К ардиоваскулярные свойства гетерилсодержащих окс и мов гексагидробензофуранонов
На правах рукописи
Волотова елена владимировна
Кардиоваскулярные свойства гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов
14.00.25 фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Волгоград 2009
Работа выполнена на кафедре фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Тюренков Иван Николаевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Мирзоян Рубен Симонович
доктор медицинских наук, профессор
Косолапов Вадим Анатольевич
Ведущая организация: Саратовский государственный медицинский
университет
Защита состоится «_____»____________2009 г. в __________часов
на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1
Автореферат разослан «_____»_______________2009 г.
Ученый секретарь
Диссертационного Совета,
доктор медицинских наук,
профессор А.Р.Бабаева
Актуальность проблемы
Заболевания сердечно-сосудистой системы являются ведущей причиной ранней инвалидизации и преждевременной смертности трудоспособного населения как в России, так и во всем мире. На сегодняшний день от сердечно-сосудистых заболеваний умирает больше людей, чем от каких-либо других болезней. В России распространенность сердечно-сосудистых заболеваний, включая ИБС, артериальную гипертензию, различные нарушения сердечного ритма, неуклонно растет, а по смертности от них наша страна находится на одном из первых мест в мире. В настоящее время существует большой выбор антиангинальных, противоаритмических и антигипертензивных препаратов. Однако, несмотря на широкий выбор лекарственных средств, у большинства из них имеется значительное количество нежелательных эффектов. Таким образом, проблема поиска и создания новых лекарственных средств для профилактики, фармакологической коррекции и лечения сердечно-сосудистых заболеваний продолжает оставаться одной из центральных в современной фармакологии. С этой точки зрения наше внимание привлекла группа соединений бензофуранового ряда, поскольку они обладают высокой биологической активностью, большой широтой фармакологического действия.
Цель исследования – провести целенаправленный поиск среди гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов веществ с кардиоваскулярными свойствами и изучить возможные механизмы их специфического действия.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние новых производных бензофуранонов на кардиогемодинамические показатели и показатели вариабельности сердечного ритма.
2. Изучить противоишемическое действие новых производных бензофуранонов на модели 30-минутной окклюзии нисходящей ветви левой коронарной артерии. Оценить их влияние на функциональное состояние очага ишемии (ФСОИ) миокарда в сравнении с эталонными препаратами.
4. Провести поиск веществ с антиаритмическими свойствами среди гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов на реперфузионной, аконитиновой и хлоридкальциевой моделях нарушения сердечного ритма в сравнении с эталонными препаратами.
5. Изучить кардиопротекторное действие наиболее активного соединения при стрессорном повреждении миокарда.
6. Провести изучение возможного кардиогемодинамического механизма кардиоваскулярного действия наиболее активного вещества (влияние на основные показатели кардио- и гемодинамики, микроциркуляцию).
7. Изучить его симпатикотропные эффекты, влияние на эндотелиальную функцию, гемореологические показатели, перекисное окисление липидов и антиоксидантное действие.
Новизна исследования. Впервые проведен скрининг в ряду гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов по противоишемической, антиаритмической, антигипоксической активности, по влиянию на вариабельность сердечного ритма. Проведен анализ зависимости химической структуры и кардиоваскулярного действия.
Выявлено соединение РГПУ-201, оказывающее выраженное антиангинальное и кардиопротективное действие в условиях стрессорного повреждения миокарда. Изучено влияние соединения РГПУ-201 на основные показатели кардио- и гемодинамики, микроциркуляцию, эндотелиальную функцию, гемореологические свойства. Показано, что в основе кардиотропного действия РГПУ-201 лежит его влияние на центральные симпатические структуры, а также незначительное -адренолитическое действие, антигипоксические и антиагрегантные свойства, способность подавлять процессы ПОЛ, улучшать микроциркуляцию.
Научно-практическая ценность работы. Полученные данные о кардиоваскулярных свойствах, а также связи химической структуры и фармакологического действия позволили рекомендовать химикам-синтетикам продолжить целенаправленный синтез и поиск в ряду производных оксимов бензофуранонов веществ с биологической активностью, в частности кардиопротекторным действием. Выявленное соединение РГПУ-201 обладает высокой кардиопротективной активностью при ишемическом, аритмогенном и стрессорном повреждении миокарда и является перспективным для дальнейшего углубленного изучения и разработки на его основе нового лекарственного средства для лечения ИБС.
Положения, выносимые на защиту:
- Новые гетерилсодержащие оксимы гексагидробензофуранонов обладают противоишемическими свойствами при транзиторной окклюзии левой коронарной артерии, оказывая сопоставимое с препаратами сравнения амиодароном и верапамилом или превосходящее их действие.
- Соединение РГПУ-201 на различных моделях нарушения ритма обладает антиаритмическими и противофибрилляторными свойствами.
- Соединение РГПУ-201 оказывает кардипротективное действие при стрессорном повреждении миокарда.
- Механизм действия соединения РГПУ-201 обусловлен центральным симпатикотропным, антиагрегантным, антиоксидантным, эндотелиопротективным действием.
Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на 66-ой и 67-ой открытой итоговой конференции студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2008, 2009), представлялись на XV, XVI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2008, 2009), III и IV Международных (XII, XIII Всероссийских) Пироговских научных медицинских конференциях (Москва, 2008, 2009), IX Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Владивосток, 2008). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работы.
Структура и объем диссертации:
Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, обсуждение результатов, научно-практические рекомендации, выводы, список литературы, содержащий 177 источника, из них 73 отечественных и 104 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и содержит 12 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнено на 392 белых крысах-самцах и 112 белых мышах. В настоящем исследовании изучены кардиоваскулярные свойства 7 гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов под лабораторными шифрами: РГПУ-201, РГПУ-209, РГПУ-210, РГПУ-211, РГПУ-212, РГПУ-213 и РГПУ-214. Все вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия)[1]. Скрининг осуществлен с применением доз, составляющих 1/10 от молекулярной массы (мг/кг): РГПУ-201 – 24 мг/кг; РГПУ-209 – 32 мг/кг; РГПУ-210 – 34 мг/кг; РГПУ-211 – 42 мг/кг; РГПУ-212 – 30 мг/кг; РГПУ-213 – 31 мг/кг; РГПУ-214 – 39 мг/кг. В качестве препаратов позитивного контроля на различных этапах исследования использовались: амиодарон – 1,5 мг/кг (Sanofi Winthrop Industrie, Бельгия), обзидан – 0,25 мг/кг (Isis Pharma, Германия), верапамил – 0,25 мг/кг (ОАО «Биосинтез», Россия), новокаинамид – 40 мкг/кг (Ферейн, Россия), фенибут – 25 мг/кг (синтезирован на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им.А.И.Герцена, Санкт-Петербург, Россия), сулодексид 30 ЛЕ (Аlfa Wassermann, Италия).
Изучение влияния исследуемых соединений на кадиогемодинамические показатели и показатели вариабельности сердечного ритма выполнено на наркотизированных крысах (этаминал-натрия 40 мг/кг в/бр). Измерение артериального давления (АД) производилось фотоплетизмографическим методом с хвоста крысы с помощью монитора давления и с использованием оригинального пакета компьютерных программ. Запись ЭКГ во II стандартном отведении и реограммы проводилась с помощью реографа 4РГ-2М и с использованием оригинального пакета компьютерных программ. Анализ показателей вариабельности сердечного ритма (ВСР) проводился по данным ЭКГ, записанным во II стандартном отведении, использовались следующие характеристики: ЧСС – частота сердечных сокращений, SDNN — стандартное отклонение временного ряда кардиоинтервалов, Мо – мода – наиболее часто встречающаяся величина RR интервалов в исследуемый период времени, АМо – амплитуда моды – ее процентное значение, ВАР – вариационный размах – разница между максимальными и минимальными значениями RR интервалов, ИВР – индекс вегетативного равновесия.
Изучение продолжительности биоэлектрической активности сердца при выключении дыхания животных проводилось с помощью внутривенного введения дитилина мышам-самцам (Овсянникова С.Ю., 1978). О продолжительности электрической активности сердца судили по длительности сохранения биопотенциалов сердца во II стандартном отведении на электрокардиограмме после остановки дыхания (Торкунов П.А., Сапронов Н.С., 2000).
Моделирование острой коронарной недостаточности и постишемической реперфузии проводили на наркотизированных крысах (этаминал-натрия 40 мг/кг в/бр) при 10-ти и 30-ти минутной окклюзии нисходящей ветви левой коронарной артерии (НВЛКА) на границе ее верхней и средней трети. О влиянии изучаемых соединений и препаратов сравнения на функциональное состояние очага ишемии судили по динамике ST сегмента на ЭКГ, записываемой во II стандартном отведении.
Антиаритмическое действие гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов изучали в условиях ишемического и реперфузионного повреждения миокарда, на аконитиновой и хлоридкальциевой моделях аритмий.
Моделирование аконитиновой модели нарушения ритма воспроизводили путем внутривенного введения нитрата аконитина в дозе 40 мкг/кг наркотизированным крысам (по методу, описанному Н.В. Кавериной и З.П. Сеновой (1981)).
Хлоридкальциевую аритмию вызывали внутривенным введением хлорида кальция в дозе 200 мг/кг (Бердяев С.Ю., 1992).
Острая токсичность изучена в соответствии с общепринятыми рекомендациями (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005). Для расчета ЛД50 был использован пробит-анализ выживаемости.
Исследование кардиопротективного действия наиболее активного соединения проводилось в условиях острого эмоционально-болевого стресса, вызываемого путем подвешивания животных за дорсальную шейную кожную складку длительностью 24 часа (Островский О.В., Дудченко Г.П., 1985). О выраженности общего стрессорного воздействия на организм животного судили по состоянию триады стрессорного повреждения (изменение массы вилочковой железы и надпочечников, эрозивно-язвенное поражение слизистой оболочки желудка (Перцов С.С., 1995)).
