Комплексная оценка репаративного процесса при использовании культуры фибробластов для закрытия раневых дефектов кожи после микрокристаллической дермабразии (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Дорожкина Елена Борисовна

Комплексная оценка репаративного процесса при использовании культуры фибробластов для закрытия раневых дефектов кожи после микрокристаллической дермабразии

(экспериментальное исследование)

14.00.15 – Патологическая анатомия

14.00.11 – Кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва, 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, доцент Колсанов Александр Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Орлов Евгений Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Туманов Владимир Павлович

доктор медицинских наук, профессор Курдина Мария Игоревна

Ведущая организация:

Институт морфологии РАМН

Защита состоится «9» ноября 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «9» октября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор А.И. Щеголев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время количество дефектов кожи, в частности, рубцов вследствие ожогов, операций, порезов, трещин, травм, язв, постакне имеет тенденцию к увеличению (Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003). Высокая популяционная частота рубцовых новообразований, являющихся следствием постоперационных осложнений, ожоговых и механических трав, дерматозов инфекционного и неинфекционного генеза, обеспечивает ежегодный прирост заболеваемости во многих станах мира (Карпова О.И. c соавт., 1988; Sahi W.J. et all., 1994).

Современный клинический опыт мировой и отечественной дерматологии позволяет использовать высокоэффективные, научно-обоснованные подходы к лечению рубцов различного генеза. Наряду с традиционными методами пластической, эстетической и реконструктивно-восстановительной хирургии, в последние годы активно внедряются консервативные методики, основанные на использовании новых медицинских технологий (Адаскевич В.П., 2000; Morelli J.G., 1998; Acland K.M. et all.,2000). Среди множества предлагаемых способов лечения рубцов дермабразия занимает ведущее место из-за значительно меньшего количества рецидивов данной патологии. При дермабразии вместе с эпидермисом удаляется верхняя часть сосочкового слоя дермы, что влечет за собой большие структурные изменения не только в эпидермисе, но и в дерме.

Актуальной является проблема оптимизации заживления раневых дефектов кожи после дермабразии. Применение современных раневых покрытий, обладающих высокими гемостатическими, антимикробными, анестезирующими, сорбционными и некролитическими свойствами позволяет свести до минимума риск возникновения послеоперационных осложнений. Включение в полимерные перевязочные материалы стимуляторов регенерации и эффективных антисептиков расширяет спектр дерматохирургических вмешательств, основным из которых является механическая дермабразия (Фришберг И.А., 1984; Жигульцова Т.И. с соавт., 2000; Fulton J.E., 1996; Harmon D., 2002).

Разработка и внедрение новых высокотехнологичных способов восстановления целостности кожного покрова с использованием клеточных культур фибробластов и кератиноцитов позволяет оптимизировать течение репаративных процессов в ране и снизить риск формирования грубых рубцов, что важно для больных как в хирургической практике, так и в дерматологии (Саркисов Д.С. с соавт., 1995; Туманов В.П., 1999; Алексеев А.А. с соавт., 2002). Фибробласты ускоряют механизм регенерации кожи за счет вырабатываемых ими следующих факторов роста: 1) основной фактор роста фибробластов – влияет на рост всех типов клеток в ране (дерме), стимулирует продукцию внеклеточного матрикса (коллаген, эластин, фибронектин); 2) эпидермальный фактор роста – усиливает пролиферацию и миграцию эпидермоцитов; 3) -трансформирующий фактор роста – активно влияет на ангиогенез; 4) -трансформирующий фактор роста – стимулирует хемотаксис фибробластов и выработку новых волокон коллагена, эластина и фибронектина; 5) фактор роста эпидермоцитов – ускоряет процесс заживления ран; 6) фибробласты продуцируют компоненты внеклеточного матрикса: протеогликаны, хондроитин-4-сульфат, коллагены 4 типов и другие (Васильев А.В. с соавт., 2001).

Таким образом, исследования по комплексному изучению вопросов регенерации при использовании новых высокотехнологичных способов лечения ран после дермабразии являются актуальными и современными.

Цель исследования

Провести комплексную оценку воспалительно-репаративного процесса на модели поверхностных плоскостных ран кожного покрова при использовании культуры аллофибробластов и 3% раствора перманганата калия в эксперименте.

Задачи исследования

1. Создать модель поверхностного плоскостного раневого дефекта кожного покрова за счет применения микрокристаллической дермабразии в эксперименте.
2. Провести сравнительную оценку процессов заживления раневых дефектов кожного покрова при использовании культуры аллофибробластов и 3% раствора перманганата калия после микрокристаллической дермабразии в эксперименте.
3. Изучить в сравнении количественные изменения клеток периферической крови, гистамина и оксипролина при использовании культуры аллофибробластов и 3% раствора перманганата калия после микрокристаллической дермабразии в эксперименте.
4. Создать математическую модель и алгоритм расчета для разработки компьютерной программы оценки и прогнозирования течения раневого процесса.
5. Теоретически обосновать и разработать способ лечения раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии путем применения культуры аллофибробластов.

