Сравнительная оценка специфической фармакологической активности различных гемостатических средств местного и системного действия

На правах рукописи

ТЕР-АРУТЮНЯНЦ АРТЕМ АНДРЕЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ МЕСТНОГО И СИСТЕМНОГО ДЕЙСТВИЯ

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

14.00.29. - гематология и переливание крови

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом научном центре РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Андрей Павлович Момот

кандидат медицинских наук Галина Геннадьевна Белозерская

Официальные оппоненты:

ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор Рошен Джафарович Сейфулла

Доктор медицинских наук, профессор Марина Васильевна Леонова

Ведущая организация:

Государственное учреждение научно-исследовательский институт фармакологии

им. В.В. Закусова РАМН

Защита состоится «1» июня 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова д. 1).

Автореферат разослан «30» апреля 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Джанашия П.Х.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Профилактика и остановка кровотечений имеют важнейшее значение в различных областях клинической медицины, прежде всего в гематологии (Воробьев А.И. 2005; Giangrande P. 2005; Yanada M., и соавт. 2007), хирургии (Fraser I.S., и соавт. 2008), травматологии (Lienhart H.G, и соавт. 2008), онкологии (Lichtiger B. and Huh Y. 2008), акушерстве (Mercier F.J. и соавт. 2008) и др. в связи с увеличением числа больных с геморрагическими проявлениями, широким использованием антикоагулянтов (гепаринов и препаратов кумаринового ряда) (Akolu E. и соавт. 1994), внедрением в медицинскую практику лекарств, обладающих наряду с необходимыми терапевтическими эффектами гепатотоксическим действием.

Особую роль играет разработка гемостатических средств в медицине катастроф и для оказания помощи при критических и неотложных состояниях в условиях боевых действий (Blackbourne L.H. 2008; Spinella P.C. 2008). Развитие военной науки и техники неизбежно сопровождается появлением новых видов поражений, увеличением их количества, усилением тяжести патологического процесса, в том числе геморрагических осложнений при огнестрельных ранениях, воздействиях ядерного и химического оружия (Hess J.R, Holcomb J.B 2008; Чазов Е.И, и соавт. 1984).

Актуальность данного исследования связана и с тем, что зачастую препараты для остановки кровотечений, традиционно применяемые в медицинской практике, недостаточно эффективны и неспособны привести к действенному снижению кровопотери, что опасно развитием геморрагического шока, острого ДВС-синдрома, ишемии и некрозов жизненно важных органов. Это обусловлено широким разнообразием причин, способствующих возникновению гематомного и/или микроциркуляторного типа кровоточивости (Баркаган З.С., Момот А.П., 2001). Клинический опыт показывает, что при плановых хирургических вмешательствах на печени, почках, селезенке при целостности магистральных артерий и вен капиллярно-паренхиматозные кровотечения являются основными источниками операционной кровопотери (Абакумов М.М. и соавт. 2002; Schuster R, и соавт. 1990; Jacobson L.E, и соавт. 1992). Для их остановки прибегают к местной гипотермии, используют лазерное облучение кровоточащих тканей (Koshelev V.N, Chalyk IuV. 1992), аппликацию жидкого азота, термо- (Schuster R, и соавт. 1990) и ультразвуковую коагуляцию (Vaezy S, и соавт. 2004), парентерально вводят свежезамороженную плазму и ее продукты - факторы свертывания крови (изолировано или в различных комбинациях), амбен, эпсилон-аминокапроновую кислоту, ингибиторы сериновых протеиназ (трасилол, гордокс), адроксон, этамзилат, серотонин, окситоцин, питуитрин и ряд других препаратов, обладающих различными механизмами остановки кровотечений (Баркаган З.С., Момот А.П. 2001; Tien H, и соавт. 2007; Ranucci M. и соавт. 2008; Hedner U, и соавт. 2007; Fraser I.S. и соавт. 2008 ; Franchini M. И соавт. 2007). В числе средств, обладающих местным гемостатическим эффектом, обычно используют тромбин, фибриноген, фактор XIII, апротинин, фибриновые и полимерные пленки и композиции (Абоянц Р.К. и соавт. 1999; Mannucci P.M., 199 8).

Тем не менее, появление новых, перспективных препаратов и композиций, обладающих системным или местным гемостатическим действием требует углубленного изучения их эффективности в контролируемых (модельных) условиях эксперимента, что и было выполнено в настоящей работе.

Цель исследования: Сравнительное исследование специфической фармакологической активности различных гемостатических средств системного и местного действия.

Задачи исследования:

1. Провести анализ прокоагуляционной местной и системной гемостатической активности препарата «НовоСэвен» в модельных экспериментах у интактных кроликов и в условиях коагулопатии, вызванной гепарином и варфарином.
2. Исследовать специфическую фармакологическую активность образцов отечественного активированного рекомбинантного фактора VII (рФVIIa) в условиях экспериментальной модели на интактных кроликах и при гипокоагуляции, обусловленной гепарином и варфарином.
3. Провести сравнительный анализ результатов исследования гемостатической активности препарата «НовоСэвен» и экспериментальных серий нового отечественного рФVIIa.
4. Провести сравнительное исследование местной кровоостанавливающей способности средств различного химического строения и механизма действия при их аппликации на раневую поверхность печени кроликов.