Кардиопротекторное действие веществ оценивали по влиянию их на хроно- и инотропные резервы сердца, выявляемые при помощи функциональных проб: нагрузка объемом; проба на адренореактивность (введение адреналина в разведении 10-7 г/мл из расчета 0,1 мл/100г массы животного); максимальная изометрическая нагрузка(Тюренков, И.Н. и др., 1980) С помощью компьютерного гемодинамического анализатора на базе программы BEAT регистрировались следующие показатели кардиодинамики: левожелудочковое давление (ЛЖД), скорость сокращения и скорость расслабления миокарда (dр/dt+, dр/dt-), частота сердечных сокращений (ЧСС). Максимальная интенсивность функционирования структур миокарда (МИФС) рассчитывалась по формуле: ЛЖД х ЧСС/масса левого желудочка (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005).
Показатели микроциркуляции в сосудах брыжейки животных после стрессорного воздействия регистрировали при помощи ультразвукового допплерографа «Минимакс-Допплер-К» (ООО «СП-Минимакс», г. Санкт-Петербург).
Влияние соединения РГПУ-201 на эндотелиальную дисфункцию, вызванную острым стрессорным воздействием, оценивали по изменению тонуса сосудов мозга при модификации синтеза эндогенного оксида азота и регистрации кровотока ультразвуковым допплерографом «Минимакс-Допплер-К» (ООО «СП-Минимакс», г. Санкт-Петербург). Все тест системы вводили внутривенно: ацетилхолин в дозе 0,01 мг/кг (Acros organics, США), нитро-Л-аргинин в дозе 10 мг/кг (Acros organics, США), Л-аргинин в дозе 300 мг/кг (Acros organics, США), нитроглицерин в дозе 0,007мг/кг (Институт новых технологий РАМН, Россия). Антитромботическую функцию эндотелия оценивали по времени тромбообразования в общей сонной артерии, при аппликации на ее стенку 50% хлорида железа, и регистрации кровотока до полного прекращения тока крови. Дополнительным показателем стресспротекторного действия служила осмотическая резистентность эритроцитов.
Изучение агрегации тромбоцитов проводили на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель ЛА230-2) научно-производственной фирмы «Биола» (г. Москва) по методу Born G в модификации Габбасова З.А. и соавторов (Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. и др., 1989).
Исследование системы функционального состояния гемостаза и фибринолиза после ишемически-реперфузионного повреждения миокарда проводилось с помощью нового инструментального метода с использованием анализатора реологических свойств крови АРП-01 «МЕДНОРД», который обеспечивал автоматическую регистрацию параметров процесса свертывания крови и ее фибринолитической активности (Актуальные проблемы клинических исследований агрегантного состояния крови, 2000).
Вязкость крови определяли на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия), при скорости сдвига 10-300с-1. Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации, рассчитываемому как отношение вязкости крови при скорости сдвига 10с-1 к вязкости крови при 300 с-1 (Dintenfass L., 1989).
Оценка возможного механизма кардиоваскулярного действия проведена с использованием различных агонистов рецепторов сердечно-сосудистой системы: 1-,2- адреномиметика – изадрина (в дозе 5 мг/кг), -,- адреномиметика – норадреналина (2 мкг/кг), дофамина (в дозе 20 мкг/кг), который стимулирурует периферические дофаминовые рецепторы и опосредованно - и -адренорецепторы, М-,Н-холиномиметика – ацетилхолина (в дозе 0,01 мг/кг) (Харкевич Д.А., 2005).
Центральное симпатотропное действие исследовали в условиях стимуляции седалищного нерва и регистрации изменений артериального давления (Хаютин В.М., 1964). Артериальное давление регистрировалось с помощью компьютерного гемодинамического анализатора на базе программы ВЕАТ (Москва, Россия).
Для изучения периферической компоненты симпатотропного действия соединения регистрировалось, вызванное стимуляцией поясничной симпатической цепочки ниже уровня L4, изменение кровотока в мышце бедра. Регистрацию кровотока осуществляли при помощи ультразвукового допплерографа «Минимакс-Допплер-К» (ООО «СП-Минимакс», г. Санкт-Петербург). Раздражение седалищного нерва и поясничной цепочки осуществлялось с помощью электростимулятора ЭСЛ -2, Россия.
Пресинаптическое симпатикотропное и адреноблокирующее действие оценивалось по изменению АД, измеряемому с помощью компьютерного гемодинамического анализатора на базе программы ВЕАТ (Москва, Россия), на введение тирамина.
Изучение противогипоксической активности соединений проводилось с использованием модели острой генерализованной гипоксии: нормобарической гипоксии с гиперкапнией и гемической гипоксии, вызванной нитритной интоксикацией (нитрит натрия 250 мг/кг подкожно) (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000)
Влияние соединения РГПУ-201 на выраженность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантного статуса изучали на крысах самцах в условиях нормы и при окклюзии НВЛКА. Интенсивность ПОЛ исследовали по содержанию первичных - диеновых коньюгатов (ДК) и вторичных - малонового диальдегида (МДА) продуктов ПОЛ. Содержание ДК оценивали по поглощению УФ-излучения при 232 нм (Ушкалова В.Н., Иоанидис Н.В., Кадочникова Г.Д., 1993 г.). МДА определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Андреева М.М., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А., 1988 г.). Для характеристики антиоксидантного статуса спектрофотометрически измеряли активность ферментов супероксидисмутазы (СОД), каталазы при длине волны 406 и 410 нм соответственно (Костюк В.А., 1990г.).
