинальной мембраны показал ведущую роль в ее формировании врастающих новообразованных сосудов. Это дает основание предполагать сходство данной мембраны с сосудистой мембраной, наблюдаемой при ПДР.

На втором этапе эксперимента оценивалось влияние ТДЛКС на новообразованные сосуды глазного дна. В обоих глазах опытных животных (4 кролика породы «шиншилла») моделировалась неоваскуляризация сетчатки и зрительного нерва изученным ранее способом. На следующий день после введения разрешающей дозы VEGF (25-е сутки) на правых глазах кроликов проводилась ТДЛКС с помощью офтальмокоагулятора «Алод – 01 – Алком» («Алком – Медика», Санкт – Петербург, =0,81мкм) и зонда для транссклеральной ретинопексии по типу «side – focus». Лазерные аппликации в количестве 48 – 50 наносились трансконъюнктивально в экваториальной и преэкваториальной зоне на 360 окружности глазного яблока под контролем непрямой бинокулярной офтальмоскопии до получения коагулята 2 степени по L’Esperance. Мощность лазерного излучения составила 550 – 600 мВт, экспозиция во всех случаях была 0,6 с. Левые глаза служили контролем. Энуклеация производилась на 35-е сутки после начала эксперимента и через 10 дней после лазерного воздействия.

По данным второго этапа экспериментального исследования было выявлено, что после проведения ТДЛКС в опытных глазах отмечалась быстрая резорбция гемофтальма, возникшего после введения 5,0 мкг VEGF, в то время как в стекловидном теле парных глаз сохранялась значимая взвесь форменных элементов крови. Через 5 дней после проведения ТДЛКС на глазном дне в области заднего полюса выявлялись расширенные и извитые собственные сосуды сетчатки, ретинальные и препапиллярные геморрагии. В парных глазах сосудистые изменения носили более выраженный характер, постепенно формировалась глиальная мембрана, локализовавшаяся в области ДЗН и медуллярных волокон. По данным ФАГ, проведенной на 30-й день после начала эксперимента и 6-й день после ТДЛКС в опытных глазах выявлялась гиперфлюоресценция ДЗН, усиливающаяся на поздних фазах исследования. В парных глазах, где ТДЛКС не проводилась, наблюдалась интенсивная гомогенная экстравазация красителя, ход отдельных сосудов не прослеживался. При изучении гистологических срезов глаз, подвергшихся ТДЛКС, на ДЗН обнаруживались запустевшие новообразованные сосуды, находящиеся на различных этапах обратного развития и формирующие конгломерат мембранных структур с ядрами эндотелиоцитов. Изменений со стороны сетчатки выявлено не было. Морфологическая картина при исследовании парных глаз характеризовалась наличием развитой пролиферативной ретинопатии с формированием сосудистой эпиретинальной мембраны и тракционной деформацией сетчатки подобной той, которая наблюдалась на первом этапе эксперимента.

Клиническая часть.

Клиническая часть работы проводилась в отделе патологии сетчатки и зрительного нерва (руководитель отдела – д. м. н., профессор В. В. Нероев) Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Срок наблюдения за больными составил от 6 месяцев до 1,5 лет.

Клинические исследования базируются на анализе данных клинико - функционального обследования 61 пациента (61 глаз) с осложненной ПДР. Возраст обследованных составлял от 29 до 69 лет. 36 пациентов, страдали СД 2 типа, у 25 был диагностирован СД 1 типа. Длительность основного заболевания составляла от 3 до 26 лет.

Все пациенты были разделены на две группы: основную и контрольную. Основная группа включала 31 пациента, 31 глаз (21 глаз с гемофтальмом, 10 глаз с тракционной отслойкой сетчатки (ТОС), которым за 2 недели до запланированной витрэктомии проводили ТДЛКС. В контрольную группу вошли 30 пациентов (30 глаз), у которых хирургическое лечение заключалось только в проведении эндовитреального вмешательства по поводу гемофтальма (20 глаз) и ТОС (10 глаз).

Офтальмологическое обследование проводилось до и после лазерных и эндовитреальных вмешательств по традиционной методике, включающей визометрию, тонометрию, гониоскопию, ультразвуковое А – и В – сканирование, электрофизиологические исследования, биомикроскопию, офтальмоскопию, фоторегистрацию переднего отдела глаза и глазного дна.