Научная новизна

1. Оценена в эксперименте на кроликах гемостатическая активность отечественного рФVIIa при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг в сравнении с «НовоСэвен»
2. Выявлена высокая эффективность отечественного рФVIIa в условиях экспериментальной коагулопатии, обусловленной наиболее распространенными в клинической практике антикоагулянтами - гепарином и варфарином
3. Сочетание системного и местного воздействия отечественного рФVIIa приводит к более результативному кровоостанавливающему эффекту по сравнению с применением его или системно, или местно
4. Впервые в эксперименте на модели капиллярного кровотечения оценена местная гемостатическая активность аппликатов, включающих факторы свертывания крови: «НовоСэвен», отечественный препарат рФVIIa, растворимый фибрин-мономер, комбинация фибрин-мономера с эпсилон-аминокапроновой кислотой, а также активаторов факторов свертывания крови: эхитокс, либетокс, анцистрон.

Практическая значимость работы

Установлено, что отечественный рФVIIa проявляет в условиях внутривенного введения близкую гемостатическую активность к препарату «НовоСэвен», что свидетельствует о целесообразности его дальнейших доклинических и клинических испытаний.

Включение отечественного рФVIIa в состав гемостатических средств, предназначенных для местного применения (аппликации), может расширить спектр использования данного рекомбинантного белка.

Применение белка крови фибрин-мономера самостоятельно или в комплексе с эпсилон-аминокапроновой кислотой может лечь в основу разработки гемостатической композиции, предназначенной, для остановки паренхиматозных кровотечений при местном применении.

Положения, выносимые на защиту:

1. Внутривенное введение препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг интактным кроликам сокращает протромбиновое время (ПВ) свертывания плазмы, повышает активность ФVII в плазме крови и сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери.
2. Внутривенное введение отечественного рФVIIa приводит к сокращению значений ПВ и возрастанию активности ФVII в плазме животных. Введение отечественного рФVIIa сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери.
3. При внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг отечественный рФVIIa обладает сопоставимой специфической фармакологической активностью с препаратом «НовоСэвен»
4. Препарат «НовоСэвен» и отечественный рФVIIa способны купировать действие гепарина, устранять антикоагулянтый эффект варфарина, уменьшая время остановки кровотечения и объем кровопотери.
5. Местным гемостатическим действием обладают белок крови фибрин-мономер, отечественный рФVIIa и препарат «НовоСэвен», а также эхитокс.

Личный вклад автора

Автором была проведена серия экспериментов на 201 кролике породы «Шиншилла» по изучению специфической фармакологической активности средств системного и местного действия (43 образца). Диссертантом освоены и лично проводились современные методики исследования системы гемостаза, в том числе и на моделях коагулопатии: определение основных параметров активности системы гемостаза, оценка активности образцов рФVIIa in vitro и ex vivo, а также определение местной и системной гемостатической активности на модели капиллярно-паренхиматозного кровотечения в эксперименте.

Апробация диссертации

По материалам исследования были сделаны доклады на 12-ом Всероссийском съезде сердечно сосудистых-хирургов (Москва 2006) на тему «Оценка гемостатического действия рекомбинантного FVIIa (NovoSeven) в эксперименте», Всероссийской конференции молодых ученых (Москва 2008) - «Специфическая фармакологическая активность рФVIIa (НовоСэвен) в условиях экспериментальной гипокоагуляции» и Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы, кровоточивость ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» - «Исследование гемостатической активности отечественного рФVIIa на модели тромбоцитопении при острой лучевой болезни у кроликов».

Апробация диссертации проведена на заседании проблемной комиссии «Патология гемостаза» (протокол №15 от 29.09.2008).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественной литературе, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 таблицами и 45 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 241 источник, в том числе 77 отечественных и 164 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В экспериментах in vitro исследовалась и сопоставлялась удельная коагуляционная активность образцов отечественного активированного фактора свертывания крови VII (рФVIIa) с активностью зарубежного препарата рФVIIa "NovoSeven®" выпускаемого в Дании фирмой «Novo Nordisk» (далее «НовоСэвен»).

В исследованиях ex vivo, были охарактеризованы плазменная и клеточная составляющие системы гемостаза у интактных лабораторных животных при введении им отечественного или зарубежного рФVIIa. Также исследование фармакологической активности отечественного рФVIIа и препарата «НовоСэвен» проводили на животных с фармакологически обусловленной гипокоагуляцией вызываемой варфарином и гепарином.

Плазменный гемостаз изучали с помощью определения времени свертывания цельной крови (ВСЦК) по методу Ли–Уайт и активированного частичного тромбопластинового времени - АЧТВ (отражающего интегральное состояние гемостаза после контактной активации), протромбинового времени - ПВ (отражающего суммарную активность факторов протромбинового комплекса, продуцируемых печенью), тромбинового времени - ТВ и концентрации фибриногена (отражающих уровень фибриногена и состояние финального этапа фибринообразования). Была определена активность ФVII в плазме животных по J. Morrissey. Исследована агрегационная способность тромбоцитов по методу G. Born, определено число тромбоцитов по методу B.Walkowiak и соавторов (данные методы отражают состояние тромбоцитарного гемостаза, наиболее быстро реагирующего на внешние воздействия).