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни, критерия Фишера, методом однофакторного дисперсионного анализа, критериев Стьюдента с поправкой Бонферрони, критерия Ньюмена-Кейсла, пробит-анализа выживаемости. Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Excel XP, STATISTICA 6.0, BioStat 2008 5.2.5.0. Статистически значимыми расценивались эффекты при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
В результате проведенных скрининговых исследований среди гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранона были выявлены соединения РГПУ-201, РГПУ-209, РГПУ-211, РГПУ-213 положительно влияющие на состояние гемодинамики.
Установлено, что соединение РГПУ-201 в дозе 24 мг/кг вызывало к 30 мин после окончания его введения постепенное снижение ЧСС на 12%, увеличение ударного выброса (УОК) и минутного объема крови (МОК) соответственно на 34% и 17%, при этом общее периферическое сопротивление сосудов (ОПСС) снижалось на 17%. К 60-й мин наблюдения все регистрируемые показатели гемодинамики практически вернулись к исходному состоянию.
Введение соединения РГПУ-209 в дозе 32 мг/кг приводило к незначительному урежению ЧСС (на 8%), снижению АД на 9% (на 30-й мин) за счет уменьшения ОПСС (на 28%) на фоне значительного роста УОК (на 35%). МОК увеличился на 26%.
После введении соединения РГПУ-211 в дозе 41 мг/кг через 60 мин отмечалось постепенное снижение АД (на 12%), ЧСС (на 13%) и увеличение УОК (на 28%), МОК (на 13%), ОПСС при этом снижалось на 19% от фоновых значений.
Соединение РГПУ-213 в дозе 31 мг/кг вызывало снижение АД (на 11%) на фоне брадикардии (на 15%), повышения УОК (на 18%) и снижения ОПСС (на 11%) в течении первых 30 мин. МОК достоверно не отличался от фоновых значений.
При исследовании влияния производных бензофуранона на показатели ВСР обнаружены соединения, влияющие на состояние симпатической и парасимпатической нервной системы. Установлено, что после введения исследуемых соединений достоверно по сравнению с исходным состоянием возрастали следующие показатели: SDNN (у крыс, получавших РГПУ-201 на 22%, РГПУ-211 на 18-32%, РГПУ-212 – на 12%, РГПУ-213 – на 32%), что может свидетельствовать о снижении активности симпатической нервной системы. Тогда как, у животных, получавших РГПУ-214, SDNN снизился на 21% от исходного уровня, что говорит об уменьшении активности парасимпатического отдела нервной системы. Мода (Мо) увеличилась по сравнению с исходными значениями на 13% при введении РГПУ-201, на 18% при введении РГПУ-211, на 15 % при введении РГПУ-213; амплитуда моды (АМо) уменьшалась на 23%, 11% у животных, получавших РГПУ-201, РГПУ-213 соответственно, что также показывает на снижение активности симпатического отдела автономной нервной системы, и увеличивалась на 17% по сравнению с исходным уровнем при введении РГПУ-214, что свидетельствует о повышении симпатического влияния на сердце крыс; вариационный размах (ВАР) повышался по сравнению с исходным состоянием при введении РГПУ-201, РГПУ-211, РГПУ-212, РГПУ-213 максимально на 23%, 30%, 25%, 38%, соответственно. Полученные данные свидетельствовали об увеличении на фоне введения РГПУ-201, РГПУ-211, РГПУ-213 и меньшей степени РГПУ-212 тонуса парасимпатического отдела нервной системы, а также уменьшении симпатические влияния на сердце крыс. Такой сдвиг вегетативной регуляции сердечной деятельности может способствовать росту резервов миокарда, что имеет большое значение при лечении больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
В ходе проведенного исследования было выявлено, что изучаемые вещества в различной степени влияют на переживаемость миокарда в условиях аноксии (таб. 1).
Таблица 1.
Влияние соединений на продолжительность биоэлектрической активности сердца в условиях асфиксии
| Соединения (n=8) | Доза мг/кг | ПЭА, сек. (М ± m) | % |
| Контроль | - | 382±22,91 | - |
| РГПУ-201 | 24 | 655±24,13* | 171,4% |
| РГПУ-209 | 32 | 507±26 | 132,6% |
| РГПУ-210 | 34 | 586±23,36* | 153,2% |
| РГПУ-211 | 41 | 529±26,07* | 138,5% |
| РГПУ-212 | 30 | 584±21,65* | 152,7% |
| РГПУ-213 | 31 | 589±16,57* | 154,2% |
| РГПУ-214 | 38 | 431±24,83 | 112,7% |
Примечание: ПЭА– продолжительность биоэлектрической активности сердец животных в условиях асфиксии, вызванной введением дитилина; * - p<0,05,– достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных (непараметрический U-критерий Манна-Уитни)
Практически все изучаемые вещества, за исключением РГПУ-214, значительно увеличивали продолжительность биоэлектрической активности сердца, но наиболее выраженное действие в условиях аноскии оказывало соединение РГПУ-201.