ТДЛКС проводилась под местной проводниковой и инстилляционной анестезией с помощью диодного офтальмокоагулятора DC 3300 («Nidek», Япония, =0,81мкм) и специального зонда для транссклеральной ретинопексии. Лазерные аппликации в подавляющем большинстве случаев наносились трансконъюнктивально в экваториальной и преэкваториальной зоне, на 270 - 360 окружности глазного яблока, избегая коагуляции в области 3 и 9 часов, а также в зоне отслоенной сетчатки. Особое внимание уделяли коагуляции зон сетчатки, прилежащих к областям будущих склеротомий. Энергетические параметры лазерного излучения: мощность варьировала от 680 до 860 мВт (785 ± 52 мВт), экспозиция составляла 0,6 – 0,8 с (0,74 ± 0,09 с), общее количество коагулятов было от 113 до 135 (125 ± 8 коагулятов). Трансцилиарная витрэктомия проводилась по стандартной методике с использованием инструментов 20 калибра, эндолазеркоагуляции сетчатки, субстанций для интравитреальной тампонады.

Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA, версия 6.0 (StatSoft Inc., США), применялись t критерий, критерий 2 Пирсона и точный критерий Фишера, линейный корреляционный и регрессионный анализ. Критическим признан уровень значимости р = 0,05. Для обнаружения признаков, характеризующих группы объектов исследуемого набора данных, по которым каждый новый объект может быть отнесен к тому или иному классу, использовалась задача «классификация» методом k – ближайшего соседа.

Иммунологические исследования.

Иммунологические исследования проводились в лаборатории иммунологии и вирусологии (руководитель – д. б. н., профессор О. С. Слепова) Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца.

Изучалось содержание VEGF и PEDF в СЖ и СК у 16 пациентов (32 глаза) основной группы, 10 пациентов (18 глаз) контрольной группы и у 5 здоровых добровольцев методом иммуноферментного анализа с использованием тест – систем («Human VEGF ELISA Kit», BioSource International Inc., USA; «ChemiKineTM Pigment Epithelium-Derived Factor Sandwich ELISA Kit», Chemicon International Inc., USA). У пациентов основной группы забор СЖ осуществляли перед проведением ТДЛКС, а также на 3-й, 7-й и 14-й дни после лазерного вмешательства. У пациентов контрольной группы СЖ собирали однократно перед проведением витрэктомии. СЖ парных глаз была исследована однократно с целью получения более полной иммунологической характеристики локального содержания исследуемых факторов при различных клинических картинах ПДР.

У пациентов с ПДР и здоровых доноров оба фактора выявлялись во всех пробах СЖ. Содержание VEGF при ПДР составляло 365,1 ± 124,2 пг/мл, что было выше показателей здоровых доноров - 207,4 ± 24,8 пг/мл (р>0,05), уровни PEDF - 3,87 ± 2,45 нг/мл были достоверно ниже нормы - 12,56 ± 2,44 нг/мл (р<0,01).

Установлено, что особенности локальной продукции VEGF и PEDF отражают тяжесть течения пролиферативного процесса в глазу и зависят от наличия лазеркоагуляции сетчатки в анамнезе. Самые высокие значения VEGF в сочетании с минимальными показателями PEDF определялись в случаях распространения пролиферативного процесса на передний отдел глаза с развитием рубеоза радужки, вторичной неоваскулярной глаукомы и достоверно отличались от нормы. При преимущественной локализации пролиферативного процесса в заднем отделе глаза и наличии осложнений в виде кровоизлияния в стекловидное тело или ТОС значения VEGF были ниже, а PEDF выше показателей при неоваскулярной глаукоме (табл. 1).

С целью изучения вопроса о взаимосвязи концентрации VEGF и PEDF в СЖ от стадии ПДР все образцы были разделены на две подгруппы: осложненная ПДР и не осложненные стадии пролиферативного процесса (начальная, среднетяжелая, тяжелая). Было выявлено, что концентрация VEGF, равная 467 пг/мл и выше, определялась только при осложненной ПДР, соответствующая 202 пг/мл и ниже, обнаруживалась исключительно при отсутствии осложнений. Значения VEGF, находящиеся в пределах 202 – 467 пг/мл, могли соответствовать любой стадии ПДР. Уровни PEDF, равные 1,84 нг/мл и ниже, определялись только при осложненной ПДР. Более высокая концентрация PEDF встречалась при всех стадиях ПДР.