Научная новизна

Разработана экспериментальная модель поверхностной плоскостной раны кожного покрова после микрокристаллической дермабразии (рац. предл. № 556 от 20.04.2007 г.).

Дополнены морфологические особенности заживления раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии при использовании культуры аллофибробластов на носителе в сравнении с 3% раствором перманганата калия.

Впервые изучены количественные изменения клеток периферической крови, гистамина и оксипролина при использовании культуры аллофибробластов в сравнении с применением 3% раствора перманганата калия после микрокристаллической дермабразии в эксперименте.

Разработана компьютерная программа оценки и прогнозирования течения раневого процесса.

Впервые разработан способ лечения раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии за счет использования культуры аллофибробластов на носителе (рац. предл. № 555 от 20.04.2007 г.).

Практическая значимость

Способ моделирования раневого дефекта кожного покрова путем применения микрокристаллической дермабразии позволяет в 100% случаев получить поверхностную плоскостную рану кожи в эксперименте.

Программа оценки и прогнозирования течения раневого процесса позволяет объективно судить о процессах заживления ран различной этиологии, прогнозировать течение раневого процесса и определять тактику лечения ран в эксперименте и клинической практике.

Внедрение способа лечения раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии за счет использования культуры аллофибробластов на носителе позволит оптимизировать течение репаративных процессов в ране и снизить риск формирования рубцов.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены и обсуждены на III Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), на съезде травматологов и ортопедов России (Самара, 2006), на межвузовских научных конференциях молодых ученых «Аспирантские чтения – 2005» (Самара, 2005), «Аспирантские чтения – 2006» (Самара, 2006); на Международных конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005; 2006); на заседании кафедры дерматовенерологии СамГМУ, кафедры общей хирургии с курсом оперативной хирургии СамГМУ, кафедры патологической анатомии СамГМУ, кафедры гистологии и эмбриологии СамГМУ и Центральной научно-исследовательской лаборатории СамГМУ (Самара, 2005, 2006, 2007).

Внедрение результатов исследования

Способ моделирования раневого дефекта кожного покрова путем применения микрокристаллической дермабразии используется при выполнении экспериментов на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Самарского государственного медицинского университета. Основные положения и выводы работы используются в обучении студентов, клинических ординаторов и интернов, слушателей на кафедрах дерматовенерологии, оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий Самарского государственного медицинского университета. Разработанная программа оценки и прогнозирования течения раневого процесса используется при проведении экспериментов на животных в ЦНИЛ и в клинической практике на базе клиники кожных и венерических болезней Самарского государственного медицинского университета, в центре эстетической медицины «Данне».

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в т.ч. 2 статьи в реферируемом журнале ВАК, получены 2 рационализаторских предложения.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 1 таблицу, 33 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 541 источник, из них 290 отечественных и 251 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Более благоприятное течение раневого процесса при использовании культуры аллофибробластов в сравнении с традиционным лечением 3% раствором перманганата калия в лечении раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии по результатам морфологических, гематологических, биохимических и статистических методов исследований.
2. Высокая эффективность применения культуры аллофибробластов в лечении раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальный раздел работы выполнен на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории СамГМУ (директор – профессор Л.Т. Волова) в рамках научной тематики ЦНИЛ: «Регуляция регенераторных процессов в опорных и покровных тканях организма за счет дифференцированного применения аллогенных тканей, культуры клеток, тканевых компонентов, лекарственных и немедикаментозных факторов воздействия».

В эксперименте на 52 белых лабораторных крысах изучали эффективность культуры аллофибробластов в сравнении с традиционным лечением 3% раствором перманганата калия при лечении поверхностных плоскостных дефектов кожи в межлопаточной области после микрокристаллической дермабразии. Для получения модели плоскостной поверхностной раны площадью 400 мм2 применяли прибор для микродермабразии «Crystal» (Италия). Действие прибора основано на выбрасывании на кожу потока инертных микрокристаллов с высокоабразивными свойствами, контролируемого посредством градуируемого вакуума. На конце наконечника прибора имеется эллиптическое отверстие, при контакте которого с кожей возникает вакуум, направляющий поток микрокристаллов на кожу.

В эксперименте на лабораторных животных после полного выстригания шерсти, обезжиривания 70% раствором этилового спирта проводили глубокое воздействие со шлифовкой на уровне сосочкового слоя.

После получения модели плоскостной поверхностной раны лабораторные животные были разделены на 3 серии. В первой (основной) серии (20 крыс) лечение поверхностных ран проводили культурой аллофибробластов на культуральной подложке (Фолидерм), во второй (серия сравнения) серии (20 крыс) – раневые дефекты лечили 3% раствором перманганата калия (традиционное лечение), в третьей (контрольной) серии (12 крыс) – поверхностные раны заживали самостоятельно «под струпом».

В первой серии на раневой дефект помещали культуру клеток (аллофибробластов) на подложке клеточным слоем вниз, после чего к ране фиксировали рамку и закрывали стерильным перевязочным материалом. Культуру аллофибробластов на подложке для лечения раневых дефектов применяли однократно. Во второй серии раневой дефект обрабатывали 3% раствором перманганата калия, после чего подшивали рамку и закрывали стерильным перевязочным материалом.