При изучении влияния гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов на функциональное состояние очага ишемии также были выявлены соединения, оказывающие выраженное антиангинальное действие (рис.1).
 | Рис. 1. Изменение площади под кривой ST сегмента под влиянием исследуемых соединений, амиодарона и верапамила. Обозначения:* р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы |
Наибольшая противоишемическая активность отмечалась у соединений РГПУ-201 > РГПУ-213 > РГПУ-212, которые в значительной мере уменьшали подъем ST- сегмента в условиях 30-ти минутной окклюзии нисходящей ветви левой коронарной артерии и способствовали более быстрому возвращению показателей ST сегмента к фоновым значениям при реперфузии. По антиишемическому действию соединение РГПУ-201 превосходило амиодарон и незначительно уступало верапамилу.
При изучении зависимости противоишемического действия от дозы было установлено, что максимальный эффект наиболее активное соединение – РГПУ-201 оказывает в дозе 24 мг/кг, при этом по силе действия незначительно превосходит или оказывает сопоставимое действие с препаратами сравнения амиодароном, обзиданом и верапамилом. Минимальная его ЕД20 составила 7 мг/кг, ЕД 40 – 24 мг/кг, ЛД50 – 717мг/кг, ТИ – 102 и 30, соответственно.
При скрининговом исследовании антиаритмической и противофибрилляторной активности среди производных бензофуранонов в условиях ишемического и реперфузионного повреждения миокарда, на аконитиновой и хлоридкальциевой моделях аритмий было установлено, что только соединение под лабораторным шифром РГПУ-201 оказывало умеренное противоаритмическое действие, несколько уступающее, препаратам сравнения. Все другие соединения выражено уступали препаратам позитивного контроля (обзидану, новокаинамиду, верапамилу, амиодарону).
Таким образом, скрининговые исследования показали, что соединение РГПУ-201 является более перспективным для дальнейшего углубленного изучения.
Учитывая тот факт, что эмоциональный стресс является одним из факторов риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, а также может усугублять их течение, было проведено изучение кардиопротекторного действия соединения РГПУ-201 в условиях стрессорного воздействия.
Первоначально проведенный анализ триады стрессорного воздействия у крыс после иммобилизационно-болевого стрессирования показал, что РГПУ-201 в значительной мере уменьшает выраженность гипертрофии надпочечников и инволюции тимуса и предупреждает стрессорное повреждение слизистой оболочки желудка (таб. 2).
Таблица 2.
Влияние РГПУ-201 и фенибута на выраженность стрессобусловленных морфосоматических нарушений («стрессорной триады») у животных в условиях острого стресса
| Группы | Относительный коэффициент массы органов мг/100г веса животного (М±m) | Степень язвенного поражения слизистой оболочки желудка | |
| надпочечники | тимус | ||
| Контроль-интакт (n=6) | 17,1±1,02 | 77,5±8,83 | 0,17±0,17 |
| Контроль-стресс + физ. р-р (n=6) | 23,9±1,36 (39,9%) | 54,2±2,18 (-30,1%) | 1,83±0,31 |
| Контроль-стресс + РГПУ-201 (n=6) | 20,6±0,88* (20,2%) | 67,2±2,54** (-13,4%) | 1,17±0,31 |
| Контроль-стресс + Фенибут(n=6) | 19,3±0,46** (12,9%) | 67,8±3,12** (-12,6%) | 0,83±0,17* |
Примечание: *- р<0,05; **-р<0,01 – достоверность различий по сравнению со стрессированной контрольной группой (непараметрический U-критерий Манна-Уитни).
Исследование кардиопротекторного действие РГПУ-201 с использованием функциональных проб в условиях острого иммобилизационно-болевого стресса показало, что в ответ на введение нагрузки объемом, адреналина, а также в условиях пережатия восходящей части дуги аорты, у животных, получавших РГПУ-201 и фенибут отмечается более выраженное повышение внутрижелудочкового давления, скорости сокращения и скорости расслабления миокарда, по сравнению со стрессированными животными, получавшими физиологический раствор (рис.2).
Кроме этого, максимальная интенсивность функционирования структур миокарда (МИФС) была выше у крыс, получавших исследуемые соединения, чем у животных контрольной группы стрессированных животных. Так в группе интактных животных данный показатель составил 91±5,09, в контрольной группе – 74,4 ±4,68, а в группах получавших РГПУ-201 и фенибут, соответственно, 87,5±3,04 и 90,1 ±4,14 мм рт. ст. х уд. мин-1 х мг-1.
При изучении влияния соединений на скорость кровотока в брыжеечных сосудах было выявлено, что показатели микроциркуляции были выше у животных, получавших РГПУ-201 и фенибут, по сравнению со стрессированными крысами контрольной группы (рис.3).
А Б В
Рис.2. Динамика показателей сократимости миокарда у животных, подвергшихся стрессорному воздействию в условиях нагрузки объемом (А), адреналином (Б) и максимальной изометрической нагрузки (В).