Выявленная обратная корреляционная зависимость между VEGF и PEDF в СЖ при различных стадиях ПДР (r=-0,7587, p=0,007) свидетельствует о разбалансировке в системе про- и антиангиогенных факторов, что может влиять на развитие осложнений пролиферативного процесса.

При наличии панретинальной лазеркоагуляции в анамнезе значения VEGF в СЖ были ниже – 331,0 ± 54,0 пг/мл (p<0,05), а PEDF выше - 4,02 ± 0,85 нг/мл (p>0,05) показателей без лазерного воздействия (423,6 ± 7,04 пг/мл и 3,30 ± 0,90 нг/мл соответственно).

Статистически достоверных различий содержания VEGF и PEDF в СК пациентов с ПДР и здоровых пробандов выявлено не было. Концентрация VEGF в СК не отражала тяжести течения пролиферативного процесса в глазу, не коррелировала с уровнями фактора в СЖ (r=-0,2161; p=0,576).

Таблица 1

Содержание VEGF и PEDF в слезной жидкости при осложненной и не осложненной ПДР

Осложнения ПДР	Концентрация VEGF (пг/мл)				Концентрация PEDF (нг/мл)
	СЖ
	n	Разброс (от…до…)	Mean ± SD	р	Разброс (от…до…)	Mean ± SD	р
Гемофтальм	9	204 – 530	343,8 ± 57,7	0,0775	1,36 – 11,6	4,64 ± 1,49	0,0027
Тракционная отслойка сетчатки	11	242 – 700	403,2 ± 90,9	0,1263	1,68 – 5,24	3,22 ± 0,64	0,0042
Рубеоз радужки	6	314 – 480	417,0 ± 36,6	0,0082	1,38 – 4,32	2,08 ± 0,80	0,0065
Вторичная н/в глаукома	4	384 – 586	479,0 ± 41,4	0,0042	1,2 – 1,38	1,26 ± 0,05	0,0113
ПДР без осложнений	20	134 - 464	316,0 ± 109,1	0,0812	2 – 8,34	4,75 ± 2,10	0,0021
Здоровые доноры	10	150 - 238	207,4 ± 24,8	-	7,04 – 18,0	12,56 ± 2,44	-

Примечание: достоверность различий по сравнению с показателями здоровых доноров

Сочетанный анализ продукции VEGF в СЖ и СК выявил изолированное повышение уровня ростового фактора в слезе у большинства пациентов с ПДР и лишь в некоторых случаях на фоне его высокой концентрации в СК. Опираясь на полученные данные, именно CЖ, а не СК, использовалась нами в качестве тест – пробы при изучении особенностей секреции VEGF и PEDF у пациентов с ПДР до и после ТДЛКС.

После проведения ТДЛКС содержание VEGF снижалось на 3 день (р=0,0102), повышалось к концу 1 недели и вновь снижалось на 2 неделе (р=0,0059). Значения PEDF к 3 дню повышались, на 1 неделе снижались, а к концу 2 недели вновь повышались (р=0,0498). На первой неделе после вмешательства уровни факторов изменялись зависимо друг от друга, что подтвердил проведенный корреляционный анализ (рис. 1). Следует отметить, что в большинстве случаев концентрации VEGF и PEDF после проведения лазерного вмешательства приближались к значениям здоровых доноров, но не всегда достигали их.

Рис. 1. Обратная динамика уровней VEGF и PEDF в СЖ после ТДЛКС.

Результаты проведения транссклеральной диодной лазеркоагуляции сетчатки у пациентов основной группы.