Заключительной частью работы стали серии острых экспериментов in vivo, в которых исследования были направлены на изучение гемостатической активности рФVIIa при его внутривенном введении на моделях паренхиматозного кровотечения. Моделированное кровотечение вызывалось у интактных животных с нормальной функцией гемостаза, а также у животных с спровоцированной гипокоагуляцией, вызываемой непрямым антикоагулянтом (варфарином). С помощью специального приспособления, производили резекцию печени. Остановку развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполняли путем равномерного наложения на всю площадь раневой поверхности марлевого тампона. Время остановки кровотечения определяли по секундомеру. Критерием оценки момента остановки кровотечения являлось полное отсутствие проникновения крови через поверхность и края наложенного марлевого тампона. Настоящий метод описан в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под редакцией В.П. Фисенко.

Эксперименты на лабораторных животных были выполнены на 201 кролике породы «Шиншилла» обоего пола массой 2,5 – 4 кг. Количество циркулирующей крови у данных животных составляет по разным данным от 5,45% до 7,69 % массы тела. Этот факт обуславливает возможность проводить опыты сопровождающиеся кровопотерей до 40 мл крови без нарушения гемостазиологических требований. Кроме того, толерантность тромбоцитов кролика к различным лекарственным средствам близка к таковым у человека, что обуславливает схожую реакцию со стороны клеточного гемостаза на изучаемые лекарственные вещества.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование специфической фармакологической активности препарата «НовоСэвен» в эксперименте у интактных кроликов и при индуцированной коагулопатии

В настоящее время все чаще применяются продукты генно-инженерных технологий, которые становятся альтернативой белкам из донорской крови. В результате серии научных исследований появилась новая технология остановки кровотечений с помощью препарата «НовоСэвен» – рекомбинантного активированного фактора свертывания VII (рФVIIa).

В соответствии с полученными данными клинического применения рФVIIa при острых кровотечениях и в хирургической практике определено, что наиболее эффективной является доза 90 мкг/кг.

В настоящем разделе работы была поставлена задача исследовать гемостатическую активность препарата «НовоСэвен» в эксперименте у интактных кроликов и при индуцированной коагулопатии. Во всех экспериментах по исследованию гемостатической активности данный препарат вводился в дозе 90 мкг/кг.

Коагуляционная активность препарата «НовоСэвен»

В ходе экспериментов было показано, что препарат «НовоСэвен» дозозависимо влияет на время свертывания дефицитной по фактору VII плазмы крови человека. Время образования фибринового сгустка составило 69,5±5,1; 81,0±6,4; 102,4±4,8; 143,4±8,9 сек при использовании рФVIIa в концентрации 1000; 100; 10 и 1 нг/мл, соответственно. При проведении контрольного исследования было установлено, что при инкубировании дефицитной по фактору VII плазмы с одним растворителем рФVIIa время образования фибринового сгустка составляло 262,8 сек.

Влияние препарата «НовоСэвен» на основные коагулогические показатели ex vivo

В данной серии экспериментов было исследовано влияния препарата «НовоСэвен» на основные показатели свертываемости крови при его внутривенном введении кроликам в дозе 90 мкг/кг. Показано, что через 15 и 60 мин после внутривенного введения «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг укорачивалось ПВ и значительно возрастала активность ФVII по сравнению с исходной его активностью. Другие показатели коагулограммы (АЧТВ, ТВ, концентрация фибриногена) в динамике не менялись, без изменений остались также число и агрегация тромбоцитов в течение всего периода наблюдений.

Исследование гемостатической активности препарата «НовоСэвен» в эксперименте на животных

Для изучения гемостатической активности препарата «НовоСэвен» было определено время остановки кровотечения и измерен объем кровопотери в остром эксперименте на двух группах кроликов. Животным первой группы внутривенно вводился физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия) в объеме, равном объему растворителя препарата «НовоСэвен» (контрольный эксперимент). Животным второй группы был введен препарат «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг массы тела.

У животных первой группы через 60 мин после введения физраствора время остановки кровотечения было сокращено в среднем на 4,3% от исходных значений, а к концу наблюдения (через 180 мин) время остановки кровотечения достигало 94,6±7,1% от исходного уровня. При введении животным препарата «НовоСэвен» наблюдалось укорочение времени остановки кровотечения, через 60 мин. При этом прослеживалась аналогичная динамика изменения объема кровопотери на протяжении всего эксперимента. В контрольной группе животных данный параметр оставался в диапазоне исходных значений. Таким образом, в эксперименте на животных был продемонстрирован гемостатический эффект препарата «НовоСэвен» на протяжении первых 3-х часов после его внутривенного введения.

Исследование способности препарата «НовоСэвен» купировать гепарин-индуцированную гипокоагуляцию

Для демонстрации антикоагулянтного действия гепарина мы использовали такие показатели коагулограммы как АЧТВ и в ВСЦК. Первой группе кроликов внутривенно вводился гепарин в дозе 500 МЕ/кг (контрольная группа), второй группе (опытная группа) помимо гепарина проводилась инфузия препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг (инъекция препарата «НовоСэвен» производилась спустя 5 минут после введения гепарина).