Животных во всех сериях выводили из эксперимента передози­ровкой эфира на 3, 7, 14, 21 сутки.

Культуру аллофибробластов получали по стандартной технологии в лаборатории культур клеток ЦНИЛ СамГМУ. Источником клеток в экспериментальном разделе служила кожа лабораторных новорожденных крысят. После фрагментации и ферментативной обработки дермы 0,25% трипсином в течение 15 минут получали первичную культуру фибробластов. Первичную культуру под микробиологическим и морфологическим контролем пассировали. В качестве культуральной среды использовали среду Игла в модификации Дульбенко или среду Игла с двойным набором аминокислот с добавлением антибиотиков, 2% глутамина и 5% эмбриональной сыворотки. Культивирование проводили в условиях абсолютной влажности, при температуре 37°С, 5-6% СО2.

Для трансплантации использовали культуры 4-17 пассажей. Перед трансплантацией на рану клетки пассировали на подложку «Фолидерм». Культура росла и сохранялась на пленке до трансплантации на рану от 1 до 14 суток.

Для оценки результатов экспериментов использовали комплекс методов исследования. Динамику изменений площади раневого дефекта определяли методами раневой планиметрии. Проводили гистологическое исследование кусочков кожи в области дефекта вместе с участками прилегающих интактной кожи и мышц. Серийные парафиновые срезы биоптатов кожи окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон. Эластические волокна выявляли окраской орсеином. Гистологические срезы изучали светооптически и телеметрически с помощью видеокамеры CCD KOCOM KCC-31OPD и светового микроскопа Nicon ALPHAPHOT-2 YS2-H (Japan). По всем сериям и срокам эксперимента было изготовлено и изучено 478 гистологических препаратов. Комплексное морфологическое исследование образцов грануляционной ткани экспериментальных животных включало в себя морфометрическое исследование и светомикроскопическую радиоавтографию. Для проведения количественного анализа подсчитывали на всех сроках лечения число пролиферирующих фибробластов в полях зрения.

Метаболизм коллагена изучали по изменению количественного содержания свободного и белковосвязанного оксипролина в плазме крови по методике Т.В. Замараевой (1977).

Для количественной оценки процессов воспаления в организме лабораторных животных на различные пластические материалы вычисляли содержание гистамина в крови по методике С.А. Мещеряковой (1971).

Цитологическую картину раневого процесса изучали по данным микроскопии мазков-отпечатков по методу М.П. Покровской и М.С. Макарова (1942). Мазки крови, фиксированные в смеси Никифорова, окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимза, определяли лейкоцитарную формулу с подсчетом относительного содержания лейкоцитов.

Статистическая обработка результатов выполнена при помощи пакета статистической обработки STATISTICA 6 ©StatSoft, Inc. (2001).

Первой методикой, примененной к массиву данных, была программа описательной статистики. Были изучены средние величины в группах наблюдения, величины среднего квадратического отклонения. Нормальность распределения наблюдений оценивалась по методикам Шапиро-Вилка, Колмогорова-Смирнова.

Необходимое количество наблюдений определяли по методике Г.П. Котельникова, М.В. Угловой, Б.А. Углова. С учетом данных о нормальности распределения выполняли матричный тест корреляции Пирсона для выявления взаимной корреляции между переменными. Для группировки переменных применяли кластерный анализ методом древовидной кластеризации, а также факторный анализ (Котельников Г.П., Шпигель А.С., 2001).

Результаты исследований и их обсуждение

Заживление раневых дефектов в сравниваемых сериях экспериментов имело сходный качественный характер, но отличалось сроками эпителизации.

При осмотре на 3-и сутки в серии с применением культуры аллофибробластов (основная серия) на дефекте выявляли подложку без признаков воспаления в ране и окружающих тканях. Серозный экссудат определялся в небольшом количестве по краю раны. При цитологическом исследовании в раневых мазках-отпечатках выявляли большое количество фибробластов. Подложка закрывала всю раневую поверхность, поэтому об истинных размерах раны судить было сложно. В серии с использованием 3% раствора перманганата калия и в контрольной серии («без лечения») на дефекте определяли струп, соизмеримый с исходными размерами раны.

При гистологическом исследовании в этот срок выявляли сходную картину, которая заключалась в активном образовании грануляционной ткани в дне раны, регенерации эпителия с краев раны и из базального слоя эпидермиса наружного эпителиального влагалища волосяного фолликула, что подтверждалось при радиоавтографическом исследовании.

Более выраженные репаративные процессы в ране определяли в опытах с аллофибробластами. В грануляционной ткани в основной серии животных выявляли значительное количество капилляров, тяжи веретенообразных фибробластов.