После ТДЛКС у 13 пациентов (13 глаз, 42%) на 1 - 3 день наблюдалась частичная резорбция взвеси крови в стекловидном теле. При этом у 9 пациентов (29%) острота зрения повысилась на 0,01 – 0,07, у 4 больных (13%) улучшилась до 0,1 – 0,3. Во всех глазах с рубеозом радужки выявлен регресс новообразованных сосудов через 7 – 14 дней после лазерного воздействия, что косвенно свидетельствует о возможном влиянии ТДЛКС на неоваскуляризацию сетчатки. У всех пациентов наблюдалась легкая ожоговая реакция со стороны конъюнктивы, выраженный болевой синдром отсутствовал. Признаки повреждения склеры не отмечались в течение всего периода наблюдения. Внутриглазное давление оставалось в пределах нормы. В 10 случаях (32,3%) выявлялся реактивный ирит, купировавшийся в течение 3-5 дней на фоне противовоспалительной терапии. Воспалительные явления наблюдались у молодых пациентов с СД 1 типа и высокими показателями VEGF в СЖ до проведения ТДЛКС (537 ± 109,1 пг/мл, р<0,01). Несмотря на применение стандартных энергетических параметров лазерного воздействия, в 4 глазах из 31 (13%) возник симптом «щелчка», обусловленный индивидуальными особенностями пигментации глазного дна и толщины склеры. В 2 глазах из этих четырех на следующий день после проведения ТДЛКС наблюдалось незначительное кровоизлияние в стекловидное тело. Однако в дальнейшем, в этих случаях, осложнений, связанных с разрывами или отслойкой сетчатки, мы не отмечали.

Результаты проведения витрэктомии у пациентов основной и контрольной групп.

Основными критериями сравнения эффективности хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР основной и контрольной групп являлись острота зрения, характер и частота интра- и послеоперационных осложнений, повторных эндовитреальных вмешательств, прилегания сетчатки при ее тракционной отслойке, а также частота стабилизации процесса на 6 и 12 месяце наблюдения. Через 6 месяцев после витрэктомии у большинства пациентов контрольной группы (70%) острота зрения находилась в пределах 0,01- 0,09. В то время как в основной группе в 64,5% случаев острота зрения была выше 0,1 (рис. 2). К 12 месяцу наблюдения основная группа лидировала по количеству пациентов с остротой зрения, равной 0,1 и выше (70,9%). В контрольной группе число пациентов с аналогичными зрительными функциями достигло 16 (53,3%), но увеличилось количество пациентов с остротой зрения ниже 0,01 вплоть до светоощущения с неправильной светопроекцией (рис. 3).

Рис. 2. Сравнение остроты зрения у пациентов основной и контрольной групп через 6 месяцев после витрэктомии.

В основной группе прослеживалась тенденция к увеличению числа пациентов, у которых наблюдалось улучшение зрительных функций в течение всего периода наблюдения. В контрольной группе отмечалось неуклонное увеличение количества пациентов со снижением остроты зрения после проведенной витрэктомии (рис. 4).

Рис. 3 Сравнение остроты зрения у пациентов основной и контрольной групп через 12 месяцев после витрэктомии.

Рис. 4. Сравнительная динамика остроты зрения пациентов основной и контрольной групп.

В таблице 2 обобщены результаты лечения пациентов основной и контрольной групп. Частота интраоперационных кровотечений из новообразованных сосудов сетчатки была достоверно ниже у пациентов основной группы (11 глаз, 35,5 %) по сравнению с контрольной группой (19 глаз, 63,3 %, p < 0,05). В двух случаях в основной (6,5%) и контрольной группе (6,7%) наблюдались вновь возникшие разрывы сетчатки. На периферии глазного дна у всех пациентов основной группы обнаруживались пигментированные, иногда сливные, лазеркоагуляты, а также отслойка задней гиалоидной мембраны, что значительно облегчало манипуляции с ней.