Полученные данные (табл. №1) показали, что через 30 мин после инфузии гепарина в крови обеих сравниваемых групп животных произошло удлинение АЧТВ. Через 60 минут данный показатель у кроликов, которым вводили только гепарин, максимально удлинился и достиг в среднем 210 сек. В то же время бедная тромбоцитами плазма животных, получавших как гепарин, так и «НовоСэвен», показала укорочение данного показателя (до 68 сек), а через 120 мин данный показатель составил 25 сек, при этом в контрольной группе АЧТВ составило 36 сек.

Таблица №1

Влияние препарата «НовоСэвен» на длительность свертывания плазмы и крови у кроликов с гепарин-индуцированной коагулопатией, (Х+m)

Группы животных Временные экспериментальные точки	Контрольная группа (Гепарин 500 МЕ/кг)		Опытная группа (Гепарин 500 МЕ/кг + «НовоСэвен» )
	АЧТВ,с (n=9)	ВСЦК, с (n=5)	АЧТВ, с (n=6)	ВСЦК, с (n=5)
Исходные данные	17,2±1,7	139±10	16,9±1,9	139±10
Через 30 мин после введения	193,7±10,4	>1800	176,2±7,5	>1800
Через 60 мин после введения	210,4±9,0 *	>1800*	68,5±5,9 *	1583±112*
Через 90 мин после введения	70,7±7,2 *	1562±98*	36,4±6,2 *	1269±83*
Через 120 мин после введения	36,3±2,9 *	1029±107	25,1±4,1 *	1027±103
Через 180 мин после введения	21,2±2,3	431±20	21,1±2,6	463±31

* - достоверное различия между соответствующими данными в одном временном интервале при р<0,05

Схожие по своей динамике и направленности данные были получены и при исследовании образцов крови сравниваемых групп кроликов по методике ВСЦК.

Анализ полученных данных позволяет заключить, что введение препарата «НовоСэвен» животным с гепарин-индуцированной коагулопатией в значительной мере нейтрализует антикоагулянтное действие гепарина.

Исследование способности препарата «НовоСэвен» купировать варфарин-индуцированную гипокоагуляцию

В следующей серии экспериментов исследована способность препарата «НовоСэвен» нейтрализовать коагулопатию обусловленную медикаментозным снижением синтеза в печени факторов протромбинового комплекса – VII, IX, X и II. Коагулопатию у кроликов вызывали с помощью перорального введения антикоагулянта непрямого действия - варфарина в дозе 0,15 мг/кг массы тела, что соответствовало максимальной суточной дозе препарата при лечении больных. Животные получали варфарин на протяжении 3 дней.

Для иллюстрации действия антикоагулянта проводилось исследование ВСЦК и ПВ бедной тромбоцитами плазмы. В остром эксперименте определяли время остановки кровотечения и объем кровопотери у животных, получавших варфарин (контрольная группа) или комбинацию варфарина с препаратом «НовоСэвен». Последний вводился внутривенно в дозе 90 мкг/кг (опытная группа).

Результаты исследования показали, что по окончанию перорального введения варфарина у экспериментальных животных наступало состояние гипокоагуляции, проявляющееся удлинением ВСЦК с 225 сек до 571 сек и ПВ с 10,2 сек до 15,2 сек. Введение препарата «НовоСэвен» животных с варфарин-индуцированной гипокоагуляцией на временном экспериментальном интервале в 30 минут приводило к укорочению ПВ, данный показатель оставался стабильно коротким в течение трех часов наблюдения.

Гемостатическая активность препарата «НовоСэвен» при его введении животным с варфарин-индуцированной гипокоагуляцией проявилась сокращением времени остановки кровотечения по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе на протяжении всего периода наблюдений. При оценке объема потерянной крови в данных экспериментах была установлена похожая тенденция. Спустя 60 мин после введения препарата «НовоСэвен» объем кровопотери снизился в 2,6 раза по сравнению с таковым в контрольной группе.

Исследование и анализ специфической фармакологической активности отечественного препарата рФVIIa на интактных кроликах и при экспериментальной коагулопатии

В настоящем разделе работы проводилось исследование специфической фармакологической активности образцов отечественного рекомбинантного активированного фактора VII (рФVIIa), предназначенного для внутривенного введения, и представлен сравнительный анализ активности отечественных образцов рФVIIa с препаратом «НовоСэвен». Исследованные образцы рФVIIa были предоставлены Институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Коагуляционная активность образцов отечественного рФVIIa

Исследовалась коагуляционная активность 14 серий отечественного рФVIIa. Исследования проводили в диапазоне начальных концентраций отечественного рФVIIa в дефицитной по фактору ФVII плазме крови от 1 до 1000 нг/мл. В качестве эталона для сравнения исследуемого параметра использовали разведения препарата «НовоСэвен» в концентрациях, эквивалентных концентрациям отечественного рФVIIa.

Задачей данного исследования явилось выявление серий отечественного рФVIIa которые бы совпадали или были бы максимально близки по значениям времени образования фибринового сгустка под действием препарата «НовоСэвен». По результатам работы было выделено несколько серий отечественного рФVIIa, обладающих сопоставимой фармакологической активностью с препаратом «НовоСэвен». В данную группу вошли серии: 1, 2, 3, 4.