На 3-и сутки в серии с использованием 3% раствора перманганата калия раневая поверхность представлена струпом – безъядерным скоплением разрушенных клеточных пластов, интенсивно окрашенным оксифильно эозином в темно-малиновый цвет. Струп сверху покрыт фибриновым сгустком, окрашенным эозином в бледно-розовый цвет. Под базальным слоем выражена клеточная инфильтрация, представленная как воспалительными явлениями, так и регенераторными. Среди клеток инфильтрата – интенсивно базофильно окрашенные молодые фибробласты, лейкоциты, макрофаги. Сосочки дермы сглажены, уплощены.

Характерной особенностью данного срока является резко выраженный отек всех слоев дермы и глубжележащего слоя подкожно-жировой клетчатки, что проявляется в дерме набуханием и деструктуризацией коллагеновых волокон. На микропрепаратах это выглядит как наличие большого количества бесклеточных и бестканевых пустот между волокнами. Волокна расположены неупорядоченно, хаотично. В глубоких слоях дермы выражено разрушение кожных дериватов – волосяных фолликулов и сальных желез – их структура нарушена, вокруг развит межуточный отек. В глубжележащих мышечных слоях также отмечается межуточный отек – бесклеточные пространства между волокнами, заполненные жидкостью, набухание волокон и нарушение их структуры и хода. Во всех слоях дермы отмечается тромбоз сосудов – их просвет расширен, содержимое представлено рыхлыми безъядерными фибриновыми тромбами, окрашивающимися эозином в розовый цвет. В прилежащих к зоне дефекта участках интактной кожи отмечается резкий контраст между здоровыми участками и поврежденными. Эпидермис здоровых участков имеет нормальную толщину и 5-ти слойное строение, все его слои четко выражены. Клеточной инфильтрации нет. Сосочки дермы хорошо выражены и вдаются в базальную мембрану эпидермиса. Коллагеновые волокна имеют нормальную структуру и расположение, их ход упорядочен, отека не отмечается. Сосуды не расширены.

В опытах с применением культуры аллофибробластов эпителизация раневой поверхности шла более интенсивно по сравнению с серией животных, где местно использовали 3% раствор перманганата калия, и контрольной серией («без лечения»). Количество пролиферирующих фибробластов в основной серии составило 5,1±0,2 (р<0,05), тогда как в серии с использованием 3% раствора перманганата калия – 3,2±0,2 (р<0,05), в контрольной серии – 2,4±0,1.

К 5-м суткам у всех лабораторных животных в опытах с применением культуры аллофибробластов подложку с раны удаляли. На месте раневого дефекта визуально определяли полную эпителизацию без признаков рубцевания.

Гистологически в данной серии животных на 5-е сутки выявляли полное восстановление всех слоев эпидермиса, базальную мембрану, формирующийся сетчатый слой. Толщина эпителия в зоне раневого дефекта приближается к пограничной нормальной толщине эпидермиса. В области регенерата базальная мембрана уплощена, сосочки дермы незначительно сглажены по сравнению с интактными участками кожи. Межуточного отека и клеточной инфильтрации в дерме не выявляется. Молодые коллагеновые волокна интенсивно формируются и созревают. Они имеют нормальную толщину и форму. Среди клеточных элементов в зоне регенерата преобладают молодые фибробласты. Идет активное формирование дериватов кожи – молодых волосяных фолликулов и кожных желез. Они находятся на разных стадиях развития, но волосы и протоки желез еще не достигают поверхности кожи. Выявляются расширенные капилляры во всех слоях дермы – сосуды полнокровны. Подкожно-жировая клетчатка и подлежащие мышечные волокна имеют нормальную структуру и расположение.

При осмотре на 5-е сутки в серии с использованием 3% раствора перманганата калия и контрольной серии при осмотре определяли струп, покрывающий 1/3 - 1/4 площади раны по сравнению с исходными размерами. На участках раны, не покрытой струпом, выявляли эпителизацию раневого дефекта без признаков рубцевания.

При гистологическом исследовании струп состоял из высохшего экссудата, местами со скоплением нейтрофильных лейкоцитов. Под струпом в дне раны выявляли хорошо развитую грануляционную ткань. Под струп на раневую поверхность наползал регенерирующий эпидермис.