Обозначения: # -данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05 в сравнении с группой стрессированных животных
Рис. 3. Изменения параметров микроциркуляции у стрессированных животных.
Обозначения: Vam- средняя линейная скорость см/сек, Qam – соответствующая им объемная скорость кровотока мл/мин; # - данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; * -данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05 в сравнении с группой стрессированных животных.
Возможно этот эффект связан с предупреждением дисфункции эндотелия (рис.4). Используя комплексный подход в оценке эндотелиальной дисфункции, по данным функционирования NO-синтазной активности, включающий регистрацию реакции сосудов мозга на введение ацетилхолина, Л-аргинина и нитро-L-аргинина, установлено, что в условиях стресса, у животных, получавших РГПУ-201, отмечался больший прирост кровотока в ответ на введение ацетилхолина и большее его падение на введение нитро-Л-аргинина.
Рис.4. Динамика церебрального кровотока при модификации выделения и синтеза эндогенного оксида азота у интактных и стрессированных животных.
Обозначения: АЦХ – введение ацетилхолина; Л-арг – введение L-аргинина; НТГ-введение нитроглицерина; Н-Ларг –введение нитро-L-аргинина; стресс – животные повергшиеся стрессу, получавшие физиологический раствор, Стресс + РГПУ-201 – стрессированные животные, получавшие РГПУ-201, Стресс+сулодексид - стрессированные животные, получавшие сулодексид, интакт – интактные крысы; * p<0,05 в сравнении с показателями стрессированных животных
Возможно лучшие показатели микроциркуляции у животных, получающих соединение РГПУ-201 и фенибут, в сравнении с контрольной стрессированной группой, связаны с их антиагрегантными свойствами, выявленными как при аппликации 50% хлорида железа на адвентицию сонной артерии, так и при исследовании АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (рис.5).
 | Рис. 5. Влияние РГПУ-201 и фенибута на агрегацию тромбоцитов у стрессированных крыс. Обозначения: # - данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; * -данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05 в сравнении с группой стрессированных животных |
При изучении возможных нейромедиаторных механизмов кардиоваскулярного действия соединения РГПУ-201 с использованием различных агонистов рецепторов сердечно-сосудистой системы (изадрина, норадреналина, дофамина, ацетилхолина) было установлено, что соединение РГПУ-201 частично блокировало снижение артериального давления и увеличение частоты сердечных сокращений, вызываемые изадрином (рис.6), и не оказывало влияния на эффекты норадреналина, дофамина, ацетилхолина.
А.   | Б.  |
| Рис.6. Изменение среднего гемодинамического давления (А) и частоты сердечных сокращений (Б) после введения изадрина у крыс контрольной группы и получавших РГПУ-201. | |
В ходе проведенного исследования симпатикотропного действия соединения РГПУ-201 в условиях стимуляции седалищного нерва и регистрации изменений артериального давления было установлено, что после введения соединение РГПУ-201 степень повышения АД снизилась на 40%, что очевидно обусловлено его центральным симпатоингибирующим действием (рис.7).
 | Рис.7. Изменение степени повышения АД при раздражении седалищного нерва. Обозначения: * p<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы  |
Для исключения ганглионарного и периферического симпатолитического действия соединения РГПУ-201 было выполнено исследование с раздражением поясничной симпатической цепочки и с введением тирамина. Установлено, что соединение РГПУ-201 не влияло на степень снижения кровотока при раздражение поясничной симпатической цепочки, а также на изменения АД вызванного введением тирамина. Эти данные свидетельствуют об отсутствии у соединения РГПУ-201 ганглионарного, симпато и адренолитического действия, что позволяет считать подавление реакций АД, вызванных раздражением седалищного нерва обусловлено подавлением активности центральных симпатических структур.
При изучении влияния соединением РГПУ-201 на реологические свойства крови, в условиях ишемического и реперфузионного повреждения миокарда было установлено, что данное соединение увеличивало временной показатель протромбиновой активности (r), временной показатель тромбиновой активности (k), время формирования фибрин-тромбоцитарной структуры сгустка (T), при этом суммарный показатель ретракции и спонтанного лизиса сгустка (F) практически достигал уровня интактных животных. Вместе с тем происходило уменьшение по отношению к контролю ретракционной способности тромбоцитов и интенсивности их спонтанной агрегации (Ar), фибрин-тромбоцитарной константы крови (АМ), что свидетельствует об уменьшении выраженности гиперкоагуляции, вызванной ишемией миокарда (рис.8).
 | Рис.8. Функционального состояния гемостаза у крыс после ишемически-реперфузионного повреждения миокарда. Обозначения: по оси OY – изменение гемореологических показателей относительно интактных животных, по оси ОХ: r – временной показатель протромбиновой активности, k – временной показатель тромбиновой активности, АМ – фибрин-тромбоцитарной константы крови, Т – время формирования фибрин-тромбоцитарной структуры сгустка, F – суммарный показатель ретракции и спонтанного лизиса сгустка, kk –показатель тромбиновой активности, t – константа свертывания крови, * p<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы; |
Также после перенесенного ишемическо-реперфузионного повреждения миокарда индуцированная агрегация тромбоцитов была ниже у животных, получавших соединение РГПУ-201 по сравнению с животными контрольной группы, получавшими физиологический раствор.