Влияние образцов отечественного рФVIIa на показатели гемостаза в эксперименте ex vivo

Интактным животным внутривенно вводились растворы разных серий отечественного рФVIIa или препарата «НовоСэвен» (вещество сравнения). Доза действующего вещества составляла 90 мкг/кг массы тела. Оценку основных параметров коагулограммы производили спустя 60 минут после инфузии рФVIIa.

В результате проделанной работы выяснилось, что все исследуемые серии отечественного рФVIIa вызывали увеличение активности ФVII (в среднем на 38,8%) и укорочение ПВ (в среднем до 5,4 сек) при их внутривенном введении кроликам в дозе 90 мкг/кг. В тоже время инфузия препарата «НовоСэвен» приводила к сопоставимым сокращениям значений ПВ (до 5,3 сек) и возрастанию активности ФVIIa (на 36,9%) в плазме животных. При этом показатели коагулограммы такие как АЧТВ, тромбиновое время, концентрация фибриногена, число и агрегационныя активность тромбоцитов достоверно не изменялись.

Исследование гемостатической активности отечественных образцов рФVIIa в эксперименте на животных

В данном разделе работы проводилось исследование гемостатической активности четырех серий отечественного ФVIIa. (табл. №2)

Сравнение результатов фармакологического действия четырех серий отечественного рФVIIa показало стойкий гемостатический эффект уже на 30 минуте наблюдения. При этом сокращение времени остановки кровотечения составляло от 34,3 до 57,1%. Через 60 минут после инъекции сокращение времени кровотечения достигало от 48,4 до 55,7%. При анализе результатов объема кровопотери выявлено стойкое уменьшение этого параметра, коррелирующее с сокращением времени остановки кровотечения. Уменьшение объема кровопотери через 30 и 60 минут наблюдения составляло 42,5-64,1% и 52,8-70,8%, соответственно. Показатели времени остановки кровотечения и объема кровопотери отличались при исследовании различных серий рФVIIa, но оставались соизмеримыми с результатами исследования препарата «НовоСэвен».

Таблица №2

Влияние рФVIIa (отечественные образцы, препарат «НовоСэвен») и физраствора на время остановки кровотечения и объем кровопотери в эксперименте на животных, (X±m)

Вводимое вещество	Временные экспериментальные точки
	До введения	30 мин	60 мин	120 мин	180 мин
Время остановки кровотечения, %
рФVIIa серия №1 (n=4)	100	54,6±9,5*	22,8±3,5*	33,1±5,2*	38,4±5,0
рФVIIa серия №2 (n=4)		42,9±8,3*	41,3±9,2	57,1±3,5	68,7±4,0
рФVIIa серия №3 (n=4)		55,9±3,8	51,6±5,3	72,1±6,5	76,2±4,2
рФVIIa серия №4 (n=4)		65,7±9,9	44,3±4,5	62,5±5,6	70,2±7,2
«НовоСэвен» (n=9)		84,9±3,6	54,6±5,2	66,6±6,8	62,0±5,6
Физраствор (n=6)		78,5±6,9	95,7±4,2	92,9±5,5	94,6±7,1
Объем кровопотери, %
рФVIIa серия №1 (n=4)	100	35,9±5,2	33,5±3,5	21,9±4,5	27,6±3,7
рФVIIa серия №2 (n=4)		53,8±8,3*	47,2±4,9	15,8±8,9*	32,7±3,7
рФVIIa серия №3 (n=4)		57,5±6,6	29,2±4,6	37,6±5,5	54,8±8,4
рФVIIa серия №4 (n=4)		55,8±8,6	32,3±5,8	55,2±6,3	44,0±11,4
«НовоСэвен» (n=9)		86,4±3,5	46,8±5,5	44,6±9,1	66,5±13,4
Физраствор (n=6)		73,5±8,5	76,0±7,2	91,2±5,3	95,2±6,3

* - различия значений параметров гемостаза в сравнении со соответствующими значениями в группе экспериментов с применением препарата «НовоСэвен» статистически достоверны при р<0,05

Исследование способности отечественного рФVIIa купировать гепарин-индуцированную гипокоагуляцию

Первой группе животных внутривенно вводили среднемолекулярный гепарин в дозе 500 МЕ/кг. Второй группе наряду с гепарином вводили препарат «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг. Третьей группе помимо гепарина инфузировали отечественный рФVIIa серии №1 в дозе 90 мкг/кг. Для оценки антикоагулянтного действия отечественного рФVIIa использовали такие показатели коагулограммы как АЧТВ и ВСЦК.

В результате эксперимента было отмечено, что до введения веществ статистически значимых различий между средними значениями АЧТВ в сопоставляемых группах не наблюдалось и они составляли 17,2±1,2, 16,6±1,9 и 19,9±1,8 сек, соответственно. В дальнейшем через 30 минут после инъекции гепарина значение АЧТВ в трех группах удлинилось и составляло 176,2-193,7 секунд. Через 60 минут у животных, получивших только гепарин, данный показатель достиг своего максимума и составил 210,4±9,0 сек., в то время как АЧТВ во второй и третьей группе составляло 68,5±5,9 и 111,5±12,3 сек, соответственно. Сокращение данного показателя прослеживалось у второй и третьей группы до 120 минутного интервала эксперимента. Спустя 180 минут после инъекций значения АЧТВ в трех группах сравнялись (21,1-23,1 сек).