У пациентов основной группы в целом наблюдалось менее осложненное течение послеоперационного периода по сравнению с контрольной группой. Послеоперационное реактивное воспаление (9 глаз, 30%) и отслойка сетчатки (1 глаз, 3,3%) в раннем послеоперационом периоде выявлялись чаще в контрольной группе. В основной группе частота послеоперационного реактивного синдрома составляла 16,1% (5 глаз), отслойки сетчатки не наблюдалось. Рецидив гемофтальма в раннем послеоперационном периоде возник у 8 пациентов (22,6%) основной группы и у 6 пациентов (20%) контрольной группы (р>0,05), в позднем послеоперационном периоде у 8 (25,8%) и 16 пациентов (53,3%) соответственно (р<0,05). ТОС развилась в сроки от 4 до 9 месяцев после витрэктомии в 3 глазах (9,7%) пациентов основной группы и в 10 глазах (33,3%) пациентов контрольной группы (р<0,05). Необходимость в ревизии витреальной полости возникла у 6 пациентов (19,4%) основной группы и у 18 пациентов (60%) контрольной группы (р<0,01). Рубеоз радужки наблюдался в 2,5 раза чаще у пациентов контрольной группы (5 глаз, 16,7%) без проведения ТДЛКС перед витрэктомией по сравнению с основной группой (2 глаза, 6,5%), где транссклеральное лазерное воздействие использовалось в качестве первого этапа хирургического лечения (р>0,05). Частота прилегания сетчатки при ее тракционной отслойке была выше в основной группе пациентов, составляла 80% через 6 месяцев после витрэктомии и достигала 90% к 12 месяцу после операции, в то время как в контрольной группе она не превышала 70% в течение всего периода наблюдения. Вторичная неоваскулярная глаукома развилась у 1 пациента основной (3,2%) и контрольной группы (3,3%) через 7 месяцев после витрэктомии.

Таблица 2

Сравнение результатов лечения пациентов с осложненной ПДР основной и контрольной групп

Группа	Осложнения (%)									Повторные операции (%)**	Прилегание сетчатки (%)		Стабилизация процесса (%)
	Интраоперационные		Ранние послеоперационные			Поздние послеоперационные
	Кровотечения*	Разрыв сетчатки	Рецидив гемофтальма	Послеоперационный реактивный синдром	Отслойка сетчатки	Рецидив гемофтальма*	Отслойка сетчатки*	Рубеоз радужки	Вторичная н/в глаукома		6 мес	12 мес	6 мес	12 мес **
Основная	35,5	6,5	22,6	16,1	0	25,8	9,7	6,5	3,2	19,4	80	90	77,4	83,9
Контрольная	63,3	6,7	20	30	3,3	53,3	33,3	16,7	3,3	60	70	70	70	43,3

Примечание: * - p < 0,05; ** - p < 0,01.

Таблица 3

Содержание VEGF и PEDF в слезной жидкости пациентов с осложненной ПДР основной и контрольной групп с различными интра- и послеоперационными осложнениями

Кон центрация факто ра роста

Осложнение

Стабилизация процесса

Интраоперационное

Послеоперационное

Кровотечение

Раннее

Позднее

6 месяцев

12 месяцев

Гемофтальм

Послеоперационный реактивный синдром

Гемофтальм

Отслойка сетчатки

Рубеоз радужки/ н/в глаукома

есть

нет

есть

нет

есть

нет

есть

нет

есть

нет

есть

нет

есть

нет

есть

нет

VEGF пг/мл Mean±SD

351,4 ± 118,8

296,4 ± 208,1

323,7 ± 156,1

326,2 ± 174,7

405,5 ± 199,3

267,1 ± 110,1

348,0 ± 129,0

312,2 ± 186,5

425,6 ± 174,4

235,2 ± 90,1

432,6 ± 190,5

262,8 ± 113,0

260,8 ± 110,5

414,3 ± 191,5

288,0 ± 97,9

342,6 ± 188,8

р

0,4834

0,9766

0,0687

0,6603

0,0074

0,0254

0,0408

0,5171

PEDF нг/мл Mean±SD

4,02 ± 2,22

5,48 ± 2,96

4,18 ± 2,38

6,09 ± 3,02

3,09 ± 1,87

5,78 ± 2,62

3,48 ± 2,37

5,39 ± 2,67

4,15 ± 2,12

5,25 ± 3,03

3,25 ± 2,66

5,40 ± 2,46

5,72 ± 2,53

3,19 ± 2,24

6,39 ± 2,74

3,86 ± 2,24

р

0,2459

0,1531

0,0298

0,1515

0,3926

0,0877

0,0426

0,0427

У этих пациентов до эндовитреального вмешательства отмечался самый высокий уровень VEGF (700 пг/мл и 530 пг/мл).