В серии с использованием 3% раствора перманганата калия струп отпадал лишь к 7-8 суткам после операции, в контрольной серии струп отпадал на 9-10 сутки. На 7-е сутки в серии с применением 3% раствора перманганата калия при гистологическом исследовании в зоне дефекта отмечается интенсивная регенерация поврежденного эпителия. Его толщина возрастает по сравнению с предыдущим сроком, но всё же значительно меньше нормы. Наиболее выраженными являются два слоя клеток – базальный и роговой. Отмечается наличие раневого струпа, отслаивающегося от поверхности регенерирующего эпидермиса. Струп представлен как безъядерными детритными массами, интенсивно окрашенными оксифильно эозином в темно-малиновый цвет, так и хлопьями и нитями фибрина, окрашенными эозином в бледно-розовый цвет. В области регенерата базальная мембрана уплощена, сосочки дермы значительно сглажены. В дерме под базальной мембраной и в глубжележащих слоях определяется интенсивная клеточная инфильтрация, представленная скоплением пролиферирующих фибробластов, лейкоцитов и макрофагов. Встречаются единичные тучные клетки. В дерме по-прежнему отмечаются явления отека – коллагеновые волокна местами истончены, местами - набухшие и деструктурированные, между ними есть пустоты. Направление их хода и структура нарушены. Также отмечается сохраняющийся незначительный отек подлежащей области дефекта подкожно-жировой клетчатки. В глубоких слоях дермы идёт формирование новых кожных дериватов – отмечаются молодые новообразованные волосяные луковицы и зачатки сальных и потовых желез. Однако все они находятся на ранних стадиях развития – выводные протоки желез не достигают поверхности кожи, волосяные луковицы лишь в зачаточном состоянии, без формирующихся волос. Мышечные волокна в подлежащей зоне регенерата области истончены, хаотично расположены, между ними также присутствуют небольших размеров пустоты, что свидетельствует о легко выраженном отеке эндомизия волокон. Как в зоне регенерата, так и в прилежащих к ней интактных участках кожи встречается множество крупных и мелких тонкостенных сосудов. Их просвет резко расширен, содержит большое количество эритроцитов – отмечается выраженное полнокровие и стаз. По-прежнему отмечается довольно резкий контраст между структурой регенерирующей кожи в зоне раневого дефекта и прилежащими участками здоровой, интактной кожи.

На 14-е сутки в серии с использованием культуры аллофибробластов при гистологическом изучении кожи в области восстановленного дефекта наблюдали все слои эпидермиса, базальную мембрану, сформированные сосочковый и сетчатый слои дермы.

На 14-е сутки в серии с использованием 3% раствора перманганата калия при гистологическом исследовании в зоне дефекта регенераторные процессы практически завершены. Толщина эпителия в зоне нанесения раны возрастает по сравнению с предыдущим сроком, но по-прежнему меньше нормальной. Струпа и наложений фибрина нет. В области регенерата базальная мембрана уплощена, сосочки дермы незначительно сглажены по сравнению с интактными участками кожи. В дерме клеточной инфильтрации нет, межуточного отека не выявляется. Идет интенсивное формирование и созревание молодых коллагеновых волокон. Они имеют нормальную толщину и форму, но их расположение местами упорядочено, местами хаотично. Отмечается общая повышенная клеточность в зоне регенерата – среди клеточных элементов преобладают молодые фибробласты. Идет активное формирование дериватов кожи – молодых волосяных фолликулов и кожных желез. Они находятся на разных стадиях развития, но волосы и протоки желез еще не достигают поверхности кожи. По-прежнему отмечается наличие расширенных капилляров во всех слоях дермы – сосуды полнокровны. Подкожно-жировая клетчатка и подлежащие мышечные волокна имеют нормальную структуру и расположение.

На 14-е сутки в основной серии количество пролиферирующих фибробластов значительно сократилось по сравнению с предыдущим сроком и составляло 0,5±0,1 (р<0,05), тогда как в серии сравнения – 1,2±0,1.

На 21-е сутки в серии с использованием культуры аллофибробластов выявили нормальную гистологическую картину кожного покрова без каких-либо морфологических изменений. Дериваты кожи сформированы. Подкожно-жировая клетчатка и подлежащие мышечные волокна имеют нормальную структуру и расположение. В эти же сроки в серии животных с применением 3% раствора перманганата калия регенерация кожного покрова завершена. Коллагеновые волокна имеют нормальную толщину и форму, их расположение в основном упорядочено. Молодые волосяные фолликулы и кожные железы находятся на разных стадиях развития. Подлежащие слои имеют нормальную структуру и расположение.

Направленность морфологической динамики заживления раневых дефектов после операции дермабразии в третьей серии (без лечения) была схожей с двумя сериями, однако процесс эпителизации раневых дефектов при макро-и микроскопическом исследовании отставал на 2-3 дня от серии лабораторных крыс, у которых местно использовали 3% раствор перманганата калия. В одном наблюдении в контрольной серии выявили инфицирование раны и удлинение срока заживления (через контракцию и рубцевание раны) на 5 дней.

Таким образом, при лечении поверхностных ран после операции дермабразии выявлено достоверно более раннее заживление раневых дефектов под воздействием культуры аллофибробластов по сравнению с серией животных, где применяли 3% раствор перманганата калия. К 5-м суткам в основной серии отмечали макроскопически - полное заживление и отсутствие струпа, при гистологическом исследовании - формирование многослойного плоского эпителия на всей поверхности раны с верификацией всех его слоев и базальной мембраны. Подобную картину в серии сравнения (3% раствор перманганата калия) наблюдали лишь на 7-8 сутки. В последующие сроки при морфологическом исследовании процесс регенерации в серии с использованием культуры аллофибробластов проходил интенсивнее, чем в других сериях, и опережал серию с применением 3% раствора перманганата калия - на 5-7 дней, контрольную серию – на 9-10 дней. Эпителизация ран у лабораторных животных происходила за счет стимуляции пролиферации эпидермиса в придатках кожи и с краев раны.