Время свертывания цельной крови до инъекций составляло 139-145 сек. После проведения инфузии гепарина венозная кровь животных каждой группы не сворачивалась в течение более 30 минут (1800 сек.). Спустя 60 минут после инъекций первой группе цельная венозная кровь не приобрела способность к свертыванию. В тоже время образцы крови второй и третьей групп животных, образовывали сгусток на 1583±112 и 1521±132 сек, соответственно. Эффект сокращенного ВСЦК проявлялся во второй и третьей группе к 90 минуте наблюдения. При этом значения ВСЦК в первой, второй и третьей группах составили 1562±98, 1269±83 и 1292±78 сек, соответственно. На 120 и 180 минуту наблюдения значения ВСЦК между тремя группами не отличались.

Исследование способности отечественных образцов рФVIIa купировать варфарин-индуцированную гипокоагуляцию

Задачей данного раздела работы было исследование способности отечественного рФVIIa при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг купировать антикоагулянтный эффект, вызванный трехдневным пероральным введением варфарина в дозе 0,15 мг/кг.

В данном исследовании определено ВСЦК и ПВ. В серии острых экспериментов оценивали время остановки кровотечения и объем кровопотери животных с варфарин-индуцированной гипокоагуляцией после внутривенного введения им отечественного образца рФVIIa в дозе 90 мкг/кг.

Рисунок №1

Изменение ПВ после введения отечественного рФVIIa или препарата «НовоСэвен» животным с варфарин-индуцированной гипокоагуляцией

Результаты исследования показали, что при экспериментальной варфарин-индуцированной коагулопатии время свертывания цельной крови увеличивалось с 238±21 секунд до 458±16 секунд, а ПВ – с 9,2±0,2 секунд до 15,8±0,3 секунд.

В результате сравнения значений ПВ при применении отечественного рФVIIa и препарата «НовоСэвен» не было выявлено достоверных различий между ними (Рис. №1). При этом оба вещества сокращали данный показатель до 5,2-5,6 сек. (30 минут после инъекции). Данный эффект сохранялся в обеих группах животных до конца наблюдения (180 мин). Исследование гемостатической активности отечественного рФVIIa при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг животным с варфарин-индуцированной гипокоагуляцией показало, что уже через 30 минут после инъекции происходило сокращение времени остановки кровотечения в 2 раза, что совпадает с данным показателем при применении препарата «НовоСэвен» (2,1 раза). Спустя 60 и 120 минут наблюдения время остановки кровотечения составляло 56,1±6,8% и 54,3±5,9%, а при применении препарата «НовоСэвен» 34,1±4,8 и 30,1±5,5. К концу эксперимента время остановки кровотечения было равно 53,1±6,3%, а при использовании препарата «НовоСэвен» показатель составлял 44,2±3,6% от исходного значения. Также было зафиксировано сокращение объема кровопотери. Так, на интервалах 30, 60 и 120 минут после введения отечественного рФVIIa объем кровопотери сокращался до 36,1±7,5, 45,7±7,3 и 55,7±5,8%, а при использовании препарата «НовоСэвен» данный показатель сократился до 51,5 ± 4,2, 30,9 ± 3,9 и 29,6 ± 5,1 % на соответствующих временных интервалах. Объем кровопотери через 180 минут после инъекций составлял 55,5±4,5% и 24,4±2,0%, соответственно. Таким образом, внутривенная инфузия отечественного рФVIIa животным с варфарин-индуцированной гипокоагуляцией приводила к существенному сокращению как времени остановки кровотечения, так и объема кровопотери.

Оценка местной кровоостанавливающей активности композиций на основе применения факторов свертывания крови и их активаторов

В настоящем разделе работы на раневой поверхности печени кролика исследовалась гемостатическая активность белков крови: тромбина, фибриногена, фибрин-мономера «ООО Технология Стандарт», препарата «НовоСэвен» («Novo Nordisk») и отечественного рФVIIa, изготовленного в Институте Биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Также в данном разделе было проведено исследование гемостатической активности рФVIIa при сочетании его воздействия системно и местно.

Эксперименты по определению гемостатической активности отечественного рФVIIa при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг и местной аппликации в количестве 263 мкг/см2 в остром опыте на животных показали, что через 60 минут после внутривенного введения отечественного рФVIIa время остановки кровотечения сократилось примерно в 2 раза и составляло 123±19 секунды. Местная аппликация на раневую поверхность порошка отечественного рФVIIa в дозе 263 мкг/см2 на фоне введенного внутривенно отечественного рФVIIa в дозе 90 мкг/кг приводила к уменьшению времени остановки кровотечения до 45±10 секунд и резкому снижению объема кровопотери - до нескольких капель крови (Рис. №2).

Рисунок №2

Изменение гемостатического эффекта от сочетания системного и местного воздействия отечественного рФVIIa

Следующим этапом работы явилось проведение сравнительного исследования гемостатической активности препарата «НовоСэвен» и отечественного рФVIIa наносимых в форме порошка на раневую поверхность печени интактного кролика. При аппликации порошка препарата «НовоСэвен» на раневую поверхность в дозе 263 мкг/см2 происходило резкое сокращение времени остановки кровотечения до 25,3% при контроле 100%. В результате местного нанесения порошка отечественного рФVIIa в той же дозе время остановки кровотечения сокращалось до 28%.