Частота стабилизации процесса через 6 месяцев после витрэктомии была достоверно выше у пациентов с низкими показателями VEGF и высокими значениями PEDF (табл. 3), в основной группе составляла 77,4%, в контрольной группе - 70% (p>0,05; табл. 2). Через 12 месяцев стабилизация процесса отмечалась достоверно чаще у пациентов с высокой концентрацией PEDF (табл. 3), в основной группе ее частота увеличилась до 83,9%, а в контрольной группе сократилась до 43,3% (р<0,01; табл. 2). Также было выявлено, что уровень VEGF у пациентов с развитием в послеоперационном периоде ТОС, рубеоза радужки и вторичной неоваскулярной глаукомы был достоверно выше, по сравнению с пациентами без этих осложнений (табл. 3).

ВЫВОДЫ

1. С помощью дробного интравитреального введения рекомбинантного человеческого VEGF кроликам в течение 35 дней по разработанной схеме получена модель неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва. Морфологический анализ образующихся у опытных животных эпиретинальных мембран доказал ведущую роль в их формировании врастающих новообразованных сосудов, что указывает на их сходство с сосудистыми мембранами, характерными для ПДР.
2. На основании данных клинико-морфологического исследования доказано, что ТДЛКС способствует инволюции моделированных интравитреальным введением VEGF новообразованных сосудов сетчатки и зрительного нерва у опытных животных, препятствуя развитию активной пролиферативной ретинопатии с появлением сосудистых эпиретинальных мембран и угрозой отслойки сетчатки.
3. Выявлены достоверные изменения содержания VEGF и PEDF в СЖ пациентов с ПДР в сравнении с показателями здоровых доноров, выражающиеся в повышении содержания VEGF и снижении концентрации PEDF с наличием обратной корреляционной связи между двумя факторами. Установлено, что особенности локальной продукции VEGF и PEDF отражают тяжесть течения пролиферативного процесса в глазу и зависят от наличия лазеркоагуляции сетчатки в анамнезе. Содержание VEGF и PEDF в СК пациентов с ПДР достоверно не отличается от показателей здоровых пробандов, уровень VEGF в СК не отражает тяжести течения пролиферативного процесса в глазу и не коррелирует с уровнями фактора в СЖ.
4. Разработаны иммунологические критерии прогноза развития осложнений пролиферативного процесса на основании тестирования VEGF и PEDF в СЖ пациентов с ПДР. Осложненная стадия ПДР ассоциируется с концентрацией VEGF, равной или превышающей 467 пг/мл и/или уровнем PEDF, равным или ниже 202 нг/мл.
5. Доказано, что ТДЛКС является эффективным и безопасным способом коагуляции сетчатки у пациентов с осложненной ПДР, способствует рассасыванию гемофтальма, повышению остроты зрения, частичному регрессу новообразованных сосудов. Установлено положительное влияние ТДЛКС на состояние локальной продукции VEGF и PEDF у пациентов с осложненной ПДР в виде изменения их баланса в пользу антиангиогенных влияний.
6. На основании данных клинических исследований доказано, что применение ТДЛКС перед витрэктомией у пациентов с осложненной ПДР способствует получению более высоких и стабильных анатомических и функциональных результатов хирургического лечения по сравнению с группой пациентов без предварительной ТДЛКС. Целесообразно применять ТДЛКС в качестве первого этапа хирургического лечения пациентов с ПДР, осложненной развитием гемофтальма, ТОС, рубеоза радужки.
7. Исходные уровни VEGF и PEDF влияют на развитие осложнений как в раннем, так и в позднем послеоперационном периоде, и, как следствие, обусловливают стабилизацию пролиферативного процесса и успех хирургического лечения пациентов с осложненной ПДР. Риск развития отслойки сетчатки и рубеоза радужки/вторичной неоваскулярной глаукомы в послеоперационном периоде ассоциируется с исходными уровнями VEGF 425±174,4 пг/мл и 432,6±190,5 пг/мл соответственно. Вероятность прогрессирования пролиферативного процесса через 6 месяцев после операции выше при уровнях VEGF, равных 414,3±191,5 пг/мл, а PEDF 3,19±2,24 нг/мл; через 12 месяцев после операции - при содержании PEDF в пределах 3,86±2,24 нг/мл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведение ТДЛКС рекомендуется за 2 недели до трансцилиарной витрэктомии у пациентов с ПДР, осложненной развитием гемофтальма, ТОС, рубеоза радужки. ТДЛКС позволяет добиться частичного регресса новообразованных сосудов на фоне нивелирования локального дисбаланса VEGF и PEDF, стабилизирует состояние глаз на дооперационном этапе и обусловливает более благоприятные исходы хирургического лечения данной категории больных.