При радиоавтографическом исследовании на 3, 7-е сутки определяли более высокий уровень (в 2 раза выше) синтеза ДНК в базальных клетках регенерирующего эпителия и высокую пролиферативную активность фибробластов дермы в серии с культурой аллофибробластов по сравнению с серией сравнения.

Динамика изменений содержания свободного и связанного оксипролина во всех опытах носила сходный характер, но имела разную количественную характеристику. Начиная с 3-х суток, во всех сериях отмечали максимальное увеличение свободного оксипролина, что было связано с его выходом в периферическую кровь. Связанный оксипролин на 3-и сутки от начала лечения в опытах снижался. Далее во всех сериях лабораторных животных выявляли уменьшение свободного оксипролина, хотя процессы распада молекул коллагена продолжались, и увеличение связанного оксипролина в связи с усилением регенераторных процессов. В опытах с использованием культуры аллофибробластов свободный оксипролин возвращался к нормальным значениям к 14-м суткам, тогда как в серии с применением 3% раствора перманганата калия и контрольной серией – лишь к 21-м суткам. Увеличение связанного оксипролина к 14-м суткам объяснялось активизацией процессов коллагеногенеза (идет биосинтез молекул коллагена) в ране. Процессы синтеза коллагена были более выражены в опытах с применением аллофибробластов, что подтверждалось более интенсивным ростом связанной фракции оксипролина.

Динамика изменений содержания гистамина в периферической крови во всех сериях носила сходный характер и заключалась в максимальном его увеличении на 3-и сутки. Далее в сериях наблюдали последующее снижение и возвращение к нормальным значениям к 21-м суткам. Однако, если в опытах с применением культуры аллофибробластов изучаемый показатель находился в пределах нормы уже к 14-м суткам, то в серии с использованием 3% раствора перманганата калия – лишь приближался к норме.

Вычисление абсолютного количества лейкоцитов, палочкоядерных лейкоцитов и сегментоядерных лейкоцитов в периферической крови показало, что максимальных значений изучаемые показатели достигали на 3-и сутки. Однако, в опытах с применением культуры аллофибробластов (1-я серия) для лечения раневых дефектов и в серии с использованием 3% раствора перманганата калия (2-я серия) изучаемые показатели начинали снижаться к 7-м суткам, возвращаясь к норме в 1-й серии на 14-е сутки, во 2-й серии – на 21-е сутки. В контрольной серии (3-я серия) значения абсолютного количества лейкоцитов, палочкоядерных лейкоцитов и сегментоядерных лейкоцитов оставались высокими на 14-е сутки и приближались к норме на 21-е сутки.

Динамика изменений процентного содержания лимфоцитов и моноцитов в периферической крови экспериментальных животных во всех сериях носила однонаправленный характер, который заключался в снижении данных показателей. Минимальные значения изучаемых показателей выявляли на 3-и сутки, далее выявляли нормализацию данных показателей: в опытах с аллофибробластами – к 14-м суткам, в серии с использованием 3% раствора перманганата калия и в контрольной серии – к 21-м суткам.

Во всех сериях на все сроки отмечали снижение процентного содержания эозинофилов и базофилов (или не выявляли вообще в периферической крови).

Таким образом, количественные изменения клеток периферической крови при местном лечении поверхностных раневых дефектов после операции дермабразии носили сходный характер. Изучаемые показатели достигали максимальных значений на 3-и сутки, после чего происходила их нормализация. Однако, степень выраженности и сроки полной нормализации показателей крови были различны. В серии с применением аллофибробластов нормализация изучаемых показателей происходила к 14-м суткам, тогда как в серии с применением 3% раствора перманганата калия сравнения и в контрольной серии – лишь к 21-м суткам.

Для изучения нормальности переменных и обоснования выбора методик статистического анализа все изучаемые параметры во все сроки наблюдения были проанализированы с учетом тестов нормальности. Проверка на нормальность проведена для всех рядов данных. Во всех случаях характер распределения соответствовал нормальному. Ошибочных точек, выпадающих из общей закономерности, ни в одной из переменных выявлено не было. Количество значений в выборке определено как достаточное. Таким образом, проведена валидация результатов исследования.

С целью редуцировать количество переменных и определить возможность их группировки, проведен факторный анализ. Выявлена группировка переменных в два достаточных фактора. Первый включает показатели лейкоцитоза, уровень гистамина, площади раны до 14 суток эксперимента, второй – уровень оксипролина, площадь раны позднее 14 суток эксперимента, количество пролиферирующих фибробластов при авторадиографии.

С учетом выделенных при кластерном и факторном анализе группировок определяется четкая смена связей и зависимостей в процессе заживления раны с течением времени и логическое разделение показателей по направлению к двум факторам – условно «воспалительному» и «регенерационному».

Для построения математической модели использована методика системного многофакторного анализа Углова Б.А., Котельникова Г.П., Угловой М.В. (1985) в сочетании с техникой моделирования структурными уравнениями (SEPATH) и метода множественной многомерной регрессии наименьшими квадратами.