При исследовании местной кровоостанавливающей способности аппликаций на основе белков крови, было показано, что нанесение порошка фибриногена в различных дозах на раневую поверхность печени не приводило к выращенному гемостатическому эффекту из-за низкой адгезивной способности, которая не позволяла веществу удерживаться на кровоточащей раневой поверхности, а фиксация вещества марлевой салфеткой оказалась неэффективной. В результате исследования местной гемостатической активности различных порошка тромбина, в дозах соответствующих 125, 250 и 500 NIH в момент нанесения на раневую поверхность смывались током крови и не оказывали влияния на гемостатический эффект. Нанесение на кровоточащую рану печени порошка тромбина 750 и 1250 NIH приводило к быстрому образованию тромбов, но отсутствие фиксирующей основы не позволяло осуществить законченный гемостаз. Фиксация порошка тромбина в дозе соответствующей 500 NIH на ране при помощи марлевой салфетки, приводило к укорочению времени остановки кровотечения в два раза по сравнению с контрольным значением. Увеличение количества тромбина до 625, 750 и 1250 NIH приводило к существенному сокращению времени остановки кровотечения до 42,7±6,4, 33,4±4,0 и 31,4±3,4%, соответственно.

Исследование местного апплицирования порошка фибрин-мономера в дозах 25 и 50 мг/см2 показало низкий гемостатический эффект, так как вещество смывало током крови. Однако, увеличение дозы лиофилизата фибрин-мономера (100, 125, 150, 200 мг/см2) сокращало время остановки кровотечения до 17,3±1,6%, 17,8±1,6%, 16,2±1,0%, 14,9±1,6%, соответственно. В результате проведения эксперимента была отмечена выраженная адгезивная способность фибрин-мономера, которая проявилась эффективным гемостазом без фиксации субстанции на кровоточащей ране. Добавление эпсилон-аминокапроновой кислоты в состав композиции из текстильного носителя и белка крови фибрин-мономера приводило к укорочению времени остановки кровотечения до 12,3±7,2% от контрольного значения.

В следующей группе экспериментов была исследована гемостатическая активность некоторых активаторов свертывания крови, в качестве которых были использованы фирмы «Технология Стандарт». Были исследованы следующие вещества: анцистрон, эхитокс, лебитокс. Анцистрон, обладая тромбиноподобным действием, превращает фибриноген в фибрин, однако при этом отщепляя только фибринопептиды А. Еще одной особенностью является то, что он не активирует XIII фактор свертывания крови и не блокируется антитромбином, а также комплексом «гепарин-антитромбин III». Лебетокс – осуществляет запуск свертывания крови путем активации фактора X. Эхитокс, обладает прямым активирующим действием на протромбин. При этом получившийся тромбин в отличие от физиологического тромбина малоподвержен инактивации гепарином и комплексом «антитромбин III – гепарин».

Это послужило основанием для испытания данных веществ на способность останавливать экспериментальное кровотечение. Однако, выполняя настоящий раздел работы, мы не пытались рекомендовать именно эти вещества как гемостатические средства местного действия. Однако в случае выраженного эффекта какого-либо соединения мы считали бы целесообразным в дальнейшей работе провести испытания кровоостанавливающего действия нетоксичных дериватов этих белков в условиях местной аппликации.

Полученные данные показали, что наибольшим кровоостанавливающим эффектом обладал раствор эхитокса с содержанием вещества 866 мкг/мл, при его использовании время остановки кровотечения составляло 122±12 сек. Вторым по гемостатической активности оказался также раствор эхитокса с меньшим содержанием вещества (4,31 мкг/мл), время остановки кровотечения составляло 185±23 сек. Менее заметное кровоостанавливающие влияние было выявлено при нанесении на рану раствора содержащего 1250 мкг/мл лебитокса. Время остановки кровотечения при аппликации данного раствора на рану печени составляло 192±13 сек. Низким гемостатическим эффектом обладали растворы лебитокса в концентрациях 312,50 мкг/мл и 0,16 мкг/мл, а также растворы, содержащие анцисторон в концентрациях 45 и 2,5 NIH/мл, времена остановки кровотечения соответственно составляли 206±19, 256±21, 248±24 и 262±31 сек, соответственно. Контрольное время остановки кровотечения составляло 278±40 сек.

Выводы:

1. Внутривенное введение препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг интактным кроликам сокращает протромбиновое время свертывания плазмы в 1,6 раза, повышает активность ФVII в плазме крови на 37,5% и на 60 минуте наблюдения сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери соответственно на 45,4% и 53,2%
2. Внутривенное введение отечественного рФVIIa приводит к сокращению значений ПВ в 1,7 раза и возрастанию активности ФVII в плазме животных на 37,7%. Введение отечественного рФVIIa на 30 минуте наблюдения сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери на 45,7% и на 53,3% соответственно
3. Анализ экспериментальных данных in vitro, ex vivo и in vivo показывает, что при внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг отечественный рФVIIa обладает сопоставимой специфической фармакологической активностью с препаратом «НовоСэвен»
4. Препарат «НовоСэвен» и отечественный рФVIIa способны купировать действие гепарина через 60 минут после их введения и устранять антикоагулянтый эффект варфарина, уменьшая время остановки кровотечения и объем кровопотери примерно в 2,5 раза
5. Изучение местного гемостатического действия исследованных нами прокоагуляционных белков показало, что наиболее выраженной способностью к остановке кровотечений обладают фибрин-мономер в дозе 100 мг/см2, фибрин-мономер в сочетании с ЭАКК, отечественный рФVIIa в дозе 263мг/см2 и препарат «НовоСэвен» 263мг/см2, а также раствор эхитокса в концентрации 866 мкг/мл, менее заметным кровоостанавливающим действием обладали растворы анцистрона и лебетокса