2. С целью прогнозирования развития осложнений пролиферативного процесса рекомендуется определение содержания VEGF и PEDF в СЖ пациентов с ПДР методом ИФА. Концентрации VEGF равные или превышающие 467 пг/мл и/или уровни PEDF равные или ниже 202 нг/мл ассоциируются с высоким риском развития осложненной стадии ПДР.
3. Определение содержания VEGF и PEDF в СЖ методом ИФА у пациентов с осложненной ПДР до витрэктомии рекомендовано для прогнозирования развития осложнений и вероятности прогрессирования пролиферативного процесса в отдаленном послеоперационном периоде. Риск развития отслойки сетчатки и рубеоза радужки/вторичной неоваскулярной глаукомы выше при среднем содержании VEGF до операции 425±174,4 пг/мл и 432,6±190,5 пг/мл соответственно. Вероятность прогрессирования пролиферативного процесса через 6 месяцев после операции гораздо выше при уровнях VEGF, равных 414,3±191,5 пг/мл, PEDF 3,19±2,24 нг/мл; через 12 месяцев после операции - при содержании PEDF в пределах 3,86±2,24 нг/мл.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Нероев В.В., Сарыгина О.И., Левкина О.А., Хорошилова – Маслова И. П. Экспериментальное моделирование новообразованных сосудов сетчатки // Пролиферативный синдром в офтальмологии: сб. науч. тр. – М., 2008. – С. 24 – 27.
2. Нероев В.В., Сарыгина О.И., Левкина О.А. Факторы, влияющие на глазной ангиогенез // Вестник офтальмологии. – 2009. – Том 125, №3. – С. 52 – 55.
3. Нероев В.В., Сарыгина О.И., Левкина О.А., Слепова О.С. Изучение локальной секреции про- и антиангиогенных факторов до и после проведения лазеркоагуляции сетчатки у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией // Медицинская иммунология. – 2009. – Том 11, №4-5. – С. 369 – 370.
4. Сарыгина О.И., Нероев В.В., Левкина О.А. Роль сосудистого эндотелиального роста в патогенезе диабетической ретинопатии // Вестник офтальмологии. – 2009. – Том 125, №2. – С. 58 – 60.
5. Сарыгина О.И., Нероев В.В., Левкина О.А., Слепова О.С. Изучение локальной секреции про- и антиангиогенных факторов до и после проведения транссклеральной диодной лазеркоагуляции сетчатки у пациентов с осложненной ПДР // Федоровские чтения – 2009. – М., 2009. – С. 438 – 440.
6. Сарыгина О.И., Нероев В.В., Левкина О.А., Хорошилова – Маслова И.П. Экспериментальное моделирование пролиферативной ретинопатии путем интравитреального введения VEGF кроликам // Офтальмология. – 2009. – Том 6, №3. – С. 25 – 29.
7. Левкина О.А., Нероев В.В., Сарыгина О.И. Применение транссклеральной диодной лазеркоагуляции сетчатки в качестве первого этапа хирургического лечения пациентов с ПДР // Актуальные проблемы офтальмологии: сб. науч. трудов – М., 2009. – С. 390 – 394.

Изобретения.

1. Нероев В.В., Сарыгина О.И., Хорошилова – Маслова И.П., Левкина О.А. Заявка на патент РФ № 2009124328 с приоритетом от 26.06.2009: «Способ моделирования неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва у кроликов».
2. Нероев В.В., Сарыгина О.И., Слепова О.С., Левкина О.А. Заявка на патент РФ № 2009124327 с приоритетом от 26.06.2009: «Способ диагностики развития осложнений при пролиферативной диабетической ретинопатии у пациентов с непрозрачными оптическими средами глаза».

Список сокращений.

СД – сахарный диабет

СЖ – слезная жидкость

СК – сыворотка крови

ПДР – пролиферативная диабетическая ретинопатия

ТДЛКС – транссклеральная диодная лазеркоагуляция сетчатки

VEGF – сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor)

PEDF – фактор, выделенный из пигментного эпителия (pigment epithelium derived factor)