При проведении моделирования сформированы два интегральных критерия соответственно описанным выше группировкам при кластерном и факторном анализе. Критерий 1 – «воспалительный» - больше соответствовал показателям цитологии раневого отделяемого. Его значение в большей степени оказывало вклад в длительность очищения раны и длительность преэкспоненциальной фазы планиметрической кривой. Критерий 2 – «регенераторный» - больше соответствовал динамике числа фибробластов, уровню оксипролина. Его значение определяло площадь под планиметрической кривой и в большей степени влияло на скорость заживления раны. Влияние обоих критериев учтено в значении главного интегрального критерия. Каждый критерий пересчитывали в 100-балльную шкалу для упрощения вычислений.

Кроме того, определен коэффициент влияния способа лечения на процесс заживления. Значение коэффициента влияния для контрольной серии установлено в 1,0. При этом коэффициент влияния на фоне применения калия перманганата составил 1,1. Наибольшее значение имеет коэффициент влияния у культуры фибробластов - 3,3, что свидетельствует об ускорении процесса заживления раны при их использовании.

Полученная математическая модель представляет собой группу формул и алгоритмов, позволяющую оценивать и прогнозировать изменение показателей. При подстановке в нее показателей, полученных в ходе эксперимента, она позволяет предсказать течение раневого процесса. Трактовка указанных показателей указывала на направленность патологического процесса и саногенеза, позволяла формулировать экспертное заключение.

Обобщенный интегральный критерий свидетельствовал о течении процесса заживления раны в целом. Переход к первой стадии раневого процесса соответствовал значению обобщенного интегрального критерия 34,6±3,8. Переход ко второй стадии – регенерации – отмечался при значении 58,3±6,8. Эпителизация раневого дефекта наблюдалась при значении обощенного критерия в диапазоне 78,9-84,3 ±6,76. Большое внимание придавали и скорости увеличения раневого интегрального показателя. Прирост показателя на 3,8 единицы в сутки и более свидетельствовал о нормальном течении раневого процесса и позволял прогнозировать, когда будет достигнуто полное заживление раны по формуле , где Тэп – количество дней, максимально необходимое для закрытия язвы, Fn – значение интегрального показателя в день наблюдения, Fn-1 – значение показателя в день накануне.

На основе полученной математической модели для оценки и прогнозирования течения раневого процесса нами разработана компьютерная для изучения регенерации ран кожи и мягких тканей, прогнозирования течения и оценки эффективности их лечения (соавторы Колсанов А.В., Яремин Б.И., Миронов А.А., Золотовицкая Н.Н., Хачатрян А.В.). Исходный алгоритм создан на языке программирования php 5.0 - Zend для любых платформ, поддерживающих php и базы данных MySQL (Linux, Microsoft Windows) и предназначен для ввода полученных цифровых показателей, характеризующих течение заживления раневого дефекта. В основе работы программы лежит использование математической модели, анализирующей взаимоотношения между полученными величинами и рассчитывающей интегральные показатели для конкретной ситуации.

Выводы

1. Разработанная модель плоскостной поверхностной раны позволяет изучать течение раневого процесса у экспериментальных животных и оценивать эффективность различных способов местного лечения после дермабразии.
2. В сравниваемых сериях эксперимента наблюдали общую тенденцию заживления ран, однако в серии с использованием культуры аллофибробластов отмечали уменьшение длительности фазы экссудации, более интенсивный процесс эпителизации ран, высокую пролиферативную активность фибробластов, начиная уже с 3-х суток, что сопровождалось значительным увеличением белковосвязанного оксипролина в периферической крови.

Реэпителизация поверхностных ран кожного покрова при использовании культуры аллофибробластов происходила с образованием полноценного слоя эпидермиса за счет пролиферации базальных эпидермоцитов с краев раны и придатков кожи.

3. Количественные изменения клеток периферической крови и медиатора воспаления – гистамина свидетельствуют о более благоприятном течении раневого процесса в серии экспериментов при местном применении культуры аллофибробластов по сравнению с 3% раствором перманганата калия и контрольной серией.
4. Разработана и внедрена компьютерная программа для ЭВМ, которая путем высчитывания значений интегральных показателей на основе введенных числовых параметров позволяет оценить направленность патологического процесса и прогнозировать течение раневого процесса.
5. Разработанный способ местного лечения раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии с использованием культуры аллофибробластов позволяет сократить сроки эпителизации ран в 1,5 раза, предотвратить вторичную контаминацию и оптимизировать течение репаративных процессов в ране.