При ишемии миокарда соединение РГПУ-201 достоверно снижало вязкость крови, особенно при низких скоростях сдвига, и индекс агрегации эритроцитов (таб. 3)[2].
Таблица 3.
Влияние РГПУ-201 на вязкость крови крыс с ишемией миокарда при различных скоростях сдвига (M±m).
| Группы животных | Скорость сдвига, сПз | |||||
| 300с-1 | 200с-1 | 100с-1 | 50с-1 | 20с-1 | 10с-1 | |
| Интактные | 3,82±0,07 | 4±0,06 | 4,7±0,06 | 5,7±0,08 | 7,3±0,14 | 8,26±0,23 |
| Ишемия миокарда | 4,2±0,11 | 4,37±0,13 | 5,23±0,15 | 6,53±0,21 | 8,92±0,31 | 10,88±0,49 |
| Ишемия миокарда+ РГПУ-201 | 4,07±0,07 | 4,2±0,09 | 4,98±0,11 | 6,05±0,18 | 7,78±0,32* | 8,92±0,47* |
Примечание: * данные статистически достоверны по t-критерию Стьюдента в сравнении с показателями контрольной группы животных при р<0,05.
На моделях гемической и нормобарической гипоксии с гиперкапнией установлено, что исследуемое соединение увеличивало латентный период наступления апноэ и продолжительность жизни животных по сравнению с животными контрольной группы, что свидетельствует о его противогипоксической активности (таб. 4).
Таблица 4.
Влияние РГПУ-201 на длительность латентного периода наступления апноэ и продолжительность жизни у животных в условиях гиперкапнической и гемической гипоксий
| Группы (n=8) | Доза мг/кг | Гиперкапническая гипоксия | Гемическая гипоксия | ||
| ЛПА, сек. (М ± m) | % | Время жизни, сек. (М ± m) | % | ||
| Контроль | - | 780±30,73 | - | 1556±33,48 | - |
| РГПУ-201 | 24 | 927±33,35* | 118,7% | 2479±40,78* | 159,3% |
Примечание: ЛПА – латентный период наступления апноэ у животных в условиях нормобарической гипоксии с гиперкапнией; время жизни – время выживания животных в условиях гемической гипоксии на фоне метгемоглобинобразования;*-p<0,05(непараметрический U-критерий Манна-Уитни).
При изучении влияние соединения РГПУ-201 на показатели состояния процессов ПОЛ и антиоксидантной системы в условиях острой ишемии миокарда установлено, что соединение РГПУ-201 нивелирует проявления окислительного стресса, предупреждая накопления ДК (на 24,1%) и МДА (на 30,5%), и не влияет на показатели антиоксидантной системы[3] (рис.9).
 |  |
Рис.9. Влияние соединения РГПУ-201 на содержание диеновых коньюгатов и малонового диальдегида при острой ишемии миокарда.
Примечание: # данные статистически достоверны по t-критерию Стьюдента в сравнении с показателями интактных животных при р<0,05; * данные статистически достоверны по t-критерию Стьюдента в сравнении с показателями контрольной группы животных при р<0,05.
Таким образом, механизм кардиопротективного действия соединения РГПУ-201 обусловлен центральным симпатоингибирующим, антистрессорным действием, позитивным влиянием на кардиогемодинамику, микроциркуляцию, эндотелиальную функцию, его противогипоксическими свойствами.
ВЫВОДЫ
- Проведенный целенаправленный поиск веществ с кардиоваскулярными свойствами среди 7 гетерилсодержащих оксимов гексагидробензофуранонов позволил выявить соединения под лаборатоными шифрами РГПУ-201, РГПУ-209, РГПУ-211, РГПУ-213, положительно влияющие на состояние гемодинамики, оказывающие брадикардическое и нормализующее действие на вариабельность сердечного ритма.
- В условиях 30-ти минутной окклюзии нисходящей ветви левой коронарной артерии соединения РГПУ-201 в большей мере, чем другие исследуемые вещества улучшало функциональное состояние очага ишемии, оказывая сопоставимое с амиодароном, верапамилом и обзиданом действие. Наиболее выраженный противоишемический эффект соединение РГПУ-201 оказывает в дозе 24 мг/кг, минимальная ЕД20 составляет 7 мг/кг, ЕД 40 – 24 мг/кг, ЛД50 – 717мг/кг, ТИ – 102 и 30, соответственно.
- При изучении антиаритмической и противофибрилляторной активности производных бензофуранонов установлено, что только соединение РГПУ-201 оказывает противоаритмическое действие, незначительно уступающее препаратам сравнения (обзидану, новокаинамиду, верапамилу, амиодарону).
- Соединение РГПУ-201 в условиях острого стресса препятствует истощению функциональных резервов сердца, улучшает микроциркуляцию, снижает агрегационную активность тромбоцитов, оказывает эндотелиопротективное действие.