Практические рекомендации:

Результаты исследования используются для проведения дальнейших доклинических и клинических испытаний отечественного рФVIIa. Применение белка крови фибрин-мономера самостоятельно или в комплексе с эпсилон-аминокапроновой кислотой, может лечь в основу разработки гемостатической композиции, предназначенной, для остановки паренхиматозных кровотечений при местном применении.

Список печатных работ по теме диссертации:

1. Г.Г. Белозерская, В.А. Макаров, Е.А. Жидков, Л.С. Малыхина, О.А. Сергеева, А.А. Тер-Арутюнянц, Л.В. Макарова. Гемостатические средства местного действия (обзор).// Химико-фармацевтический журнал, 2006, Т.40, №7, С.9-15.
2. Белозерская Г.Г., Васильева Т.М., Тер-Арутюнянц А.А., Макаров В.А., Малыхина Л.С., Сергеева О.А. // Исследование специфической фармакологической активности препарата НовоСэвен в эксперименте // Гематология и трансфузиология, 2007, №3, С.23-27
3. А.А. Тер-Арутюнянц, Г.Г. Белозерская, В.А.Макаров, Т.М. Васильева, Л.С. Малыхина. Оценка гемостатического действия рекомбинантного FVIIa (NovoSeven) в эксперименте // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», тезисы двенадцатого всеросийского съезда сердечно-сосудистых хирургов, Москва, 2006, 28-31 октября, Т.7, №5, С.225.
4. А.А. Тер-Арутюнянц, Г.Г. Белозерская, Т.М. Васильева, А.П. Момот, Л.С. Малыхина, В.А. Макаров. Исследование влияния fVIIa (NovoSeven) на системный и локальный гемостаз. // Материалы научно-практической конференции Сборник статей: «Новое в гематологиии трасфузиологии», Киев, 2006, Выпуск 6, С.129-136.
5. А.А. Тер-Арутюнянц, Т.М. Васильева, Г.Г. Белозерская, А.П. Момот, В.А. Макаров Исследование активности и влияния на тромбоцитарную функцию рекомбинантного fVIIa (NovoSeven) in vitro. Комплексное определение параметров плазменного и клеточного гемостаза ex vivo. // Материалы II международного симпозиума «Гемостаз – проблемы и перспективы», Киев, 2006, 8-9 сентября, С. 219-224
6. Макаров В.А., Белозерская Г.Г., Малыхина Л.С., Малыхина С.Г., Васильева Т.М., Дрозд Н.Н., Петрухина Г.Н., Мифтахова Н.Т., Климанова Е.В., Лапикова Е.С., Сергеева О.А.,Тер-Арутюнянц А.А., Толстенков А.С. Лекарственная регуляция функции гемостаза. // Проблемы патологии системы гемостаза, Барнаул, 2007, стр. 135-139
7. Белозерская Г. Г., Тер-Арутюнянц А.А., Макаров В. А., Сергеева О. А., Малыхина Л. С., Исследование влияния фармакологически активных веществ на местную остановку кровотечения // Материалы III съезда фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г, 1, с. 1607
8. Тер-Арутюнянц А.А., Белозерская Г.Г., Васильева Т.М., Малыхина Л.С., Малыхина С.Г., Сергеева О.А., Макаров В.А. Специфическая фармакологическая активность рФVIIa (НовоСэвен) в условиях экспериментальной гипокоагуляции // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», тезисы двенадцатой ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва, 2008, 18-20 мая, Т.9, №3, С.144.
9. Белозерская Г.Г., Тер-Арутюнянц А.А., Воробъев А.И, Малыхина А.С., Сергеева О.А., Малыхина С.Г., Васильева Т.М., Макаров В.А. Оценка специфической фармакологической активности рекомбинантного активированного фактора VII на моделях экспериментальной гипокоагуляции у кроликов // Гематология и трансфузиология, 2008, №4, С.35-41
10. Тер-Арутюнянц А.А., Белозерская Г.Г., Васильева Т.М., Малыхина Л.С., Сергеева О.А., Макаров В.А. Специфическая фармакологическая активность препарата НовоСэвен в условиях экспериментальной гипокоагуляции // Материалы конференции «Достижения в гематологии и трансфузиологии», 2009, С.47
11. Тер-Арутюнянц А.А., Белозерская Г.Г., Момот А.П., Сергеева О.А., Малыхина Л.С., Васильева Т.М., Васильева Т.М., Макаров В.А. Сравнительное исследование специфической фармакологической активности отечественного рФVIIа и препарата «НовоСэвен» // Материалы четвертой всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечно-сосудистой хирургии», 2009, 4-6 февраля, С. 517