Практические рекомендации

1. Разработанный способ местного лечения раневых дефектов кожного покрова после микрокристаллической дермабразии за счет использования культуры аллофибробластов может быть использован в хирургической и дерматокосметологической практике.
2. После микрокристаллической дермабразии трансплантацию культуры аллофибробластов на подложке необходимо проводить на подготовленную рану в условиях операционной без обезболивания.
3. Подложка с культурой аллофибробластов помещается клеточным слоем на раневую поверхность, без образования воздушных пузырей и гематом.
4. Подложка удаляется с раневой поверхности после ее полной эпителизации.
5. В качестве подложки для культуры аллофибробластов может быть применено раневое покрытие Фолидерм.
6. Для оценки и прогнозирования течения раневого процесса, в клинической практике и эксперименте целесообразно применять разработанную компьютерную программу, основанную на кластерном и системном многофакторном анализе данных, полученных с помощью раневой планиметрии, цитологических, бактериологических, бактериоскопических, морфологических, биохимических, гистохимических и дополнительных методов исследования больного или лабораторного животного.
7. О течении процесса заживления раны в целом можно использовать обобщенный интегральный критерий. Переход к первой стадии раневого процесса соответствует значению обобщенного интегрального критерия 34,6±3,8. Переход ко второй стадии – регенерации – отмечается при значении 58,3±6,8. Эпителизация раневого дефекта наблюдается при значении обобщенного критерия в диапазоне 78,9-84,3 ±6,76.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дорожкина Е.Б. Культура фибробластов в лечении раневых дефектов кожи после операции дермабразии / Е.Б. Дорожкина // Аспирантские чтения-2006.- Самара, 2006.- С. 75-78.
2. Дорожкина Е.Б. Изучение заживления ран кожного покрова при использовании культуры фибробластов / А.В. Колсанов, Е.Б. Дорожкина, Н.Н. Золотовицкая // Актуальные проблемы современной науки: Труды 1-го Международного форума.- Самара, 2005.- С. 205-207.
3. Дорожкина Е.Б. Клеточные культуры фибробластов в лечении раневых дефектов кожи / Е.Б. Дорожкина, С.С. Чаплыгин // Актуальные вопросы современной медицинской науки в здравоохранении: Материалы 61-й межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием.- Екатеринбург, 2006.-С. 339-340.
4. Дорожкина Е.Б. Современные подходы в лечении раневых дефектов кожи после операции дермабразии: экспериментальное обоснование / А.В. Колсанов, Е.Б. Дорожкина // Актуальные проблемы современной науки: Труды 2-го Международного форума.-Самара, 2006.- С. 107-110.
5. Дорожкина Е.Б. Оценка эффективности применения культуры фибробластов в лечении раневых дефектов кожи после операции дермабразии в эксперименте / Е.Б. Дорожкина, С.С. Чаплыгин // Науки о человеке: Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2006. - С. 68-69.
6. Экспериментально-клиническая оценка эффективности применения культуры фибробластов / А.В. Колсанов, В.Д. Иванова, Л.Т. Волова, Е.Б. Дорожкина, Н.Н. Золотовицкая // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия: Ежегодник Российской ассоциации клинических анатомов в составе ВНОАГЭ. Приложение к журналу «Морфологические ведомости».- Вып. 6-й.- 2006.-С.69-73.
7. Дорожкина Е.Б. Экспериментальное обоснование применения культуры фибробластов в лечении раневых дефектов кожи / А.В. Колсанов, Е.Б. Дорожкина, А.В. Толстов // Актуальные вопросы современной медицины: Сб. статей и тезисов XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института. - Самара, 2006.- С. 57-59.
8. Дорожкина Е.Б. Клеточные технологии в лечении раневых дефектов кожи после операции дермабразии / А.В. Колсанов, Л.Т. Волова, Е.Б. Дорожкина // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: Материалы III Всероссийского симпозиума с международным участием. – М., 2007.- С 26-27.
9. Клеточные культуры фибробластов в лечении раневых дефектов и рубцовых деформаций кожи в эксперименте / А.В. Колсанов, Л.Т. Волова, В.Д. Иванова, Е.В. Орлов, Е.Б. Дорожкина, Н.Н. Золотовицкая // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия: Ежегодник Российской ассоциации клинических анатомов в составе ВНОАГЭ. Приложение к журналу «Морфологические ведомости».- Вып. 7-й. - 2007.-С. 17-23.
10. Дорожкина Е.Б. Оценка эффективности использования культуры фибробластов в лечении раневых дефектов кожи после дермабразии / А.В. Колсанов, Е.В. Орлов, Е.Б. Дорожкина // Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику: Материалы дистанционной научно-практической конференции. - Пермь, 2007. - С. 92 – 94.

Рационализаторские предложения

1. Способ лечения раневых дефектов кожного покрова с использованием культуры фибробластов после микрокристаллической дермабразии / А.В. Колсанов, Е.Б. Дорожкина, С.С. Чаплыгин // Уд. рац. предл. №555 от 20.04. 2007 г., выд. Самарским государственным медицинским университетом.
2. Способ моделирования раневого дефекта кожного покрова путем применения микрокристаллической дермабразии / А.В. Колсанов, Е.Б. Дорожкина, С.С. Чаплыгин // Уд. рац. предл. №556 от 20.04.2007г., выд. Самарским государственным медицинским университетом.

Подписано в печать 05.10.2007.

Формат 6084/16. Бумага офсетная. Печать оперативная.

Объем 1,0 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 936.

Отпечатано с готового оригинал-макета

в типографии ООО «Офорт»

443068, г. Самара, ул. Межевая, 7.

Лицензия ПД 7-0050 от 30.08.2000 г.

Тел. 335-37-01, 335-37-45