- Соединения РГПУ-201 уменьшает повышение АД, вызванное раздражением седалищного нерва, не оказывает ганглионарное, симпато- и адренолитическое действие, уменьшает хронотропный эффект на введение изадрина, и практически не меняет реакции АД и ЧСС на введение ацетилхолина, дофамина, норадреналина, что свидетельствует о его центральном симпатоингибирующем и слабом -адреноблокирующем действии.
- Гетерилсодержащий оксим гексагидробензофуранона – соединение РГПУ-201 в условиях ишемического и реперфузионного повреждения миокарда корригирует гемореологические показатели, уменьшает агрегационную активность тромбоцитов и эритроцитов, снижает вязкость крови.
- Соединение РГПУ-201 в условиях ишемии сердца при перевязки коронарной артерии незначительно подавляет процессы ПОЛ, снижая уровень ДК на 24,1% и МДА на 30,5% в миокарде.
- Результаты фармакологических исследований соединения РГПУ-201 свидетельствуют о перспективности его дальнейшей разработки в качестве кардиопротективного препарата.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Полученные данные указывают на целесообразность и перспективность дальнейшего углубленного изучения кардиопротективных свойств соединения РГПУ-201.
2. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности продолжения химиками-синтетиками целенаправленного синтеза новых производных оксимов бензофуранонов веществ с целью поиска веществ с биологической активностью и, в частности, с кардиопротекторными свойствами.
Список опубликованных работ по теме диссертации:
- Волотова Е.В. Изучение антигипоксической активности новых производных бензофурана / Е.В. Волотова // Вестник Российского государственного медицинского университета: материалы III Международной (XII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 20 марта 2008г.). – М.: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, 2008. – Т. 61, №2 – С.274-275.
- Тюренков И.Н. Оценка кардиопротективного действия новых производных бензофурана при гипоксии / И.Н. Тюренков, Е.В. Волотова, В.М. Берестовицкая, О.С. Васильева, С.М. Александрова // Человек и лекарство: тезисы докладов 15-го Российского национального конгресса 14-18 апреля 2008г. – Москва, 2008. – С.714-715.
- Волотова Е.В. Противоишемическая активность новых производных бензофурана / Е.В. Волотова // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 66-ой открытой научно-практической конференция молодых учёных и студентов с международным участием – Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2008. – С.157.
- Волотова Е.В. Влияние нового производного бензофурана на индекс энергетических затрат сердца у экспериментальных животных / Е.В. Волотова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов IX Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (20 сентября 2008 г.) / науч. ред. О.В. Семешина, Т.А. Бродская. – Владивосток: «Медицина ДВ», 2008. – С.9.
- Волотова Е.В. Оценка протигипоксической активности потенциального кардиопротективного средства / Е.В. Волотова, И.Н. Тюренков, В.М. Берестовицкая, О.С. Васильева // Вестник РУДН Серия Медицина. – 2008. – №8. – С.229-232.
- Волотова Е.В. Влияние новых гетероциклических соединений на показатели вариабельности сердечного ритма / Е.В. Волотова // Вестник новых медицинских технологий. – 2008. – Т.XV, №4. – С. 114-115.
- Волотова Е.В. Влияние нового гетероциклического соединения на индуцированную агрегацию тромбоцитов/ Е.В. Волотова // Вестник Российского государственного медицинского университета: материалы IV Международной (XIII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 19 марта 2009 г.) – М.: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. – 2009. – №3. – С.15-16.
- Волотова Е.В. Анализ бета-адреноблокирующего действия нового гетероциклического соединения / Е.В. Волотова, В.М. Берестовицкая, О.С. Васильева // Человек и лекарство: тезисы докладов 16-го Российского национального конгресса 6-10 апреля 2009г. – Москва, 2009. – С. 633-634.
- Тюренков И.Н. Изучение влияния соединения РГПУ-201 на систему функционального состояния гемостаза у крыс / И.Н. Тюренков, Е.В. Волотова // Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)/ материалы международной научной конференции. – Ярославль: Изд-во ЯГПУ им. К.Д. Ушинского, 2009. – С.97.
- Волотова Е.В. Противоаритмическое действие нового гетероциклического соединения РГПУ-201 / Е.В. Волотова // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 67-ой открытой научно-практической конференция молодых учёных и студентов с международным участием – Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2009. – С.171.
[1] Выражаем искреннюю благодарность зав.кафедрой органической химии РГПУ им.А.И..Герцена, д.х.н., проф. Берестовицкой В.М., к.х.н., доц. Васильевой О.С. и всем сотрудникам кафедры за предоставленные для исследования вещества
[2] Исследование выполнено совместно с к.м.н. Науменко Л.В., Сысоевой В.А. За что выражаем искреннюю благодарность им и зав.кафедрой, ЗДН, член-корреспонденту РАМН, д.м.н., проф. Спасову А.А.
[3] Исследование выполнено совместно с сотрудниками кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ВолГМУ, за что выражаем искреннюю благодарность зав.кафедрой, д.м.н., проф. Островскому О.В. и к.м.н. Буреевой А.А.
